MX2013004173A - Metodos para alterar la reactividad de las paredes de las celulas vegetales. - Google Patents

Abstract

Se proveen métodos y medios para producir oligosacáridos con carga positiva en la pared de las células vegetales, que comprenden introducir en dicha célula vegetal una proteína de nodulación C fusionada a una secuencia heteróloga que es una señal de anclaje para el aparato de Golgi.

Description

MÉTODOS PARA ALTERAR LA REACTIVIDAD DE LAS PAREDES DE LAS CELULAS VEGETALES CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se relaciona con la modificación de la reactividad de las paredes de las células vegetales, incluyendo las paredes secundarias de las células vegetales, particularmente como puede hallárselas, en las fibras naturales de las plantas productoras de fibras. En particular, la presente invención se relaciona con fibrás de algodón que presentan una reactividad alterada. La reactividad modificada podría aplicarse en métodos para teñir material derivado de plantas que contuviera paredes celulares, ta como fibras naturales, usando colorantes que reaccionan con las fibras, para mejorar, por ejemplo, la fijación del color, o para reducir los volúmenes de agua de desecho usada durante el procedimiento de tinción. La reactividad modificada también podría aplicarse para mejorar la reactividad de las fibras naturales con reactivos tales como los retardantes de las llamas, repelentes del agua, del aceite y de la tjerra, los agentes antiarrugas, los suavizantes, los agentes antí-estáticos, los agentes blanqueadores fluorescentes, etc.

En la presente invención se proveen métodos para incrementar la eficiencia de la producción de oligómeros de N-acetil glucosamina en las paredes de las células vegetales, con la v ntaja adicional de que las plantas soportan bien el lavado. Los colorantes que reaccionan con las fibras son moléculas en las que se combinan cromóforos con un grupo reactivo, qde forma uniones covalentes fuertes con la fibra mediante una reacción con ids grupos hidroxilo. Los enlaces covalentes le confieren una buena resistencia la fibra coloreada ante el lavado.

Durante el procedimiento qe tinción, se necesitan grandes cantidades de electrolitos para proteger los colorantes aniónicos de las cargas aniónicas de las fibras. Es necesario eliminar los colorantes hidrolizados sin reaccionar (que pueden hallarse en una proporción de hasta 40%) con múltiples pasos de lavado, con lo que se generan grandes volúmenes de agua residual, la cual también contiene Iqs electrolitos que se mencionaron con anterioridad.

Por consiguiente, al incorporarse una carga eléctrica positiva en las fibras de celulosa, por ejemplo, mediante la incorporación de compuestos químicos con carga positiva, podrían mejorarse las posibilidades de tinción de las fibras de celulosa naturales, y también podría mejorarse cualquier reacción química de las fibras de celulosa modificadas con compuestos químicos con carga negativa. También posibilitaría el uso de colorantes ácidos.

En diversas publicaciones se ha descrito la incorporación o el recubrimiento con oligómeros de quitosán en fibras de celulosa para preparar mezclas, hiladoso tejidos de quitosán/celulosa. El quitosán es un polímero de glucosamina con carga positiva, que puede obtenerse a través de la desacetilación de la quitina, por ejemplo, con tratamientos alcalinos. Lja quitina misma es un polímero de N-acetilglucosamina con enlaces ß-1 (GIcNAc).

En la solicitud de patente de los Estados Unidos US2003/0134120, se describe el recubrimiento de fibras naturales cop quitosán.

Liu et al. (Carbohydrate Pofymers 44(2003) 233-238) describen un método para recubrir fibras de algodón con quitosán mediante la oxidación del hilado de algodón con periodato dje potasio a 60°C en agua, y el tratamiento subsiguiente con una solución de quitosán en ácido acéticó acuoso. Con el recubrimiento de quitosán, la superficie de la fibra de algodón presentó actividad fisiológica y biológica Como la reactividad química del grupo amino es mayor que la del grupo hidroxilo de los monómeros de celulosa, la fibra tiene un mayor potencial para recibir modificaciones químicas adicionales. Más aun, la superficie suave de la fibra de algodón se tornó rugosa, lo que es una señal de un mayor potencial para la absorción de fármacos y la liberación controlada de los mismos.

Sobre la base de la función fisiológica del quitosán, por ejemplo, en la inhibición de los dermatofitos, en numerosas vestimentas, tejidos y fibras funcionales se emplean fibras con mezclas de celulosa-quitosán, conjugados de fibras de celulosa-quitosán y tejidos recubiertos con resinas que contienen quitosán.

En el documento WO00/09 29 se describe la expresión de una secuencia que es una señal de anclaje para el aparato de Golgi, y una región de terminación de la transcripción poliadenilación. En otra modalidad, se provee un método para producir una planta, tal como una planta de algodón, que comprende oligosacáridos con Carga pe-*, en sus célu,aS usando métodos de conformidad con la in ención, en donde la longitud de las raíces de dicha planta es esencialmente idéntica a la de una planta de tip silvestre que no comprende el gen de la NODC.

En la invención también se provee un método para producr plantas que comprenden oligosacáridos con carga positiva en las paredes de sus células, que también comprende un paso en el que se desacetilan los oligosacáridos mencionados, que consisten de monómeros de N acetilglucosamina, en donde dicho paso comprende tratar las paredes de las células de la planta con una solución alcalina o a través de^ la acción enzimática de quitina desacetilasas.

En la invención también sé proveen genes quiméricos que comprenden un promotor que puede expresarse en las plantas, una región dé ADN que codifica para una proteína de nodulación C fusionada a una secuencia que es una señal de anclaje, con el objeto de dirigirla a las membranas del aparato de Golgi, y una región de terminación de la transcripción y poliadenilación, así como células vegetales, plantas tales como plantas de algodón, y fibras de algodón que comprenden el gen quimérico mencionado. En otra modalidad, en la invención se proveen plantas que consisten esencialmente de células vegetales que comprenden un pueden reconocerse, por ejemplo, detectando la NODC que es codificada por los genes quiméricos, a través de su unión incrementada a los colorantes aniónicos, que incluyen el rojo Congo, a través de su unión incrementada a aglutinina del germen de trigo o sobre la base de su reactividad incrementada con los colorantes que reaccionan con leis aminas, en comparación con las fibras de algodón provenientes de plantas de algodón de una línea isogénicá que no contiene un gen quimérico que codifica para una NODC enlazada operablemente a una secuencia que es u na señal de anclaje para el aparato de Golgi, según se describe en la presente. La presencia y/o la cantidad dé oligosacáridos en las fibras de algodón también pueden determinarse de manera directa, por ejemplo, con una cromatografía en capa delgada de alto rendimiento (HPTLC) o con una cromatografía de líquidos de alto rendimiento combinada con una espectrometría de masa (HPLC-MS) En otra modalidad, la invención se relaciona con el uso de una región de ADN que codifica para una N-abetilglucosamina transferasa capaz de dirigirse al aparato de Golgi de una célula vegetal para incrementar ?e? cantidad de oligosacáridos con carga positiva en la pared de una célulai vegetal o para incrementar la reactividad de las paredes de las células vegetales, a través de modificaciones q ímicas de las paredes de estas células vegetales.

