KR20130122635A

KR20130122635A - 식물 세포벽의 반응성을 변경하는 방법

Info

Publication number: KR20130122635A
Application number: KR20137012470A
Authority: KR
Inventors: 프랑크 뮤레와에터; 바텔 반홀름
Original assignee: 바이엘 크롭사이언스 엔.브이.
Priority date: 2010-10-15
Filing date: 2011-09-30
Publication date: 2013-11-07
Also published as: CN103154253A; EP2627771A1; EP2627771B1; ES2548166T3; AU2011316154A1; MY172312A; MX2013004173A; PE20131462A1; WO2012048807A1; AU2011316154B2; US20130198976A1; CA2816156A1; US20190153458A1; US10202613B2; KR101966619B1; MX344886B; ZA201302604B; CN103154253B; AR083452A1

Abstract

이형 골지 신호 고정 서열에 융합된 뿌리혹 형성 C 단백질을 식물 세포에 도입함으로써, 식물 세포벽 중의 양으로 하전된 올리고당을 제조하기 위한 방법 및 수단이 제공된다.

Description

식물 세포벽의 반응성을 변경하는 방법{METHODS FOR ALTERING THE REACTIVITY OF PLANT CELL WALLS}

본 발명은, 특히 섬유 생산 식물의 천연 섬유에서 발견될 수 있는, 2 차 식물 세포벽을 포함한 식물 세포벽의 반응성의 개질에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 변경된 반응성을 갖는 면 섬유에 관한 것이다. 개질된 반응성은 식물 유래 물질, 예컨대 천연 섬유를 함유하는 세포벽을 섬유 반응성 염료를 사용하여 염색하는 방법에 적용되어, 예컨대 염색견뢰도를 개선시키거나 염색 공정 동안 사용된 폐수의 부피를 감소시킬 수 있다. 개질된 반응성은 또한 천연 섬유와 반응물, 예컨대 난연제, 방수제, 방유제 및 오염방지제, 주름 방지제, 유연제, 정전기 방지제, 형광 증백제 등과의 반응성을 개선시키는 데에 적용될 수 있다.

본 발명은, 본 발명의 방법에 의해 제조된 식물이 뿌리 성장에서 지연을 보여주지 않는다는 추가의 장점과 함께, 식물 세포벽 중의 N-아세틸글루코사민 올리고머의 생산 효율을 증가시키는 방법을 제공한다.

식물로부터의 셀룰로오스 함유 천연 섬유를 포함하는 천연 섬유, 예컨대 면 및 리넨은 5000 년이 넘게 인류에 의해 사용되어 왔다. 그러나, 천연 셀룰로오스 함유 섬유는 β-1-4 결합된 포도당 단량체로 구성된 셀룰로오스의 비교적 불활성인 성질로 인해 합성 섬유의 화학적 다면성을 갖지 않는다.

이 비교적 불활성인 성질은 예컨대 면 섬유 및 직물의 염색 공정 동안 명백하다. 여러 유형의 염료, 예컨대 직접 염료 및, 가장 중요하게는, 섬유 반응성 염료(둘 다 음이온성 분자임)가 면의 염색에 사용된다. 면 자체는 물에서 음이온성 전하로 발전하며, 특별한 처리 없이 섬유 또는 직물에 의한 염료의 흡수가 매우 정교하다.

직접 염료는 상기 셀룰로오스 중합체와 비교적 약한 수소 결합을 생성하여 반영구적인 부착을 형성한다. 직접 염료는 섬유 반응성 염료보다 사용하기에 더 용이하고 덜 비싸지만, 세척에 잘 견디지 못한다. 섬유 반응성 염료는 발색단을 히드록실 기와의 반응을 통해 섬유와 강한 공유 결합을 형성하는 반응성 기와 결합시키는 분자이다. 상기 공유 결합은 세탁에 대하여 염색된 섬유의 우수한 저항성을 제공한다.

상기 염색 공정 동안, 음이온성 염료를 음이온성 섬유 전하로부터 차폐하기 위하여 다량의 전해질이 요구된다. 미반응한 가수분해된 염료(40% 이하)는 수차례의 세척 단계에 의해 제거될 필요가 있는데, 이는 상기 언급된 전해질을 또한 함유하는 다량의 폐수를 발생시킨다.

따라서, 셀룰로오스 섬유에, 예컨대 양으로 하전된 화학 화합물을 통합시킴으로써, 양전하를 제공하는 것은 천연 셀룰로오스 섬유의 염색성을 개선시킬뿐만 아니라 개질된 셀룰로오스 섬유의 음으로 하전된 화학 화합물과의 임의의 화학 반응을 개선시킬 수 있다. 산성 염료의 사용을 또한 가능하게 할 것이다.

여러 출판물은 키토산 올리고머를 셀룰로오스 섬유에 통합시키거나 또는 코팅시켜 키토산/셀룰로오스 블렌드, 얀 또는 직물을 제조함을 설명하고 있다. 키토산은 글루코사민의 양으로 하전된 중합체이며, 이는 키틴의 탈아세틸화, 예컨대 알칼리 처리에 의해 수득될 수 있다. 키틴 자체는 β-1-4 결합된 N-아세틸글루코사민(GlcNAc)의 중합체이다.

미국특허출원 제2003/0134120호는 천연 섬유를 키토산으로 코팅함을 설명하고 있다.

문헌[Liu et al. Carbohydrate Polymers 44(2003) 233-238]은 면사를 60 ℃, 물에서 과요오드산칼륨로 산화시킨 후, 수성 아세트산 중의 키토산 용액으로 처리함으로써 면 섬유를 키토산으로 코팅하는 방법을 설명하고 있다. 키토산 코팅으로, 면 섬유 표면이 생리학적 및 생물학적으로 활성이 된다. 아미노 기의 화학적 반응성이 셀룰로오스 단량체의 히드록실 기보다 더 크므로, 상기 섬유는 추가적인 화학적 개질의 잠재력을 더 갖는다. 더욱이, 면 섬유의 매끄러운 표면이 거칠어지는데, 이는 약물 흡수 및 그의 조절된 방출의 더 큰 잠재력을 암시한다.

예컨대 피부 사상균을 억제하는 키토산의 생리학적 기능에 근거하여, 많은 기능성 의복, 직물 및 섬유가 셀룰로오스-키토산 블렌드 섬유, 셀룰로오스 섬유-키토산 콘쥬게이트 및 키토산 함유 수지로 코팅된 직물을 사용한다.

국제특허출원공개 제00/09729호는 산업적인 용도 및 개선된 질병 내성을 위해 세포벽을 변경시키기 위한 식물에서 키틴 신타제 및 키틴 데아세틸라제 유전자의 발현을 설명하고 있다. 구체적으로 인용된 용도는 하기와 같다: 셀룰로오스, 키틴 및 키토산의 단일 식물 공급원을 제공하고, 인장 강도를 증가시키고, 취성 스냅을 증가시킨다. 구체적으로 제시된 키틴 신타제 유전자는 진균 유기체로부터 유래되었다. 식물 중의 키틴 또는 키토산의 제조에 대한 실험 데이터도, 식물 세포벽 중의 그의 통합에 대한 실험 데이터도 제공되어 있지 않다.

국제특허출원공개 제2006/136351호는 국제특허출원공개 제00/09729호에서 제안된 전략이 식물 세포벽에의 키틴의 기능적 통합을 유도하지 않는다는 것을 보여주고 있다. 대신에, 국제특허출원공개 제2006/136351호는 오직 N-아세틸글루코사민 트랜스퍼라제가 골지체로 이동되는 경우에만 키틴이 면 섬유의 2 차 세포벽 중에 효과적으로 생산된다는 것을 개시하고 있다. 뉴로스포라 크라싸(Neurospora crassa)로부터의 진균성 키틴 신타제에서, 골지체로의 이동은 이 진균성 키틴 신타제의 이형 신호 고정 서열과의 작동가능한 융합에 의해 및 식물 중의 결과 키메릭 유전자의 발현에 의해 달성된다. 그러나, N-아세틸글루코사민 트랜스퍼라제의 NODC 유형에서, 신호 고정 서열의 첨가는 골지체로의 NodC 단백질의 현지화를 위하여 및 외부 GlcNAc 공급 없이 키토-올리고당의 식물 세포벽으로의 통합을 위하여 요구되지 않는다. 키틴이 식물 세포벽 중에서 효과적으로 생산될 수 있음에도 불구하고, NODC를 포함하는 유전자 이식 식물이 야생형 식물과 비교하여 더 짧은 뿌리를 가진다는 것이 또한 관찰되었다.

따라서, 식물 세포벽, 예컨대 양으로 하전된 다당류를 포함하는 2 차 세포벽을 생산하는 대체적인 방법에 대한 요구가 남아있다. 특히, 그의 세포벽 중에 양으로 하전된 올리고당을 갖지만, 뿌리 성장 지연이 없는 식물을 생산하는 방법을 제공하는 것에 대한 요구가 존재한다. 상기 및 다른 문제들이 본원의 하기 다양한 실시양태, 실시예 및 청구범위에 기재된 바에 따라 해결된다.

한 실시양태에서, 본 발명은 식물 세포에 키메릭 유전자를 도입함을 포함하는 세포벽, 특히 식물 세포의 2 차 세포벽 중에 양으로 하전된 올리고당을 포함하는 식물 세포, 식물, 예컨대 목화 식물을 제조하는 방법을 제공하여, 키메릭 유전자가 골지 신호 고정 서열에 융합된 NODC 유형 N-아세틸글루코사민 트랜스퍼라제를 암호화하는 DNA 영역에 작용적으로 결합된 식물 발현성 프로모터; 및 전사 종결 및 폴리아데닐화 영역을 포함한다. 또다른 실시양태에서, 언급된 식물의 뿌리 길이가 NODC 유전자를 포함하지 않은 야생형 식물의 뿌리 길이와 본질적으로 동일한 것이 특징인 본 발명에 따른 방법을 사용하여 세포 중에 양으로 하전된 올리고당을 포함하는 식물, 예컨대 목화 식물을 제조하는 방법이 제공된다.

본 발명은 N-아세틸글루코사민 단량체로 구성된 언급된 올리고당을, 언급된 식물로부터의 세포벽을 알칼리 용액으로 처리함으로써 또는 키틴 데아세틸라제의 효소 활동을 통해 탈아세틸화하는 단계를 더 포함하는, 세포벽 중에 양으로 하전된 올리고당을 포함하는 식물을 제조하는 방법을 추가로 제공한다.

또한, 본 발명은 식물 발현성 프로모터를 포함하는 키메릭 유전자; 골지체 막을 표적으로 하는 신호 고정 서열에 융합된 뿌리혹 형성 C 단백질을 암호화하는 DNA 영역; 및 전사 종결 및 폴리아데닐화 영역, 및 이러한 키메릭 유전자를 포함한 식물 세포, 식물, 예컨대 목화 및 면 섬유를 제공한다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 언급된 식물의 뿌리 길이가 NODC를 포함하지 않는 야생형 식물의 뿌리 길이와 본질적으로 동일한 것이 특징인, 골지 신호 고정 서열에 융합된 NODC를 포함하는 키메릭 유전자를 포함하는 식물 세포로 본질적으로 구성된 식물을 제공한다.

본 발명은 추가로 골지 신호 고정 서열에 융합된 NODC를 포함하는 키메릭 유전자를 포함하는 면 섬유로부터 발생된 식물 세포, 식물, 예컨대 목화 식물, 면 섬유 및 얀을 제공한다.

본 발명은 또한 증가된 양의 올리고당을 포함하는 식물 세포벽을 제공하고, 이는 2 내지 10, 또는 2 내지 9, 또는 2 내지 8, 또는 2 내지 7, 또는 2 내지 6, 또는 2 내지 5, 또는 3 내지 5의 중합도를 갖는 양으로 하전된 올리고당, 예컨대 올리고-N-아세틸글루코사민일 수 있다. 이러한 식물 세포벽은 본 발명의 방법에 의해 수득될 수 있다. 이러한 식물 세포벽은 추가의 화학적 개질 처리될 수 있다.

특정한 실시양태에서, 본 발명은 본원에서 언급된 증가된 양의 양으로 하전된 올리고당을 포함하는 면 섬유, 및 이러한 면 섬유를 포함하는 얀, 직물을 제공한다. 면 섬유는 그 자체로 사용될 수 있거나, 염색을 포함한 추가의 화학적 개질 처리될 수 있다. 이들 면 섬유는, 예컨대 키메릭 유전자를 포함한 NODC의 감지를 통해, 콩고 레드(congo red)를 포함한 그의 음이온성 염료의 증가된 결합을 통해, 소맥 배아 응집소의 그의 증가된 결합을 통해 또는 본원에 기재된 바와 같이 골지 신호 고정 서열에 작용적으로 결합된 키메릭 NODC 유전자를 함유하지 않는 동질유전자 계통의 목화 식물로부터 수득된 면 섬유와 비교하여 아민 반응성 염료와의 그의 증가된 반응성을 통해 인지될 수 있다. 면 섬유 중의 올리고당의 존재 및/또는 양은 또한 예컨대 고성능 박층 크로마토그래피(HPTLC) 또는 고성능 액체 크로마토그래피 및 질량 분석법(HPLC-MS)을 통해 직접 측정할 수 있다.

또다른 실시양태에서, 본 발명은 식물 세포의 세포벽 중의 양으로 하전된 올리고당의 양을 증가시키기 위하여 또는 이러한 식물 세포벽의 화학적 개질을 위한 식물 세포벽의 반응성을 증가시키기 위하여, 식물 세포의 골지체에 표적화될 수 있는 N-아세틸글루코사민 트랜스퍼라제를 암호화하는 DNA 영역의 용도에 관한 것이다.

한 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 섬유 또는 본원에 기재된 얀 또는 직물을 제공하는 것, 및 언급된 섬유, 얀 또는 직물에 반응성 있는 염료를 적용하는 것을 포함하는 면 섬유, 얀 또는 직물을 염색하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 하기 작용적으로 결합된 DNA 영역을 포함하는 키메릭 유전자를 제공한다: 식물 발현성 프로모터; 골지 신호 고정 서열에 융합된 NODC 유형 N-아세틸글루코스아민 트랜스퍼라제를 암호화하는 DNA 영역; 및 전사 종결 및 폴리아데닐화 영역. 또한, 식물 세포벽 중의 양으로 하전된 올리고당의 양을 증가시키기 위한 및 개선된 반응성, 예컨대 염색성으로 면 섬유, 얀 및 직물을 제조하기 위한 이들 키메릭 유전자의 용도를 제공한다.

도 1은 상이한 NODC 단백질의 아미노산 서열의 배열이다. 모든 단백질에서 보존된 아미노산 잔기는 굵게 표시된다. ROT_NODC_RHILP: 라이조비움 레구미노사룸(Rhizobium leguminosarum , 비브리오 파세올리(biovar phaseoli)으로부터의 NODC 단백질; ROT_NODC_BRAJA: 브라디라이조비움 자포니쿰(Bradyrhizobium japonicum)으로부터의 NODC 단백질; ROT_NODC_RHIS3: 라이조비움 스페시즈(균주 N33)로부터의 NODC 단백질; ROT_NODC_RHISN: 라이조비움 스페시즈로부터의 NODC 단백질; ROT_NODC_RHILV: 라이조비움 레구미노사룸(비브리오 비시애(viciae))으로부터의 NODC 단백질; 및 ROT_NODC_AZOCA: 아조라이조비움 카울리노단스(Azorhizobium caulinodans)로부터의 NODC 단백질.
도 2는 상이한 NODC 단백질의 아미노산 서열의 배열이다. 모든 단백질에서 보존된 아미노산 잔기는 굵게 표시된다. ROT_NODC_BRAJA: 브라디라이조비움 자포니쿰으로부터의 NODC 단백질; ROT_NODC_RHIS3: 라이조비움 스페시즈(균주 N33)로부터의 NODC 단백질; ROT_NODC_RHISN: 라이조비움 스페시즈로부터의 NODC 단백질; ROT_NODC_RHILV: 라이조비움 레구미노사룸(비브리오 비시애)으로부터의 NODC 단백질 및 ROT_NODC_AZOCA: 아조라이조비움 카울리노단스로부터의 NODC 단백질.
도 3은 야생형(col) 및 pTJN6 및 pTGK42로 형질전환된 유전자 이식 아라비돕시스 식물의 뿌리 길이이다. A: 야생형 식물과 pTJN6으로 및 pTGK42를 함유하는 두 계통으로 형질전환된 식물 간의 비교; 검은 막대: 야생형; 체크무늬 막대: pTJN6-23; 빗살무늬 막대: pTGK42-10; 수직 줄무늬 막대: pTGK42-28. B: 야생형 식물과 pTJN6을 함유하는 다양한 유전자 이식 계통 간의 비교. 검은 막대: 야생형; 체크무늬 막대: pTJN6-4; 빗살무늬 막대: TJN6-14; 수직 줄무늬 막대: pTJN6-23; 수평 줄무늬 막대: pTJN6-26.
도 4는 pTJN6으로 형질전환된 아라비돕시스 식물 중의 GlcNAc의 단량체, 이량체, 삼량체, 사량체 및 오량체의 존재이다. 원모양의 값은 GlcNAc 올리고머에서의 값을 나타낸다; 이들 값 위의 육각형의 갯수는 이들 올리고머의 중합도를 나타낸다. 그래프는 쌍으로 도시되어 있는데, 상부 그래프는 야생형이고 하부 그래프는 pTJN6을 함유하는 형질전환체이다.

본 발명은, 식물 세포 중의 발현에서, NODC 유형의 N-아세틸글루코사민 트랜스퍼라제로의 이형 골지 신호 고정 서열의 융합이 골지 신호 고정 서열에 융합되지 않은 NODC 유형의 N-아세틸글루코사민 트랜스퍼라제를 발현하는 식물로부터의 세포벽과 비교한 경우, 식물 세포벽 중의 특정 N-아세틸글루코사민 올리고머의 통합을 65 배까지 예기치않게 증가시켰다는 발견에 기초한다. GlcNAc 올리고머의 합성은 성장 배지로의 GlcNAc의 외부 첨가를 요구하지 않았다. 동시에, 식물 중의 NODC의 발현이 뿌리 길이에 부정적으로 영향을 미치는 반면, 이형 골지 신호 고정 서열의 NODC에의 융합은 뿌리 길이를 야생형 수준으로 회복시켰다.

따라서, 본 발명의 첫번째 실시양태에서, 식물 세포벽, 특히 2 차 세포벽 중에 양으로 하전된 올리고당의 제조 방법이 제공된 반면, 상기 방법은 키메릭 유전자를 식물 세포에 도입하는 단계를 포함하고, 상기 키메릭 유전자는 하기 작용적으로 결합된 DNA 절편을 포함한다:

- 식물 발현성 프로모터;

- 골지체 막에 표적용 신호 고정 서열에 융합된 NODC 유형의 N-아세틸글루코사민 트랜스퍼라제를 암호화하는 DNA 영역; 및

- 전사 종결 및 폴리아데닐화 영역.

또다른 실시양태에서, 세포벽, 특히 2 차 세포벽 중에 양으로 하전된 올리고당을 포함하는 식물의 제조 방법이 제공되는 반면, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다:

o 하기 작용적으로 결합된 DNA 절편을 포함하는 키메릭 유전자를 식물 세포로 도입하는 단계:

- 식물 발현성 프로모터;

- 전사 종결 및 폴리아데닐화 영역;

o 언급된 식물 세포의 식물로의 재생.

본 발명의 방법에 적합한 것은 뿌리혹 형성 C 단백질이 언급된 식물 세포 중에서 발현되는 것이다. 상기 뿌리혹 형성 C 단백질은 언급된 식물의 모든 세포에서 발현될 수 있다. 대신에, 상기 뿌리혹 형성 C 단백질은 언급된 식물의 특정 조직, 예컨대 뿌리 또는 목화 잎에서만 발현될 수도 있다.

뿌리혹 형성 단백질 및 그의 암호화 유전자는 근생균과 콩과 식물 사이의 공생의 전형적인 뿌리혹 형성을 유도하는 리포키토올리고당 신호 또는 아세틸화된 키토올리고머(Nod 인자)의 합성에 관여한다.

이들 리포키토올리고당의 합성에 요구된 가장 중요한 Nod 유전자 산물은 NODA, NODB 및 NODC이다. 다른 Nod 유전자 산물이 결여된 경우, 그들은 N-결합된 아실 기를 운반하는 4 또는 5 개의 N-아세틸글루코사민 잔기의 올리고머로 구성된 중심 신호를 형성할 수 있다. 뿌리혹 형성 인자의 합성에서 3 개의 단백질 각각의 기능은 널리 공지되어 있다: NODC는 키토-올리고당 쇄를 생산하는 N-아세틸글루코사미닐 트랜스퍼라제이고; NODB는 키틴 올리고당 데아세틸라제로 작용하여 키토-올리고당 쇄의 비환원성 N-아세틸글루코사민 잔기로부터의 N-아세틸 기를 제거하고; NODA는 NODB의 작용에 의해 생성되는 유리 아미노 기에의 아실 쇄의 부착에 관여한다. 다른 nod 유전자에 의해 암호화되는 다른 Nod 인자는 상이한 뿌리혹 형성 인자를 구분하는 장식적인 화학 기들 중 임의의 것을 제공한다. 본 발명의 목적을 위해, 오직 NODC 단백질과 암호화 유전자만이 관련성을 갖는다.

뿌리혹 형성 C 단백질("NODC 단백질")은 잘 특성화된 단백질이다(검토를 위해 문헌[Kamst and Spaink, 1999, Trends in Glycoscience and Glycotechnology, 11, pp. 187-199]을 참조). 이는 β-결합된 단당류 잔기를 함유하는 선형 다당류의 합성에 관여하는 β-다당류 신타제 단백질 과에 속한다. NODC와 구조적으로 가장 밀접하게 관련된 효소는 키틴(β-1-4 결합된 N-아세틸글루코사민); 셀룰로오스(β-1-4 결합된 포도당 잔기의 중합체); 히알루론산(N-아세틸글루코사민 및 글루쿠론산의 공중합체) 및 지브라피시 배의 초기 발생 동안 생성되는 키틴 올리고당의 합성에 관련된 트랜스퍼라제이다. 이들 단백질 사이에 보존된 6 개의 짧은 영역이 인지될 수 있다. NODC 단백질의 경우, 이들 짧은 서열들은 하기에 상응한다:

1) 서열 번호 1의 23 번 위치의 K 잔기(아조라이조비움 카울리노단스로부터의 NODC)

2) 서열 번호 1의 86 내지 88 번 위치의 서열 DDG

3) 서열 번호 1의 137 내지 141 번 위치의 서열 VDSDT

4) 서열 번호 1의 207 내지 213 번 위치의 서열 GPCAMYR

5) 서열 번호 1의 237 내지 242 번 위치의 서열 GEDRHL

6) 서열 번호 1의 274 내지 278 번 위치의 서열 QQLRW

그러나, 일부 NODC 단백질 또는 그의 변종이 존재할 수도 있음을 인식하는 것이 중요하며, 이때 상기 언급한 공통 서열 중 1 개 이상이 절대적으로 보존되는 것은 아니다.

또한, NODC 단백질은 흔히 막 통과 도메인을 나타내는 아미노산 잔기의 소수성 신장부를 특징으로 한다(문헌[Barney et al. 1996, Molecular Microbiology 19, pp. 443-453]). N-말단 소수성 도메인은 N_out-C_in 배향으로 세균막에 걸쳐 있으며, 이때 인접한 큰 친수성 도메인은 세균 세포질에 노출되어 있다. 이 배향은, 잠재적으로 3 개 막의 전장을 함유하는 C-말단 부근의 소수성 영역(들)의 존재에 의존하는 것으로 보이며, 따라서 상기 NODC의 C 말단은 통상적으로는 세균 주변세포질 중에 위치한다.

또한, NODC의 큰 친수성 고리는 다른 β-글루코실 트랜스퍼라제 중의 유사 영역에 대한 다른 구조적 유사성을 갖는다. 이 영역은 교번하는 β-시트와 α-나선으로 이루어진 A 도메인(서열 번호 4의 서열에서 약 잔기 45 내지 140으로부터 연장됨), 및 NOCD의 진행성에 기여하는 것으로 생각되는 B 도메인(서열 번호 4의 잔기 215 내지 280에 상응함)으로 구성되는 것으로 제안되었다. 상기 A-도메인에서, 2 개의 아스파르트산염 잔기가 보존되어 있고(서열 번호 4의 잔기 88 및 139); 상기 B-도메인에는 1 개의 아스파르트산염 잔기 및 동기 QXXRW(서열 번호 4의 잔기 240 및 276 내지 280)가 또한 보존되어 있으며, 촉매 활성에 중요한 것으로 생각된다.

상이한 NODC 단백질들이 서로 비교되는 경우, 보다 많이 보존된 아미노산 서열들이 밝혀졌다. 도 1은 서열 번호 1, 2, 8, 4, 7, 5로부터의 상이한 NODC 단백질들의 배열을 나타내고, 하기를 (순서대로) 포함한 상이한 NODC 단백질 사이의 다수의 보존된 잔기를 나타낸다:

- 서열 PXVDVIXPXXNE

- 서열 VDDGSXN

- 서열 GDXXLDVDSDTXXXXDV

- 서열 GXXMGQ

- 서열 DMEYWLACNEERXXQXRFGXVMXCXGXCXMYR

- 서열 FRTXYXPXAXAXTXVP

- 서열 YLXQQLRWARSTXRXTXL

- 서열 QNXGXXLL

- 서열 RFXFXXXHXXXNXXXLXPLKXYALXT

도 2는 상이한 NODC 단백질의 부분집합의 배열을 나타내고, 하기와 같은 훨씬 더 많은 보존된 잔기들을 보여준다:

- 서열 WLTRLIDMEYWLACNEERXXQXRFGXVMCCCGPCAMYRRS

- 서열 LLXXYEXQXFXGXPSXFGEDRHLTILMLXAGFRTXYVPXAXAXTXVP

- 서열 YLRQQLRWARSTXRDTXLA

상이한 근생균에 의해 생산된 리포-키틴 올리고당에서 올리고당 백본(backbone)의 길이는 2 내지 6 개의 잔기로 다양하다. 뿌리혹 형성 단백질 NODC가 키토-올리고당 쇄의 합성에서 키틴 올리고당 쇄 길이의 중요한 결정인자라는 것이 보여져왔다(문헌[Kamst et al., 1997, Journal of Bacteriology 179, pp. 2103-2108]).

NODC 유형의 N-아세틸글루코사민 트랜스퍼라제를 암호화하는 암호화 영역을 라이조비움, 아조라이조비움, 브라디라이조비움, 메조라이조비움(Mesorhizobium), 랄스토니아(Ralstonia), 쿠프리아비두스(Cupriavidus), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 부르콜데리아(Burkholderia), 시노라이조비움(Sinorhizobium), 디설포박테리움(Desulfobacterium), 독도니아(Dokdonia), 메틸로박테리움(Methylobacterium), 필로박테리움(Phyllobacterium) 또는 싸이크로플렉수스(Psychroflexus) 속에 속하는 세균으로부터 직접 수득할 수 있다. 그러나, 이러한 암호화 영역이 심지어 식물, 특히 NODC 유형의 단백질을 과발현하는 키메릭 유전자가 도입되는 섬유 생산 식물에 적합한 코돈 용법을 사용하여 또한 합성적으로 생산될 수 있다는 것이 즉시 명백해진다.