En una modalidad, la invención se relaciona con un método paraj teñir fibras de algodón, hilados o tejidos, que comprende proveer fibras, hilados o tejidos como los que se describen en la presente, y aplicar un colorante capaz de reaccionar con dichas fibras, con dichos hilados o con dichos tejidos.

En la invención también se proveen genes quiméricos que comprenden las siguientes regiones de ADN enlazadas operablemente: un promotor que puede expresarse en las plantas, una región de ADN que codifica para una N-acetilglucosamina transferasa del tipo de la NODC, que está fusionada a una secuencia que es una señal de anclaje para el aparatD de Golgi, y una región de terminación de la transcripción y poliadenilación, así como el uso de estos genes quiméricos para incrementar la cantidad de oligosacáridos con carga positiva en la pared de una célula vegetal y para producir fibras de algodón, hilados y tejidos con una reactividad mejorada, tal como una idoneidad para la tinción mejorada.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1. Alineación de la secuencia de aminoácidos de distintas proteínas NODC. Los residuos de aminoácido conservados en todas las proteínas se indican en negritas. ROT_NODC_RHILP: proteína NODC de Rhizobium leguminosarum (biova edad phaseoli); ROT_NODC_BRAJA: proteína NODC de Bradyrhizobium japonicum; ROT_NODC_RHIS3 proteína NODC de Rhizobium sp. (cepa N33); ROT_NODC_RHISN: proteína NODC de Rhizobium sp; ROT_NODC_RHILV: oroteína NODC de Rhizobium leguminosarum (biovahedad viciae) y ROT_NODC_AZOCA: proteína NODC representan el grado de polimerización de estos oligómeros. Los gráficos se proveen en pares, de los cuales el gráfico superior corresponde a la planta de tipo silvestre, y el gráfico inferior corresponde al transformante que contiene a pTJN6.

DESCRIPCION DETALLADA DE LAS DI FERENTES MODALIDADES DE LA INVENCION La presente invención se basa en el descubrimiento de que, al expresar una fusión de una secuencia heteróloga que es una señal de anclaje para el aparato de Golgi con una N-acetilglucosamina transferasa del tipo de la NODC en las células vegetales, inesperadamente se obtiene como resultado una incorporación incrememtada de oligómeros de N acetilglucosamina específicos en las paredes de la célula vegetal, en donde dicho incremento es de hasta 65 veces, en comparación con las paredes de las células de las plantas donde se expresa una N-acetilglucosamina transferasa del tipo de la NODC que no está fusionada a una secuencia que es una señal de anclaje para el aparato de Golgi. Para efectuar la síntesis de los oligómeros de GIcNAc, no es necesaria la adición externa de GIcNAc al medio de cultivo.

Al mismo tiempo, mientras qúe la expresión de la NODC en las plantas afecta negativamente la longitud de las raíces, la fusión de una secuencia heteróloga que es una señal de anclaje para el aparato de Golgi a N. La función de cada una de las tres proteínas en la síntesis de los factores de nodulación es bien conocida: la NODC es una N-acetilglucosaminjl transferasa que produce la cadena del quito-oligosacárido; el grupo N-acetill) del residuo de N-acetilglucosamina no reductor de la cadena de quito-oligosacáridos es removido por la NODB, que actúa como una quitiná oligosacárido desacetilasa; y la NODA participa en la unión de la cadena de acilo al grupo amino libre que es generad p por la NODB. Otros factores Noel codificados por otros genes nod, abarcan cualquiera de los grupos químicos de decoración con los que pueden discriminarse los diferentes factores de: nodulación. Para los propósitos de la presente invención, solamente sor relevantes las proteínas NODC y los genes que las codifican La proteína de nodulación C (la "proteína NODC") es una proteína que ha sido bien caracterizada (para hallar una revisión, véase Kamst y Spaink, 1999, Trenes in Glycoscience and Glycotechnology, 1 1 , pp. 187-199). Pertenece a la familia de las proteínas ß-polisacárido sintasas, que participan en la síntesis de polisacáridos lineales que contienen residuos de| monosacárido con enlaces ß. Las enzimas que presentan un mayor] parentesco estructural con las NODC, son las transferasas que participan en la síntesis de la quitina (que comprende N acetilglucosaminas con enlaces ß-1-4), de la celulosa (que es un polímero de residuos de glucosa con enlaces ß-1-4), del ácido hialurónico (que es un copolímero de N-acetilglucosamina y ácido glucurónico) y de los oligosacáridos de quitina que se producen durante el desarrollo temprano de los embriones de pez cebra. Pueden reconocerse - la secuencia PXVDVIXPXXÑE, - la secuencia VDDGSXN, - la secuencia GDXXLDVDS TXXXXDV, - la secuencia GXXMGQ, la secuencia DMEYWLACNEERXXQXRFGXVMXCXGXCXMYR, - la secuencia FRTXYXPXAXAXTXVP, - la secuencia YLXQQLRWARSTXRXTXL - la secuencia QNXGXXLL y - la secuencia RFXFXXXHXXXNXXXLXPLKXYALXT En la figura 2 se representa una alineación de un sub-conjuntd de proteínas NODC diferentes, en donde se presentan residuos aun más conservados, tales como los que se detallap a continuación la secuencia WLTRLID EYWLACNEERXXQXRFGXVMCCCGPCAMYRRS, la secuencia LLXXYEXQXFXGXPSXFGEDRHLTILMLXAGFRTXYVPXAXAXTXVP y - la secuencia YLRQQLRWARSTXRDTXLA La longitud de la estructura !de base del oligosacárido en los oligosacáridos de lipo-quitina que son producidos por distintas Rhizobiaceae, varía entre dos y seis residuos. Se ha demostrado que la proteína de nodulación NODC es un determinante importante de la longitud de la cadena de oligosacáridos de quitina en la síntesis de la cadena de quito- AAD11385 AAD11387 AAD 1 1389 AAD1 1391 , AAD1 393 AAD1 1395, AAD11397 AAD1 1399 AAD11401 AAD11403, AAD1 1405 AAG60998, AAK00157 AAK39956 AAK39957 AAK39958, AAK39959 AAK3996 , AAK39961 AAK39962 AAK39963 AAK39964, AAK39965 AAK39966, AAK39967 AAK50872 AAK65131 AAL88670, AAN62903 AAS91748, AAU 11338 AAU11339 AAU11340 AAU1 1341 , AAU 1 1342 AAU1 134 , AAU11344 AAU11345 AAU1 1346 AAU 11347, AAU 1 1348 AAU1 1349, AAU11350 AAU11351 AAU 1 1352 AAU1 1353, AAU 1 1354 AAU11355, AAU11356 AAU11357 AAU 1 1358 AAU 1 1359, AAU1 1360 AAU1 136' , AAU11362 AAU11363 AAU11364 AAU 11365, AAX30049 AAX30050, AAY44091 AAY44092 AAY44093 AAY89044, AAZ8 541 ABC40958, ABC67303 ABD39006 ABD39007 ABD39008, ABD39009 ABD3901 CI ABD3901 1 ABD39012 ABD39013 ABD39014, ABD39015 ABD39016, ABD39017 ABD39018 ABD39019 AEID39020, ABD39021 ABD39022, ABD39023 ABD39024 ABD39025 ABD39026, ABD39027 ABD39028, ABD39029 ABD39030 ABD39031 ABD39032, ABD39033 ABD39034, ABD39035 ABD39036 ABD39037 ABD39038, ABD67413 ABD67416 ABD67419 ABD67422 ABD67425 ABD67428, ABD67431 ABD67434 ABD73319 ABD73320 ABD73321 ABD73322, ABD73323 ABD73324 ABD73325 ABD73326 ABD73327 ABD73328, ABD73329 ABD73330Í ABD94161 ABD94162 ABD94163 ABD94164, ABD94165 ABF93198 ABF93199, ABF93200, ABF93201 , AB ABM69186, ABM69187 ABM69188, ABM69189, ABM69190, ABN0921 ABN09218, ABN09219 ???11 177, ???11 178, ABS85177, ABS85178, ABS85179, ABU69044, ABU69045, ABU69046, ABU69050, ABU69051 , ABU69052, ABU69056, ABU69057, ABU69058, ABU89879, ABV25689, ABV25690, ABV25694, ABW96 96, ABW96197, ABW9620 ABW96202, ABW96203, ABW96207, ABW96208, ABW96209, , ???5963 ???59635, ???59636, ACA8031 ACA803 2, ACA80313, ACD39339, ACD39340, ACD39341 , ACD39345, ACD39346, ACD39347, ACD63095, ACD63096, ACD63097, ACD63101 , ACD63102, ACD63103, ACF 19764, ACF19765, ACF19766, ACF19770, ACH91221 , ACH91222, ACH91226, ACH91227, ACH91228, ACH91232, ACH91233, ACH91242, ACH91246, ACH91247, ACH91248, ACI47336, ACI47337, ACI47338, ACI47339, ACI47340, ACI47341 , ACI47342 ACI47343, ACI47344, ACI47345, ACL12058, ACL12059, ACL50517 ACL50518, ACL50519, ACL50520, ACL50521 , ACL50522, ACL50523 ACM69382, ACM79634, ACM79635, ACM79638, ACM79639, ACM79640, ACM79641 , ACM79644, ACM79645, ACM79646, ACN17701 , ACN69203, ACN69204, ACN69205, ACN69206, ACN69209, ACN69210, ACN69211 , ACN69212, AC058665, AC058666, AC058667, AC058668, AC05867 AC058672, AC058673, AC058674, ACS35430, ACS35434, ACT34091 , ACT34094, ACT3410' ACT34104, ACT34107, ACT34110, ACT34119, ACT34122, ACT34125, ACT34128, ACT34137, ACT34140, ACT34143, ACV52950, ACV5295 -Í, ACV52954, ACV52955, ACX47326, ACX47329, ACX47330, ACX47331 , ACX47332, ACY02884, ACY78518, ACZ52692, ACZ52693, ACZ52696, ACZ52697, ADD20957, ADD20958, ADD20961 , ADD20962, ADD20963, ADD20964, ADD20967, ADD20968, ADD20969, ADD20970, ADG63646, ADG63647, ADG63648, ADG63649, ADG63652, ADJ18191 , ADJ18192, BAA06082, BAA06085 BAA06086, BAA06087, BAA06088, BAA24092 BAB52500, C26813,CAA25810, C CAA26310 CAA2631 1 , CAA51773, CAA51774, CAB56055, CAC42489, CAD29949, CAD29950, CAD29953, CAD29954, CAD29955, CAD29956, CÁD29957, CAD31533, CAD43933, CAD90257, CAD90583, CAD90584, CAD90585, CAD90586, CAD90587, CAD90588, CAH04369, CAN84684, CAP64017, EAQ38847, EAS72439, NP_106714,NP_435719, NP_443883, P04340, P04341 , P04677, P04673, P04679, P06234, P06235, P17862, P24151 , P26024, P50357, P53417 P72334, Q07755, Q53513, YP_001796208, YP_002605865, ZP_01050448 ZP_01252570 (que se incorporan en la presente a modo de referencia).

En el cuadro a continuación se resumen otros ingresos en las bases de datos UNIPROT que abarcan proteínas NODC de longitud completa. Todas las secuencias de aminoácidos que se mencionan a través de números de acceso, se incorporan en la presente a modo de referencia.

CUADRO Proteínas NODC de longitud completa Sin embargo, ha de resultar 'evidente la posibilidad adicional de usar variantes de las proteínas NODC en las que se hayan deletado sustituido o insertado uno o más residuos de aminoácido, que puedan ó 52 amino ácidos de la misma; Munro eí al.1991 , EMBO Journal, 10: 3577-3588), la secuencia de señal de anclaje de la galactosil transferasa humana (particularmente los primeros 60 aminoácidos de la misma) o la secuencia de señal de anclaje del homólogo de Arabidopsis del receptor HDEL de levadura (AtERD2) (Saint-Jore et al., 2002, Th Plant Journal, 29: 661-678), l!a secuencia de señal de anclaje de a proteína p1 ,2-xilosiltransferasa (particularmente los primeros 36 aminoácidos de la misma; Pagny eí al 2003, The Plant Journal 33: 189-203), la secuencia de señal de anclaje de la N-acetil-glucosaminil transferasa I (particularmente los primeros 77 aminp ácidos de la misma; Essl et al. 1999 FEBS Lett. 453: 169-173) o fragmento de 20 aminoácidos de la proteína lisosomal humana LAMP (Brandizzi et al., 2002, Plant Cell 14: 1077-1092; todas las publicaciones sé incorporan en la presente a modo de referencia). Otras secuencias direccionamiento hacia el aparato de Gplgi que pueden emplearse en la fusión con el extremo C de la N-acetilglúcosamina transferasa, incluyen la secuencia de aminoácidos "YYHDL" qu puede hallarse en la proteína DAGAT1 de Arabidopsis, y la secuencia "LKLEI" que puede hallarse er DAGAT2 de Arabidopsis. La fusión de una secuencia que es una señal de anclaje para el aparato de Golgi y la NODC puede llevarse a cabo con técnicas convencionales de ADN recom inante, a través de la unión de fragmentos de ADN que codifican para los polipéptidos respectivos.