NODC 단백질에 대한 상이한 서열을 데이터베이스, 예컨대 하기의 수탁 번호로 나타내는 단백질 서열로부터 입수할 수 있다: 1615305C, 1615305D, 1615305E, AAA26226, AAA63602, AAB16897, AAB24745, AAB34509, AAB47353, AAB51164, AAB71694, AAB91695, AAB95329, AAC80567, AAD11313, AAD11315, AAD11317, AAD11319, AAD11321, AAD11323, AAD11325, AAD11327, AAD11329, AAD11331, AAD11333, AAD11335, AAD11337, AAD11339, AAD11341, AAD11343, AAD11345, AAD11347, AAD11349, AAD11351, AAD11353, AAD11355, AAD11357, AAD11359, AAD11361, AAD11363, AAD11365, AAD11367, AAD11369, AAD11371, AAD11373, AAD11375, AAD11377, AAD11379, AAD11381, AAD11383, AAD11385, AAD11387, AAD11389, AAD11391, AAD11393, AAD11395, AAD11397, AAD11399, AAD11401, AAD11403, AAD11405, AAG60998, AAK00157, AAK39956, AAK39957, AAK39958, AAK39959, AAK39960, AAK39961, AAK39962, AAK39963, AAK39964, AAK39965, AAK39966, AAK39967, AAK50872, AAK65131, AAL88670, AAN62903, AAS91748, AAU11338, AAU11339, AAU11340, AAU11341, AAU11342, AAU11343, AAU11344, AAU11345, AAU11346, AAU11347, AAU11348, AAU11349, AAU11350, AAU11351, AAU11352, AAU11353, AAU11354, AAU11355, AAU11356, AAU11357, AAU11358, AAU11359, AAU11360, AAU11361, AAU11362, AAU11363, AAU11364, AAU11365, AAX30049, AAX30050, AAY44091, AAY44092, AAY44093, AAY89044, AAZ81541, ABC40958, ABC67303, ABD39006, ABD39007, ABD39008, ABD39009, ABD39010, ABD39011, ABD39012, ABD39013, ABD39014, ABD39015, ABD39016, ABD39017, ABD39018, ABD39019, ABD39020, ABD39021, ABD39022, ABD39023, ABD39024, ABD39025, ABD39026, ABD39027, ABD39028, ABD39029, ABD39030, ABD39031, ABD39032, ABD39033, ABD39034, ABD39035, ABD39036, ABD39037, ABD39038, ABD67413, ABD67416, ABD67419, ABD67422, ABD67425, ABD67428, ABD67431, ABD67434, ABD73319, ABD73320, ABD73321, ABD73322, ABD73323, ABD73324, ABD73325, ABD73326, ABD73327, ABD73328, ABD73329, ABD73330, ABD94161, ABD94162, ABD94163, ABD94164, ABD94165, ABF93198, ABF93199, ABF93200, ABF93201, ABF93202, ABM69186, ABM69187, ABM69188, ABM69189, ABM69190, ABN09217, ABN09218, ABN09219, ABN11177, ABN11178, ABN11179, ABP93834, ABS85176, ABS85177, ABS85178, ABS85179, ABS85180, ABS85181, ABS85182, ABU69044, ABU69045, ABU69046, ABU69047, ABU69048, ABU69049, ABU69050, ABU69051, ABU69052, ABU69053, ABU69054, ABU69055, ABU69056, ABU69057, ABU69058, ABU69059, ABU69060, ABU69061, ABU89879, ABV25689, ABV25690, ABV25691, ABV25692, ABV25693, ABV25694, ABW96196, ABW96197, ABW96198, ABW96199, ABW96200, ABW96201, ABW96202, ABW96203, ABW96204, ABW96205, ABW96206, ABW96207, ABW96208, ABW96209, ABW96210, ABW96211, ABY59633, ABY59634, ABY59635, ABY59636, ABY59637, ACA80309, ACA80310, ACA80311, ACA80312, ACA80313, ACC77565, ACD39337, ACD39338, ACD39339, ACD39340, ACD39341, ACD39342, ACD39343, ACD39344, ACD39345, ACD39346, ACD39347, ACD62595, ACD63093, ACD63094, ACD63095, ACD63096, ACD63097, ACD63098, ACD63099, ACD63100, ACD63101, ACD63102, ACD63103, ACD63104, ACF19762, ACF19763, ACF19764, ACF19765, ACF19766, ACF19767, ACF19768, ACF19769, ACF19770, ACH91221, ACH91222, ACH91223, ACH91224, ACH91225, ACH91226, ACH91227, ACH91228, ACH91229, ACH91230, ACH91231, ACH91232, ACH91233, ACH91242, ACH91243, ACH91244, ACH91245, ACH91246, ACH91247, ACH91248, ACH91249, ACI47333, ACI47334, ACI47335, ACI47336, ACI47337, ACI47338, ACI47339, ACI47340, ACI47341, ACI47342, ACI47343, ACI47344, ACI47345, ACL12058, ACL12059, ACL50517, ACL50518, ACL50519, ACL50520, ACL50521, ACL50522, ACL50523, ACM69382, ACM79634, ACM79635, ACM79636, ACM79637, ACM79638, ACM79639, ACM79640, ACM79641, ACM79642, ACM79643, ACM79644, ACM79645, ACM79646, ACN17701, ACN69201, ACN69202, ACN69203, ACN69204, ACN69205, ACN69206, ACN69207, ACN69208, ACN69209, ACN69210, ACN69211, ACN69212, ACN69213, ACO58664, ACO58665, ACO58666, ACO58667, ACO58668, ACO58669, ACO58670, ACO58671, ACO58672, ACO58673, ACO58674, ACO58675, ACP40990, ACS35430, ACS35434, ACT34091, ACT34094, ACT34097, ACT34100, ACT34101, ACT34104, ACT34107, ACT34110, ACT34113, ACT34116, ACT34119, ACT34122, ACT34125, ACT34128, ACT34131, ACT34134, ACT34137, ACT34140, ACT34143, ACV52950, ACV52951, ACV52952, ACV52953, ACV52954, ACV52955, ACX47326, ACX47327, ACX47328, ACX47329, ACX47330, ACX47331, ACX47332, ACX47333, ACX47334, ACY02884, ACY78518, ACZ52692, ACZ52693, ACZ52694, ACZ52695, ACZ52696, ACZ52697, ADD20957, ADD20958, ADD20959, ADD20960, ADD20961, ADD20962, ADD20963, ADD20964, ADD20965, ADD20966, ADD20967, ADD20968, ADD20969, ADD20970, ADD20971, ADG63645, ADG63646, ADG63647, ADG63648, ADG63649, ADG63650, ADG63651, ADG63652, ADJ18191, ADJ18192, BAA06082, BAA06083, BAA06084, BAA06085, BAA06086, BAA06087, BAA06088, BAA06089, BAA06090, BAA24092, BAB52500, C26813, CAA25810, CAA25811, CAA25814, CAA26310, CAA26311, CAA51773, CAA51774, CAA608779, CAA67139, CAB56055, CAC42489, CAD29949, CAD29950, CAD29951, CAD29952, CAD29953, CAD29954, CAD29955, CAD29956, CAD29957, CAD31533, CAD43933, CAD90257, CAD90583, CAD90584, CAD90585, CAD90586, CAD90587, CAD90588, CAH04369, CAN84684, CAP64017, EAQ38847, EAS72439, NP_106714, NP_435719, NP_443883, P04340, P04341, P04677, P04678, P04679, P06234, P06235, P17862, P24151, P26024, P50357, P53417, P72334, Q07755, Q53513, YP_001796208, YP_002605865, ZP_01050448 또는 ZP_01252570(본원에 참고로 인용됨).

전장 NODC 단백질을 나타내는 UNIPROT 데이터베이스 중의 다른 항목이 하기 표 1에 요약되어 있다. 수탁 번호로 참조된 모든 언급된 아미노산 서열들은 본원에 참고로 인용된다.

[표 0]

전장 NODC 단백질

그러나, 1 개 이상의 아미노산 잔기가 결실되거나 치환되거나 삽입되었으며, 상기 언급된 아미노산 서열로부터 추론할 수 있는 NODC 단백질의 변종들이 또한, 효소 활성이 변하지 않은 한, 본 발명에 따른 방법에서 동일한 효과로 사용될 수 있다는 것이 명백해질 것이다. 이들 변종 NODC 단백질은 본원에 언급된 NODC 단백질 중 임의의 하나와 약 95%의 서열 일치를 가질 수 있다. 체외에서 NODC 단백질의 효소 활성을 측정하는 방법이, 예컨대 문헌[Kamst et al., 1997 Journal of Bacteriology, 179, pp. 2103-2108]에 기재되어 있다.

따라서, 본원에 사용된 바와 같이, "NODC 유형의 N-아세틸글루코사민 트랜스퍼라제"는 GlcNAc 일부를 UDP-GlcNAc로부터 초기 키틴 올리고당으로 전달하는 것을 촉진하는 N-아세틸글루코사민 트랜스퍼라제이다. 바람직하게는 상기 단백질은 상이한 NODC 단백질들을 비교함으로써 발견될 수 있는 보존된 영역을 함유한다.

본 발명의 방법에 적합한 것은 서열 번호 1 내지 서열 번호 9에 열거된 단백질, 특히 서열 번호 1에 열거된 단백질 및 이러한 단백질을 암호화하는 DNA 절편이다.

NODC는 골지체 막에 NODC를 표적으로 하는 이형 신호 고정 서열을 갖춰야 한다. 이러한 서열은 당업계에 공지되어 있고, 하기를 포함한다: α-2,6-시알릴트랜스퍼라제의 막 투과 분절의 내부 및 인접 서열(특히 그의 처음 44 또는 52 아미노산; [Munro et al. 1991, EMBO Journal, 10:3577-3588]); 인간 갈락토실 트랜스퍼라제로부터의 신호 고정 서열(특히 그의 처음 60 아미노산) 또는 효모 HDEL 수용체의 아라비돕시스 동족체로부터의 신호 고정 서열(AtERD2)([Saint-Jore et al., 2002, The Plant Journal, 29:661-678]), β-1,2-자일로실트랜스퍼라제 단백질로부터의 신호 고정 서열(특히 그의 처음 36 아미노산; [Pagny et al., 2003, The Plant Journal, 33:189-203]), N-아세틸글루코사미닐 트랜스퍼라제 I의 신호 고정 서열(특히 그의 처음 77 아미노산; [Essl et al., 1999, FEBS Lett., 453:169-173) 또는 인간 리소좀 단백질 LAMP1의 20 아미노산 절편([Brandizzi et al., 2002, Plant Cell, 14:1077-1092])(모든 출판물은 본원에 참조로서 인용됨). N-아세틸글루코사민 트랜스퍼라제의 C-말단에서 융합에 의해 사용될 다른 골지 표적 신호는 아라비돕시스 DAGAT1 단백질에서 발견될 수 있는 아미노산 서열 "YYHDL" 또는 아라비돕시스 DAGAT2에서 발견될 수 있는 "LKLEI"을 포함한다. 각각의 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 절편과의 결합에 의한 이러한 골지 신호 고정 서열의 NODC에의 융합은 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 달성될 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같은 이형 신호 고정 서열은 융합되는 단백질의 자연적 일부가 아닌 신호 고정 서열을 의미한다. 따라서, 상기 이형 신호 고정 서열은 동일 종으로부터의 또다른 단백질로부터 유래될 수 있거나, 또다른 종으로부터의 단백질로부터 유래될 수 있다.

본 발명에 따른 키메릭 유전자는 식물 발현성 프로모터를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "프로모터"는 전사 개시 중에 DNA 의존성 RNA-폴리머라제에 의해 인식되고 (직접 또는 간접적으로) 결합되는 임의의 DNA를 나타낸다. 프로모터는 전사 개시 부위, 및 전사 개시 인자 및 RNA 폴리머라제의 결합 부위를 포함하고, 유전자 발현 조절 단백질들이 결합할 수 있는 다양한 다른 부위(예컨대 인핸서(enhancer))를 포함한다.

본원에 사용된 바와 같은, 용어 "식물 발현성 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 조절(개시)할 수 있는 DNA 서열을 의미한다. 이는 식물 기원의 임의의 프로모터를 포함하지만, 또한 식물 세포에서 전사를 조정할 수 있는 비식물 기원의 임의의 프로모터, 즉 바이러스 또는 세균 기원, 예컨대 CaMV35S의 특정 프로모터, 지하 클로버 바이러스 프로모터 4 번 또는 7 번, T-DNA 유전자 프로모터, 예컨대 Pmas, Pnos, Ptr1, Ptr2, 카사바(Cassava) 엽맥 모자이크 바이러스 등을 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같은 전사 종결 및 폴리아데닐화 영역은 초기 RNA의 절단을 추진하는 서열이고, 그 후 폴리(A) 꼬리가 결과 RNA 3' 말단에 첨가된다. 식물에서 전사 종결 및 폴리아데닐화 신호 기능적인 것은 3'nos, 3'35S, 3'his 및 3'g7을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

우선적으로 섬유 세포에서 전사의 개시 및 유지를 조절하는 식물 발현성 프로모터는 작용적으로 결합된 DNA 영역의 전사를 식물의 다른 세포 또는 조직에서보다 섬유 세포 및 하부 표피세포에서 더 높은 수준으로 추진하는 프로모터이다. 이러한 프로모터는 섬유 특이적 β-튜불린 유전자로부터의 목화로부터의 프로모터(국제특허출원공개 제0210377호에 기재된 바와 같음), 섬유 특이적 액틴 유전자로부터의 목화로부터의 프로모터(국제특허출원공개 제0210413호에 기재된 바와 같음), 목화로부터의 섬유 특이적 지질 전달 단백질 유전자로부터의 프로모터(미국특허 제5792933호에 개시된 바와 같음), 종피로부터의 프로모터 및 목화로부터의 섬유 특이적 프로티아제([Hou et al., 2008, Chinese Science Bulletin 53, pp. 2639-2645]), 목화로부터의 섬유 특이적 R2R3 MYB 유전자로부터의 프로모터([Pu et al., 2008, Genetics 180, pp. 811-820]), 목화로부터의 익스팬신 유전자로부터의 프로모터(국제특허출원공개 제9830698호), 목화 중의 키티나아제 유전자로부터의 프로모터(미국특허 제2003106097호), CesA1의 프로모터(미국특허 제6271443호), 또는 미국특허 제6259003호 또는 미국특허 제6166294호 또는 국제특허출원공개 제96040924호에 기재된 섬유 특이적 유전자의 프로모터를 포함한다.

본 발명에 따른 양으로 하전된 올리고당은 N-아세틸글루코사민 올리고머, 예컨대 β-1-4 결합된 N-아세틸글루코사민 올리고머로 구성된다. 언급된 올리고당은 2 내지 10, 또는 2 내지 9, 또는 2 내지 8, 또는 2 내지 7, 또는 2 내지 6, 또는 2 내지 5, 또는 3 내지 5 개의 N-아세틸글루코사민 단량체를 포함할 수 있다.

본원에서 사용된 중합도는 올리고머 또는 중합체 중에 존재하는 단량체의 갯수이다. N-아세틸글루코사민 올리고머의 중합도는 언급된 올리고머 중에 존재하는 N-아세틸글루코사민 단량체의 갯수이다.

또다른 실시양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 방법을 사용하여 세포벽 중의 양으로 하전된 올리고당을 포함하는 식물을 생산하는 방법을 제공하고, 이는 언급된 식물이 NODC 유전자를 포함하지 않는 식물의 뿌리 길이와 본질적으로 동일한 뿌리 길이를 갖는 것을 특징으로 한다.

NODC 유전자를 포함하지 않는 야생형 뿌리의 길이의 70 % 이상, 또는 80% 또는 90%, 또는 95%, 또는 70% 내지 120%, 또는 80% 내지 120%, 또는 80% 내지 110%, 또는 90% 내지 110%, 또는 95% 내지 110%의 길이, 또는 NODC 유전자를 포함하지 않는 야생형 뿌리의 길이와 일치하는 경우, 상기 뿌리 길이는 본질적으로 동일하다.

추가의 실시양태에서, 본 발명에 따른 식물은 목화, 대마 또는 아마로부터 선택된다. 추가의 실시양태에서, 언급된 식물은 섬유를 포함하는 목화 식물이다.

본 발명은 식물 세포벽, 예컨대 2 차 세포벽 또는 본 발명에 따른 방법을 사용하여 식물 세포로부터 수득된 이러한 세포벽을 포함하는 섬유를 추가로 제공한다. 이러한 식물 세포벽은 셀룰로오스에 포함된 양으로 하전된 올리고당, 예컨대 N-아세틸글루코사민 올리고머, β-1-4 결합된 N-아세틸글루코사민 또는 키틴을 포함한다.

본 발명은 또한 본 발명의 방법에 의해 수득된 식물로부터 식물 세포벽 및 섬유를 분리하는 단계를 제공한다.

글루코사민 잔기를 포함하는 올리고머가 수득될 정도로, 본 발명에 따른 양으로 하전된 다당류 추가로 개질, 예컨대 부분적으로 또는 완전히 탈아세틸화될 수 있다. 결과 글루코사민의 아미노 기는 N-아세틸글루코사민의 아미노아세틸 기 또는 셀룰로오스의 히드록실 기보다 화학적으로 더 반응성이다.

N-아세틸글루코사민의 탈아세틸화는 열-기계-화학적 기술의 적용을 통해([Pelletier et al, 1990, Biotechnol Bioeng. 36, pp. 310-315]), 알칼리 주입 기술을 사용하여([Rao et al, 1987, Indian Journal of Technology, 25, pp. 194-196]), 희석제로서 물-혼화성 용매를 사용하여([Batista and Roberts, 1990, Makromolekulare Chemie-Macromolecular Chemistry and Physics, 191, pp. 429-434]), 탈아세틸화 공정 동안 산소를 가두기 위하여 티오페놀을 사용하여([Domard and Rinaudo, 1983, International Journal of Biological Macromolecules, 5, pp. 49-52]), 또는 오토클레이브 조건을 사용하여([No et al., 2000, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 48, pp. 2625-2627]) 알칼리 가수분해를 포함하는 방법을 사용하여 화학적으로 수행될 수 있다. 또한, 키틴의 탈아세틸화는 키틴 데아세틸라제를 사용하여 효소적으로 수행될 수 있다. 이러한 키틴 데아세틸라제는 무코르 로욱시(Mucor rouxii), 아브시디아 코에룰레아(Absidia coerulea), 아스퍼질루스 니둘란스(Aspergillus nidulans), 콜레토트리쿰 린데무티아눔(Colletotrichum lindemuthianum) 및 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)로부터의 것들을 포함한다.

본 발명에 따라 수득된 식물 세포벽, 특히 탈아세틸화하는 단계의 대상이었던 것들은 추가로 화학적으로 개질될 수 있다. 이러한 식물 세포벽을 함유하는 산물, 예컨대 섬유, 얀 또는 직물은 당업계에서 개시된 셀룰로오스-키토산 블렌드의 성질과 닮은 성질, 예컨대 개선된 염색성, 예컨대 피부 사상균의 개선된 억제, 조절된 약물 방출 등을 갖는다.

또한, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 키메릭 유전자, 및 이러한 키메릭 유전자를 함유하는 식물 세포 또는 식물, 및 세포벽 중에 양으로 하전된 올리고당의 양을 증가시키기 위한 또는 화학적 개질, 예컨대 염색성을 위한 식물 세포벽, 면 섬유 또는 얀 또는 직물의 반응성을 증가시키기 위한 언급된 키메릭 유전자의 용도를 제공한다. 본 발명은 언급된 식물의 뿌리 길이가 이러한 키메릭 유전자를 함유하지 않는 동질유전자형 식물의 뿌리 길이와 본질적으로 동일한 것이 특징인 이러한 키메릭 유전자를 함유하는 식물, 예컨대 목화 식물을 추가로 제공한다. 본 발명은 이러한 목화 식물로부터의 섬유, 및 언급된 섬유로부터 제조된 얀 또는 직물을 추가로 제공한다.

N-아세틸글루코사민 올리고머의 생산 효율의 증가, 또는 본원에서 사용된 바와 같은 식물 세포벽 중의 양으로 하전된 올리고당의 양의 증가는 식물 세포벽 중의 양으로 하전된 올리고당 또는 N-아세틸글루코사민 올리고머의 2 배 이상, 또는 5 배 이상, 또는 10 배 이상, 또는 20 배 이상, 또는 2 내지 100 배, 또는 5 내지 100 배, 또는 10 내지 100 배 또는 20 내지 200 배 증가를 의미한다.

특정한 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 방법에 따른 목화 식물로부터 수득되거나 수득될 수 있는, 또는 본 발명에 따라 키메릭 유전자를 포함하는 면 섬유를 제공한다. 즉, 면 섬유는 그 세포의 게놈, 예컨대 핵 게놈 중에 골지 신호 고정 서열에 융합된 NODC 유형 N-아세틸글루코사민 트랜스퍼라제를 암호화하는 DNA 영역에 작용적으로 결합한 식물 발현성 프로모터를 포함하는 키메릭 유전자를 포함하는 목화 식물로부터 제공된다. 목화 식물로 이전된 키메릭 유전자에 포함된 DNA 암호화 영역 또는 프로모터의 특별한 실시양태는 이 문헌의 다른 부분에서 기재된다.

본 발명에 따른 면 섬유는 음이온성 염료(예컨대 콩고 레드)에 의한 증가된 염색에 대한 이러한 섬유의 능력, 아민 반응성 염료(예컨대 테트라플루오로페닐 에스터)에 의한 증가된 염색에 대한 이러한 섬유의 능력에 의해, 천연 면 섬유, 즉, 본 발명에 따른 키메릭 유전자를 포함하지 않는 동질유전자 계통으로부터 수득된 면 섬유와 구분될 수 있다. 본 발명에 따른 면 섬유는 또한 키토-올리고머와 결합하는 맥아 아글루티닌의 결합 능력을 갖는다. 본 발명에 따른 면 섬유는 또한, 바람직하게는 상기 섬유 세포 벽 물질을 셀룰라제로 처리한 후에 N-아세틸글루코사민 및 GlcNAc 올리고머, 예컨대 키토바이오스, 키토트라이오스 또는 키토테트라오스의 직접적인 검출에 의해 천연 면 섬유와 구분될 수 있다. 본 발명에 따른 면 섬유는 또한 그의 증가된 질소 함량에 의해 구분될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 면 섬유는 양으로 하전된 올리고머가 섬유를 구성하는 2 차 식물 세포벽에 다소 고르게 분포된다는 점에서, 키토산 코팅된 섬유 또는 키토산/셀룰로오스 블렌딩된 얀과 구분될 수 있다. 따라서, 이후에 기재되는 바와 같이, 예컨대 WGA 또는 콩고 레드 또는 테트라플루오로페닐로 염색된 면 섬유의 현미경 관찰 섹션에서, 염료는 면 섬유를 구성하는 세포벽 전체를 통해 다소 고르게 분포될 것인 반면, 키토산 코팅된 섬유에서 염색은 처리된 섬유의 표면에서 시트로서 위치한 키토산의 코트에 집중될 것이다.

본 발명에 따른 면 섬유는 또한 면 섬유와 관련된 식물 물질 중에 남아있는 핵산 중에 키메릭 유전자를 포함하는 NODC의 검출에 의해 다른 면 섬유와 구분될 수 있다.

본 발명에 따른 식물 세포벽 물질의 음이온성 염료, 예컨대 콩고 레드에 의해 증가된 염색을, 예컨대 균일한 양의 물질을 표준 조건 하에서 염색하고, 상기 물질을 표준화된 영역(예컨대 다중웰 플레이트 중의 웰) 위에 펴 바르고, 상기 영역의 사진을 물질의 착색된 층의 회색 등급으로 디지털화함으로써 정량화할 수 있다. 회색이 적을수록 식물 세포벽 물질은 더 염색된 것이다. 이 방식으로, 본 발명에 따른 면 섬유 및 세포벽 물질은 콩고 레드에 의한 염색에서 NODC 암호화 유전자가 없는 동질유전자형 식물 계통으로부터의 대조군 세포벽 물질 또는 섬유와 비교하여 10% 이상, 또는 30% 이상, 또는 50% 이상의 증가로써 수득될 수 있다.

본 발명에 따른 식물 세포벽 물질은 또한 산 염료, 예컨대 액시드 오렌지 7로 염색될 수 있다. 본 발명에 따른 섬유 및 세포벽 물질은 액시드 오렌지 7에 의한 염색에서 NODC 암호화 유전자가 없는 동질유전자형 식물 계통으로부터의 대조군 세포벽 물질 또는 섬유와 비교하여 50% 이상, 또는 70% 이상, 또는 50 내지 100%의 증가로써 수득될 수 있다.

맥아 아글루티닌(커플링된 형광표지 기에 의해 검출 가능함)과 특이적으로 결합하는 신규의 면 섬유의 능력은 천연 면 섬유에 대한 상기 제공된 신규의 면 섬유의 분명히 구분되는 특징이다. 매우 낮은 배경 형광을 제외하고, 천연 면 섬유는 WGA-알렉사 플루오르 488 또는 555로 처리하는 경우 염색/형광을 발하지 않는다. 면 섬유의 형광성은 키토-올리고머가 존재할 때 5 배 이상 증가한다. 따라서, 본 발명은 맥아 아글루티닌, 또는 형광표지에 커플링된 WGA, 예컨대 WGA 알렉사 488 또는 WGA 알렉사 555와 특이적으로 결합할 수 있거나, 또는 WGA 알렉사 488 또는 WGA 알렉사 555로 처리하는 경우 UV광 하에서 밝은 형광을 제공하는 면 섬유를 제공한다. 상기 형광은 상기 면 섬유의 표면에 국한되지 않고 상기 섬유 세포의 세포벽 전체를 통해 분포된다.

면 섬유를 포함한, 본 발명에 따른 식물 세포벽 물질은 전형적으로 0.1 ㎍/㎎ 세포벽 물질 이상, 또는 1 ㎍/㎎ 세포벽 물질 이상, 또는 5 ㎍/㎎ 세포벽 물질 이상의 농도로 키토-올리고당을 갖는다.

본 발명의 방법이 식물 세포 중에 키메릭 유전자의 도입에 관한 것이면 어디에서든지, 이러한 방법이 식물 세포가 성숙한 식물 내로 통합되는 경우에도 또한 적용될 수 있음은 명백할 것이다. 예컨대 유전자 이식 세포는 확립된 방법에 따라 유전자 이식 식물 내에 재생될 수 있다.

식물 세포 및 식물을 형질전환시키는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 목화 식물을 형질전환시키는 방법도 또한 당업계에 널리 공지되어 있다. 목화의 아그로박테리움 매개된 형질전환이 예컨대 미국특허 제5,004,863호 또는 미국특허 제6,483,013호에 기재되어 있고 입자 충격에 의한 목화 형질전환은, 예컨대 국제특허출원공개 제92/15675호에 보고되어 있다.

키메릭 유전자, 예컨대 코커(Coker) 312, 코커310, 코커 5아칼라(Acala) SJ-5, GSC25110, 화이버맥스(FiberMax) 819, 시오크라(Siokra) 1-3, T25, GSA75, 아칼라 SJ2, 아칼라 SJ4, 아칼라 SJ5, 아칼라 SJ-C1, 아칼라 B1644, 아칼라 B1654-26, 아칼라 B1654-43, 아칼라 B3991, 아칼라 GC356, 아칼라 GC510, 아칼라 GAM1, 아칼라 C1, 아칼라 로얄(Royale), 아칼라 맥사(Maxxa), 아칼라 프리마(Prema), 아칼라 B638, 아칼라 B1810, 아칼라 B2724, 아칼라 B4894, 아칼라 B5002, 비아칼라 "피커" 시오크라, "스트립퍼" 변종 FC2017, 코커 315, 스톤빌(STONEVILLE) 506, 스톤빌 825, DP50, DP61, DP90, DP77, DES119, McN235, HBX87, HBX191, HBX107, FC 3027, 켐브레드(CHEMBRED) A1, 켐브레드 A2, 켐브레드 A3, 켐브레드 A4, 켐브레드 B1, 켐브레드 B2, 켐브레드 B3, 켐브레드 C1, 켐브레드 C2, 켐브레드 C3, 켐브레드 C4, 페이매스터(PAYMASTER) 145, HS26, HS46, 시칼라(SICALA), 피마(PIMA) S6 및 오로블랑코 피마(ORO BLANCO PIMA), 화이버맥스(등록상표) FM5013, FM5015, FM5017, FM989, FM832, FM966 및 FM958, FM989, FM958, FM832, FM991, FM819, FM800, FM960, FM966, FM981, FM5035, FM5044, FM5045, FM5013, FM5015, FM5017 또는 FM5024를 배발생 캘러스가 유도될 수 있는 목화 식물 및 이들로부터 유래된 유전자형을 갖는 식물에서 형질전환에 의해 도입될 수 있다.

본원에서 사용된 "목화"는 고시퓸 히르수툼(Gossypium hirsutum), 고시퓸 바르바덴세(barbadense), 고시퓸 아르보레움(arboreum) 및 고시퓸 헤르바세움(herbaceum) 또는 이러한 종들 간 교배로부터의 자손을 포함한다.

본 발명의 방법 및 수단은 또한 다른 식물 종들, 예컨대 대마, 황마, 아마 및 목질 식물에 사용될 수 있으며, 이에는 피누스 스페시즈(Pinus spp .), 포풀루스 스페시즈(Populus spp .), 피세아 스페시즈(Picea spp .), 유칼립투스 스페시즈(Eucalyptus spp .) 등이 포함되나 이에 한정되지 않는다.

상기 수득된 형질전환된 식물을 통상적인 육종 계획에 사용하여 동일한 특징을 갖는 보다 많은 형질전환된 식물을 생산하거나 본 발명에 따른 키메릭 유전자를 동일하거나 관련된 식물 종의 다른 품종 또는 하이브리드 식물에 도입시킬 수 있다. 상기 형질전환된 식물로부터 수득한 종자는 안정한 게놈 삽입물로서 본 발명의 키메릭 유전자를 함유하며 상기는 또한 본 발명에 포함된다.

면 섬유, 얀 또는 직물 염색 방법과 관련하여 사용될 수 있는 반응성 염료는 리액티브 레드(Reactive Red) 120(RR120), 리액티브 옐로우(Yellow) 176(RY176), Levafix Blue(레바픽스 블루) CA, 리액티브 오렌지(Orange) 35, 리리액티브 블랙(Black) 5, 리액티브 레드 116을 포함한다. 염색은 또한 산 염료, 예컨대 액시드(Acid) 오렌지 7, 액시드 블루 62, 액시드 블루 281, 액시드 레드 361, 액시드 블루 277, 액시드 레드 4, 액시드 블루 113, 액시드 옐로우 137, 액시드 블루 127:1, 및 액시드 블루 193을 포함한다. 이들 염료는 당업계에 널리 공지된 프로토콜에 따라 적용된다.

본 발명에 사용된 "포함하는"은 서술된 특징, 정수, 단계 또는 성분들의 존재를 명시하는 것으로서 해석되어야 하지만, 하나 이상의 특징, 정수, 단계 또는 성분, 또는 이들의 그룹의 존재 또는 첨가를 불가능하게 하는 것은 아니다. 따라서, 예컨대 뉴클레오티드 또는 아미노산의 서열을 포함하는 핵산 또는 단백질은 실제로 인용된 것들보다 더 많은 뉴클레오티드 또는 아미노산을 포함할 수 있다, 즉 보다 큰 핵산 또는 단백질 중에 포함될 수 있다. 작용적으로 또는 구조적으로 정의된 DNA 영역을 포함하는 키메릭 유전자는 추가적인 DNA 영역 등을 포함할 수 있다.

본원에 개시된 방법에 의해 수득된 유전자 이식 식물 세포 및 식물은 또한 이후의 형질전환 절차, 예컨대 추가의 키메릭 유전자를 도입하는 데에서 추가로 사용될 수 있다.

본원에 개시된 또는 본원에 개시된 방법에 의해 수득된 키메릭 유전자를 포함하는 목화 식물 또는 종자는 목화 제초제, 예컨대 디우론(Diuron), 플루오메트론(Fluometuron), MSMA, 옥시플루오르펜(Oxyfluorfen), 프로메트린(Prometryn), 트리플루랄린(Trifluralin), 카펜트라존(Carfentrazone), 클레토딤(Clethodim), 플루아지폽-부틸(Fluazifop-butyl), 글리포세이트(Glyphosate), 노플루라존(Norflurazon), 펜디메탈린(Pendimethalin), 피리티오박-나트륨(Pyrithiobac-sodium), 트리플록시설푸론(Trifloxysulfuron), 테프랄옥시딤(Tepraloxydim), 글루포시네이트(Glufosinate), 플루미옥사진(Flumioxazin), 티미아주론(Thidiazuron); 목화 살충제, 예컨대 아세페이트(Acephate), 알디카브(Aldicarb), 클로르피리포스(Chlorpyrifos), 사이퍼메트린(Cypermethrin), 델타메트린(Deltamethrin), 아바멕틴(Abamectin), 아세트아미프리드(Acetamiprid), 에마멕틴 벤조에이트(Emamectin Benzoate), 이미다클로프리드(Imidacloprid), 인독사카브(Indoxacarb), 람다-시할로트린(Lambda-Cyhalothrin), 스피노사드(Spinosad), 티오디카브(Thiodicarb), 감마-시할로트린(Gamma-Cyhalothrin), 스피로메시펜(Spiromesifen), 피리달릴(Pyridalyl), 플로니카미드(Flonicamid), 플루벤디아미드(Flubendiamide), 트리플루무론(Triflumuron), 리낙시피르(Rynaxypyr), 베타-시플루트린(Beta-Cyfluthrin), 스피로테트라매트(Spirotetramat), 클로티아니딘(Clothianidin), 티아메톡삼(Thiamethoxam), 티아클로프리드(Thiacloprid), 디네토푸란(Dinetofuran), 플루벤디아미드(Flubendiamide), 시아지피르(Cyazypyr), 스피노자드(Spinosad), 스피노토람(Spinotoram), 감마-시할로트린(gamma- Cyhalothrin), 4-[[(6-클로르피리딘-3-일)메틸](2,2-디플루오르에틸)아미노]푸란-2(5H)-온, 티오디카브(Thiodicarb), 아베르멕틴(Avermectin), 플로니카미드(Flonicamid), 피리달릴(Pyridalyl), 스피로메시펜(Spiromesifen), 설폭사플로르(Sulfoxaflor); 및 목화 살균제, 예컨대 아족시스트로빈(Azoxystrobin), 빅사펜(Bixafen), 보스칼리드(Boscalid), 카르벤다짐(Carbendazim), 클로로탈로닐(Chlorothalonil), 코퍼(Copper), 시프로코나졸(Cyproconazole), 디페노코나졸(Difenoconazole), 디목시스트로빈(Dimoxystrobin), 에폭시코나졸(Epoxiconazole), 페나미돈(Fenamidone), 플루아지남(Fluazinam), 플루오피람(Fluopyram), 플루옥사스트로빈(Fluoxastrobin), 플룩사피록사드(Fluxapyroxad), 이프로디온(Iprodione), 이소피라잠(Isopyrazam), 이소티아닐(Isotianil), 만코젭(Mancozeb), 마넵(Maneb), 메토미노스트로빈(Metominostrobin), 펜티오피라드(Penthiopyrad), 피콕시스트로빈(Picoxystrobin), 프로피넵(Propineb), 프로티오코나졸(Prothioconazole), 피라클로스트로빈(Pyraclostrobin), 퀸토젠(Quintozene), 테부코나졸(Tebuconazole), 테트라코나졸(Tetraconazole), 티오파네이트-메틸(Thiophanate-methyl), 트리플록시스트로빈(Trifloxystrobin)으로 추가로 처리될 수 있다. 목화 제초제로 처리하는 경우, 언급된 목화 식물 또는 종자는 바람직하게는 추가로 각각 제초제 내성을 부여하는 특성을 포함하거나 언급된 제초제에 자연적으로 내성이 있다.

하기 비제한적인 실시예는 식물 세포벽을 변경하는 방법을 기재한다. 실시예에서 달리 나타내지 않는 한, 모든 재조합 DNA 기술은 문헌[Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY and in Volumes 1 and 2 of Ausubel et al. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USA]에 기재된 바와 같이 표준 프로토콜에 따라 수행된다. 식물 분자 연구를 위한 표준 물질 및 방법이 문헌[R.D.D. Croy, Plant Molecular Biology Labfax (1993)(BIOS Scientific Publications Ltd(UK) 및 Blackwell Scientific Publications(UK)에 의해 공동으로 출판됨)]에 기재되어 있다.

상세한 설명 및 실시예 전반에 걸쳐, 서열 목록에 표시된 하기 서열을 참조한다:

서열 번호 1: 아조라이조비움 카울리노단스(Azorhizobium caulinodans)의 뿌리혹 형성 단백질 C

서열 번호 2: 브라디라이조비움 자포니쿰(Bradyrhizobium japonicum)의 뿌리혹 형성 단백질 C

서열 번호 3: 라이조비움 갈레가에(Rhizobium galegae)의 뿌리혹 형성 단백질 C

서열 번호 4: 라이조비움 레구미노사룸(Rhizobium leguminosarum, 비브리오 비시애(biovar viciae))의 뿌리혹 형성 단백질 C

서열 번호 5: 라이조비움 멜릴로티(Rhizobium meliloti)의 뿌리혹 형성 단백질 C

서열 번호 6: 라이조비움 트로피치(Rhizobium tropici)의 뿌리혹 형성 단백질 C

서열 번호 7: 라이조비움 레구미노사룸(Rhizobium leguminosarum, 비브리오 파세올리(biovar phaseoli))의 뿌리혹 형성 단백질 C

서열 번호 8: 라이조비움 스페시즈 균주 N33의 뿌리혹 형성 단백질 C

서열 번호 9: 라이조비움 로티(Rhizobium loti)의 뿌리혹 형성 단백질 C

서열 번호 10: pTJN6의 T-DNA

서열 번호 11: 골지-신호 고정 서열에 결합된 NODC의 아미노산 서열

서열 번호 12: 골지 표적 서열을 추가적으로 포함하는 핵산을 암호화하는 NODC에 작용적으로 결합된 F286 섬유 선택적 프로모터를 포함하는 키메릭 유전자를 포함하는 T-DNA의 핵산 서열(=pTDBI146)

서열 번호 13: 골지 표적 서열을 추가적으로 포함하는 핵산을 암호화하는 NODC에 작용적으로 결합된 Gluc1A 프로모터를 포함하는 키메릭 유전자를 포함하는 T-DNA의 핵산 서열(=pTDBI158)

서열 번호 14: 골지 표적 서열을 추가적으로 포함하는 핵산을 암호화하는 NODC에 작용적으로 결합된 Gluc1D 프로모터를 포함하는 키메릭 유전자를 포함하는 T-DNA의 핵산 서열(=pTDBI159)

서열 번호 15: 골지 표적 서열을 추가적으로 포함하는 핵산을 암호화하는 NODC에 작용적으로 결합된 익스팬신 프로모터를 포함하는 키메릭 유전자를 포함하는 T-DNA의 핵산 서열(=pTDBI165)

서열 번호 16: 골지 표적 서열을 추가적으로 포함하는 핵산을 암호화하는 NODC에 작용적으로 결합된 E6 프로모터를 포함하는 키메릭 유전자를 포함하는 T-DNA의 핵산 서열(=pTGK96)

실시예

실시예 1: 골지 신호 고정 서열에 융합된 N-아세틸글루코사민 트랜스퍼라제 단백질을 암호화하는 키메릭 식물 발현성 유전자의 구축.

표준 재조합 DNA 기술을 사용하여, 하기의 작용적으로 결합된 DNA 절편을 함유하는 식물 발현성 NODC 키메릭 유전자를 구축하였다:

·CaMV로부터의 35S 프로모터 영역

·번역되지 않은 리더 서열을 암호화하는 DNA 절편(5'Cab22L)

·아라비돕시스 탈리아나로부터의 β-1,2-자일로실트랜스퍼라제의 35 N-말단 아미노산을 암호화하는 DNA 절편

·이전 DNA 절편으로 인 프레임 복제된 아조라이조비움 카울리노단스의 NODC를 암호화하는 DNA 절편

·CaMV 35S 전사물로부터의 전사 종결 및 폴리아데닐화 신호(3' 35S)

상기 키메릭 유전자를 포스피노트리신에 대한 내성을 제공하는 키메릭 bar 유전자와 함께 T-DNA 벡터의 T-DNA 경계 사이에 도입시켰다. 생성된 T-DNA 벡터를 pTJN6이라 명명하였다. 이 벡터의 T-DNA의 서열을 서열 번호 10에 제공하였다.

T-DNA 벡터 pTJN6을 침지법([Clough SJ and Bent AF, (1998), 식물 J., 16: 735-743])에 의해 아라비돕시스 탈리아나의 형질전환에 사용된 아그로박테리움 균주 C58C1RIF(pEHA101)([Hood, et al.,(1986), J. Bact., 168: 1291])에 도입시켰다.

실시예 2: 유전자 이식 아라비돕시스 식물의 뿌리 길이의 분석.

야생형 아라비돕시스 및 pTJN6(이형 골지 신호 고정 서열을 갖는 NODC) 및 pTGK42(이형 골지 신호 고정 서열을 갖지 않는 NODC; 국제특허출원공개 제2006/136351호 참조)로 형질전환된 유전자 이식 아라비돕시스 식물을 가스 멸균시키고 개질된 비타민(시그마(Sigma)) 및 20 g/l 포도당을 포함하는 0.5x 무라시게-스쿠그(Murashige 및 Skoog, MS) 기본 염 배지에 플레이팅하였다. 4 ℃에서 2 일 동안 침윤시킨 후, 플레이트를 21 ℃에서 9 일의 기간 동안 빛의 16 시간의 낮/밤 체제로 성장 배양기에서 수직으로 배치하였다. 플레이트를 벤치-탑 스캐너로 스캔하고, 이미지제이(ImageJ)로 측정하였다. 분석을 위하여 데이터를 마이크로소프트 엑셀(Microsoft Excel)로 내보내었다. 뿌리 길이를 측정하고 야생형 식물의 뿌리 길이와 비교하였다. 도 3A는 pTGK42로 형질전환된 식물의 뿌리 길이가 야생형의 뿌리 길이보다 약 25% 짧은 반면, 야생형과 pTJN6을 포함한 형질전환 식물 사이의 뿌리 길이에 있어 유의한 차이가 없다는 것을 보여준다. 도 3B는, pTJN6을 포함하는 다른 유전자 이식 계통에서, 야생형 및 유전자 이식 식물 사이의 뿌리 길이에 있어 유의한 차이가 없다는 것을 보여준다.

실시예 3: 형질전환 아라비돕시스 식물의 세포벽 중의 GlcNAc 올리고머의 특성화.

pTJN6으로 형질전환된 유전자 이식 아라비돕시스 식물 중의 GlcNAc 올리고머를 문헌[Rozaklis et al., 2002, Clinical Chemistry, 48:131-139]에 기재된 바에 따라 유도체화, 고성능 액체 크로마토그래피 및 질량 분석법의 조합을 사용하여 분석하였다. 간략히, 잎 시료(20 내지 150 mg)를 액체 질소에서 스냅 냉동시키고, 리치 밀 분쇄기를 사용하여 2 ml 에펜도르프 튜브에서 분쇄하였다. 0.5 ml 80% MeOH를 첨가하고, 상기 튜브를 볼텍싱하고 미리 냉각된 테이블 탑 원심분리기에서 원심분리시켰다(5 분, 14000 rpm). 상층액을 깨끗한 2 ml 튜브로 이동시키고 스피드 백(speed vac)에서 동결 건조시켰다. 펠렛을 0.5M PMP를 함유하는 100 ㎕ MeOH 및 100㎕ 800 mM NH3에 재현탁시켰다. 반응 혼합물을 70 ℃, 써모믹서(thermomixer)에서 9 분 동안 850 rpm에서 배양하였다. 이 배양 단계 후, 200 ㎕ 800 mM 포름산을 첨가하여 반응 혼합물을 중화시킨 후, 물로 500 ㎕까지 만들었다. 0.5 ml 클로로포름을 사용한 순차적인 클로로포름 추출 3 회 후, 시료를 동결 건조시키고 200 ㎕ 물에 재현탁시켰다. 시료를 피니건 매트(Finnigan Mat) LCQ 질량 분석기를 사용하여 액퀴티(Acquity) UPLC BEH C18 컬럼(워터스 코포레이션(Waters Corp.), 미국 매사추세츠주 밀포드 소재)(1.7 ㎛, 150 mm×2.1 mm)로 분석하였다. 이동상은 (A) 1% ACN 및 0.1% 아세트산 암모늄을 함유하는 물 및 (B) 1% 물 및 0.1% 아세트산 암모늄을 함유하는 ACN으로 구성되었다. 컬럼 온도를 55 ℃로 및 오토샘플러 온도를 10 ℃로 유지하였다. 구배 용출 초기화 동안 300 ㎕/분의 유량이 적용되었다. 하기 조건: 0 분에서 20%(B), 10 분에서 25%(B) 및 14 분에서 100%(B). 양의 모드로 작동된 전기분무 이온화(ESI)로 용출 화합물의 전체 MS 및 MS/MS 스텍트럼을 수득한다. 유도화된 GlcNAC는 552의 m/z 값을 가지고, 총 피크 면적은 정량을 위한 최적의 접근 방법으로 간주되었다. 특정 m/z 값을 갖는 유일한 특정 화합물이 추가의 절편화를 위하여 선택된 MS/MS에 의해 GlcNAC-올리고머를 검출하였다. 유도화된 단량체 또는 이량체 각각에 상응하는, 552-피크 또는 755-피크를 정량을 위하여 사용하였다. 이들 수준을 pTGK42로 형질전환된 아라비돕시스 식물(국제특허출원공개 제2006/136351호) 및 야생형 아라비돕시스 식물의 수준과 비교하였다.

표 1은, 골지 신호 고정 서열의 부재시보다, 골지 신호 고정 서열의 존재 하에서 GlcNAc2의 양이 65 배까지 증가하고, GlcNAc3의 양이 35 배까지 증가했다는 것을 보여준다.

[표 1]

pTJN6(이형 골지 신호 고정 서열을 갖는 NODC) 및 pTGK42(이형 골지 신호 고정 서열을 갖지 않는 NODC; 국제특허출원공개 제2006/136351호 참조)로 형질전환된 아라비돕시스 식물의 잎 중의 N-아세틸글루코사민 올리고머 GlcNAc2 및 GlcNAc3의 상대량

NODC 골지 신호 고정 서열을 함유하는 식물의 뿌리가 야생형 식물의 뿌리와 동일한 길이를 가짐에 따라, 골지 신호 고정 서열을 갖지 않는 NODC를 함유하는 식물의 뿌리가 야생형보다 상당히 짧은 반면, GlcNAc2 및 GlcNAc3의 올리고머가 잎에 상기된 방법을 사용한 골지 신호 고정 서열을 갖지 않는 NODC(pTGK42) 및 골지 신호 고정 서열을 갖는 NODC(pTJN6)를 포함하는 아라비돕시스 식물의 뿌리에 존재하는지 여부를 조사하였다.

표 2는 pTJN6 식물로부터의 뿌리가 pTGK42 식물로부터의 뿌리에서보다 더 높은 수준에서의 GlcNAc2 및 GlcNAc3 올리고뉴클레오티드를 함유한다는 것을 보여준다. 뿌리에서의 GlcNAc2 및 GlcNAc3의 수준은 잎에서 보다 상당히 더 높다. 야생형 식물의 뿌리에서의 GlcNAc 올리고의 존재는 아마도 TGK42 식물 및 pTJN6 식물로부터의 뿌리 물질의 오염 때문일 것이다.

이러한 결과는 NODC에 골지 신호 고정 서열의 첨가에 의한 뿌리 길이의 야생형 수준으로의 복구가 뿌리에서의 GlcNAc 올리고의 축적의 결핍 때문이 아니라는 것을 보여준다.

[표 2a]

조직 mg당 발현된, pTJN6(이형 골지 신호 고정 서열을 갖는 NODC) 및 pTGK42(이형 골지 신호 고정 서열을 갖지 않는 NODC; 국제특허출원공개 제2006/136351호 참조)로 형질전환된 아라비돕시스 식물의 뿌리 및 잎 중의 N-아세틸글루코사민 올리고머 GlcNAc2의 상대량

[표 2b]

조직 mg당 발현된, pTJN6(이형 골지 신호 고정 서열을 갖는 NODC) 및 pTGK42(이형 골지 신호 고정 서열을 갖지 않는 NODC; 국제특허출원공개 제2006/136351호 참조)로 형질전환된 아라비돕시스 식물의 뿌리 및 잎 중의 N-아세틸글루코사민 올리고머 GlcNAc3의 상대량

실시예 4: 유전자 이식 아라비돕시스 식물의 세포벽 중의 5까지의 중합도를 갖는 GlcNAc 올리고머의 특성화.

야생형 아라비돕시스 식물과 비교되는 pTJN6으로 형질전환된 아라비돕시스 식물 중의 5까지의 중합도를 갖는 GlcNAc 올리고머를 검출하기 위하여, PMP-유도체화를 수행하였다. 시냅트(Synapt) HDMS Q-Tof 질량 분석기(마이크로매스(Micromass), 영국 맨체스터 소재)에 연결된 워터스 액퀴티 UPLC 계(워터스 코포레이션, 미국 매사추세츠주 밀포드 소재)에서 LC-MS 분석을 수행하였다. 크로마토그래피 분리는 구배 용출을 사용하여 액퀴티 BEH C18 컬럼(2.1 mm x 150 mm, 1.7 ㎛)(워터스 코포레이션, 미국 매사추세츠주 밀포드 소재)에서 이루어졌다. 이동상은 (A) 1% ACN 및 0.1% 포름산을 함유하는 물 및 (B) 1% water 및 0.1% 포름산을 함유하는 ACN으로 구성되었다. 컬럼 온도를 40 ℃로 및 오토샘플러 온도를 10 ℃로 유지하였다. 0 분에서 5%(B), 30 분에서 50%(B) 및 33 분에서 100%(B)인 구배 용출 초기화 동안 350 ㎕/분의 유량을 적용하였다. 정확한 질량 측정을 위하여 용출액을 전자분무 이온화원 및 락스페이스 인터페이스(lockspray interface)를 구비한 질량 분석기로 전달하였다. MS 공급원 파라미터는 하기와 같다: 모세관 전압 1.5 kV, 샘플링 콘 40 V, 추출 콘 4 V, 공급원 온도 120 ℃, 탈용매화 온도 350 ℃, 콘 기류량 50 L/h, 탈용매화 가스량 550 L/h. 트랩 및 이동 세포를 위한 충돌 에너지를 각각 6 및 4 V에서 설정하였다. 데이터 수집을 위하여, 동적 범위 향상 방식이 활성화되었다. 음성 중심 V-방식(negative centroid V-mode)으로 전체 스캔 데이터를 기록하였고, 질량 범위는 매스링스 소프트웨어(Masslynx software, 워터스 코포레이션, 미국 매사추세츠주 밀포드 소재)를 사용하여 0.2 s/스캔의 스캔속도로 m/z 100 내지 1600 사이로 설정되었다. 류-엔케팔린(Leu-enkephalin)(0.1% 포름산으로 산성화된 물/ACN, (1:1, v/v)에 용해된 400 pg/㎕)을 0.5 초의 스캔 시간(스캔 3회를 평균함)으로 매 10 초마다 스캔함에 의한 잠금 질량 보정에 사용하였다. MS/MS 목적을 위하여, 트랩 충돌 에너지를 10 내지 45 V로 램핑한 것을 제외하고는 동일하게 설정을 적용하였다. 사용된 모든 용매는 ULC/MS 등급(바이오솔브(Biosolve), 네덜란드 발켄스바드 소재)이었고, 물은 DirectQ-UV 정수기(밀포어 에스에이에스(Millipore S.A.S), 프랑스 몰샤임 소재)로 제조되었다. 도 4는 pTJN6-23을 발현한 식물이 GlcNAc의 단량체, 이량체, 삼량체, 사량체 및 오량체를 함유한다는 것을 보여준다.

실시예 5: 목화에서 골지 신호 고정 서열에 융합된 NODC 의 섬유 특이적 발현.

실시예 1에서 설명된 골지 신호 고정 서열에 융합된 키메릭 NODC 유전자를 포함하는 유전자 이식 목화 식물은, F286 섬유 선택적 프로모터(미국특허 제2003/106097호에서 개시됨)(=pTDBI146), Gluc1A(=pTDBI158) 및 Gluc1D(=pTDBI159) 프로모터(국제특허출원공개 제2008/083969호), E6 프로모터(미국특허 제6096950호)(=pTGK96) 또는 익스팬신 프로모터(미국특허 제6566586호)(=pTDBI165)의 조절 하에서, 미국특허 제6483013호에 기재된 바와 같은 형질전환 방법을 사용하여 생성되었다. 이들 유전자 이식 목화 식물로부터의 섬유를 단리시키고 HPLC에 의해 N-아세틸글루코사민 중합체를 분석하였다. 이들 유전자 이식 섬유는 오직 TFA 가수분해에서만 검출될 수 있는 0.5%까지의 글루코사민을 함유하였고, 이는 중합체의 일부임을 보여주었다. 비형질전환된 계통의 섬유는 0.01% 미만의 GlcN을 함유하였다. 키토바이오스의 존재는 pTDBI158로 형질전환된 계통 중 하나로부터의 섬유에서 증명되었다. 키토바이오스는 비형질전환된 계통으로부터의 섬유에서 검출되지 않았다. 높은 수준의 N-아세틸 올리고머를 갖는 선택된 계통이 필드에서 성장했고, 정상적으로 자라 정상적인 꼬투리를 형성한 계통이 선택될 수 있었다. 이들 계통으로부터의 섬유는 개선된 반응성, 예컨대 개선된 염색성을 갖는 얀 및 직물을 제조하는 데에 사용되었다. 유전자 이식 식물의 목화 꼬투리로부터 단리된 섬유는 세포벽 전반에 걸쳐 고르게 분포되는 N-아세틸글루코사민 중합체를 증가된 양으로 가졌다.