Tal como se usa en la presente, el término una secuencia heteróloga que es una señal de anclaje háce referencia a una secuencia que En la invención también se proveen genes quiméricos como los que se describen en la presente, y células vegetales o plantas que contienen dichos genes quiméricos, así como el uso de los genes quiméricos mencionados para incrementar la cant dad de oligosacáridos con carga positiva en las paredes celulares, o para incrementar la reactividad de las paredes de las células vegetales, de las fibras de algodón, de los hilados o de los tejidos, con el propósito de realizar modificaciones químicas, lo que abarca parámetros como la idoneidad para la tinción. En la invención también se proveen plantas, tales como plantas de algodón, que contienen genes quiméricos como los mencionados, en donde la longitud de las raíces de estas plantas es esencialmente idéntica a la longitud de las raíces de las plantas isogénicas que no contienen los genes quiméricos. En la invención también se proveen fibras que provienen de plantas de algodón como las mencionadas, así como hilados o tejidos que han sido elaborados con dichas fibras.

Tal como se usan en la presente, los términos un incremento en la eficiencia de la producción de oligómeros de N-acetilglucosamina y un incremento en la cantidad de oligosacáridos con carga positiva en las paredes de las células vegetales, hacen referencia a incrementos en la cantidad de oligosacáridos con carga positiva o de oligómeros de N-acetilglucosamina en las paredes de las células vegetales, donde dichos incrementos son de por lo menos 2 veces, por lo menos 5 veces, por lo menos 10 veces o por lo menos 20 veces, o de entre 2 y 100 veces, de entlre 5 y 100 veces, de entre 10 y 100 veces o de entre 20 y 100 veces.

En una modalidad específica, en la invención se proveen fibras de algodón que se obtienen o que pueden obtenerse de plantas de algodón de conformidad con los métodos de la invención, o que comprenden un gen quimérico de conformidad con la invención. En otras palabras, se proveen fibras de algodón que provienen de plantas de algodón que en su genoma, tal como el genoma nuclear de sus células, comprenden un gen quimérico que comprende un promotor que puede expresarse en las plantas enlazadc operablemente a una región de ADN que codifica para una N acetilglucosamina transferasa del tipo de la NODC, que está fusionada a uná secuencia que es una señal de anclaj e para el aparato de Golgi. Las modalidades particulares de las regiones codificantes de ADN o los promotores incluidos en los genes quiméricos que son transferidos a las plantas de algodón, son como se las describe en otras secciones en este documento.

Las fibras de algodón de cohformidad con la invención puederji distinguirse de las fibras de algodón naturales, es decir, las fibras de algodón que provienen de las líneas isogénicas que no comprenden un gen quimérico de conformidad con la invención, a través de la capacidad de estas fibras teñirse en mayor medida con colorantes aniónicos (que incluyen, por ejemplo el rojo Congo), a través de la capacidad de estas fibras de teñirse en mayor medida con colorantes que reaccionan con las aminas (que incluyen, pot ejemplo, el éster de tetrafluorofenilo). Las fibras de algodón de conformidad con la invención también tienen la capacidad de unirse a la aglutinina del germen de trigo, que se une a los quito-ol gomeros. Las fibras de algodón de conformidad con la invención también pueden distinguirse de las fibras de algodón naturales mediante la detección directa de los oligómeros de N acetilglucosamina y GIcNAc, tales como la quitobiosa, la quitotriosa o la quitotetraosa, preferiblemente después del tratamiento del material basado en fibras de paredes celulares con una celulasa. Las fibras de algodón dé conformidad con la invención también pueden distinguirse por su mayor contenido de nitrógeno.

Las fibras de algodón de conformidad con la invención también pueden distinguirse de las fibras recubiertas con quitosán o de los hilados con combinaciones de quitosán/celulosa a través de la distribución más o menos uniforme de los oligómeros con carga posi iva en las paredes secundarias de las células vegetales que constituyen ¡las fibras. Por consiguiente, en secciones microscópicas de fibras de algodón que han sido teñidas, porj ejemplo, con WGA, con rojo Congo o con tetrafluorofenilo, como se describirá más adelante en la presente, los colorantes se distribuirán de una manera más o menos uniforme a lo largo de las paredes celulares que constituyen las fibras de algodón, mientras que en las fibras recubiertas con quitosán, la tinción se concentrará en el recubrimiento de quitosán, que estará localizado en una lámina en la superficie de las fibras ratadas.

Las fibras de algodón de con Formidad con la invención también pueden distinguirse de otras fibras de algodón a través de la detección de los DP61 , DP90, DP77, DES1 19, McN235, HBX87, HBX191 , HBX107, FC3027 CHEMBRED A1 , CHEMBRED A2, CHEMBRED A3, CHEMBRED A4 CHEMBRED B1 , CHEMBRED B2, CHEMBRED B3, CHEMBRED C1 CHEMBRED C2, CHEMBRED C3, CH EMBRED C4, PAYMASTER 145 HS26, HS46, SICALA, PIMA S6 y ORO B _ANCO PIMA, Fibramax® FM5013, FM5015, FM5017, FM989, FM832, FM966 y FM958, FM989, FM958, FM832[ FM991 , FM819, FM800, FM960, FM966, FM981 , FM5035, FM5044, FM5045 FM5013, FM5015, FM5017 o FM5024, así como las plantas con genotipos derivados de los mismos.

El término "algodón", tal como se usa en la presente, incluye Gossypium hirsutum, Gossypium barbadense, Gossypium arboreum y Gossypium herbaceum, así como la progenie de los cruzamientos entre estas especies.

Los métodos y los medios de la presente invención también pueden emplearse para plantas de otras especies, tales como el cáñamo, el yute, el lino y las plantas leñosas que abarcan, sin limitaciones, Pinuss pp., Populus spp., Picea spp., Eucalyptus spp., etc.

La planta transformada obtenida puede usarse en un esquema de mejoramiento genético convencional para producir más plantas transformadas con las mismas características, o bien para introducir el gen quimérico de conformidad con la invención en otras variedades de plantas de especies idénticas o relacionadas, o en plantas híbridas. Las semillas obtenidas de las plantas transformadas contienen los genes quiméricos de la invención en un inserto genómico estable, y también se incluyen en la invención.

Los colorantes reactivos que pueden usarse en conexión con el método para teñir las fibras, los hilados o¡ los tejidos de algodón, abarcan el rojo reactivo 120 (RR120), el amarillo reactivo 176 (RY176), el azul de LevafixCA, el anaranjado reactivo 35, el negro reactivo 5 y el rojo reactivo 116. La tinción también puede efectuarse con colorantes ácidos, tales como ej anaranjado ácido 7, el azul ácido 62, el azul ácido 281 , el rojo ácido 361 , el azul ácido 277, el rojo ácido 4, el azul ácido 113, el amarillo ácido 137, el azu ácido 127:1 y el azul ácido 193. Estos co orantes se aplican de conformidad con protocolos bien conocidos en la técnica.

Tal como se usa en la presente, el término "que comprende" denota la presencia de las características, los números, los pasos o los componentes mencionados, según se indican, pero no excluye la presencia o la adición de una o más características, ijiúmeros, pasos o componentes, o| grupos de los mismos. Así, por ejemplo, ur| ácido nucleico o una proteína que¡ comprendan una secuencia de nucleói idos o de aminoácidos pueden comprender más nucleótidos o aminoácidos que los citados de hecho, es decir, pueden estar incluidos en un ácido n cleico o una proteína más grande. Un gen quimérico que comprende una región de ADN, definida desde el punto} de vista funcional o estructural, puede comprender regiones de ADN adicionales, etc.

Las células vegetales y las plántas transgénicas que se obtienen con los métodos que se describen en la presente, también pueden usarse en procedimientos de transformación ulteriores, por ejemplo, para introducir un gen quimérico adicional.

Las plantas o las semillas dé algodón que comprenden el gen quimérico como se describen en la presente o que se obtienen con métodos como se describen en la presente, también pueden tratarse con herbicidas apropiados para el algodón, tales como el ¡diürón, el fluometurón, el MSMA, e oxifluorfeno, la prometrina, la trifluralina, la carfentrazona, el cletodim, e fluazifo p-butilo, el glifosato, el norflurazon, la pendimetalina, el piritiobac sodio, el trifloxisulfurón, el tepraloxidim, el glufosinato, el flumioxazin o e tidiazurón, con insecticides apropiados para el algodón, tales como el acetato el aldicarb, el clorpirifos, la cipermetrina, la deltametrina, la abamectina, e acetamiprid, el benzoato de emamectina el imidacloprid, el indoxacarb, la lambda-cihalotrina, el spinosad, el tiodicarb, la gamma-cihalotrina, e espiromesifeno, el piridalilo, el flonicamid, la flubendiamida, el triflumurón, e i rinaxipir, la beta-ciflutrina, el espirotetramat, la clotianidina, el tiametoxam, el tiacloprid, el dinetofurano, la flubendiamida, el ciazipir, el spinosad, e spinotoram, la gamma-cihalotrina, la 4-[[(6-clorpiridin-3-il)metil](2,2-| difluoroetil)amino]furan-2(5H)-ona, el tiodicarb, la avermectina, la flonicamida, el piridalilo, el espiromesifeno o el sulfoxaflor, o con fungicidas apropiados para el algodón, tales como la azoxistrobina, el bixafeno, el boscalid, el carbendazim, el clorotalonil, el cobre, el ciproconazol, el difenoconazol, la dimoxistrobína, el epoxiconazol, la fenamidona, el fluazinam, el fluopiram, la caulinodans SEQ ID NO 2: proteína de nodulación C de Bradyrhizobium japonicum SEQ ID NO 3: proteína de nodulación C de Rhizobium galegae SEQ ID NO 4: proteína I de nodulación C de Rhizobiu i leguminosarum (biovariedad viciae) SEQ ID NO 5: proteína de nódulación C de Rhizobium meliloti SEQ ID NO 6: proteína de nodulación C de Rhizobium tropici SEQ ID NO 7: proteína de nodulación C de Rhizobium leguminosarum (biovariedad phaseoli) SEQ ID NO 8: proteina de nodulación C de la cepa N33 Rhizobium sp.

SEQ ID NO 9: proteína de nódulación C de Rhizobium loti SEQ ID NO 10: ADN-T de pTJN6 SEQ ID NO 1 1 : Secuencia de aminoácidos de una NODC unidá a una secuencia que es una señal de anclaje para el aparato de Golgi SEQ ID NO 12: secuencia cíe ácido nucleico de un ADN-T que comprende un gen quimérico que comprende el promotor selectivo para las fibras F286 enlazado operablemente a un ácido nucleico que codifica para una NODC, que también comprende una sjeñal de direccionamiento para él aparato de Golgi (pTDBI146) SEQ ID NO 13: secuencia de ácido nucleico de un ADN-T que comprende un gen quimérico que comprende el promotor GludA enlazado operablemente a un ácido nucleico que codifica para una NODC, que también comprende una señal de direccionamiento para el aparato de Golgi (pTDBI158).

SEQ ID NO 14: secuencia de ácido nucleico de un ADN-T que comprende un gen quimérico que comprende el promotor GludD enlazado operablemente a un ácido nucleico que codifica para una NODC, que también comprende una señal de direccionamiento para el aparato de Golgi (pTDBI159).

SEQ ID NO 15: secuencia de ácido nucleico de un ADN-T qué comprende un gen quimérico que comprende el promotor de la expansina enlazado operablemente a un ácido nucleico que codifica para una NODC, que también comprende una señal de direccionamiento para el aparato de Golgi (pTDBI165).

SEQ ID NO 16: secuencia de ácido nucleico de un ADN-T qué comprende un gen quimérico que corrjprende el promotor E6 enlazad operablemente a un ácido nucleico que codifica para una NODC, que también comprende una señal de direccionamiento para el aparato dé Golgi (pTGK96) i ADN-T, junto con un gen quimérico bar que confería resistencia a la fosfinotricina. El vector de ADN-T resultante se denominó pTJN6. La secuencia del ADN-T de este vector se provee como SEQ ID NO: 10.

El vector de ADN-T pTJN6 se introdujo en la cepa de Agrobacterium C58C1 RIF (pEHA101 ; Hood et al (1986) J. Bact. 168: 1291 que se empleó para transformar Arabidopsis thaliana de conformidad con_él método de inmersión floral (Clough, SJ y Bent, AF (1998) Plant J. 16: 735: 743).