실시예 6: 증가된 반응성을 갖는 면 섬유.

섬유 특이적 프로모터에 작용적으로 결합된 골지 신호 고정 서열에 융합된 키메릭 NODC 유전자를 포함하는 유전자 이식 목화 식물을 실시예 5에서 설명한 바와 같이 생성하였다. 성숙한 면 섬유를 이들 식물로부터 수확하였고 콩고 레드로 염색할 수 있거나 WGA-알렉사 플루오르 555와 반응시킬 수 있었다. 나아가, 얻어진 성숙한 면 섬유를 면 반응성 염료를 포함한 상업적 염료(예컨대 리액티브 레드 120, 레바픽스 블루 CA), 산 염료(액시드 오렌지 7, 액시드 블루 281) 및 울 반응성 염료(예컨대 리액티브 레드 116, 리얼란 앰버(Realan Amber) EHF)로 염색할 수 있었다.

WGA - 알렉사 555 염색

면 섬유를 탈수 또는 침투시킬 필요가 없었다. 대신에, 섬유를 클로로포름:메탄올 혼합물(1:1)로 10 분 동안 3 회 처리한 다음, 아세톤에서 10 분 동안 2 회 처리하고 및 에테르에서 5 분 동안 2 회 처리함으로써 지질 및 왁스를 제거하였다. 섬유는 공기 건조시켰다.

섬유를 WGA-알렉사 555, WGA-알렉사 488 또는 WGA-테트라메틸로다민으로 염색할 수 있었다.

섬유를 블로킹 용액(150 mM NaCl, 10 mM 인산나트륨 완충액 pH 7.4; 0.1% 트윈(Tween) 20 및 1% 소 혈청 알부민)에 넣고 1 시간 동안 배양하였다. 그 후에, 완충액을 WGA-플루오로크롬을 함유하는 동일한 완충액으로 교체하고 4 시간 동안 배양하였다. WGA-플루오로크롬 용액을 블로킹 용액으로 교체하고, 10 분 동안 세척한 다음, BSA가 없는 블로킹 용액으로 10 분 동안 3 회 세척하였고, BSA 및 트윈이 없는 블로킹 용액으로 5 분 동안 2 회 세척하였다. 상기 염색된 섬유를 현미경 슬라이드 상에 고정시키고 알렉사 플루오르 488 컨쥬게이트의 경우 필터셋(Filterset) 38(여기: BP470/40; 방출: BP525/50), 또는 알렉사 플루오르 555 또는 테트라메틸로다민 컨쥬게이트의 경우 필터셋 20(여기: BP546/12; 방출: BP575-640)을 사용하여 형광 현미경(액시오플랜(Axioplan) 2 (자이스(Zeiss), 독일 예나 소재)에 의해 평가하였다. 특정 형광을 비유전자 이식 목화 식물로부터의 면 섬유에서 검출할 수 없는 반면에, 골지 신호 고정 서열에 융합된 키메릭 NODC 유전자를 포함하는 유전자 이식 목화 식물로부터의 면 섬유에서는 밝은 형광을 검출할 수 있었다. 면 섬유의 가상 현미경 섹션은 WGA-플루오르 555가 목화 섬유 세포의 2차 세포벽 전반에 걸쳐 고르게 분포되어 있음을 보여준다.

염색을 위한 준비를 하기 위해, 섬유를 30 분 동안 80 ℃에서 1 g/l 탄산나트륨 및 1g/l 산도진(Sandozin) NIN(비이온성 세제)을 함유하는 증류수로 처리한 후 건조하였다. 섬유를 60 분 동안 98 ℃에서 2% omf 액시드 블루 62를 함유한 50:1의 리큐어:섬유 비를 사용하여 염색하였다. 염색 후, 섬유 시료를 냉수로 헹구고 주위 조건에서 건조하였다. 소모량을 분광광도계를 사용하여 염색 전후의 염료 용기의 염료 농도를 측정함으로써 결정하였다.

T-DNA 벡터 pTDBI158로 형질전환된 목화 계통의 예시에서 볼 수 있는 것과 같이, 상기 프로토콜에 따라 액시드 블루 62로 염색된 섬유는 증가된 소모량 수준을 보여준다.