EJEMPLO 2 Análisis de la longitud de las raíces de plantas de Arabidopsis transqénicas Se esterilizaron con gas plantas de Arabidopsis de tipo silvestre y plantas de Arabidopsis transgénicas qúe habían sido transformadas con pTJN6 (que comprendía una NODC con una secuencia heteróloga que era una señal de anclaje para el aparato de Golgi) o con pTGK42 (que comprendía una NODC sin una secuencia heteróloga que fuera una señal de anclaje para el aparato de Golgi; véase el documento WO2006/136351) Posteriormente, se las sembró en un medid basal de Murashige y Skoog (MS) i 0.5 x que incluía vitaminas modificadas (Si¿jma) y 20 g/l de glucosa. Después de un período de inclusión que se prolongó durante 2 días a 4°C, las placas se colocaron verticalmente en una cámara de crecimiento con un régimen de compuestos eluidos en el modo de ionización por electroaspersión (ES ) positiva. La GIcNAc derivatizada tiene un valor m/z de 552 en el modo positivo. Se consideró que el área total de los picos era el mejor abordaje para la cuantificacion. Los oligómeros de GIcNAc se detectaron en el modo de MS/MS. En este contexto, solamente s;e seleccionaron compuestos coji valores m/z específicos para continuar con la fragmentación. Para la cuantificacion, se usó el pico 552 o e pico 755, que corresponden al monómero derivatizado o al dímero, respectivamente. Estos niveles se compararon con los que se determinaron en plantas de Arabidopsis que habían sido transformadas con pTGK42 (documento WO2006/136351) y en plantas de Arabidopsis de tipo silvestre.

En el cuadro 1 se muestra que, en presencia de la secuencia que era una señal de anclaje para el aparato de Golgi, la cantidad de GlcNAc2 fue hasta 65 veces mayor, y que la cantidad de GlcNAc3 fue hasta 35 veces mayor que en ausencia de la secuencia que era una señal de anclaje para el aparato de Golgi.

CUADRO 11 Cantidades relativas de los oliqómeros de N-acetilglucosamina GlcNAc2 y GIcNAc 3 en hojas de plantas de Arabidopsis que habían sido transformadas con pTJN6 (que comprendía una NODC con una secuencia heterologa que era una señal de anclaje para el aparato de Gol i) o con pTGK42 (que comprendía una NODC sin una secuencia heterologa que fuera una señal de anclaje para el aparato de Golqi; véase el documento WO2006/136351) niveles de GlcNAc2 y GlcNAc3 en las raíces son significativamente mayores que en las hojas. La presencia de oligos de GIcNAc en las raíces de las plantas de tipo silvestre probablemente se deba a la contaminación con material proveniente de las raíces de las plantas pTGK42 y de las plantad pTJN6.

Con estos resultados, puede mostrarse que la restauración de la longitud de las raíces hasta los niveles nórmales por medio de la adición dé una secuencia que es una señal de anclaje para el aparato de Golgi a una NODC, no se debe a la ausencia de acumulación de oligos de GIcNAc en las raíces.

CUADRO 2A Cantidades relativas del oliqómero de N-acetilqlucosamina GlcNAc2 en raíces y hojas de plantas de Arabidopsis que habían sido transformadas con pTJN6 (que comprendía una NODC con una secuencia heterologa que era una señal de anclaje para el aparato de Golqi) o con pTGK42 (que comprendía una NODC sin una secuencia heterolo a ue fuera una señal de ancla e ara el a arato de Gol i CUADRO 2B Cantidades relativas del oligómero de N-acetilglucosamina GlcNAc3 en raíces y hojas de plantas de Arabidopsis que habían sido transformadas con pTJN6 (que comprendía una NODC con una secuencia heterologa que era una señal de anclaje para el al parato de Gol i) o con pTGK42 ue com rendía una NODC sin una secuencia heterolo a ue fuera una EJEMPLO 4 Caracterización de los oliaómeros de GIcNAc aue presentan un arado de polimerización de hasta 5 en las paredes celulares de plantas de Arabidopsis transaénicas Para detectar los oligómeros de GIcNAc que presentaban un grado de polimerización de hasta 5 en plan as de Arabidopsis que habían sido transformadas con pTJN6, en comparación con plantas de Arabidopsis de tipo silvestre, se llevó a cabo una derivatizació i con PMP. Se realizó un análisis de LC-MS en un sistema de UPLC Waters Acquity (Waters Corp., Milford, MA, USA) que estaba conectado a un espectrómetro de masa Synapt HDMS Q-Tof (Micromass, Manchester, Reino Unido). La separación cromatográfica se efectuó en una columna Acquity BEH C18 (de 2.1 mm x 150 mm, 1.7 pm) (Waters Corp., Milford, MA, USA), usando una elución con un gradiente. Las fases móviles estaban compuestas por (A)¡ agua con 1 % de ACN y 0.1 % de ácido fórmico y (B) ACN con 1% de agua y 0.1 % de ácido fórmico. La temperatura de la columna se mantuvo en 40°C, y la temperatura del analizador automático de muestras se mantuvo en 10°C. Se aplicó una magnitud de flujo de 350 µ?/min durante la elución con el gradiente, que comenzó en el tiempo 0 con 5% de (B), siguió con 50% de (B) una vez transcurridos 30 minutos y finalizó con 100% de (B) a los 33 minutos. El eluyente fue dirigido a un espectrómetro de masa que estaba equipado con una fuente de ionización por electroaspersión y una interfase de chorro fijo para determinar la masa con precisión. Los parámetros para la fuente de la MS abarcaron un voltaje capilar de 1.5 kV un cono de muestreo de 40V, un cono de extracción de 4V, una tempera ura de la fuente de 120°C, una temperatura de desolvatación de 350°C, un flujo de gas en el cono de 50 L/h y un flujo de gas de desolvatación de 550 L/h. La energía de colisión de la trampa y la célula de transferencia se fijó en 6 y 4V, respectivamente. Para adquirir los datos, se accionó el modo dé mejora del rango dinámico. Los datos del barrido completo se registraron en el modo V central. El rango de masa se fijó entre m/z 100 y 1600, con una velocidad de barrido de 0.2 segundos/barrido. Se empleó el software Masslynx (Waters Corp., Milford, MA, USA). Se usó leu-encefalina (a razón de 400 pg/µ?, solubilizada en agua/ACN (1:1 , v/v) y acidificada con 0.1% de ácido fórmico) para calibrar el espectrómetro de masa. Con este propósito, se realizó un barrido cada 10 segundos y se usó un período de barrido de 0.5 segundos. Se empleó un promedio de 3 barridos. Para llevar a cabo el análisis de MS/MS, se aplicaron los mismos parámetros, excepto que la energía de colisión de la trampa se incrementó desde 10 hasta 45 V. Todos los solventes empleados fueron de grado ULC/MS (Biosolve, Valkenswaard, Los Países Bajos). El agua se produjo con un sistema de purificación DireótQ-UV (Millipore S.A.S, Molsheim, Francia). En la figura 4 se ilustra que las plantas en donde se expresaba pTJN6-23 contenían monómeros, dímeros, trímeros, tetrámeros y pentámeros de GIcNAc. el azul de LevafixCA), los colorantes ácidos (el anaranjado ácido 7 o el azu ácido 281) o los colorantes que reaccionan con la lana (por ejemplo, el rojó reactivo 116 o el ámbar de Realan EHF) Tinción con WGA-Alexa 555 necesario deshidratar o permeabilizar las fibras de algodón. En lugar de esto, es posible eliminar los lípidos y las ceras sometiendo las fibras a 3 tratamientos dé 10 minutos con una mezcla de cloroformo y metanol (1 :1), seguidos por dps tratamientos de 10 minutos con acetona y dos tratamiento de 5 minutos con éter. Las fibras se dejan secar al aire.