SEQUENCE LISTING <110> Bayer CropScience NV <120> Methods for altering the reactivity of plant cell walls <130> BCS10-2016 <140> PCT/EP2011/004929 <141> 2011-09-30 <150> EP 10013693.6 <151> 2010-10-15 <150> US 61/394,109 <151> 2010-10-18 <160> 16 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 397 <212> PRT <213> Azorhizobium caulinodans <400> 1 Met Ser Val Val Asp Val Ile Gly Leu Leu Ala Thr Ala Ala Tyr Val 1 5 10 15 Thr Leu Ala Ser Ala Tyr Lys Val Val Gln Phe Ile Asn Val Ser Ser 20 25 30 Val Thr Asp Val Ala Gly Leu Glu Ser Asp Ala Leu Pro Leu Thr Pro 35 40 45 Arg Val Asp Val Ile Val Pro Thr Phe Asn Glu Asn Ser Ser Thr Leu 50 55 60 Leu Glu Cys Val Ala Ser Ile Cys Ala Gln Asp Tyr Arg Gly Pro Ile 65 70 75 80 Thr Ile Val Val Val Asp Asp Gly Ser Thr Asn Lys Thr Ser Phe His 85 90 95 Ala Val Cys Asp Lys Tyr Ala Ser Asp Glu Arg Phe Ile Phe Val Glu 100 105 110 Leu Asp Gln Asn Lys Gly Lys Arg Ala Ala Gln Met Glu Ala Ile Arg 115 120 125 Arg Thr Asp Gly Asp Leu Ile Leu Asn Val Asp Ser Asp Thr Val Ile 130 135 140 Asp Lys Asp Val Val Thr Lys Leu Ala Ser Ser Met Arg Ala Pro Asn 145 150 155 160 Val Gly Gly Val Met Gly Gln Leu Val Ala Lys Asn Arg Glu Arg Ser 165 170 175 Trp Leu Thr Arg Leu Ile Asp Met Glu Tyr Trp Leu Ala Cys Asn Glu 180 185 190 Glu Arg Ile Ala Gln Ser Arg Phe Gly Ser Val Met Cys Cys Cys Gly 195 200 205 Pro Cys Ala Met Tyr Arg Arg Ser Ala Ile Thr Pro Leu Leu Ala Glu 210 215 220 Tyr Glu His Gln Thr Phe Leu Gly Arg Pro Ser Asn Phe Gly Glu Asp 225 230 235 240 Arg His Leu Thr Ile Leu Met Leu Lys Ala Gly Phe Arg Thr Gly Tyr 245 250 255 Val Pro Gly Ala Val Ala Arg Thr Leu Val Pro Asp Gly Leu Ala Pro 260 265 270 Tyr Leu Arg Gln Gln Leu Arg Trp Ala Arg Ser Thr Tyr Arg Asp Thr 275 280 285 Ala Leu Ala Leu Arg Ile Lys Lys Asn Leu Ser Lys Tyr Ile Thr Phe 290 295 300 Glu Ile Cys Ala Gln Asn Leu Gly Thr Ala Leu Leu Leu Val Met Thr 305 310 315 320 Met Ile Ser Leu Ser Leu Thr Thr Ser Gly Ser Gln Thr Pro Val Ile 325 330 335 Ile Leu Gly Val Val Val Gly Met Ser Ile Ile Arg Cys Cys Ser Val 340 345 350 Ala Leu Ile Ala Lys Asp Phe Arg Phe Leu Tyr Phe Ile Val His Ser 355 360 365 Ala Leu Asn Val Leu Ile Leu Thr Pro Leu Lys Leu Tyr Ala Leu Leu 370 375 380 Thr Ile Arg Asp Ser Arg Trp Leu Ser Arg Glu Ser Ser 385 390 395 <210> 2 <211> 485 <212> PRT <213> Bradyrhizobium japonicum <400> 2 Met Asp Leu Leu Ala Thr Thr Ser Ala Ala Ala Val Ser Ser Tyr Ala 1 5 10 15 Leu Leu Ser Thr Ile Tyr Lys Ser Val Gln Ala Leu Tyr Ala Gln Pro 20 25 30 Ala Ile Asn Ser Ser Leu Asp Asn Leu Gly Gln Ala Glu Val Val Val 35 40 45 Pro Ala Val Asp Val Ile Val Pro Cys Phe Asn Glu Asn Pro Asn Thr 50 55 60 Leu Ala Glu Cys Leu Glu Ser Ile Ala Ser Gln Asp Tyr Ala Gly Lys 65 70 75 80 Met Gln Val Tyr Val Val Asp Asp Gly Ser Ala Asn Arg Asp Val Val 85 90 95 Ala Pro Val His Arg Ile Tyr Ala Ser Asp Pro Arg Phe Ser Phe Ile 100 105 110 Leu Leu Ala Asn Asn Val Gly Lys Arg Lys Ala Gln Ile Ala Ala Ile 115 120 125 Arg Ser Ser Ser Gly Asp Leu Val Leu Asn Val Asp Ser Asp Thr Ile 130 135 140 Leu Ala Ala Asp Val Val Thr Lys Leu Val Leu Lys Met His Asp Pro 145 150 155 160 Gly Ile Gly Ala Ala Met Gly Gln Leu Ile Ala Ser Asn Arg Asn Gln 165 170 175 Thr Trp Leu Thr Arg Leu Ile Asp Met Glu Tyr Trp Leu Ala Cys Asn 180 185 190 Glu Glu Arg Ala Ala Gln Ala Arg Phe Gly Ala Val Met Cys Cys Cys 195 200 205 Gly Pro Cys Ala Met Tyr Arg Arg Ser Ala Leu Ala Leu Leu Leu Asp 210 215 220 Gln Tyr Glu Ala Gln Phe Phe Arg Gly Lys Pro Ser Asp Phe Gly Glu 225 230 235 240 Asp Arg His Leu Thr Ile Leu Met Leu Lys Ala Gly Phe Arg Thr Glu 245 250 255 Tyr Val Pro Asp Ala Ile Ala Ala Thr Val Val Pro His Ser Leu Arg 260 265 270 Pro Tyr Leu Arg Gln Gln Leu Arg Trp Ala Arg Ser Thr Phe Arg Asp 275 280 285 Thr Phe Leu Ala Trp Arg Leu Leu Pro Glu Leu Asp Gly Tyr Leu Thr 290 295 300 Leu Asp Val Ile Gly Gln Asn Leu Gly Pro Leu Leu Leu Ala Ile Ser 305 310 315 320 Ser Leu Ala Ala Leu Ala Gln Leu Leu Ile Asp Gly Ser Ile Pro Trp 325 330 335 Trp Thr Gly Leu Thr Ile Ala Ala Met Thr Thr Val Arg Cys Cys Val 340 345 350 Ala Ala Leu Arg Ala Arg Glu Leu Arg Phe Ile Gly Phe Ser Leu His 355 360 365 Thr Pro Ile Asn Ile Cys Leu Leu Leu Pro Leu Lys Ala Tyr Ala Leu 370 375 380 Cys Thr Leu Ser Asn Ser Asp Trp Leu Ser Arg Lys Val Thr Asp Met 385 390 395 400 Pro Thr Glu Glu Gly Lys Gln Pro Val Ile Leu His Pro Asn Ala Gly 405 410 415 Arg Ser Pro Ala Gly Val Gly Gly Arg Leu Leu Leu Phe Val Arg Arg 420 425 430 Arg Tyr Arg Ser Leu His Arg Ala Trp Arg Arg Arg Arg Val Phe Pro 435 440 445 Val Ala Ile Val Arg Leu Ser Thr Asn Lys Trp Ser Ala Asp Asp Ser 450 455 460 Gly Arg Lys Pro Ser Val Ile Arg Ala Arg Val Gly Cys Arg Arg Pro 465 470 475 480 Val Ala Pro Arg His 485 <210> 3 <211> 433 <212> PRT <213> Rhizobium galegae <400> 3 Met Thr Leu Leu Glu Thr Ile Gly Ile Ala Ala Val Thr Leu His Ala 1 5 10 15 Leu Leu Ser Ala Ile Tyr Lys Ser Met Gln Ala Phe Tyr Ala Arg Lys 20 25 30 Ala Ser Gly Ser Gln Pro Arg Ser Lys Asp Ile Asp Pro Ala Ala Leu 35 40 45 Pro Ser Val Asp Ile Ile Val Pro Cys Phe Asn Glu Asp Pro Ala Ile 50 55 60 Leu Ser Ala Cys Leu Ser Ser Leu Ala Gly Gln Asp Tyr Gly Gly Lys 65 70 75 80 Leu Arg Ile Tyr Met Val Asp Asp Gly Ser Cys Asn Arg Glu Ala Ile 85 90 95 Leu Pro Val His Asp Phe Tyr Thr Ser Asp Pro Arg Phe Glu Phe Leu 100 105 110 Leu Leu Ser Lys Asn Val Gly Lys Arg Lys Ala Gln Ile Ala Ala Ile 115 120 125 Glu Arg Ser Cys Gly Asp Leu Ile Leu Asn Val Asp Ser Asp Thr Ser 130 135 140 Ile Ala Ser Asp Val Val Thr Leu Leu Val Glu Lys Met Arg Asp Ser 145 150 155 160 Asp Val Gly Ala Ala Met Gly Gln Leu Lys Ala Ser Asn Arg Asp Lys 165 170 175 Asn Leu Leu Thr Arg Leu Ile Asp Met Glu Tyr Trp Leu Ala Cys Asn 180 185 190 Asp Glu Arg Ala Ala Gln Ala Arg Phe Gly Ala Val Met Cys Cys Cys 195 200 205 Gly Pro Cys Ala Met Tyr Arg Arg Ser Ala Leu Leu Leu Leu Leu Asp 210 215 220 Gln Tyr Gln Thr Gln Leu Tyr Arg Gly Lys Pro Ser Asp Phe Gly Glu 225 230 235 240 Asp Arg His Leu Thr Ile Leu Met Leu Ser Ala Gly Phe Arg Thr Glu 245 250 255 Tyr Val Pro Glu Ala Ile Ala Lys Thr Val Val Pro Asp Arg Met Gly 260 265 270 Ser Tyr Leu Arg Gln Gln Leu Arg Trp Ala Arg Ser Thr Phe Arg Asp 275 280 285 Thr Leu Leu Ala Leu Pro Leu Leu Pro Ser His Asn Arg Phe Leu Thr 290 295 300 Leu Asp Ala Ile His Gln Asn Ile Gly Pro Leu Leu Leu Ala Val Ser 305 310 315 320 Ser Ala Thr Gly Ile Thr Gln Phe Ile Leu Thr Ala Thr Val Pro Gly 325 330 335 Trp Thr Ile Ile Ile Ile Ala Ser Met Thr Met Val Arg Cys Ser Val 340 345 350 Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Gln Ile Arg Phe Leu Ala Phe Ser Leu His 355 360 365 Thr Leu Ile Asn Leu Phe Met Leu Ile Pro Leu Lys Gly Phe Ala Leu 370 375 380 Leu Thr Leu Ser Asn Ser Asp Trp Leu Ser Arg Gly Ser Thr Thr Asp 385 390 395 400 Gly Pro Ala Ile Ala Glu Ser Asn Ala Ala Ser Asn Glu Ala Glu Ile 405 410 415 Val Ala Ser Ala Ser Pro Phe Gly Gly Gly Thr Ser Trp Arg Phe Arg 420 425 430 Arg <210> 4 <211> 424 <212> PRT <213> Rhizobium leguminosarum <400> 4 Met Thr Leu Leu Ala Thr Thr Ser Ile Ala Ala Ile Ser Leu Tyr Ala 1 5 10 15 Met Leu Ser Thr Val Tyr Lys Ser Ala Gln Val Phe His Ala Arg Arg 20 25 30 Thr Thr Ile Ser Thr Thr Pro Ala Lys Asp Ile Glu Thr Asn Pro Val 35 40 45 Pro Ser Val Asp Val Ile Val Pro Cys Phe Asn Glu Asp Pro Ile Val 50 55 60 Leu Ser Glu Cys Leu Ala Ser Leu Ala Glu Gln Asp Tyr Ala Gly Lys 65 70 75 80 Leu Arg Ile Tyr Val Val Asp Asp Gly Ser Lys Asn Arg Asp Ala Val 85 90 95 Val Ala Gln Arg Ala Ala Tyr Ala Asp Asp Glu Arg Phe Asn Phe Thr 100 105 110 Ile Leu Pro Lys Asn Val Gly Lys Arg Lys Ala Ile Ala Ala Ile Thr 115 120 125 Gln Ser Ser Gly Asp Leu Ile Leu Asn Val Asp Ser Asp Thr Thr Ile 130 135 140 Ala Pro Asp Val Val Ser Lys Leu Ala His Lys Met Arg Asp Pro Ala 145 150 155 160 Val Gly Ala Ala Met Gly Gln Met Lys Ala Ser Asn Gln Ala Asp Thr 165 170 175 Trp Leu Thr Arg Leu Ile Asp Met Glu Tyr Trp Leu Ala Cys Asn Glu 180 185 190 Glu Arg Ala Ala Gln Ala Arg Phe Gly Ala Val Met Cys Cys Cys Gly 195 200 205 Pro Cys Ala Met Tyr Arg Arg Ser Ala Met Leu Ser Leu Leu Asp Gln 210 215 220 Tyr Glu Thr Gln Leu Tyr Arg Gly Lys Pro Ser Asp Phe Gly Glu Asp 225 230 235 240 Arg His Leu Thr Ile Leu Met Leu Ser Ala Gly Phe Arg Thr Glu Tyr 245 250 255 Val Pro Ser Ala Ile Ala Ala Thr Val Val Pro Asp Thr Met Gly Val 260 265 270 Tyr Leu Arg Gln Gln Leu Arg Trp Ala Arg Ser Thr Phe Arg Asp Thr 275 280 285 Leu Leu Ala Leu Pro Val Leu Pro Gly Leu Asp Arg Tyr Leu Thr Leu 290 295 300 Asp Ala Ile Gly Gln Asn Val Gly Leu Leu Leu Leu Ala Leu Ser Val 305 310 315 320 Leu Thr Gly Ile Gly Gln Phe Ala Leu Thr Ala Thr Leu Pro Trp Trp 325 330 335 Thr Ile Leu Val Ile Gly Ser Met Thr Leu Val Arg Cys Ser Val Ala 340 345 350 Ala Tyr Arg Ala Arg Glu Leu Arg Phe Leu Gly Phe Ala Leu His Thr 355 360 365 Leu Val Asn Ile Phe Leu Leu Ile Pro Leu Lys Ala Tyr Ala Leu Cys 370 375 380 Thr Leu Ser Asn Ser Asp Trp Leu Ser Arg Gly Ser Val Ala Ile Ala 385 390 395 400 Pro Thr Val Gly Gln Gln Gly Ala Thr Lys Met Pro Gly Arg Ala Thr 405 410 415 Ser Glu Ile Ala Tyr Ser Gly Glu 420 <210> 5 <211> 426 <212> PRT <213> Rhizobium meliloti <400> 5 Met Tyr Leu Leu Asp Thr Thr Ser Thr Ala Ala Ile Ser Ile Tyr Ala 1 5 10 15 Leu Leu Leu Thr Ala Tyr Arg Ser Met Gln Val Leu Tyr Ala Arg Pro 20 25 30 Ile Asp Gly Pro Ala Val Ala Ala Glu Pro Val Glu Thr Arg Pro Leu 35 40 45 Pro Ala Val Asp Val Ile Val Pro Ser Phe Asn Glu Asp Pro Gly Ile 50 55 60 Leu Ser Ala Cys Leu Ala Ser Ile Ala Asp Gln Asp Tyr Pro Gly Glu 65 70 75 80 Leu Arg Val Tyr Val Val Asp Asp Gly Ser Arg Asn Arg Glu Ala Ile 85 90 95 Val Arg Val Arg Ala Phe Tyr Ser Arg Asp Pro Arg Phe Ser Phe Ile 100 105 110 Leu Leu Pro Glu Asn Val Gly Lys Arg Lys Ala Gln Ile Ala Ala Ile 115 120 125 Gly Gln Ser Ser Gly Asp Leu Val Leu Asn Val Asp Ser Asp Ser Thr 130 135 140 Ile Ala Phe Asp Val Val Ser Lys Leu Ala Ser Lys Met Arg Asp Pro 145 150 155 160 Glu Val Gly Ala Val Met Gly Gln Leu Thr Ala Ser Asn Ser Gly Asp 165 170 175 Thr Trp Leu Thr Lys Leu Ile Asp Met Glu Tyr Trp Leu Ala Cys Asn 180 185 190 Glu Glu Arg Ala Ala Gln Ser Arg Phe Gly Ala Val Met Cys Cys Cys 195 200 205 Gly Pro Cys Ala Met Tyr Arg Arg Ser Ala Leu Ala Ser Leu Leu Asp 210 215 220 Gln Tyr Glu Thr Gln Leu Phe Arg Gly Lys Pro Ser Asp Phe Gly Glu 225 230 235 240 Asp Arg His Leu Thr Ile Leu Met Leu Lys Ala Gly Phe Arg Thr Glu 245 250 255 Tyr Val Pro Asp Ala Ile Val Ala Thr Val Val Pro Asp Thr Leu Lys 260 265 270 Pro Tyr Leu Arg Gln Gln Leu Arg Trp Ala Arg Ser Thr Phe Arg Asp 275 280 285 Thr Phe Leu Ala Leu Pro Leu Leu Arg Gly Leu Ser Pro Phe Leu Ala 290 295 300 Phe Asp Ala Val Gly Gln Asn Ile Gly Gln Leu Leu Leu Ala Leu Ser 305 310 315 320 Val Val Thr Gly Leu Ala His Leu Ile Met Thr Ala Thr Val Pro Trp 325 330 335 Trp Thr Ile Leu Ile Ile Ala Cys Met Thr Ile Ile Arg Cys Ser Val 340 345 350 Val Ala Leu His Ala Arg Gln Leu Arg Phe Leu Gly Phe Val Leu His 355 360 365 Thr Pro Ile Asn Leu Phe Leu Ile Leu Pro Leu Lys Ala Tyr Ala Leu 370 375 380 Cys Thr Leu Ser Asn Ser Asp Trp Leu Ser Arg Tyr Ser Ala Pro Glu 385 390 395 400 Val Pro Val Ser Gly Gly Lys Gln Thr Pro Ile Gln Thr Ser Gly Arg 405 410 415 Val Thr Pro Asp Cys Thr Cys Ser Gly Glu 420 425 <210> 6 <211> 452 <212> PRT <213> Rhizobium tropici <400> 6 Met Asn Leu Leu Asp Ala Thr Ser Thr Ala Ala Ile Ser Leu Tyr Ala 1 5 10 15 Met Leu Ser Thr Ala Tyr Lys Ser Met Gln Val Val Tyr Ala Arg Pro 20 25 30 Ile Glu Glu Pro Ser Thr Ser Ala Glu Pro Ile Ala Ser Ala Gln Trp 35 40 45 Pro Ser Val Asp Val Ile Ile Pro Ser Phe Asn Glu Asp Pro Gly Thr 50 55 60 Leu Trp Asp Cys Leu Glu Ser Ile Ala His Glu Glu Tyr Ala Gly Asp 65 70 75 80 Leu Asn Val Tyr Val Val Asp Asp Gly Ser Ser Asn Arg Asp Ala Ile 85 90 95 Thr Pro Val His Thr Ala Phe Ala Arg Asp Pro Arg Phe Thr Phe Ile 100 105 110 Leu Leu Arg Lys Asn Val Gly Lys Arg Lys Ala Gln Ile Ala Ala Ile 115 120 125 Arg Arg Ser Ser Gly Asp Leu Val Leu Asn Val Asp Ser Asp Thr Ile 130 135 140 Leu Ala Pro Asp Val Val Val Lys Leu Ala Leu Lys Met Gln Asp Pro 145 150 155 160 Ala Ile Gly Ala Ala Met Gly Gln Leu Ala Ala Ser Asn Arg His Glu 165 170 175 Thr Trp Leu Thr Arg Leu Ile Asp Met Glu Tyr Trp Leu Ala Cys Asn 180 185 190 Glu Glu Arg Ala Ala Gln Ala Arg Phe Gly Ala Val Met Cys Cys Cys 195 200 205 Gly Pro Cys Ala Met Tyr Arg Arg Thr Ala Leu Thr Met Leu Leu Asp 210 215 220 Gln Tyr Glu Thr Gln Met Phe Arg Gly Lys Arg Ser Asp Phe Gly Glu 225 230 235 240 Asp Arg His Leu Thr Ile Leu Met Leu Lys Ala Gly Phe Arg Thr Glu 245 250 255 Tyr Val Pro Thr Ala Ile Ala Ala Thr Val Val Pro Asn Lys Leu Arg 260 265 270 Pro Tyr Leu Arg Gln Gln Leu Arg Trp Ala Arg Ser Thr Phe Arg Asp 275 280 285 Thr Leu Leu Ala Met Asn Leu Leu Pro Gly Leu Asp Arg Phe Leu Thr 290 295 300 Leu Asp Val Ile Gly Gln Asn Leu Gly Pro Leu Leu Leu Ala Leu Ser 305 310 315 320 Val Leu Thr Gly Leu Ala Gln Phe Ala Leu Thr Gly Thr Val Pro Trp 325 330 335 Trp Thr Cys Leu Met Ile Ala Ser Met Thr Met Ile Arg Cys Ser Val 340 345 350 Ala Ala Val Arg Ala Arg Gln Phe Arg Phe Ile Gly Phe Ser Leu His 355 360 365 Thr Phe Ile Asn Ile Phe Phe Leu Leu Pro Leu Lys Ala Tyr Ala Leu 370 375 380 Cys Thr Leu Ser Asn Ser Asp Trp Leu Ser Arg Gly Ser Ala Ala Lys 385 390 395 400 Ala Thr Gly Lys Gly Gly Lys Leu Asp Ala Ile Gln Asp Pro Val Ala 405 410 415 Ala Ser Ser Pro Arg Glu Ser Gln Glu Asn Glu Ala Pro Leu Arg Arg 420 425 430 His Asn Leu Ala Arg Asp Ala Thr Arg Ser Met Ala Tyr Asp Gly Ile 435 440 445 Cys Thr Asp Gln 450 <210> 7 <211> 428 <212> PRT <213> Rhizobium leguminosarum <400> 7 Met Thr Met Leu Asp Thr Thr Ser Thr Val Ala Val Ser Leu Tyr Ala 1 5 10 15 Leu Leu Ser Thr Ala Tyr Lys Ser Met Gln Ala Val Tyr Ser Leu Pro 20 25 30 Thr Asp Val Ser Leu Ala Ser His Gly Leu Gly Gly Phe Asp Glu Leu 35 40 45 Pro Ser Val Asp Val Ile Val Pro Ser Phe Asn Glu Asp Pro Arg Thr 50 55 60 Leu Ser Glu Cys Leu Ala Ser Ile Ala Gly Gln Glu Tyr Gly Gly Arg 65 70 75 80 Leu Gln Val Tyr Leu Val Asp Asp Gly Ser Glu Asn Arg Glu Ala Leu 85 90 95 Arg Leu Val His Glu Ala Phe Ala Arg Asp Pro Arg Phe Asn Ile Leu 100 105 110 Leu Leu Pro Gln Asn Val Gly Lys Arg Lys Ala Gln Asp Arg Cys Asp 115 120 125 Gln Arg Ser Ala Gly Asp Met Val Leu Asn Val Asp Ser Asp Thr Ile 130 135 140 Leu Ala Ser Asp Val Ile Arg Lys Leu Val Pro Lys Asn Ala Arg Val 145 150 155 160 Ala Val Gly Arg Met Gly Gln Leu Thr Gly Pro Gln Pro Lys Arg Gln 165 170 175 Leu Ala Asp Pro Phe Asp Asp Met Glu Tyr Trp Leu Ala Cys Asn Glu 180 185 190 Glu Arg Ser Gln Gln Ala Arg Phe Gly Cys Val Met Phe Cys Ser Gly 195 200 205 Ser Cys Val Met Tyr Arg Leu Val Ser Ala Ser Leu Leu Asp Gln Tyr 210 215 220 Asp Ala Gln Tyr Phe Arg Lys Gln Arg Phe Gly Glu Ile Asp Ile His 225 230 235 240 Leu Ser His Ala Glu Gly Ser Phe Arg Thr Glu Tyr Arg Pro Ser Ala 245 250 255 His Ala Ala Thr Val Val Pro Asn Lys Leu Gly Pro Tyr Leu Gly Gln 260 265 270 Gln Leu Arg Trp Ala Arg Ser Thr Phe Arg Thr Thr Leu Leu Gly Ala 275 280 285 Pro Leu Pro Asn Leu Asn Arg Phe Leu Met Leu Asp Val Val Gly Gln 290 295 300 Asn Leu Gly Pro Leu Leu Leu Asp His Ser Val Leu Thr Gly Leu Ala 305 310 315 320 Gln Leu Ala Leu Thr Gly Thr Ala Pro Trp Leu Ala Ala Leu Met Ile 325 330 335 Val Ala Met Thr Ile Asp Arg Cys Ser Val Val Ala Leu Arg Ala Arg 340 345 350 Gln Leu Arg Phe Leu Gly Phe Ser Leu His Thr Phe Ile Asn Ile Phe 355 360 365 Leu Leu Leu Pro Leu Lys Ala Tyr Ala Leu Cys Thr Leu Ser Asn Ile 370 375 380 Ala Trp Leu Ser Ser Leu Leu Cys Trp Gln Leu Glu Ser Thr Ser Thr 385 390 395 400 Ala Asp Ala Arg Thr Thr Glu Cys Ser Asp Met Arg Thr Ala Ser Lys 405 410 415 Leu Ser Pro Pro Pro Ser Cys Gln Ala Asn Asp Val 420 425 <210> 8 <211> 450 <212> PRT <213> Rhizobium sp. <400> 8 Met Asp Leu Leu Thr Thr Thr Ser Thr Val Ala Val Ala Cys Tyr Ala 1 5 10 15 Leu Leu Ser Thr Val Tyr Lys Gly Met Gln Ala Val Tyr Ser Leu Pro 20 25 30 Pro Thr Val Ala Pro Ala Ser Glu Asp Leu Val Gly Ser Asp Leu Trp 35 40 45 Pro Ser Val Asp Val Ile Ile Pro Cys Tyr Asn Glu Gly Pro Leu Thr 50 55 60 Leu Ser Ala Cys Leu Asp Ser Ile Ala Asn Gln Glu Tyr Ala Gly Lys 65 70 75 80 Leu Arg Val Tyr Val Val Asp Asp Gly Ser Gly Asn Arg Asp Ala Val 85 90 95 Ile Pro Ile His Asp Asn Tyr Ala Gly Asp Pro Arg Phe Asp Phe Ile 100 105 110 Leu Leu Pro Glu Asn Val Gly Lys Arg Lys Ala Gln Ile Ala Ala Ile 115 120 125 Arg Arg Ser Ser Gly Asp Leu Val Leu Asn Val Asp Ser Asp Thr Thr 130 135 140 Leu Ala Ser Asp Val Ile Arg Lys Leu Ala Arg Lys Met Gln Asp Pro 145 150 155 160 Ala Ile Gly Ala Ala Met Gly Gln Leu Thr Ala Ser Asn Arg Ser Asp 165 170 175 Thr Trp Leu Thr Arg Leu Ile Asp Met Glu Tyr Trp Leu Ala Cys Asn 180 185 190 Glu Glu Arg Ala Ala Gln Ala Arg Phe Gly Ala Val Met Cys Cys Cys 195 200 205 Gly Pro Cys Ala Met Tyr Arg Arg Ser Ser Leu Leu Ser Leu Leu Asp 210 215 220 Gln Tyr Glu Thr Gln Met Phe Arg Gly Lys Pro Ser Asp Phe Gly Glu 225 230 235 240 Asp Arg His Leu Thr Ile Leu Met Leu Glu Ala Gly Phe Arg Thr Glu 245 250 255 Tyr Val Pro Asp Ala Ile Ala Val Thr Val Val Pro Asp Arg Leu Gly 260 265 270 Pro Tyr Leu Arg Gln Gln Leu Arg Trp Ala Arg Ser Thr Phe Arg Asp 275 280 285 Thr Leu Leu Ala Leu Arg Leu Leu Pro Gly Leu Asp Arg Tyr Leu Thr 290 295 300 Leu Asp Val Val Gly Gln Asn Leu Gly Pro Leu Leu Leu Ala Leu Ser 305 310 315 320 Val Ile Ala Gly Ile Ala Gln Phe Ala Leu Thr Ala Thr Leu Pro Trp 325 330 335 Pro Thr Ile Leu Val Ile Ala Ala Met Thr Ile Ile Arg Cys Thr Val 340 345 350 Thr Ala Cys Arg Ala Arg Gln Ala Arg Phe Ile Gly Phe Ser Leu His 355 360 365 Thr Phe Ile Asn Ile Phe Leu Leu Leu Pro Leu Lys Ala Tyr Ala Leu 370 375 380 Cys Thr Leu Ser Asn Ser Asp Trp Leu Ser Arg Lys Thr Ala Thr Leu 385 390 395 400 Pro Asn Ala Asp Lys Lys Gln Ile Ile Val Ala Asn Pro Ile Ala Gly 405 410 415 Val Gly Thr Gly Ser Ser Gly Ser Ala Glu Ala Ile Arg Arg Thr Asp 420 425 430 Leu Pro Arg Asp Ser Ser Lys Leu Val Asn Ala Asp Ser Val Cys Ser 435 440 445 Ala Glu 450 <210> 9 <211> 424 <212> PRT <213> Rhizobium loti <400> 9 Met Asn Leu Phe Ala Ser Ala Ser Thr Val Ala Ile Cys Ser Tyr Ala 1 5 10 15 Leu Leu Ser Thr Val Tyr Lys Thr Ala Gln Val Phe Tyr Thr Leu Pro 20 25 30 Thr Asn Val Pro Pro Thr Ser Gly Asp Pro Pro Ser Gly Glu Pro Trp 35 40 45 Pro Ser Val Asp Val Ile Ile Pro Cys Tyr Asn Glu Ala Pro Arg Thr 50 55 60 Leu Ser Asp Cys Leu Ala Ser Ile Ala Ser Gln Asp Tyr Ala Gly Lys 65 70 75 80 Leu Gln Val Tyr Val Val Asp Asp Gly Ser Ala Asn Arg Asp Ala Leu 85 90 95 Val Gly Val His Glu Glu Tyr Ala Gly Asp Pro Arg Phe Asn Phe Val 100 105 110 Ala Leu Pro Lys Asn Val Gly Lys Arg Lys Ala Gln Ile Ala Ala Ile 115 120 125 Arg Arg Ser Cys Gly Asp Leu Val Leu Asn Val Asp Ser Asp Thr Ile 130 135 140 Leu Ala Pro Asp Val Ile Thr Arg Leu Ala Leu Lys Met Gln Asp Gln 145 150 155 160 Ala Val Gly Ala Ala Met Gly Gln Leu Ala Ala Ser Asn Arg Ser Glu 165 170 175 Thr Trp Leu Thr Arg Leu Ile Asp Met Glu Tyr Trp Leu Ala Cys Asn 180 185 190 Glu Glu Arg Ala Ala Gln Ala Arg Phe Gly Ala Val Met Cys Cys Cys 195 200 205 Gly Pro Cys Ala Met Tyr Arg Arg Ser Ala Leu Val Ser Leu Leu Asp 210 215 220 Gln Tyr Glu Thr Gln Arg Phe Arg Gly Lys Pro Ser Asp Phe Gly Glu 225 230 235 240 Asp Arg His Leu Thr Ile Leu Met Leu Lys Ala Gly Phe Arg Thr Glu 245 250 255 Tyr Val Pro Glu Ala Val Ala Ala Thr Val Val Pro Asn Ser Met Gly 260 265 270 Pro Tyr Leu Arg Gln Gln Leu Arg Trp Ala Arg Ser Thr Phe Arg Asp 275 280 285 Thr Leu Leu Ala Phe Gln Leu Leu Arg Gly Leu Asn Ile Tyr Leu Thr 290 295 300 Leu Asp Val Ile Gly Gln Asn Ile Gly Pro Leu Leu Leu Ser Leu Ser 305 310 315 320 Ile Leu Ala Gly Leu Ala Gln Phe Val Thr Thr Gly Thr Val Pro Trp 325 330 335 Thr Ala Cys Leu Met Ile Ala Ala Met Thr Ile Val Arg Cys Ser Val 340 345 350 Ala Ala Phe Arg Ala Arg Gln Leu Arg Phe Leu Gly Phe Ser Leu His 355 360 365 Thr Leu Ile Asn Ile Phe Leu Leu Leu Pro Leu Lys Ala Tyr Ala Leu 370 375 380 Cys Thr Leu Ser Asn Ser Asp Trp Leu Ser Arg Ser Ser Ala Ala Asn 385 390 395 400 Val Gln Asp Thr Gly Asp Ala Leu Pro Lys Pro Asn Leu Val Gly Ser 405 410 415 Asp Ala Ala Tyr Ser Glu Gln Gln 420 <210> 10 <211> 3971 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> T-DNA of pTJN6 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(25) <223> Left T-DNA border (complement) <220> <221> terminator <222> (56)..(316) <223> 3' nos: 3'UTR from nopaline synthase gene of T-DNA pTiT37 (complement) <220> <221> misc_feature <222> (336)..(887) <223> bar: coding sequence of phosphinotricin acetyl transferease of Streptomyces hygroscopicus (complement) <220> <221> promoter <222> (888)..(1720) <223> P35S3: Promoter region from CaMV35S gene (complement) <220> <221> promoter <222> (1769)..(2303) <223> P35S2: Promoter region from CaMV35S gene <220> <221> 5'UTR <222> (2304)..(2368) <223> 5'cab22L: untranslated leader sequence of cab22L gene from Petunia <220> <221> misc_feature <222> (2369)..(2474) <223> XylT: sequence coding for 35 N-terminal amino acids of beta-1,2- xylosyltransferase from Arabidopsis thaliana <220> <221> misc_feature <222> (2475)..(3664) <223> NodC coding region from A.caulinodans <220> <221> terminator <222> (3666)..(3914) <223> 3'35S: 3' untranslated region from the CaMV35S gene <220> <221> misc_feature <222> (3947)..(3971) <223> RB: right T-DNA border (synthetic) (complement) <400> 10 cggcaggata tattcaattg taaatggctc catggcgatc gctctagagg atctgcgatc 60 tagtaacata gatgacaccg cgcgcgataa tttatcctag tttgcgcgct atattttgtt 120 ttctatcgcg tattaaatgt ataattgcgg gactctaatc ataaaaaccc atctcataaa 180 taacgtcatg cattacatgt taattattac atgcttaacg taattcaaca gaaattatat 240 gataatcatc gcaagaccgg caacaggatt caatcttaag aaactttatt gccaaatgtt 300 tgaacgatct gcttcggatc ctagaacgcg tgatctcaga tctcggtgac gggcaggacc 360 ggacggggcg gtaccggcag gctgaagtcc agctgccaga aacccacgtc atgccagttc 420 ccgtgcttga agccggccgc ccgcagcatg ccgcgggggg catatccgag cgcctcgtgc 480 atgcgcacgc tcgggtcgtt gggcagcccg atgacagcga ccacgctctt gaagccctgt 540 gcctccaggg acttcagcag gtgggtgtag agcgtggagc ccagtcccgt ccgctggtgg 600 cggggggaga cgtacacggt cgactcggcc gtccagtcgt aggcgttgcg tgccttccag 660 gggcccgcgt aggcgatgcc ggcgacctcg ccgtccacct cggcgacgag ccagggatag 720 cgctcccgca gacggacgag gtcgtccgtc cactcctgcg gttcctgcgg ctcggtacgg 780 aagttgaccg tgcttgtctc gatgtagtgg ttgacgatgg tgcagaccgc cggcatgtcc 840 gcctcggtgg cacggcggat gtcggccggg cgtcgttctg ggtccatggt tatagagaga 900 gagatagatt tatagagaga gactggtgat ttcagcgtgt cctctccaaa tgaaatgaac 960 ttccttatat agaggaaggg tcttgcgaag gatagtggga ttgtgcgtca tcccttacgt 1020 cagtggagat gtcacatcaa tccacttgct ttgaagacgt ggttggaacg tcttcttttt 1080 ccacgatgct cctcgtgggt gggggtccat ctttgggacc actgtcggca gaggcatctt 1140 gaatgatagc ctttccttta tcgcaatgat ggcatttgta ggagccacct tccttttcta 1200 ctgtcctttc gatgaagtga cagatagctg ggcaatggaa tccgaggagg tttcccgaaa 1260 ttatcctttg ttgaaaagtc tcaatagccc tttggtcttc tgagactgta tctttgacat 1320 ttttggagta gaccagagtg tcgtgctcca ccatgttgac gaagattttc ttcttgtcat 1380 tgagtcgtaa aagactctgt atgaactgtt cgccagtctt cacggcgagt tctgttagat 1440 cctcgatttg aatcttagac tccatgcatg gccttagatt cagtaggaac taccttttta 1500 gagactccaa tctctattac ttgccttggt ttatgaagca agccttgaat cgtccatact 1560 ggaatagtac ttctgatctt gagaaatatg tctttctctg tgttcttgat gcaattagtc 1620 ctgaatcttt tgactgcatc tttaaccttc ttgggaaggt atttgatctc ctggagattg 1680 ttactcgggt agatcgtctt gatgagacct gctgcgtagg aacgcggccg ctgtacaggg 1740 cccgggcata tggcgcgcca tatgcaccat acatggagtc aaaaattcag atcgaggatc 1800 taacagaact cgccgtgaag actggcgaac agttcataca gagtctttta cgactcaatg 1860 acaagaagaa aatcttcgtc aacatggtgg agcacgacac tctcgtctac tccaagaata 1920 tcaaagatac agtctcagaa gaccaaaggg ctattgagac ttttcaacaa agggtaatat 1980 cgggaaacct cctcggattc cattgcccag ctatctgtca cttcatcaaa aggacagtag 2040 aaaaggaagg tggcacctac aaatgccatc attgcgataa aggaaaggct atcgttcaag 2100 atgcccctgc cgacagtggt cccaaagatg gacccccacc cacgaggagc atcgtggaaa 2160 aagaagacgt tccaaccacg tcttcaaagc aagtggattg atgtgatatc tccactgacg 2220 taagggatga cgcacaatcc cactatcctt cgcaagaccc ttcctctata taaggaagtt 2280 catttcattt ggagaggact cgagctcatt tctctattac ttcagccata acaaaagaac 2340 tcttttctct tcttattaaa ccaaaaccat gagtaaacgg aatccgaaga ttctgaagat 2400 ttttctgtat atgttacttc tcaactctct ctttctcatc atctacttcg tttttcactc 2460 atcgtcgttt tcaagtgtcg tagatgtgat cggtttgctt gcgactgcag cctacgtgac 2520 gttggcgagc gcatacaagg tggtccagtt cattaacgtg tcgagcgtaa cggatgtcgc 2580 tggtctcgaa agtgatgctt tgccgctcac tccaagggtt gacgttatcg tgccgacatt 2640 caatgagaac tccagcacat tgctcgagtg cgtcgcttct atatgcgcac aagactaccg 2700 cggaccaata acgattgtcg tggtagacga tgggtcgacc aacaaaacat catttcacgc 2760 agtatgcgac aagtacgcga gcgacgaaag gttcatattt gtcgaacttg atcaaaacaa 2820 ggggaagcgc gccgcgcaaa tggaggccat caggagaaca gacggagacc tgatactaaa 2880 cgtagactcg gacacggtta tagataagga tgttgttaca aagcttgcgt cgtccatgag 2940 agccccgaat gtcggtggtg tcatggggca gctcgttgca aagaatcgag aaagatcttg 3000 gcttaccaga ttaatcgata tggagtactg gcttgcgtgt aacgaggagc gcattgcgca 3060 gtcgaggttt ggctccgtga tgtgttgttg tgggccgtgc gccatgtata gaagatctgc 3120 aattacgcca ctattggcag aatatgagca ccagacattc ctagggcgtc cgagcaactt 3180 tggtgaggat cgccatctca caatcctgat gctgaaggcg ggatttcgga ccgggtacgt 3240 cccaggtgcc gtagcgagga cgttggttcc ggatgggctg gcgccgtacc tgcgccagca 3300 actccgctgg gcccgcagca cttatcgcga caccgccctc gccttacgta taaagaaaaa 3360 tctaagcaaa tatatcacct ttgagatatg cgcacagaat ttgggtacgg ctctcttact 3420 tgtgatgacc atgatttcgc tttcgctgac tacatcaggg tcgcaaacgc ccgttatcat 3480 tctgggtgtc gttgtgggga tgtctataat aagatgttgt tctgtcgccc ttatagcgaa 3540 agattttcgg tttctatact tcatcgttca ctcagcgttg aatgttctaa ttttaacgcc 3600 gttaaaactc tatgccctgt taaccattcg ggatagtcgg tggctatcac gcgagagttc 3660 ctaagctagc aagcttggac acgctgaaat caccagtctc tctctacaaa tctatctctc 3720 tctattttct ccataataat gtgtgagtag ttcccagata agggaattag ggttcctata 3780 gggtttcgct catgtgttga gcatataaga aacccttagt atgtatttgt atttgtaaaa 3840 tacttctatc aataaaattt ctaattccta aaaccaaaat ccagtactaa aatccagatc 3900 atgcatggta cagcggccaa ttgcctgcag gtcgacggcc gagtactggc aggatatata 3960 ccgttgtaat t 3971 <210> 11 <211> 431 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> NODC protein linked to XylT Golgi signal anchor sequence <220> <221> SIGNAL <222> (1)..(35) <223> 35 N-terminal amino acids of beta-1,2- xylosyltransferase from Arabidopsis thaliana <220> <221> MISC_FEATURE <222> (36)..(431) <223> NODC from A.caulinodans <400> 11 Met Ser Lys Arg Asn Pro Lys Ile Leu Lys Ile Phe Leu Tyr Met Leu 1 5 10 15 Leu Leu Asn Ser Leu Phe Leu Ile Ile Tyr Phe Val Phe His Ser Ser 20 25 30 Ser Phe Ser Ser Val Val Asp Val Ile Gly Leu Leu Ala Thr Ala Ala 35 40 45 Tyr Val Thr Leu Ala Ser Ala Tyr Lys Val Val Gln Phe Ile Asn Val 50 55 60 Ser Ser Val Thr Asp Val Ala Gly Leu Glu Ser Asp Ala Leu Pro Leu 65 70 75 80 Thr Pro Arg Val Asp Val Ile Val Pro Thr Phe Asn Glu Asn Ser Ser 85 90 95 Thr Leu Leu Glu Cys Val Ala Ser Ile Cys Ala Gln Asp Tyr Arg Gly 100 105 110 Pro Ile Thr Ile Val Val Val Asp Asp Gly Ser Thr Asn Lys Thr Ser 115 120 125 Phe His Ala Val Cys Asp Lys Tyr Ala Ser Asp Glu Arg Phe Ile Phe 130 135 140 Val Glu Leu Asp Gln Asn Lys Gly Lys Arg Ala Ala Gln Met Glu Ala 145 150 155 160 Ile Arg Arg Thr Asp Gly Asp Leu Ile Leu Asn Val Asp Ser Asp Thr 165 170 175 Val Ile Asp Lys Asp Val Val Thr Lys Leu Ala Ser Ser Met Arg Ala 180 185 190 Pro Asn Val Gly Gly Val Met Gly Gln Leu Val Ala Lys Asn Arg Glu 195 200 205 Arg Ser Trp Leu Thr Arg Leu Ile Asp Met Glu Tyr Trp Leu Ala Cys 210 215 220 Asn Glu Glu Arg Ile Ala Gln Ser Arg Phe Gly Ser Val Met Cys Cys 225 230 235 240 Cys Gly Pro Cys Ala Met Tyr Arg Arg Ser Ala Ile Thr Pro Leu Leu 245 250 255 Ala Glu Tyr Glu His Gln Thr Phe Leu Gly Arg Pro Ser Asn Phe Gly 260 265 270 Glu Asp Arg His Leu Thr Ile Leu Met Leu Lys Ala Gly Phe Arg Thr 275 280 285 Gly Tyr Val Pro Gly Ala Val Ala Arg Thr Leu Val Pro Asp Gly Leu 290 295 300 Ala Pro Tyr Leu Arg Gln Gln Leu Arg Trp Ala Arg Ser Thr Tyr Arg 305 310 315 320 Asp Thr Ala Leu Ala Leu Arg Ile Lys Lys Asn Leu Ser Lys Tyr Ile 325 330 335 Thr Phe Glu Ile Cys Ala Gln Asn Leu Gly Thr Ala Leu Leu Leu Val 340 345 350 Met Thr Met Ile Ser Leu Ser Leu Thr Thr Ser Gly Ser Gln Thr Pro 355 360 365 Val Ile Ile Leu Gly Val Val Val Gly Met Ser Ile Ile Arg Cys Cys 370 375 380 Ser Val Ala Leu Ile Ala Lys Asp Phe Arg Phe Leu Tyr Phe Ile Val 385 390 395 400 His Ser Ala Leu Asn Val Leu Ile Leu Thr Pro Leu Lys Leu Tyr Ala 405 410 415 Leu Leu Thr Ile Arg Asp Ser Arg Trp Leu Ser Arg Glu Ser Ser 420 425 430 <210> 12 <211> 8491 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TDNA comprising nucleic acids encoding the F286 promoter, a Golgi retention peptide and a NODC protein <220> <221> misc_feature <222> (1)..(25) <223> right border repeat from the T-DNA of Agrobacterium tumefaciens (Zambryski, 1988) <220> <221> promoter <222> (75)..(1484) <223> sequence including the promoter region of the chitinase F286 gene of Gossypium hirsutum (cotton) (Haigler et al., 2004) <220> <221> sig_peptide <222> (1485)..(1589) <220> <221> gene <222> (1590)..(2778) <220> <221> 3'UTR <222> (2781)..(3013) <223> sequence including the 3?untranslated region of the 35S transcript of the Cauliflower Mosaic Virus (Sanfa?n et al., 1991) <220> <221> promoter <222> (3036)..(4451) <223> sequence including the promoter region of the chitinase F286 gene of Gossypium hirsutum (cotton) (Haigler et al., 2004) <220> <221> gene <222> (4452)..(6281) <223> coding region of the glutamine:fructose-6-phosphate amidotransferase gene of Escherichia coli (Frohberg and Essigmann, 2006) <220> <221> 3'UTR <222> (6282)..(6555) <223> sequence including the 3' untranslated region of the nopaline synthase gene from the T-DNA of pTiT37 (Depicker et al., 1982) <220> <221> misc_feature <222> (6598)..(6631) <223> lox: sequence including the 34bp recognition sequence for the Cre recombinase of bacteriophage P1 (Hoess and Abremski, 1985) <220> <221> promoter <222> (6632)..(7468) <223> P35S3: sequence including the promoter region of the Cauliflower Mosaic Virus 35S transcript (Odell et al., 1985) <220> <221> gene <222> (7469)..(8020) <223> bar: the coding sequence of the phosphinothricin acetyltransferase gene of Streptomyces hygroscopicus (Thompson et al., 1987). <220> <221> 3'UTR <222> (8021)..(8304) <223> 3?os: sequence including the 3' untranslated region of the nopaline synthase gene from the T-DNA of pTiT37 (Depicker et al., 1982) <220> <221> misc_feature <222> (8305)..(8338) <223> lox: sequence including the 34bp recognition sequence for the Cre recombinase of bacteriophage P1 (Hoess and Abremski, 1985) <220> <221> misc_feature <222> (8467)..(8491) <223> left border repeat from the T-DNA of Agrobacterium tumefaciens (Zambryski, 1988) <400> 12 aattacaacg gtatatatcc tgccagtact gggccccctc gagggcgatc gctacgtacc 60 tgcagggcgg ccgccaacct ctcgagctgc catattgggt ttttcactac ccacctcttc 120 attaaatgta tcttcaacct ctcaactcct ttcaccacca gacgaatctt ctttagcaaa 180 atcaaaatga ccttatgaaa atttagcacg tccacctcca gattcaaagg ctgtgaatcc 240 ccaacttcgg aaattgttca tctccacatt caagaataat gagttcctca atttgtttta 300 actgattagc cgatattaag cgagttagac tccatggaaa taaaatcacc ctaataaata 360 gcaacgcttt tgaacgtctc taggttccaa gcgtgctaag gagcgccagt aacttcaatc 420 caagttgtgc gaaaacgtat gaaatggaac tgagaccagc gttcaacatc gatgaaaatt 480 tgttttaaca atgagaactg caaatcctcc atagtcttct aacatttcaa cattcgaaat 540 ctcgaaaaga aattggcttg atatgattta tttagggtgt taattttatg tattataata 600 atgcacaaat tgatatttta tgcatcacat ttaatatttt taaagtatat aatatcaaat 660 cattttatga aaataaaaat accaaataat acataaattg atagttcaag tatttcatta 720 aaaattttca aaatataaat atcatattga aacattttat aaaagaatag ataccaaata 780 tgacatcatc ccctgttgag agtaaccaaa cactgttttc atccagccca tgagaagtat 840 ttggcccaaa agcaaaagtt tcagtacaat gaattatgaa tcccaaaaaa accccaagtg 900 gtccaggtcc aagccagtct agggctgagg aaagaaatgg aaaaattgaa aagtaattcc 960 agggtctgat tcaattttat taaatttagt ttgattttgg tttcggttca taaatttaaa 1020 aataatttta aaatgttata taaaactgtt ttttaaaaat aaattaatca ataatctaaa 1080 acgataaaaa tggcgatttg aattaagctc atattttgaa aaaaaaataa aaattatctc 1140 atccagaact gattaaaacc gaaccgatga atcctagaag ccaagccaag tgtgcagagt 1200 aagaatagaa catcaacatt ttgctttaag cttttcgttg cttgcactct aagaagcata 1260 aaacgcaagc aaaacttgac actagtgtga gtgtgagtgc ccatcattca tcaaccctga 1320 aaatcgccct tcccctaatc agttctaacc tcactttcta acactttcac tgcagcactc 1380 aaaaacattc gccgaatctt tactataaac tcccagtgtt ggtttctcca ctccaaaccc 1440 aaaccacgac caccacattt tgcttcgtat ctttgatatc tatcatgagt aaacggaatc 1500 cgaagattct gaagattttt ctgtatatgt tacttctcaa ctctctcttt ctcatcatct 1560 acttcgtttt tcactcatcg tcgttttcaa gtgtcgtaga tgtgatcggt ttgcttgcga 1620 ctgcagccta cgtgacgttg gcgagcgcat acaaggtggt ccagttcatt aacgtgtcga 1680 gcgtaacgga tgtcgctggt ctcgaaagtg atgctttgcc gctcactcca agggttgacg 1740 ttatcgtgcc gacattcaat gagaactcca gcacattgct cgagtgcgtc gcttctatat 1800 gcgcacaaga ctaccgcgga ccaataacga ttgtcgtggt agacgatggg tcgaccaaca 1860 aaacatcatt tcacgcagta tgcgacaagt acgcgagcga cgaaaggttc atatttgtcg 1920 aacttgatca aaacaagggg aagcgcgccg cgcaaatgga ggccatcagg agaacagacg 1980 gagacctgat actaaacgta gactcggaca cggttataga taaggatgtt gttacaaagc 2040 ttgcgtcgtc catgagagcc ccgaatgtcg gtggtgtcat ggggcagctc gttgcaaaga 2100 atcgagaaag atcttggctt accagattaa tcgatatgga gtactggctt gcgtgtaacg 2160 aggagcgcat tgcgcagtcg aggtttggct ccgtgatgtg ttgttgtggg ccgtgcgcca 2220 tgtatagaag atctgcaatt acgccactat tggcagaata tgagcaccag acattcctag 2280 ggcgtccgag caactttggt gaggatcgcc atctcacaat cctgatgctg aaggcgggat 2340 ttcggaccgg gtacgtccca ggtgccgtag cgaggacgtt ggttccggat gggctggcgc 2400 cgtacctgcg ccagcaactc cgctgggccc gcagcactta tcgcgacacc gccctcgcct 2460 tacgtataaa gaaaaatcta agcaaatata tcacctttga gatatgcgca cagaatttgg 2520 gtacggctct cttacttgtg atgaccatga tttcgctttc gctgactaca tcagggtcgc 2580 aaacgcccgt tatcattctg ggtgtcgttg tggggatgtc tataataaga tgttgttctg 2640 tcgcccttat agcgaaagat tttcggtttc tatacttcat cgttcactca gcgttgaatg 2700 ttctaatttt aacgccgtta aaactctatg ccctgttaac cattcgggat agtcggtggc 2760 tatcacgcga gagttcctaa gctagcaagc ttggacacgc tgaaatcacc agtctctctc 2820 tacaaatcta tctctctcta ttttctccat aataatgtgt gagtagttcc cagataaggg 2880 aattagggtt cctatagggt ttcgctcatg tgttgagcat ataagaaacc cttagtatgt 2940 atttgtattt gtaaaatact tctatcaata aaatttctaa ttcctaaaac caaaatccag 3000 tactaaaatc cagacgcgtt taattaagcg gccgccaacc tctcgagctg ccatattggg 3060 tttttcacta cccacctctt cattaaatgt atcttcaacc tctcaactcc tttcaccacc 3120 agacgaatct tctttagcaa aatcaaaatg accttatgaa aatttagcac gtccacctcc 3180 agattcaaag gctgtgaatc cccaacttcg gaaattgttc atctccacat tcaagaataa 3240 tgagttcctc aatttgtttt aactgattag ccgatattaa gcgagttaga ctccatggaa 3300 ataaaatcac cctaataaat agcaacgctt ttgaacgtct ctaggttcca agcgtgctaa 3360 ggagcgccag taacttcaat ccaagttgtg cgaaaacgta tgaaatggaa ctgagaccag 3420 cgttcaacat cgatgaaaat ttgttttaac aatgagaact gcaaatcctc catagtcttc 3480 taacatttca acattcgaaa tctcgaaaag aaattggctt gatatgattt atttagggtg 3540 ttaattttat gtattataat aatgcacaaa ttgatatttt atgcatcaca tttaatattt 3600 ttaaagtata taatatcaaa tcattttatg aaaataaaaa taccaaataa tacataaatt 3660 gatagttcaa gtatttcatt aaaaattttc aaaatataaa tatcatattg aaacatttta 3720 taaaagaata gataccaaat atgacatcat cccctgttga gagtaaccaa acactgtttt 3780 catccagccc atgagaagta tttggcccaa aagcaaaagt ttcagtacaa tgaattatga 3840 atcccaaaaa aaccccaagt ggtccaggtc caagccagtc tagggctgag gaaagaaatg 3900 gaaaaattga aaagtaattc cagggtctga ttcaatttta ttaaatttag tttgattttg 3960 gtttcggttc ataaatttaa aaataatttt aaaatgttat ataaaactgt tttttaaaaa 4020 taaattaatc aataatctaa aacgataaaa atggcgattt gaattaagct catattttga 4080 aaaaaaaata aaaattatct catccagaac tgattaaaac cgaaccgatg aatcctagaa 4140 gccaagccaa gtgtgcagag taagaataga acatcaacat tttgctttaa gcttttcgtt 4200 gcttgcactc taagaagcat aaaacgcaag caaaacttga cactagtgtg agtgtgagtg 4260 cccatcattc atcaaccctg aaaatcgccc ttcccctaat cagttctaac ctcactttct 4320 aacactttca ctgcagcact caaaaacatt cgccgaatct ttactataaa ctcccagtgt 4380 tggtttctcc actccaaacc caaaccacga ccaccacatt ttgcttcgta tctttgatat 4440 ctaggtctcc catgtgcgga attgttggtg ctatcgccca aagagacgtt gctgagattt 4500 tgttagaggg tctgcgaagg ctagagtata gaggatatga ctccgctggt ctggctgtcg 4560 ttgatgctga gggtcatatg acaaggctaa gaaggttagg aaaggttcag atgcttgctc 4620 aggcagctga ggaacatcca ttgcatggag gtactggtat tgcacatacc aggtgggcta 4680 ctcatgggga gccatcagaa gttaatgctc atccacatgt gagtgagcat atcgttgtag 4740 ttcacaatgg gataattgaa aaccacgaac cattgaggga agagttaaag gcaagaggat 4800 atacttttgt gagtgagact gacactgagg ttattgcaca tttagtgaac tgggaactca 4860 aacagggggg cacattgcgt gaggctgtgt taagagctat tcctcaactt agaggtgcat 4920 acggtactgt tattatggat tcaagacacc cagatactct ccttgcagct agatcaggta 4980 gtcccttggt cataggactt ggaatgggtg aaaattttat cgctagcgac caattggcct 5040 tattgccagt tacaagacga tttattttcc ttgaagaggg cgatattgct gagattacta 5100 gaaggtctgt gaacatcttt gataagactg gcgctgaggt taaacgtcag gatatcgagt 5160 ctaaccttca atacgatgct ggtgataaag gaatttacag gcattatatg caaaaggaaa 5220 tttatgaaca accaaatgct atcaaaaaca cacttactgg ccgtatttct catggacagg 5280 tcgatttaag cgagcttggt cctaatgcag acgaactgct atcaaaagtt gagcacatac 5340 agatactggc atgcggaact agttataatt caggaatggt gtctagatac tggttcgaaa 5400 gcttggcagg tataccttgt gatgtagaga tcgcttctga gtttaggtat agaaagtctg 5460 ctgtgcgtag aaattcatta atgattacat tatctcaatc cggagaaaca gcagatacac 5520 tggctggatt gaggctttct aaggaactcg gatatctggg ttcacttgct atttgtaatg 5580 taccaggttc ctcattggtt cgtgaatcag atctagcact tatgacaaat gcaggaactg 5640 aaataggtgt ggcaagtacc aaggctttca caacccaact gaccgtactt ttaatgttgg 5700 tagcaaaact cagtcgatta aaggggctag atgcatctat cgaacatgat attgttcacg 5760 ggcttcaagc tctcccttca agaattgaac aaatgctttc acaagataag agaatagagg 5820 cattggctga agatttttcc gacaaacatc acgcattgtt tcttggacgt ggcgatcaat 5880 atccaattgc attggaagga gctttgaagt tgaaagaaat aagttacatt cacgcagaag 5940 catatgcagc tggagaactc aagcatggtc ctttggcact catcgacgct gacatgcccg 6000 tgatcgtagt ggctcctaat aacgaactgc tcgaaaagct taaatcaaat atcgaagagg 6060 ttcgagctag aggaggtcag ctttacgttt tcgctgaaca agatgctgga ttcgtgtcaa 6120 gcgataatat gcatataatt gaaatgcctc acgttgaaga agtgattgca cctatatttt 6180 atacagtccc attgcaactt ctagcttacc atgttgcact tattaaagga actgatgttg 6240 atcagcctag aaacctagca aaatctgtaa cagtcgaata aacgcgtggc gcgccgaagc 6300 agatcgttca aacatttggc aataaagttt cttaagattg aatcctgttg ccggtcttgc 6360 gatgattatc atataatttc tgttgaatta cgttaagcat gtaataatta acatgtaatg 6420 catgacgtta tttatgagat gggtttttat gattagagtc ccgcaattat acatttaata 6480 cgcgatagaa aacaaaatat agcgcgcaaa ctaggataaa ttatcgcgcg cggtgtcatc 6540 tatgttacta gatcggaatt cgatatcatt accctgttat ccctaaagct tattaatata 6600 acttcgtata gcatacatta tacgaagtta tgtttcctac gcagcaggtc tcatcaagac 6660 gatctacccg agtaacaatc tccaggagat caaatacctt cccaagaagg ttaaagatgc 6720 agtcaaaaga ttcaggacta attgcatcaa gaacacagag aaagacatat ttctcaagat 6780 cagaagtact attccagtat ggacgattca aggcttgctt cataaaccaa ggcaagtaat 6840 agagattgga gtctctaaaa aggtagttcc tactgaatct aaggccatgc atggagtcta 6900 agattcaaat cgaggatcta acagaactcg ccgtgaagac tggcgaacag ttcatacaga 6960 gtcttttacg actcaatgac aagaagaaaa tcttcgtcaa catggtggag cacgacactc 7020 tggtctactc caaaaatgtc aaagatacag tctcagaaga ccaaagggct attgagactt 7080 ttcaacaaag gataatttcg ggaaacctcc tcggattcca ttgcccagct atctgtcact 7140 tcatcgaaag gacagtagaa aaggaaggtg gctcctacaa atgccatcat tgcgataaag 7200 gaaaggctat cattcaagat gcctctgccg acagtggtcc caaagatgga cccccaccca 7260 cgaggagcat cgtggaaaaa gaagacgttc caaccacgtc ttcaaagcaa gtggattgat 7320 gtgacatctc cactgacgta agggatgacg cacaatccca ctatccttcg caagaccctt 7380 cctctatata aggaagttca tttcatttgg agaggacacg ctgaaatcac cagtctctct 7440 ctataaatct atctctctct ctataacaat ggacccagaa cgacgcccgg ccgacatccg 7500 ccgtgccacc gaggcggaca tgccggcggt ctgcaccatc gtcaaccact acatcgagac 7560 aagcacggtc aacttccgta ccgagccgca ggaaccgcag gagtggacgg acgacctcgt 7620 ccgtctgcgg gagcgctatc cctggctcgt cgccgaggtg gacggcgagg tcgccggcat 7680 cgcctacgcg ggcccctgga aggcacgcaa cgcctacgac tggacggccg agtcgaccgt 7740 gtacgtctcc ccccgccacc agcggacggg actgggctcc acgctctaca cccacctgct 7800 gaagtccctg gaggcacagg gcttcaagag cgtggtcgct gtcatcgggc tgcccaacga 7860 cccgagcgtg cgcatgcacg aggcgctcgg atatgccccc cgcggcatgc tgcgggcggc 7920 cggcttcaag cacgggaact ggcatgacgt gggtttctgg cagctggact tcagcctgcc 7980 ggtaccgccc cgtccggtcc tgcccgtcac cgagatctga gatcacccgt tctaggatcc 8040 gaagcagatc gttcaaacat ttggcaataa agtttcttaa gattgaatcc tgttgccggt 8100 cttgcgatga ttatcatata atttctgttg aattacgtta agcatgtaat aattaacatg 8160 taatgcatga cgttatttat gagatgggtt tttatgatta gagtcccgca attatacatt 8220 taatacgcga tagaaaacaa aatatagcgc gcaaactagg ataaattatc gcgcgcggtg 8280 tcatctatgt tactagatcg aaacataact tcgtatagca tacattatac gaagttatca 8340 aaacgtcgtg agacagtttg gttaactata acggtcctaa ggtagcgatc gaggcattac 8400 ggcattacgg cactcgcgag ggtccgaatc tatgtcgggt gcggagaaag aggtaatgaa 8460 atggcaattt acaattgaat atatcctgcc g 8491 <210> 13 <211> 9567 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TDNA comprising nucleic acid sequences encoding the gluc1A promoter, a Golgi retention peptide and a NODC protein <220> <221> misc_feature <222> (1)..(25) <223> right border repeat from the T-DNA of Agrobacterium tumefaciens (Zambryski, 1988) <220> <221> promoter <222> (26)..(2025) <223> sequence including the promoter region of the beta-1,3-endoglucanase gene gluc1 of the A subgenome of Gossypium hirsutum (cotton)(Engelen and Arioli, 2008) <220> <221> sig_peptide <222> (2026)..(2130) <220> <221> gene <222> (2131)..(3321) <220> <221> 3'UTR <222> (3322)..(3554) <223> sequence including the 3?untranslated region of the 35S transcript of the Cauliflower Mosaic Virus (Sanfa?n et al., 1991) <220> <221> promoter <222> (3555)..(5527) <223> Pgluc1(A1.9): sequence including the promoter region of the beta-1,3-endoglucanase gene gluc1 of the A subgenome of Gossypium hirsutum (cotton)(Engelen and Arioli, 2008) <220> <221> gene <222> (5528)..(7357) <223> gfaEc-1Pb: coding region of the glutamine:fructose-6-phosphate amidotransferase gene of Escherichia coli (Frohberg and Essigmann, 2006) <220> <221> 3'UTR <222> (7358)..(7631) <223> 3?os: sequence including the 3' untranslated region of the nopaline synthase gene from the T-DNA of pTiT37 (Depicker et al., 1982) <220> <221> misc_feature <222> (7674)..(7707) <223> lox: sequence including the 34bp recognition sequence for the Cre recombinase of bacteriophage P1 (Hoess and Abremski, 1985) <220> <221> promoter <222> (7708)..(8544) <223> P35S3: sequence including the promoter region of the Cauliflower Mosaic Virus 35S transcript (Odell et al., 1985) <220> <221> gene <222> (8545)..(9096) <223> bar: coding sequence of the phosphinothricin acetyltransferase gene of Streptomyces hygroscopicus (Thompson et al., 1987). <220> <221> 3'UTR <222> (9097)..(9380) <223> 3?os: sequence including the 3' untranslated region of the nopaline synthase gene from the T-DNA of pTiT37 (Depicker et al., 1982) <220> <221> misc_feature <222> (9381)..(9414) <223> lox: sequence including the 34bp recognition sequence for the Cre recombinase of bacteriophage P1 (Hoess and Abremski, 1985) <220> <221> misc_feature <222> (9543)..