Las fibras pueden teñirse cor} WGA-Alexa 555, con WGA-Alexa 488 o con WGA-tetrametilrodamina.

Las fibras se colocan en la solución de bloqueo (NaCI 150 mM, un regulador de pH de fosfato de sodio 10 mM con un pH de 7.4, 0.1% de Tween 20 y 1% de albúmina de suero bovino), y se incuban durante una hora. Luego se reemplaza el regulador de pH por un regulador de pH idéntico que contiene WGA-fluorocromo, y se incuba durante 4 horas. La solución de WGA-fluorocromo se reemplaza por la solución de bloqueo, se realiza un lavado durante 10 minutos, seguido por 3 lavados de 10 minutos con una solución de bloqueo sin BSA y 2 lavados de 5 minutos con una solución de bloqueo sin BSA ni Tween. Las fibras teñidas se montan en un portaobjetos y se someten a un análisis de microscopía cjle fluorescencia Axioplan2 (Zeiss, Jena, Alemania), usando el conjunto de filtros 38 (excitación: BP470/40 emisión: BP525/50), para determinar la presencia del conjugado de flúor Alexa 488, o bien usando el conjunto de filtros 20 (excitación: BP546/12, emisión: BP575-640), para determinar la presencia del conjugado de flúor Alexa 555 o del conjugado de tetrametilrodamina). Si bien no puede detectarse una fluorescencia específica en las fibras de algodón provenientes de las plantas de algodón no transgénicas, puede detectarse una fluorescencia brillante en las fibras de algodón provenientes de las plantas de algodón transgénicas que comprenden un gen quimérico con la NODO fusionada a una secuencia que es una señal de anclaje para el aparato dé Golgi. A partir de las secciones microscópicas virtuales de las fibras de algodón, puede establecerse que el colorante WGA-fluor 555 se distribuía de manera uniforme a lo largo de la pared celular secundaria de las células de las fibras de algodón.

Para preparar las fibras para la tinción, se las trató durante 30j minutos a 80°C con agua destilada que contenía 1g/l de carbonato de sodio yj 1g/l de Sandozin NIN (un detergente no iónico), a lo que siguió un secado. Las fibras se tiñeron usando una relación entre el licor y las fibras de 50:1 , con 2% de un colorante azul ácido 62, que se aplicó durante 60 minutos a 98°C. Después de la tinción, se lavaron muestras de las fibras con agua fría y se las secó bajo condiciones ambientales. El agotamiento se determinó midiendo la concentración del colorante del baño antes y después de la tinción, para lo cual se usó un espectrofotómetro.

Tal como puede observarse en el ejemplo de una línea de algodón que fue transformada con el vector de ADN-T pTDBI158, las fibras que fueron teñidas con el colorante azul ácido 62 de conformidad con el protocolo anterior, presentaron un mayor nivel de agotamiento. transgen % de agotamiento a pH 4 % de agotamiento a pH 7 G4GH396-35101 HH nodc 23.9 18.7 G4GH396-35101 de tipo ninguno 16.3 13.0 silvestre

Claims (1)