(9567) <223> left border repeat from the T-DNA of Agrobacterium tumefaciens (Zambryski, 1988) <400> 13 aattacaacg gtatatatcc tgccagtact gggccccctc gagggcgatc gctacgtacc 60 tgcagggcgg ccgcgattat ataaataggg ggcgaatcta gggagctggc atgaccccta 120 aaatagaatt ttctattttg acctatcaaa atttttaaaa ttttaaatta gtaaaggtaa 180 atttgtactt taacctctta aaatgataaa attttacttt aatcctttaa aatttacatt 240 tttactatca taaaaattac aatttgattt tacccctaaa atttttttct agcttagccc 300 tgtatataaa tatattattt ataattttta tatttaaaat ataaagtttt taattataca 360 aataattaaa atctgatatt taaaactaaa gtaatttctt ttttcttttt actttttttt 420 aattgcaaca taatggttta aatatctata taacgtatga agtaatttga tataaatttt 480 attttaattt attattatat aaattcattt agtaaaaact tttaatagaa tcaaaatttt 540 tatttgtaaa ttcgataact tttcttatca agtatatttg tgagaaccaa atatttagta 600 aaattaatat tcttatttat aaatatgata aatcttataa aaaaatattt aaaatgaaaa 660 aaattgtaca aatattataa aaaaatattt aaaatgaaaa acattgtaca aaggctatat 720 aagaagttca aaagtttctt cgaccatgta ctcttataga gattatagat agattataaa 780 actatatgta gtttctctta acttttaaat aagaggataa atgtatttta atgtactcaa 840 acttatatat ttttatattg acaataatat caatatcaac ctaattaaga ttcattctaa 900 cattaatgtt gaagattttt aataaaagaa aaggttaata aattaattag aacacaaaca 960 aacacaaatt taagtggtat gtaaggtcct tgacccaaag gaaaaatttg ttacgtcgat 1020 taaattataa attaatttaa agtaaaatta cattttaacc taaaaaaaga gaaaagtata 1080 tctaatttct tcgaaaatgg aaagaaaatt ataaatttat ggcatttcta aaaaaattct 1140 gaattcgcta ctaaaagatg aaattataaa atccgaagca ttaccagaag atggatcacc 1200 aaatcacaaa caatcaatga aaagtaatga taattaattg aaagtgagca tttaattttg 1260 atagccatat acttcctgct gaatttatag gttctcatta atgcaattaa attatattcg 1320 acaccttttg aatgaaataa aatgacacaa gaggaaagac ggttcatcta ttttttcttt 1380 caatcgccca tcaaaatacc aaaaatgtaa ctacatgcaa aaaatcaaat atgaaaaata 1440 ttcatatttt gatattttaa tatattgtgt gttcaaaacg taaatgtatt gaaaaattat 1500 gatggtgttg ttgctgtatg tccataaaat tcaatgtact cacatttatc aaatgtatac 1560 tttgagagaa gttattttga taatactcaa gtttttttta tagatgggaa aattttttaa 1620 attatttttt gattttgatg aaatgtatat ataaatttta attcgataca tataaatata 1680 tatgtaaatt ttaaatttaa atttaataat atacaattaa gaaaataatt tacataaata 1740 tatatcctaa taaaaataaa attagaaaga ggaaatgtca aaacctcttc attatataca 1800 aatatgatgg gacacgatac cctcatgcat tgatatctca tgttgtccaa aaactcggaa 1860 tcctttttga aaaaaaactt ccagagagag tatataaatc cagcagtagg cacaagaaac 1920 gagcaccagt tattgacttt cctttgtaaa aaaaaaaaag tgctgagatc aagaaatata 1980 gtgaaatatg ggtccaagat tttctgggtt tttaatctaa gcaccatgag taaacggaat 2040 ccgaagattc tgaagatttt tctgtatatg ttacttctca actctctctt tctcatcatc 2100 tacttcgttt ttcactcatc gtcgttttca agtgtcgtag atgtgatcgg tttgcttgcg 2160 actgcagcct acgtgacgtt ggcgagcgca tacaaggtgg tccagttcat taacgtgtcg 2220 agcgtaacgg atgtcgctgg tctcgaaagt gatgctttgc cgctcactcc aagggttgac 2280 gttatcgtgc cgacattcaa tgagaactcc agcacattgc tcgagtgcgt cgcttctata 2340 tgcgcacaag actaccgcgg accaataacg attgtcgtgg tagacgatgg gtcgaccaac 2400 aaaacatcat ttcacgcagt atgcgacaag tacgcgagcg acgaaaggtt catatttgtc 2460 gaacttgatc aaaacaaggg gaagcgcgcc gcgcaaatgg aggccatcag gagaacagac 2520 ggagacctga tactaaacgt agactcggac acggttatag ataaggatgt tgttacaaag 2580 cttgcgtcgt ccatgagagc cccgaatgtc ggtggtgtca tggggcagct cgttgcaaag 2640 aatcgagaaa gatcttggct taccagatta atcgatatgg agtactggct tgcgtgtaac 2700 gaggagcgca ttgcgcagtc gaggtttggc tccgtgatgt gttgttgtgg gccgtgcgcc 2760 atgtatagaa gatctgcaat tacgccacta ttggcagaat atgagcacca gacattccta 2820 gggcgtccga gcaactttgg tgaggatcgc catctcacaa tcctgatgct gaaggcggga 2880 tttcggaccg ggtacgtccc aggtgccgta gcgaggacgt tggttccgga tgggctggcg 2940 ccgtacctgc gccagcaact ccgctgggcc cgcagcactt atcgcgacac cgccctcgcc 3000 ttacgtataa agaaaaatct aagcaaatat atcacctttg agatatgcgc acagaatttg 3060 ggtacggctc tcttacttgt gatgaccatg atttcgcttt cgctgactac atcagggtcg 3120 caaacgcccg ttatcattct gggtgtcgtt gtggggatgt ctataataag atgttgttct 3180 gtcgccctta tagcgaaaga ttttcggttt ctatacttca tcgttcactc agcgttgaat 3240 gttctaattt taacgccgtt aaaactctat gccctgttaa ccattcggga tagtcggtgg 3300 ctatcacgcg agagttccta agctagcaag cttggacacg ctgaaatcac cagtctctct 3360 ctacaaatct atctctctct attttctcca taataatgtg tgagtagttc ccagataagg 3420 gaattagggt tcctataggg tttcgctcat gtgttgagca tataagaaac ccttagtatg 3480 tatttgtatt tgtaaaatac ttctatcaat aaaatttcta attcctaaaa ccaaaatcca 3540 gtactaaaat ccagacgcgt ttaattaagc ggccgcgatt atataaatag ggggcgaatc 3600 tagggagctg gcatgacccc taaaatagaa ttttctattt tgacctatca aaatttttaa 3660 aattttaaat tagtaaaggt aaatttgtac tttaacctct taaaatgata aaattttact 3720 ttaatccttt aaaatttaca tttttactat cataaaaatt acaatttgat tttaccccta 3780 aaattttttt ctagcttagc cctgtatata aatatattat ttataatttt tatatttaaa 3840 atataaagtt tttaattata caaataatta aaatctgata tttaaaacta aagtaatttc 3900 ttttttcttt ttactttttt ttaattgcaa cataatggtt taaatatcta tataacgtat 3960 gaagtaattt gatataaatt ttattttaat ttattattat ataaattcat ttagtaaaaa 4020 cttttaatag aatcaaaatt tttatttgta aattcgataa cttttcttat caagtatatt 4080 tgtgagaacc aaatatttag taaaattaat attcttattt ataaatatga taaatcttat 4140 aaaaaaatat ttaaaatgaa aaaaattgta caaatattat aaaaaaatat ttaaaatgaa 4200 aaacattgta caaaggctat ataagaagtt caaaagtttc ttcgaccatg tactcttata 4260 gagattatag atagattata aaactatatg tagtttctct taacttttaa ataagaggat 4320 aaatgtattt taatgtactc aaacttatat atttttatat tgacaataat atcaatatca 4380 acctaattaa gattcattct aacattaatg ttgaagattt ttaataaaag aaaaggttaa 4440 taaattaatt agaacacaaa caaacacaaa tttaagtggt atgtaaggtc cttgacccaa 4500 aggaaaaatt tgttacgtcg attaaattat aaattaattt aaagtaaaat tacattttaa 4560 cctaaaaaaa gagaaaagta tatctaattt cttcgaaaat ggaaagaaaa ttataaattt 4620 atggcatttc taaaaaaatt ctgaattcgc tactaaaaga tgaaattata aaatccgaag 4680 cattaccaga agatggatca ccaaatcaca aacaatcaat gaaaagtaat gataattaat 4740 tgaaagtgag catttaattt tgatagccat atacttcctg ctgaatttat aggttctcat 4800 taatgcaatt aaattatatt cgacaccttt tgaatgaaat aaaatgacac aagaggaaag 4860 acggttcatc tattttttct ttcaatcgcc catcaaaata ccaaaaatgt aactacatgc 4920 aaaaaatcaa atatgaaaaa tattcatatt ttgatatttt aatatattgt gtgttcaaaa 4980 cgtaaatgta ttgaaaaatt atgatggtgt tgttgctgta tgtccataaa attcaatgta 5040 ctcacattta tcaaatgtat actttgagag aagttatttt gataatactc aagttttttt 5100 tatagatggg aaaatttttt aaattatttt ttgattttga tgaaatgtat atataaattt 5160 taattcgata catataaata tatatgtaaa ttttaaattt aaatttaata atatacaatt 5220 aagaaaataa tttacataaa tatatatcct aataaaaata aaattagaaa gaggaaatgt 5280 caaaacctct tcattatata caaatatgat gggacacgat accctcatgc attgatatct 5340 catgttgtcc aaaaactcgg aatccttttt gaaaaaaaac ttccagagag agtatataaa 5400 tccagcagta ggcacaagaa acgagcacca gttattgact ttcctttgta aaaaaaaaaa 5460 agtgctgaga tcaagaaata tagtgaaata tgggtccaag attttctggg tttttaatct 5520 aagcaccatg tgcggaattg ttggtgctat cgcccaaaga gacgttgctg agattttgtt 5580 agagggtctg cgaaggctag agtatagagg atatgactcc gctggtctgg ctgtcgttga 5640 tgctgagggt catatgacaa ggctaagaag gttaggaaag gttcagatgc ttgctcaggc 5700 agctgaggaa catccattgc atggaggtac tggtattgca cataccaggt gggctactca 5760 tggggagcca tcagaagtta atgctcatcc acatgtgagt gagcatatcg ttgtagttca 5820 caatgggata attgaaaacc acgaaccatt gagggaagag ttaaaggcaa gaggatatac 5880 ttttgtgagt gagactgaca ctgaggttat tgcacattta gtgaactggg aactcaaaca 5940 ggggggcaca ttgcgtgagg ctgtgttaag agctattcct caacttagag gtgcatacgg 6000 tactgttatt atggattcaa gacacccaga tactctcctt gcagctagat caggtagtcc 6060 cttggtcata ggacttggaa tgggtgaaaa ttttatcgct agcgaccaat tggccttatt 6120 gccagttaca agacgattta ttttccttga agagggcgat attgctgaga ttactagaag 6180 gtctgtgaac atctttgata agactggcgc tgaggttaaa cgtcaggata tcgagtctaa 6240 ccttcaatac gatgctggtg ataaaggaat ttacaggcat tatatgcaaa aggaaattta 6300 tgaacaacca aatgctatca aaaacacact tactggccgt atttctcatg gacaggtcga 6360 tttaagcgag cttggtccta atgcagacga actgctatca aaagttgagc acatacagat 6420 actggcatgc ggaactagtt ataattcagg aatggtgtct agatactggt tcgaaagctt 6480 ggcaggtata ccttgtgatg tagagatcgc ttctgagttt aggtatagaa agtctgctgt 6540 gcgtagaaat tcattaatga ttacattatc tcaatccgga gaaacagcag atacactggc 6600 tggattgagg ctttctaagg aactcggata tctgggttca cttgctattt gtaatgtacc 6660 aggttcctca ttggttcgtg aatcagatct agcacttatg acaaatgcag gaactgaaat 6720 aggtgtggca agtaccaagg ctttcacaac ccaactgacc gtacttttaa tgttggtagc 6780 aaaactcagt cgattaaagg ggctagatgc atctatcgaa catgatattg ttcacgggct 6840 tcaagctctc ccttcaagaa ttgaacaaat gctttcacaa gataagagaa tagaggcatt 6900 ggctgaagat ttttccgaca aacatcacgc attgtttctt ggacgtggcg atcaatatcc 6960 aattgcattg gaaggagctt tgaagttgaa agaaataagt tacattcacg cagaagcata 7020 tgcagctgga gaactcaagc atggtccttt ggcactcatc gacgctgaca tgcccgtgat 7080 cgtagtggct cctaataacg aactgctcga aaagcttaaa tcaaatatcg aagaggttcg 7140 agctagagga ggtcagcttt acgttttcgc tgaacaagat gctggattcg tgtcaagcga 7200 taatatgcat ataattgaaa tgcctcacgt tgaagaagtg attgcaccta tattttatac 7260 agtcccattg caacttctag cttaccatgt tgcacttatt aaaggaactg atgttgatca 7320 gcctagaaac ctagcaaaat ctgtaacagt cgaataaacg cgtggcgcgc cgaagcagat 7380 cgttcaaaca tttggcaata aagtttctta agattgaatc ctgttgccgg tcttgcgatg 7440 attatcatat aatttctgtt gaattacgtt aagcatgtaa taattaacat gtaatgcatg 7500 acgttattta tgagatgggt ttttatgatt agagtcccgc aattatacat ttaatacgcg 7560 atagaaaaca aaatatagcg cgcaaactag gataaattat cgcgcgcggt gtcatctatg 7620 ttactagatc ggaattcgat atcattaccc tgttatccct aaagcttatt aatataactt 7680 cgtatagcat acattatacg aagttatgtt tcctacgcag caggtctcat caagacgatc 7740 tacccgagta acaatctcca ggagatcaaa taccttccca agaaggttaa agatgcagtc 7800 aaaagattca ggactaattg catcaagaac acagagaaag acatatttct caagatcaga 7860 agtactattc cagtatggac gattcaaggc ttgcttcata aaccaaggca agtaatagag 7920 attggagtct ctaaaaaggt agttcctact gaatctaagg ccatgcatgg agtctaagat 7980 tcaaatcgag gatctaacag aactcgccgt gaagactggc gaacagttca tacagagtct 8040 tttacgactc aatgacaaga agaaaatctt cgtcaacatg gtggagcacg acactctggt 8100 ctactccaaa aatgtcaaag atacagtctc agaagaccaa agggctattg agacttttca 8160 acaaaggata atttcgggaa acctcctcgg attccattgc ccagctatct gtcacttcat 8220 cgaaaggaca gtagaaaagg aaggtggctc ctacaaatgc catcattgcg ataaaggaaa 8280 ggctatcatt caagatgcct ctgccgacag tggtcccaaa gatggacccc cacccacgag 8340 gagcatcgtg gaaaaagaag acgttccaac cacgtcttca aagcaagtgg attgatgtga 8400 catctccact gacgtaaggg atgacgcaca atcccactat ccttcgcaag acccttcctc 8460 tatataagga agttcatttc atttggagag gacacgctga aatcaccagt ctctctctat 8520 aaatctatct ctctctctat aacaatggac ccagaacgac gcccggccga catccgccgt 8580 gccaccgagg cggacatgcc ggcggtctgc accatcgtca accactacat cgagacaagc 8640 acggtcaact tccgtaccga gccgcaggaa ccgcaggagt ggacggacga cctcgtccgt 8700 ctgcgggagc gctatccctg gctcgtcgcc gaggtggacg gcgaggtcgc cggcatcgcc 8760 tacgcgggcc cctggaaggc acgcaacgcc tacgactgga cggccgagtc gaccgtgtac 8820 gtctcccccc gccaccagcg gacgggactg ggctccacgc tctacaccca cctgctgaag 8880 tccctggagg cacagggctt caagagcgtg gtcgctgtca tcgggctgcc caacgacccg 8940 agcgtgcgca tgcacgaggc gctcggatat gccccccgcg gcatgctgcg ggcggccggc 9000 ttcaagcacg ggaactggca tgacgtgggt ttctggcagc tggacttcag cctgccggta 9060 ccgccccgtc cggtcctgcc cgtcaccgag atctgagatc acccgttcta ggatccgaag 9120 cagatcgttc aaacatttgg caataaagtt tcttaagatt gaatcctgtt gccggtcttg 9180 cgatgattat catataattt ctgttgaatt acgttaagca tgtaataatt aacatgtaat 9240 gcatgacgtt atttatgaga tgggttttta tgattagagt cccgcaatta tacatttaat 9300 acgcgataga aaacaaaata tagcgcgcaa actaggataa attatcgcgc gcggtgtcat 9360 ctatgttact agatcgaaac ataacttcgt atagcataca ttatacgaag ttatcaaaac 9420 gtcgtgagac agtttggtta actataacgg tcctaaggta gcgatcgagg cattacggca 9480 ttacggcact cgcgagggtc cgaatctatg tcgggtgcgg agaaagaggt aatgaaatgg 9540 caatttacaa ttgaatatat cctgccg 9567 <210> 14 <211> 9621 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TDNA comprising nucleic acid sequences encoding the gluc1D promoter, a Golgi retention peptide and a NODC protein <220> <221> misc_feature <222> (1)..(25) <223> right border repeat from the T-DNA of Agrobacterium tumefaciens (Zambryski, 1988) <220> <221> promoter <222> (26)..(2052) <223> sequence including the promoter region of the beta-1,3-endoglucanase gene gluc1 of the D subgenome of Gossypium hirsutum (cotton)(Engelen and Arioli, 2008) <220> <221> sig_peptide <222> (2053)..(2157) <220> <221> gene <222> (2158)..(3348) <220> <221> 3'UTR <222> (3349)..(3581) <223> sequence including the 3?untranslated region of the 35S transcript of the Cauliflower Mosaic Virus (Sanfa?n et al., 1991) <220> <221> promoter <222> (3582)..(5581) <223> Pgluc1(D2.0): sequence including the promoter region of the beta-1,3-endoglucanase gene gluc1 of the D subgenome of Gossypium hirsutum (cotton)(Engelen and Arioli, 2008) <220> <221> gene <222> (5582)..(7411) <223> gfaEc-1Pb: coding region of the glutamine:fructose-6-phosphate amidotransferase gene of Escherichia coli (Frohberg and Essigmann, 2006) <220> <221> 3'UTR <222> (7412)..(7685) <223> 3?os: sequence including the 3' untranslated region of the nopaline synthase gene from the T-DNA of pTiT37 (Depicker et al., 1982) <220> <221> misc_feature <222> (7728)..(7761) <223> lox: sequence including the 34bp recognition sequence for the Cre recombinase of bacteriophage P1 (Hoess and Abremski, 1985) <220> <221> promoter <222> (7762)..(8598) <223> P35S3: sequence including the promoter region of the Cauliflower Mosaic Virus 35S transcript (Odell et al., 1985) <220> <221> gene <222> (8599)..(9150) <223> bar: coding sequence of the phosphinothricin acetyltransferase gene of Streptomyces hygroscopicus (Thompson et al., 1987). <220> <221> 3'UTR <222> (9151)..(9434) <223> 3?os: sequence including the 3' untranslated region of the nopaline synthase gene from the T-DNA of pTiT37 (Depicker et al., 1982) <220> <221> misc_feature <222> (9435)..(9468) <223> lox: sequence including the 34bp recognition sequence for the Cre recombinase of bacteriophage P1 (Hoess and Abremski, 1985) <220> <221> misc_feature <222> (9597)..(9621) <223> left border repeat from the T-DNA of Agrobacterium tumefaciens (Zambryski, 1988) <400> 14 aattacaacg gtatatatcc tgccagtact gggccccctc gagggcgatc gctacgtacc 60 tgcagggcgg ccgcttcgaa cataatgcta ataaaaaatt tcctaatcat tattaaatca 120 tttgtataaa ctataaagaa attgatatat tgtaaattaa acttttaact attcaatttt 180 ttcttaatag tcaataaatt aatcataata attcataatt aatatataat taacataacc 240 ataacataga attttttatt ttggcccatt aaaattttta aaattttaaa ttagtaaagg 300 aaaaattaca ctttgacccc ttaaaaatga taaaatttta ttttaatcct ttaaaattga 360 catttttact attgtaaaaa ttacaattta attttgcccc cctaaaaaat ttttctagct 420 tcgcccttgt gtataaatat attaattaca atttttatat ttgaattata taaataatta 480 aattttgata tttaaaacta aagtaatctc tttttttttt actttttttt aattgaaaca 540 taatggttta aatatctata ttacgtatga agtaatttaa tataaatttt attttaattt 600 attattatat aaattcattt agtaaaaact tttaatagaa tcaaaatttt tatttgtaaa 660 ttcgataact tttcttatca agtaaatttg ttgaattaaa tatttagtaa aattaatatt 720 tttatttata aatatgataa atcttataaa aaataaaaaa atatttaaaa tgaaaaacat 780 tgtacaaagg ctatataaga agttcaaaag tttcttcgac cctgtactct aatagagatt 840 atagatagat tatagaacta ttcatagttt ctcttaacct ttaaataaga attttagtgt 900 actcaaactt acatattttt atattgataa taatgtcaat accagccgag ttaagattca 960 ctcgacatta atgttgaaaa tttttaataa aagaaaatgt tgataagtta attagaacac 1020 aagcaagcac aaatttaagt ggtaagtaag gtccttgacc ctaatggaaa aattgttatg 1080 ttgattaaat tataaattaa tttaaggtaa aattatattt tgacctaaaa aaatgaaaaa 1140 aatatatcta gtttcttcga aaatgaaaag aaaataataa attgatacat tataaaattt 1200 atggcatttc taaaaaaatt ctgaatttga tgaaattata ataaaaaaaa agtttaaaaa 1260 catatagatt tcaagaatag tgggaaaatt atatttgaac aacactgaag aaatccaaag 1320 cattagcaga aaatggatca ccaaatcaca aacaatcagt gaaaagtaat gataattaat 1380 tgaaagtgag catttaaatt tgatagccat atacttcctg ctgaatttat aggttctcat 1440 taatgcaatt aaattatatt tgtcactttt tgaatgaaat aaatgacaca gttcatctat 1500 tttttttctt tcaatcgccc atcaaaatac cgaaaatgta actacattaa aaaagatcga 1560 aaaatattca tattttgata ttttaataga ttgtgtgttc aaggcgtaat gtactaaaaa 1620 attatgatgg tgttgtcgct gtatgtccat aaaattcaat gtattcgcat gtatcaaatg 1680 taaattttga cacaagttat tctaataata atcaagttat ttttatacat gagatacatc 1740 tcaaaattat ttttatatat ccgaaaaatc ataacgtacg atcaaactag aaagaggaag 1800 tgtcaaaacc tattcattat atgcaaatat gatgggacac gataccctca tgcattgata 1860 tctcatattg tccaaaaact cagaatcctt tttgaaaaaa aaaaattcca gagagagtgt 1920 ataaatccag cagtgtgcac aagaaacgag caccagttat tgacattcct ttgtaaaaaa 1980 aaaaagaagc tgagatcaag aaatatagtg aaatatgggt ccaacatttt ctgggttttt 2040 aatctcagca ccatgagtaa acggaatccg aagattctga agatttttct gtatatgtta 2100 cttctcaact ctctctttct catcatctac ttcgtttttc actcatcgtc gttttcaagt 2160 gtcgtagatg tgatcggttt gcttgcgact gcagcctacg tgacgttggc gagcgcatac 2220 aaggtggtcc agttcattaa cgtgtcgagc gtaacggatg tcgctggtct cgaaagtgat 2280 gctttgccgc tcactccaag ggttgacgtt atcgtgccga cattcaatga gaactccagc 2340 acattgctcg agtgcgtcgc ttctatatgc gcacaagact accgcggacc aataacgatt 2400 gtcgtggtag acgatgggtc gaccaacaaa acatcatttc acgcagtatg cgacaagtac 2460 gcgagcgacg aaaggttcat atttgtcgaa cttgatcaaa acaaggggaa gcgcgccgcg 2520 caaatggagg ccatcaggag aacagacgga gacctgatac taaacgtaga ctcggacacg 2580 gttatagata aggatgttgt tacaaagctt gcgtcgtcca tgagagcccc gaatgtcggt 2640 ggtgtcatgg ggcagctcgt tgcaaagaat cgagaaagat cttggcttac cagattaatc 2700 gatatggagt actggcttgc gtgtaacgag gagcgcattg cgcagtcgag gtttggctcc 2760 gtgatgtgtt gttgtgggcc gtgcgccatg tatagaagat ctgcaattac gccactattg 2820 gcagaatatg agcaccagac attcctaggg cgtccgagca actttggtga ggatcgccat 2880 ctcacaatcc tgatgctgaa ggcgggattt cggaccgggt acgtcccagg tgccgtagcg 2940 aggacgttgg ttccggatgg gctggcgccg tacctgcgcc agcaactccg ctgggcccgc 3000 agcacttatc gcgacaccgc cctcgcctta cgtataaaga aaaatctaag caaatatatc 3060 acctttgaga tatgcgcaca gaatttgggt acggctctct tacttgtgat gaccatgatt 3120 tcgctttcgc tgactacatc agggtcgcaa acgcccgtta tcattctggg tgtcgttgtg 3180 gggatgtcta taataagatg ttgttctgtc gcccttatag cgaaagattt tcggtttcta 3240 tacttcatcg ttcactcagc gttgaatgtt ctaattttaa cgccgttaaa actctatgcc 3300 ctgttaacca ttcgggatag tcggtggcta tcacgcgaga gttcctaagc tagcaagctt 3360 ggacacgctg aaatcaccag tctctctcta caaatctatc tctctctatt ttctccataa 3420 taatgtgtga gtagttccca gataagggaa ttagggttcc tatagggttt cgctcatgtg 3480 ttgagcatat aagaaaccct tagtatgtat ttgtatttgt aaaatacttc tatcaataaa 3540 atttctaatt cctaaaacca aaatccagta ctaaaatcca gacgcgttta attaagcggc 3600 cgcttcgaac ataatgctaa taaaaaattt cctaatcatt attaaatcat ttgtataaac 3660 tataaagaaa ttgatatatt gtaaattaaa cttttaacta ttcaattttt tcttaatagt 3720 caataaatta atcataataa ttcataatta atatataatt aacataacca taacatagaa 3780 ttttttattt tggcccatta aaatttttaa aattttaaat tagtaaagga aaaattacac 3840 tttgacccct taaaaatgat aaaattttat tttaatcctt taaaattgac atttttacta 3900 ttgtaaaaat tacaatttaa ttttgccccc ctaaaaaatt tttctagctt cgcccttgtg 3960 tataaatata ttaattacaa tttttatatt tgaattatat aaataattaa attttgatat 4020 ttaaaactaa agtaatctct ttttttttta ctttttttta attgaaacat aatggtttaa 4080 atatctatat tacgtatgaa gtaatttaat ataaatttta ttttaattta ttattatata 4140 aattcattta gtaaaaactt ttaatagaat caaaattttt atttgtaaat tcgataactt 4200 ttcttatcaa gtaaatttgt tgaattaaat atttagtaaa attaatattt ttatttataa 4260 atatgataaa tcttataaaa aataaaaaaa tatttaaaat gaaaaacatt gtacaaaggc 4320 tatataagaa gttcaaaagt ttcttcgacc ctgtactcta atagagatta tagatagatt 4380 atagaactat tcatagtttc tcttaacctt taaataagaa ttttagtgta ctcaaactta 4440 catattttta tattgataat aatgtcaata ccagccgagt taagattcac tcgacattaa 4500 tgttgaaaat ttttaataaa agaaaatgtt gataagttaa ttagaacaca agcaagcaca 4560 aatttaagtg gtaagtaagg tccttgaccc taatggaaaa attgttatgt tgattaaatt 4620 ataaattaat ttaaggtaaa attatatttt gacctaaaaa aatgaaaaaa atatatctag 4680 tttcttcgaa aatgaaaaga aaataataaa ttgatacatt ataaaattta tggcatttct 4740 aaaaaaattc tgaatttgat gaaattataa taaaaaaaaa gtttaaaaac atatagattt 4800 caagaatagt gggaaaatta tatttgaaca acactgaaga aatccaaagc attagcagaa 4860 aatggatcac caaatcacaa acaatcagtg aaaagtaatg ataattaatt gaaagtgagc 4920 atttaaattt gatagccata tacttcctgc tgaatttata ggttctcatt aatgcaatta 4980 aattatattt gtcacttttt gaatgaaata aatgacacag ttcatctatt ttttttcttt 5040 caatcgccca tcaaaatacc gaaaatgtaa ctacattaaa aaagatcgaa aaatattcat 5100 attttgatat tttaatagat tgtgtgttca aggcgtaatg tactaaaaaa ttatgatggt 5160 gttgtcgctg tatgtccata aaattcaatg tattcgcatg tatcaaatgt aaattttgac 5220 acaagttatt ctaataataa tcaagttatt tttatacatg agatacatct caaaattatt 5280 tttatatatc cgaaaaatca taacgtacga tcaaactaga aagaggaagt gtcaaaacct 5340 attcattata tgcaaatatg atgggacacg ataccctcat gcattgatat ctcatattgt 5400 ccaaaaactc agaatccttt ttgaaaaaaa aaaattccag agagagtgta taaatccagc 5460 agtgtgcaca agaaacgagc accagttatt gacattcctt tgtaaaaaaa aaaagaagct 5520 gagatcaaga aatatagtga aatatgggtc caacattttc tgggttttta atctcagcac 5580 catgtgcgga attgttggtg ctatcgccca aagagacgtt gctgagattt tgttagaggg 5640 tctgcgaagg ctagagtata gaggatatga ctccgctggt ctggctgtcg ttgatgctga 5700 gggtcatatg acaaggctaa gaaggttagg aaaggttcag atgcttgctc aggcagctga 5760 ggaacatcca ttgcatggag gtactggtat tgcacatacc aggtgggcta ctcatgggga 5820 gccatcagaa gttaatgctc atccacatgt gagtgagcat atcgttgtag ttcacaatgg 5880 gataattgaa aaccacgaac cattgaggga agagttaaag gcaagaggat atacttttgt 5940 gagtgagact gacactgagg ttattgcaca tttagtgaac tgggaactca aacagggggg 6000 cacattgcgt gaggctgtgt taagagctat tcctcaactt agaggtgcat acggtactgt 6060 tattatggat tcaagacacc cagatactct ccttgcagct agatcaggta gtcccttggt 6120 cataggactt ggaatgggtg aaaattttat cgctagcgac caattggcct tattgccagt 6180 tacaagacga tttattttcc ttgaagaggg cgatattgct gagattacta gaaggtctgt 6240 gaacatcttt gataagactg gcgctgaggt taaacgtcag gatatcgagt ctaaccttca 6300 atacgatgct ggtgataaag gaatttacag gcattatatg caaaaggaaa tttatgaaca 6360 accaaatgct atcaaaaaca cacttactgg ccgtatttct catggacagg tcgatttaag 6420 cgagcttggt cctaatgcag acgaactgct atcaaaagtt gagcacatac agatactggc 6480 atgcggaact agttataatt caggaatggt gtctagatac tggttcgaaa gcttggcagg 6540 tataccttgt gatgtagaga tcgcttctga gtttaggtat agaaagtctg ctgtgcgtag 6600 aaattcatta atgattacat tatctcaatc cggagaaaca gcagatacac tggctggatt 6660 gaggctttct aaggaactcg gatatctggg ttcacttgct atttgtaatg taccaggttc 6720 ctcattggtt cgtgaatcag atctagcact tatgacaaat gcaggaactg aaataggtgt 6780 ggcaagtacc aaggctttca caacccaact gaccgtactt ttaatgttgg tagcaaaact 6840 cagtcgatta aaggggctag atgcatctat cgaacatgat attgttcacg ggcttcaagc 6900 tctcccttca agaattgaac aaatgctttc acaagataag agaatagagg cattggctga 6960 agatttttcc gacaaacatc acgcattgtt tcttggacgt ggcgatcaat atccaattgc 7020 attggaagga gctttgaagt tgaaagaaat aagttacatt cacgcagaag catatgcagc 7080 tggagaactc aagcatggtc ctttggcact catcgacgct gacatgcccg tgatcgtagt 7140 ggctcctaat aacgaactgc tcgaaaagct taaatcaaat atcgaagagg ttcgagctag 7200 aggaggtcag ctttacgttt tcgctgaaca agatgctgga ttcgtgtcaa gcgataatat 7260 gcatataatt gaaatgcctc acgttgaaga agtgattgca cctatatttt atacagtccc 7320 attgcaactt ctagcttacc atgttgcact tattaaagga actgatgttg atcagcctag 7380 aaacctagca aaatctgtaa cagtcgaata aacgcgtggc gcgccgaagc agatcgttca 7440 aacatttggc aataaagttt cttaagattg aatcctgttg ccggtcttgc gatgattatc 7500 atataatttc tgttgaatta cgttaagcat gtaataatta acatgtaatg catgacgtta 7560 tttatgagat gggtttttat gattagagtc ccgcaattat acatttaata cgcgatagaa 7620 aacaaaatat agcgcgcaaa ctaggataaa ttatcgcgcg cggtgtcatc tatgttacta 7680 gatcggaatt cgatatcatt accctgttat ccctaaagct tattaatata acttcgtata 7740 gcatacatta tacgaagtta tgtttcctac gcagcaggtc tcatcaagac gatctacccg 7800 agtaacaatc tccaggagat caaatacctt cccaagaagg ttaaagatgc agtcaaaaga 7860 ttcaggacta attgcatcaa gaacacagag aaagacatat ttctcaagat cagaagtact 7920 attccagtat ggacgattca aggcttgctt cataaaccaa ggcaagtaat agagattgga 7980 gtctctaaaa aggtagttcc tactgaatct aaggccatgc atggagtcta agattcaaat 8040 cgaggatcta acagaactcg ccgtgaagac tggcgaacag ttcatacaga gtcttttacg 8100 actcaatgac aagaagaaaa tcttcgtcaa catggtggag cacgacactc tggtctactc 8160 caaaaatgtc aaagatacag tctcagaaga ccaaagggct attgagactt ttcaacaaag 8220 gataatttcg ggaaacctcc tcggattcca ttgcccagct atctgtcact tcatcgaaag 8280 gacagtagaa aaggaaggtg gctcctacaa atgccatcat tgcgataaag gaaaggctat 8340 cattcaagat gcctctgccg acagtggtcc caaagatgga cccccaccca cgaggagcat 8400 cgtggaaaaa gaagacgttc caaccacgtc ttcaaagcaa gtggattgat gtgacatctc 8460 cactgacgta agggatgacg cacaatccca ctatccttcg caagaccctt cctctatata 8520 aggaagttca tttcatttgg agaggacacg ctgaaatcac cagtctctct ctataaatct 8580 atctctctct ctataacaat ggacccagaa cgacgcccgg ccgacatccg ccgtgccacc 8640 gaggcggaca tgccggcggt ctgcaccatc gtcaaccact acatcgagac aagcacggtc 8700 aacttccgta ccgagccgca ggaaccgcag gagtggacgg acgacctcgt ccgtctgcgg 8760 gagcgctatc cctggctcgt cgccgaggtg gacggcgagg tcgccggcat cgcctacgcg 8820 ggcccctgga aggcacgcaa cgcctacgac tggacggccg agtcgaccgt gtacgtctcc 8880 ccccgccacc agcggacggg actgggctcc acgctctaca cccacctgct gaagtccctg 8940 gaggcacagg gcttcaagag cgtggtcgct gtcatcgggc tgcccaacga cccgagcgtg 9000 cgcatgcacg aggcgctcgg atatgccccc cgcggcatgc tgcgggcggc cggcttcaag 9060 cacgggaact ggcatgacgt gggtttctgg cagctggact tcagcctgcc ggtaccgccc 9120 cgtccggtcc tgcccgtcac cgagatctga gatcacccgt tctaggatcc gaagcagatc 9180 gttcaaacat ttggcaataa agtttcttaa gattgaatcc tgttgccggt cttgcgatga 9240 ttatcatata atttctgttg aattacgtta agcatgtaat aattaacatg taatgcatga 9300 cgttatttat gagatgggtt tttatgatta gagtcccgca attatacatt taatacgcga 9360 tagaaaacaa aatatagcgc gcaaactagg ataaattatc gcgcgcggtg tcatctatgt 9420 tactagatcg aaacataact tcgtatagca tacattatac gaagttatca aaacgtcgtg 9480 agacagtttg gttaactata acggtcctaa ggtagcgatc gaggcattac ggcattacgg 9540 cactcgcgag ggtccgaatc tatgtcgggt gcggagaaag aggtaatgaa atggcaattt 9600 acaattgaat atatcctgcc g 9621 <210> 15 <211> 7343 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TDNA comprising nucleic acid sequences encoding the expansin promoter, a Golgi retention peptide and a NODC protein <220> <221> misc_feature <222> (1)..