1. 5. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado además porque dicha secuencia de señal de anclaje se selecciona entre la secuencia de señal de anclaje de una sialiltransferasa de rata, la secuencia de señal de anclaje transferasa humana, la secuencia de señal de anclaje del homólogo dé Arabidopsis del receptor HDEL de levadura (AtERD2), la secuencia de señal de anclaje de la a-2,6-sialiltransferasa, la ecuencia de señal de anclaje de l pi ,2-xilosiltransferasa de Arabidopsis thaliana, la secuencia de señal de anclaje de la N-acetilgluosoaminil transferasa I de tabaco o la secuencia de aminoácidos YYHDL o LKLEI. 6. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado además porque la región de ADfjl mencionada codifica para una proteína de nodulación C que puede obtenerse de una especie de Rhizobium, de una éspecie de Azorhizobium, de una especie de Bradyrhizobium, de una especie de Mesorhizobium, de una especie de Ralstonia, de una especie de Streptomyces, de una especie de Burkholderia, de una especie de Cu' priavidus, de una especie de Sinorhizobium, de una especie de de una especie de Dokdonia, de una especie de Methyipbacterium, de una especie de Phyllobacteríum o de una especie de Psychroflexus. 7.- El método de con la reivindicación 6 caracterizado además porque la proteína de nodulación C comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nc[ 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, 1615305C, 1615305D, [1615305E, AAA26226, AAA63602, AAB 16897, AAB24745 AAB34509, AAB47353 AAB51164, AAB7169 , AAB91695, AAB95329 AAC80567, AAD11313 AAD11315, AAD11317, AAD11319, AAD11321 AAD 1323, AAD11325 AAD11327, AAD 1329, AAD11331, AAD11333 AAD1 335, AAD11337 AAD11339, AAD1134 AAD11343, AAD11345 AAD11347, AAD11349 AAD11351, AAD11353, AAD11355, AAD11357 AAD 1359, AÁD11361 AAD11363, AAD1136e, AAD11367, AAD11369 AAD11371, AAD11373 AAD11375, AAD11377, AAD11379, AAD11381 AAD11383, AAD11385 AAD11387, AAD11389, AAD11391, AAD11393 AAD11395, AAD11397 AAD11399, AAD11401, AAD11403, AAD11405 AAG60998, AAK00157 AAK39956, AAK39957, AAK39958, AAK39959 AAK39960, AAK39961 AAK39962, AAK39963, AAK39964, AAK39965 AAK39966, AAK39967 AAK50872, AAK65131, AAL88670, AAN62903 AAS91748, AAU11338 AAU11339, AAU 11340, AAU11341, AAU11342 AAU 11343, AAU 11344 AAU11345, ????134ß, AAU 11347, AAU11348 AAU 11349, AAU 11350 AAU11351, AAUII352I AAU11353, AAU 11354 AAU11355, AAU11356 AAU11357, AAU 11358, AAU 11359, AAU 11360 AAU11361, AAU11362 AAU 11363, AAU 11364, AAU 11365, AAX30049 AAX30050, AAY44091 AAY44092, AAY44093, AAY89044, AAZ81541, ABC40958, ABC67303 ABD39006, ABD39007j, ABD39008, ABD39009 ABD39010, ABD39011 ABD390 2, ABD39013! ABD39014, ABD39015 ABD39016, ABD39017 ABD39018, ABD39019!, ABD39020, ABD39021 , ABD39022, ABD39023 ABD39024 ABD39025, ABD39026, ABD39027, ABD39028, AB D39029 ABD39030 ABD39031 ABD39032, ABD39033, ABD39034, AB D39035 ABD39036 ABD39037 ABD39038, ABD67413, ABD67416, AB D67419 ABD67422 ABD67425 ABD67428, ABD67431 , ABD67434, ABD73319 ABD73320 ABD73321, ABD73322, ABD73323, ABD73324, ABD73325 ABD73326 ABD73327, ABD73328, ABD73329, ABD73330, AB 394161 ABD94162 ABD94163, ABD94164, ABD94165, ABF93198, ABF93199 ABF93200 ABF93201, ABF93202, ABM69186, ABM69187, ABM69188 ABM69 89 ABM69190, ABN09217, ABN09218, ABN09219, AB M11177 ABN1 1178 ABN1 1179, ABP93834, ABS85176, ABS85177, ABS85178 ABS85179 ABS85180, ABS85181 , ABS85182, ABU69044, ABU69045 ABU69046 ABU69047, ABU69048, ABU69049, ABU69050, ABU69051 ABU69052 ABU69053, ABU69054, ABU69055, ABU69056, ABU69057 ABU69058 ABU69059, ABU69060, ABU69061 , ABU89879, ABV25689 ABV25690 ABV25691 , ABV25692, ABV25693, ABV25694, ABW96196, ABW96197, ABW96198, ABW96199, ABW96200, ABW96201 , ABW96202 ABW96203 ABW96204, ABW96205, ABW96206, ABW96207, ABW96208 ABW96209 ABW96210, ABW9621 1 , ABY59633, ABY59634, ABY59635 ABY59636 ABY59637, ACA80309, ACA80310, ACA80311 , ACA80312 ACA80313 ACC77565, ACD39337, ACD39338, ACD39339, AC D39340 ACD39341 ACD39342, ACD39343, ACD39344, ACD39345, ACP39346 ACD39347 ACD62595, ACD63093, ACD63094, ACD63095, ACD63096 ACD63097 ACD63098, ACZ52694, ACZ52695, ACZ52696, ACZ52697, ADD20957, ADD20958 ADD20959, ADD20960, ADD20961 , ADD20962, ADD20963, ADD20964 ADD20965, ADD20966, ADD20967, ADD20968, ADD20969, ADD20970 ADD20971 , ADG63645, ADG63646, ADG63647, ADG63648, ADG63649 ADG63650, ADG63651 , ADG63652, AIDJ18191 , ADJ18192, BAA06082 BAA06083, BAA06084, BAA06085, BAA06086, BAA06087, BAA06088 BAA06089, BAA06090, BAA24092, BAB52500, C26813.CAA25810 CAA2581 1 , CAA25814, CAA26310, CAA26311 , CAA51773, CAA51774 CAA608779, CAA67139, CAB56055, CAC42489, CAD29949, CAD29950J CAD29951 , CAD29952, CAD29953, CAD29954, CAD29955, CAD29956, CAD29957, CAD31533, CAD43933, CAD90257, CAD90583, CAD90584, CAD90585, CAD90586, CAD90587, CAD90588, CAH04369, CAN84684 CAP64017, EAQ38847, EAS72439, NP_/I06714,NP_435719, NP_443883, P04340, P04341 , P04677, P04678, P04679, P06234, P06235, P17862, P24151 , P26024, P50357, P53417, P72334, Q07755, Q53513, YP_001796208, YP_002605865, ZP_ 0105Ó448 o ZP_01252570. 8. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado además porque la NODC que está fusionada a una secuencia que es una señal de anclaje para el aparato de Golgi, comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 1. 9. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado ademas porque el promotor que puede expresarse en las plantas es un promotor con especificidad por las fibras. 10. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado además porque dicho promotor que puede expresarse en las plantas es un promotor con especificidad por las fibras que se selecciona entre el promotor con especificidad por las fibras del gen de la beta tubulina del algodón, un promotor con especificidad por las fibras del gen de la actina del algodón, un promotor con especificidad por las fibras del gen de la proteína de transferencia de lípidos del algodón, un promotor con especificidad por las fibras del gen del tegumento de las semillas y la proteasa del algodón, un promotor con especificidad por las fibras del gen R2R3 MYB del algodón, un promotor del gen de la expansina del algodón o el promotor del gen de la qui ¡nasa del algodón. 11. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado además porque la planta se selecciona entre el algodón, el cáñamo o el lino. 12.- El método de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque la pared dé la célula vegetal en la planta de i algodón comprende fibras. j 13.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado además porque también comprende un paso en el que se desacetilan los oligosacáridos mencionados, que consisten de monómeros de N-acetilglucosamina, en donde dicho paso comprende tratar las paredes de las células de la planta con una solución alcalina, durante un período suficiente para desacetilar los oligosacáridos que consisten de monómeros de N-acetilglucosamina, o bien efectuar un tratamiento enzimático con quitina desacetilasas 14. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 13, caracterizado además porque también comprende e paso en el que se aislan las paredes de las células vegetales o las fibras dé dicha planta. 15. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 14, caracterizado además porque las paredes de las células vegetales de la planta mencionada son paredes celularesj secundarias. 16. - Un gen quimérico como se describe en las reivindicaciones 1 a 10. 17. - Una célula vegetal que ¿omprende el gen quimérico de la reivindicación 16 18.- Una planta que consiste esencialmente de células vegetales de la reivindicación 17. 19.- La planta de conformidad con la reivindicación 18, sus raíces es esencialmente no comprende una NODC. con la reivindicación 18 ó 19,| 21.- Una fibra que proviene! de la planta de algodón de la reivindicación 20. 22 - Un hilado o un tejido e aborados a partir de una fibra algodón de conformidad con la reivindicación 21 23. - El uso del gen quimérico de la reivindicación 16, para incrementar la cantidad de oligosacáridos con carga positiva en la pared de una célula vegetal, o para incrementar la reactividad de las paredes de las células vegetales a las modificaciones químicas 24. - El uso del gen quimérico de la reivindicación 16, pará producir plantas con oligosacáridos con carga positiva en las paredes de sus células, en donde la longitud de las raíces de dichas plantas es esencialmente idéntica a la de una planta isogénica que no comprende la proteína de la reivindicación 16, para con carga positiva en las la reivindicación 16, para mejorada, tal como una la reivindicación 16, para producir hilados y tejidos con una reactividad mejorada, tal como una idoneidad para la tinción mejorada. 28. - Un método para teñir fibras de algodón, hilados o tejidos! que comprende proveer la fibra o el hilado o tejido de ls reivindicación 22 y aplicar un reaccionar con dichas fibras, con dicho hilado o con dicho tejido.