(25) <223> right border repeat from the T-DNA of Agrobacterium tumefaciens (Zambryski, 1988) <220> <221> promoter <222> (26)..(913) <223> sequence including the promoter region of the expansin gene of Gossypium hirsutum (cotton) <220> <221> sig_peptide <222> (914)..(1018) <220> <221> gene <222> (1019)..(2209) <220> <221> 3'UTR <222> (2210)..(2442) <223> sequence including the 3?untranslated region of the 35S transcript of the Cauliflower Mosaic Virus (Sanfa?n et al., 1991) <220> <221> promoter <222> (2465)..(3303) <223> Pcwp: sequence including the promoter region of the expansin gene of Gossypium hirsutum (cotton) <220> <221> gene <222> (3304)..(5133) <223> gfaEc: coding region of the glutamine:fructose-6-phosphate amidotransferase gene of Escherichia coli (Frohberg and Essigmann, 2006) <220> <221> 3'UTR <222> (5134)..(5407) <223> 3?os: sequence including the 3' untranslated region of the nopaline synthase gene from the T-DNA of pTiT37 (Depicker et al., 1982) <220> <221> misc_feature <222> (5450)..(5449) <223> lox: sequence including the 34bp recognition sequence for the Cre recombinase of bacteriophage P1 (Hoess and Abremski, 1985) <220> <221> promoter <222> (5484)..(6320) <223> P35S3: sequence including the promoter region of the Cauliflower Mosaic Virus 35S transcript (Odell et al., 1985) <220> <221> gene <222> (6321)..(6872) <223> bar: the coding sequence of the phosphinothricin acetyltransferase gene of Streptomyces hygroscopicus (Thompson et al., 1987). <220> <221> 3'UTR <222> (6873)..(7156) <223> 3?os: sequence including the 3' untranslated region of the nopaline synthase gene from the T-DNA of pTiT37 (Depicker et al., 1982) <220> <221> misc_feature <222> (7157)..(7190) <223> lox: sequence including the 34bp recognition sequence for the Cre recombinase of bacteriophage P1 (Hoess and Abremski, 1985) <220> <221> misc_feature <222> (7319)..(7343) <223> left border repeat from the T-DNA of Agrobacterium tumefaciens (Zambryski, 1988) <400> 15 aattacaacg gtatatatcc tgccagtact gggccccctc gagggcgatc gctacgtacc 60 tgcagggcgg ccgcgggctg gtatcttttg attggcacaa acagtgcgaa caaagaagac 120 cacacaataa caattttaac aatatactaa tttaaatgaa aaattttcaa taatttaata 180 agttaaccga ggaaaactta ctaagagtta gttacccctg ttaaaataac tttcatgaag 240 taatagaaac ttttagtacg tatcatctta tatagaacaa tttctatttt cagaaagtca 300 agaaaattgt attctagaaa atggcgactt cttcaccttc agtccttccc tgatcggcgc 360 ttgtgaaaaa cgaaaaacct gagtctgatt ggctgactga aaatgaacct actcatcacc 420 attcactatt accaacttca aatgataggg gaattaactg gtaaagtgta actccaccga 480 tggttgaggt ggttggctgg agttaaatga gattttttta gttttgtttc aagtggcttc 540 aattgcaagc aattaggaga ctgcgctgga ataacccctc gctcaacctt ccgccattgt 600 tatggtttaa ttaaacatta tgtttccatc catctatatt tatatccatt aaaacaagcc 660 gttgagcaaa taatggatac tggataccat catatctatg attaaaattt tgcatgtgcc 720 cttttaatgt atagcttaag ccttaattat cctccaaatt tgtactcttt caccacttaa 780 ttggctacgt acggtactta gcgttgcttg tcatcttctg tactacaaac tctttctcat 840 tttgtataaa tagctataca ctttttctct cctcaaatca ataaggttag gtcagccaat 900 tgtttgagct accatgagta aacggaatcc gaagattctg aagatttttc tgtatatgtt 960 acttctcaac tctctctttc tcatcatcta cttcgttttt cactcatcgt cgttttcaag 1020 tgtcgtagat gtgatcggtt tgcttgcgac tgcagcctac gtgacgttgg cgagcgcata 1080 caaggtggtc cagttcatta acgtgtcgag cgtaacggat gtcgctggtc tcgaaagtga 1140 tgctttgccg ctcactccaa gggttgacgt tatcgtgccg acattcaatg agaactccag 1200 cacattgctc gagtgcgtcg cttctatatg cgcacaagac taccgcggac caataacgat 1260 tgtcgtggta gacgatgggt cgaccaacaa aacatcattt cacgcagtat gcgacaagta 1320 cgcgagcgac gaaaggttca tatttgtcga acttgatcaa aacaagggga agcgcgccgc 1380 gcaaatggag gccatcagga gaacagacgg agacctgata ctaaacgtag actcggacac 1440 ggttatagat aaggatgttg ttacaaagct tgcgtcgtcc atgagagccc cgaatgtcgg 1500 tggtgtcatg gggcagctcg ttgcaaagaa tcgagaaaga tcttggctta ccagattaat 1560 cgatatggag tactggcttg cgtgtaacga ggagcgcatt gcgcagtcga ggtttggctc 1620 cgtgatgtgt tgttgtgggc cgtgcgccat gtatagaaga tctgcaatta cgccactatt 1680 ggcagaatat gagcaccaga cattcctagg gcgtccgagc aactttggtg aggatcgcca 1740 tctcacaatc ctgatgctga aggcgggatt tcggaccggg tacgtcccag gtgccgtagc 1800 gaggacgttg gttccggatg ggctggcgcc gtacctgcgc cagcaactcc gctgggcccg 1860 cagcacttat cgcgacaccg ccctcgcctt acgtataaag aaaaatctaa gcaaatatat 1920 cacctttgag atatgcgcac agaatttggg tacggctctc ttacttgtga tgaccatgat 1980 ttcgctttcg ctgactacat cagggtcgca aacgcccgtt atcattctgg gtgtcgttgt 2040 ggggatgtct ataataagat gttgttctgt cgcccttata gcgaaagatt ttcggtttct 2100 atacttcatc gttcactcag cgttgaatgt tctaatttta acgccgttaa aactctatgc 2160 cctgttaacc attcgggata gtcggtggct atcacgcgag agttcctaag ctagcaagct 2220 tggacacgct gaaatcacca gtctctctct acaaatctat ctctctctat tttctccata 2280 ataatgtgtg agtagttccc agataaggga attagggttc ctatagggtt tcgctcatgt 2340 gttgagcata taagaaaccc ttagtatgta tttgtatttg taaaatactt ctatcaataa 2400 aatttctaat tcctaaaacc aaaatccagt actaaaatcc agcccgggtt aattaagcgg 2460 ccgcgggctg gtatcttttg attggcacaa acagtgcgaa caaagaagac cacacaataa 2520 caattttaac aatatactaa tttaaatgaa aaattttcaa taatttaata agttaaccga 2580 ggaaaactta ctaagagtta gttacccctg ttaaaataac tttcatgaag taatagaaac 2640 ttttagtacg tatcatctta tatagaacaa tttctatttt cagaaagtca agaaaattgt 2700 attctagaaa atggcgactt cttcaccttc agtccttccc tgatcggcgc ttgtgaaaaa 2760 cgaaaaacct gagtctgatt ggctgactga aaatgaacct actcatcacc attcactatt 2820 accaacttca aatgataggg gaattaactg gtaaagtgta actccaccga tggttgaggt 2880 ggttggctgg agttaaatga gattttttta gttttgtttc aagtggcttc aattgcaagc 2940 aattaggaga ctgcgctgga ataacccctc gctcaacctt ccgccattgt tatggtttaa 3000 ttaaacatta tgtttccatc catctatatt tatatccatt aaaacaagcc gttgagcaaa 3060 taatggatac tggataccat catatctatg attaaaattt tgcatgtgcc cttttaatgt 3120 atagcttaag ccttaattat cctccaaatt tgtactcttt caccacttaa ttggctacgt 3180 acggtactta gcgttgcttg tcatcttctg tactacaaac tctttctcat tttgtataaa 3240 tagctataca ctttttctct cctcaaatca ataaggttag gtcagccaat tgtttgagct 3300 accatgtgcg gaattgttgg tgctatcgcc caaagagacg ttgctgagat tttgttagag 3360 ggtctgcgaa ggctagagta tagaggatat gactccgctg gtctggctgt cgttgatgct 3420 gagggtcata tgacaaggct aagaaggtta ggaaaggttc agatgcttgc tcaggcagct 3480 gaggaacatc cattgcatgg aggtactggt attgcacata ccaggtgggc tactcatggg 3540 gagccatcag aagttaatgc tcatccacat gtgagtgagc atatcgttgt agttcacaat 3600 gggataattg aaaaccacga accattgagg gaagagttaa aggcaagagg atatactttt 3660 gtgagtgaga ctgacactga ggttattgca catttagtga actgggaact caaacagggg 3720 ggcacattgc gtgaggctgt gttaagagct attcctcaac ttagaggtgc atacggtact 3780 gttattatgg attcaagaca cccagatact ctccttgcag ctagatcagg tagtcccttg 3840 gtcataggac ttggaatggg tgaaaatttt atcgctagcg accaattggc cttattgcca 3900 gttacaagac gatttatttt ccttgaagag ggcgatattg ctgagattac tagaaggtct 3960 gtgaacatct ttgataagac tggcgctgag gttaaacgtc aggatatcga gtctaacctt 4020 caatacgatg ctggtgataa aggaatttac aggcattata tgcaaaagga aatttatgaa 4080 caaccaaatg ctatcaaaaa cacacttact ggccgtattt ctcatggaca ggtcgattta 4140 agcgagcttg gtcctaatgc agacgaactg ctatcaaaag ttgagcacat acagatactg 4200 gcatgcggaa ctagttataa ttcaggaatg gtgtctagat actggttcga aagcttggca 4260 ggtatacctt gtgatgtaga gatcgcttct gagtttaggt atagaaagtc tgctgtgcgt 4320 agaaattcat taatgattac attatctcaa tccggagaaa cagcagatac actggctgga 4380 ttgaggcttt ctaaggaact cggatatctg ggttcacttg ctatttgtaa tgtaccaggt 4440 tcctcattgg ttcgtgaatc agatctagca cttatgacaa atgcaggaac tgaaataggt 4500 gtggcaagta ccaaggcttt cacaacccaa ctgaccgtac ttttaatgtt ggtagcaaaa 4560 ctcagtcgat taaaggggct agatgcatct atcgaacatg atattgttca cgggcttcaa 4620 gctctccctt caagaattga acaaatgctt tcacaagata agagaataga ggcattggct 4680 gaagattttt ccgacaaaca tcacgcattg tttcttggac gtggcgatca atatccaatt 4740 gcattggaag gagctttgaa gttgaaagaa ataagttaca ttcacgcaga agcatatgca 4800 gctggagaac tcaagcatgg tcctttggca ctcatcgacg ctgacatgcc cgtgatcgta 4860 gtggctccta ataacgaact gctcgaaaag cttaaatcaa atatcgaaga ggttcgagct 4920 agaggaggtc agctttacgt tttcgctgaa caagatgctg gattcgtgtc aagcgataat 4980 atgcatataa ttgaaatgcc tcacgttgaa gaagtgattg cacctatatt ttatacagtc 5040 ccattgcaac ttctagctta ccatgttgca cttattaaag gaactgatgt tgatcagcct 5100 agaaacctag caaaatctgt aacagtcgaa taaacgcgtg gcgcgccgaa gcagatcgtt 5160 caaacatttg gcaataaagt ttcttaagat tgaatcctgt tgccggtctt gcgatgatta 5220 tcatataatt tctgttgaat tacgttaagc atgtaataat taacatgtaa tgcatgacgt 5280 tatttatgag atgggttttt atgattagag tcccgcaatt atacatttaa tacgcgatag 5340 aaaacaaaat atagcgcgca aactaggata aattatcgcg cgcggtgtca tctatgttac 5400 tagatcggaa ttcgatatca ttaccctgtt atccctaaag cttattaata taacttcgta 5460 tagcatacat tatacgaagt tatgtttcct acgcagcagg tctcatcaag acgatctacc 5520 cgagtaacaa tctccaggag atcaaatacc ttcccaagaa ggttaaagat gcagtcaaaa 5580 gattcaggac taattgcatc aagaacacag agaaagacat atttctcaag atcagaagta 5640 ctattccagt atggacgatt caaggcttgc ttcataaacc aaggcaagta atagagattg 5700 gagtctctaa aaaggtagtt cctactgaat ctaaggccat gcatggagtc taagattcaa 5760 atcgaggatc taacagaact cgccgtgaag actggcgaac agttcataca gagtctttta 5820 cgactcaatg acaagaagaa aatcttcgtc aacatggtgg agcacgacac tctggtctac 5880 tccaaaaatg tcaaagatac agtctcagaa gaccaaaggg ctattgagac ttttcaacaa 5940 aggataattt cgggaaacct cctcggattc cattgcccag ctatctgtca cttcatcgaa 6000 aggacagtag aaaaggaagg tggctcctac aaatgccatc attgcgataa aggaaaggct 6060 atcattcaag atgcctctgc cgacagtggt cccaaagatg gacccccacc cacgaggagc 6120 atcgtggaaa aagaagacgt tccaaccacg tcttcaaagc aagtggattg atgtgacatc 6180 tccactgacg taagggatga cgcacaatcc cactatcctt cgcaagaccc ttcctctata 6240 taaggaagtt catttcattt ggagaggaca cgctgaaatc accagtctct ctctataaat 6300 ctatctctct ctctataaca atggacccag aacgacgccc ggccgacatc cgccgtgcca 6360 ccgaggcgga catgccggcg gtctgcacca tcgtcaacca ctacatcgag acaagcacgg 6420 tcaacttccg taccgagccg caggaaccgc aggagtggac ggacgacctc gtccgtctgc 6480 gggagcgcta tccctggctc gtcgccgagg tggacggcga ggtcgccggc atcgcctacg 6540 cgggcccctg gaaggcacgc aacgcctacg actggacggc cgagtcgacc gtgtacgtct 6600 ccccccgcca ccagcggacg ggactgggct ccacgctcta cacccacctg ctgaagtccc 6660 tggaggcaca gggcttcaag agcgtggtcg ctgtcatcgg gctgcccaac gacccgagcg 6720 tgcgcatgca cgaggcgctc ggatatgccc cccgcggcat gctgcgggcg gccggcttca 6780 agcacgggaa ctggcatgac gtgggtttct ggcagctgga cttcagcctg ccggtaccgc 6840 cccgtccggt cctgcccgtc accgagatct gagatcaccc gttctaggat ccgaagcaga 6900 tcgttcaaac atttggcaat aaagtttctt aagattgaat cctgttgccg gtcttgcgat 6960 gattatcata taatttctgt tgaattacgt taagcatgta ataattaaca tgtaatgcat 7020 gacgttattt atgagatggg tttttatgat tagagtcccg caattataca tttaatacgc 7080 gatagaaaac aaaatatagc gcgcaaacta ggataaatta tcgcgcgcgg tgtcatctat 7140 gttactagat cgaaacataa cttcgtatag catacattat acgaagttat caaaacgtcg 7200 tgagacagtt tggttaacta taacggtcct aaggtagcga tcgaggcatt acggcattac 7260 ggcactcgcg agggtccgaa tctatgtcgg gtgcggagaa agaggtaatg aaatggcaat 7320 ttacaattga atatatcctg ccg 7343 <210> 16 <211> 10829 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TDNA comprising nucleic acid sequences encoding the E6 promoter, a Golgi retention peptide and a NODC protein <220> <221> misc_feature <222> (1)..(25) <223> right border repeat from the T-DNA of Agrobacterium tumefaciens (Zambryski, 1988) <220> <221> promoter <222> (26)..(2712) <223> sequence including the promoter region of the E6 gene of Gossypium barbadense (cotton) <220> <221> sig_peptide <222> (2713)..(2817) <220> <221> gene <222> (2818)..(4008) <220> <221> 3'UTR <222> (4009)..(4244) <223> sequence including the 3?untranslated region of the 35S transcript of the Cauliflower Mosaic Virus (Sanfa?n et al., 1991) <220> <221> promoter <222> (4262)..(6901) <223> Pcwp: sequence including the promoter region of the E6 gene of Gossypium barbadense (cotton) <220> <221> gene <222> (6902)..(8731) <223> gfaEc: coding region of the glutamine:fructose-6-phosphate amidotransferase gene of Escherichia coli (Frohberg and Essigmann, 2006) <220> <221> 3'UTR <222> (8732)..(9005) <223> 3?os: sequence including the 3' untranslated region of the nopaline synthase gene from the T-DNA of pTiT37 (Depicker et al., 1982) <220> <221> misc_feature <222> (9048)..(9085) <223> lox: sequence including the 34bp recognition sequence for the Cre recombinase of bacteriophage P1 (Hoess and Abremski, 1985) <220> <221> promoter <222> (9086)..(9918) <223> P35S3: sequence including the promoter region of the Cauliflower Mosaic Virus 35S transcript (Odell et al., 1985) <220> <221> gene <222> (9919)..(10470) <223> bar: the coding sequence of the phosphinothricin acetyltransferase gene of Streptomyces hygroscopicus (Thompson et al., 1987). <220> <221> 3'UTR <222> (10471)..(10750) <223> 3?os: sequence including the 3' untranslated region of the nopaline synthase gene from the T-DNA of pTiT37 (Depicker et al., 1982) <220> <221> misc_feature <222> (10751)..(10788) <223> lox: sequence including the 34bp recognition sequence for the Cre recombinase of bacteriophage P1 (Hoess and Abremski, 1985) <220> <221> misc_feature <222> (10805)..(10829) <223> left border repeat from the T-DNA of Agrobacterium tumefaciens (Zambryski, 1988) <400> 16 aattacaacg gtatatatcc tgccagtact gggccccctc gagggcgatc gctacgtacc 60 tgcagggcgg ccgcgtcaac ggatcaacat tcaattacaa taaagagtat agatagatac 120 atcaatacta tccagccctc tttcatgatg atgttgcaag ttttgcactc cacccccata 180 ttattatgaa gaggagaaat tcctgttaca acattaattg agctttattt tctaagaaat 240 gacttctaac attaataaat ttgaatcaat ttatagctat ttctcgtact ctttcgtagt 300 atagctttct ttttatgcta aaacaggaga tgattataag acgtgaagtt gtcttaagat 360 taacaaggca gttagatgca tttaaattgg tatttaagga tatgtctgta tataactaga 420 actaattaag attacaatac actgcaaaat gattccacct tttttttttt tttggttctc 480 tcttttatat gatcaaatac aatgttgata tgaacaaggt tttgcagttg tagaaaatcg 540 tggaggactt tttttttaaa aaaagaaaga taaaattcat aaaaaaatgt gaagttaagc 600 atatttagtg atgggtgggg tatggggtgg tttgctaaca tggaatgcgc atggcagatt 660 ggcactttaa agaagggatg gggccgaggg ggcgggagtt gttaaatcct cggcgtagaa 720 aaaggtcagt aagcgtgtcc ctggcattag acaaggagag ggggtagcac atgcacagcc 780 caactatatc tctttatttt atgtcccact ccactccccc tcatctctgc cgcaacatta 840 aataccttat gcatccttac tattcataat ggtttttttt gttgggttga tgttacaaaa 900 ttaaattttt tattatagat gtattaatat ttttaaaaat atataagatt ttttttaagt 960 aggagtttaa tctttggtgg tgatgttgat tttagatata ttccccaccc gcaagtagat 1020 atcatacatt ctaatataat ttaaaaaaaa gtataactaa aatatatttt atattttttt 1080 atattttttt gaatttttaa attttaaaaa attaattaaa tgttcatgtg tcatctacat 1140 gtatgcaacg ttagcgaagt ttaaaatata ttaatttttt cattcgtgat ttgaaaaaaa 1200 aaaggtaagt ttaaaggtta aacaagcata aatctaaata aatagttaaa ataatttttt 1260 ttataaagtt agagaattaa ataaattatt attttattta aaaataattt tcaataaatt 1320 actaatttag tcacataatc taatataatt taaaaaataa ttattaacat tttaatttgt 1380 atgaattctt gttatgtatg gattcaaacc cgttcgttcc atcaacaaat tgatctgcat 1440 gagacttaag ggttagaatt ttgtgtaacc ctttttcctc ctaattttta cttttaaaaa 1500 gaaattgcaa tacaattttt tttttataga attctcctat ttttatttat ttatttgctt 1560 aggaagtttt actgacactg cttttatttt tccatcaatc aaatttaaga gacaattcac 1620 tttttataat taacaaaaaa aaacaaaaag aaaataaaag aaattacttt tttctttttc 1680 gtgttcgata caagatagat gaaatatgaa aaataaaatg aaatgaaaat atattactag 1740 tgatatatga cctccattat gtaggggaaa gaaataaaaa ttatattaat ttatgatact 1800 tccataatgt ggttaaaaat aattatctag tatttttttg taaaaaaaaa aaagttgata 1860 tctatgctac taatgaggtt tcttagtgag tttgttacta ctaataaagt ttatttgcat 1920 ggttgagacc ttatgctttt caaataccca tatttgaatt ttaaaaattg tgaattttta 1980 ttatatttaa aaaacaagtt atttatataa ctagtaatgt attattttga ctttttttta 2040 atcgagttaa tgttggttat ttcgttatac caattcaata aaatatttta tttatattaa 2100 attatagcat acctcacgat gtgggtgaag taaaattatt taacaaatat attttgaaaa 2160 attgataaaa atactaaatg aggttttggt tgaatagtaa gatataatta ttacaaatta 2220 taaatatgta ggttcaaaat ctatcatgtg tatatttgta ctattattct atataaattg 2280 ataaccttat aaaagtatct aatttagttt atggttgatt gatcgataat accaaattta 2340 ttaaaaatta atattagtaa agatatatag tacaaaacta aacataaaat tttatatgtt 2400 aaggaaatag cggaaaaaat atcatatttg tagaactgtt tagcagtgtg ggagaatggg 2460 atcattacaa ggaaaaatga aatatatatc attaatacca aacataaaag aaagcgtctt 2520 ttgataaagt tgttattggt gtaatgtgaa gggaccacaa tcatcaccat tcaccacttg 2580 ctcctaattg agttgaaatc tttttacaac atagaaaact agaagatcgc cctttcttgc 2640 ttcatatata tagattttgt atcatcgcaa tttcacatca cacacacaag taaagcatta 2700 gcaaccatag ccatgagtaa acggaatccg aagattctga agatttttct gtatatgtta 2760 cttctcaact ctctctttct catcatctac ttcgtttttc actcatcgtc gttttcaagt 2820 gtcgtagatg tgatcggttt gcttgcgact gcagcctacg tgacgttggc gagcgcatac 2880 aaggtggtcc agttcattaa cgtgtcgagc gtaacggatg tcgctggtct cgaaagtgat 2940 gctttgccgc tcactccaag ggttgacgtt atcgtgccga cattcaatga gaactccagc 3000 acattgctcg agtgcgtcgc ttctatatgc gcacaagact accgcggacc aataacgatt 3060 gtcgtggtag acgatgggtc gaccaacaaa acatcatttc acgcagtatg cgacaagtac 3120 gcgagcgacg aaaggttcat atttgtcgaa cttgatcaaa acaaggggaa gcgcgccgcg 3180 caaatggagg ccatcaggag aacagacgga gacctgatac taaacgtaga ctcggacacg 3240 gttatagata aggatgttgt tacaaagctt gcgtcgtcca tgagagcccc gaatgtcggt 3300 ggtgtcatgg ggcagctcgt tgcaaagaat cgagaaagat cttggcttac cagattaatc 3360 gatatggagt actggcttgc gtgtaacgag gagcgcattg cgcagtcgag gtttggctcc 3420 gtgatgtgtt gttgtgggcc gtgcgccatg tatagaagat ctgcaattac gccactattg 3480 gcagaatatg agcaccagac attcctaggg cgtccgagca actttggtga ggatcgccat 3540 ctcacaatcc tgatgctgaa ggcgggattt cggaccgggt acgtcccagg tgccgtagcg 3600 aggacgttgg ttccggatgg gctggcgccg tacctgcgcc agcaactccg ctgggcccgc 3660 agcacttatc gcgacaccgc cctcgcctta cgtataaaga aaaatctaag caaatatatc 3720 acctttgaga tatgcgcaca gaatttgggt acggctctct tacttgtgat gaccatgatt 3780 tcgctttcgc tgactacatc agggtcgcaa acgcccgtta tcattctggg tgtcgttgtg 3840 gggatgtcta taataagatg ttgttctgtc gcccttatag cgaaagattt tcggtttcta 3900 tacttcatcg ttcactcagc gttgaatgtt ctaattttaa cgccgttaaa actctatgcc 3960 ctgttaacca ttcgggatag tcggtggcta tcacgcgaga gttcctaagc tagcaagctt 4020 ggacacgctg aaatcaccag tctctctcta caaatctatc tctctctatt ttctccataa 4080 taatgtgtga gtagttccca gataagggaa ttagggttcc tatagggttt cgctcatgtg 4140 ttgagcatat aagaaaccct tagtatgtat ttgtatttgt aaaatacttc tatcaataaa 4200 atttctaatt cctaaaacca aaatccagta ctaaaatcca gcccgggtta attaagcggc 4260 cgcgtcaacg gatcaacatt caattacaat aaagagtata gatagataca tcaatactat 4320 ccagccctct ttcatgatga tgttgcaagt tttgcactcc acccccatat tattatgaag 4380 aggagaaatt cctgttacaa cattaattga gctttatttt ctaagaaatg acttctaaca 4440 ttaataaatt tgaatcaatt tatagctatt tctcgtactc tttcgtagta tagctttctt 4500 tttatgctaa aacaggagat gattataaga cgtgaagttg tcttaagatt aacaaggcag 4560 ttagatgcat ttaaattggt atttaaggat atgtctgtat ataactagaa ctaattaaga 4620 ttacaataca ctgcaaaatg attccacctt tttttttttt ttggttctct cttttatatg 4680 atcaaataca atgttgatat gaacaaggtt ttgcagttgt agaaaatcgt ggaggacttt 4740 ttttttaaaa aaagaaagat aaaattcata aaaaaatgtg aagttaagca tatttagtga 4800 tgggtggggt atggggtggt ttgctaacat ggaatgcgca tggcagattg gcactttaaa 4860 gaagggatgg ggccgagggg gcgggagttg ttaaatcctc ggcgtagaaa aaggtcagta 4920 agcgtgtccc tggcattaga caaggagagg gggtagcaca tgcacagccc aactatatct 4980 ctttatttta tgtcccactc cactccccct catctctgcc gcaacattaa ataccttatg 5040 catccttact attcataatg gttttttttg ttgggttgat gttacaaaat taaatttttt 5100 attatagatg tattaatatt tttaaaaata tataagattt tttttaagta ggagtttaat 5160 ctttggtggt gatgttgatt ttagatatat tccccacccg caagtagata tcatacattc 5220 taatataatt taaaaaaaag tataactaaa atatatttta tattttttta tatttttttg 5280 aatttttaaa ttttaaaaaa ttaattaaat gttcatgtgt catctacatg tatgcaacgt 5340 tagcgaagtt taaaatatat taattttttc attcgtgatt tgaaaaaaaa aaggtaagtt 5400 taaaggttaa acaagcataa atctaaataa atagttaaaa taattttttt tataaagtta 5460 gagaattaaa taaattatta ttttatttaa aaataatttt caataaatta ctaatttagt 5520 cacataatct aatataattt aaaaaataat tattaacatt ttaatttgta tgaattcttg 5580 ttatgtatgg attcaaaccc gttcgttcca tcaacaaatt gatctgcatg agacttaagg 5640 gttagaattt tgtgtaaccc tttttcctcc taatttttac ttttaaaaag aaattgcaat 5700 acaatttttt ttttatagaa ttctcctatt tttatttatt tatttgctta ggaagtttta 5760 ctgacactgc ttttattttt ccatcaatca aatttaagag acaattcact ttttataatt 5820 aacaaaaaaa aacaaaaaga aaataaaaga aattactttt ttctttttcg tgttcgatac 5880 aagatagatg aaatatgaaa aataaaatga aatgaaaata tattactagt gatatatgac 5940 ctccattatg taggggaaag aaataaaaat tatattaatt tatgatactt ccataatgtg 6000 gttaaaaata attatctagt atttttttgt aaaaaaaaaa aagttgatat ctatgctact 6060 aatgaggttt cttagtgagt ttgttactac taataaagtt tatttgcatg gttgagacct 6120 tatgcttttc aaatacccat atttgaattt taaaaattgt gaatttttat tatatttaaa 6180 aaacaagtta tttatataac tagtaatgta ttattttgac ttttttttaa tcgagttaat 6240 gttggttatt tcgttatacc aattcaataa aatattttat ttatattaaa ttatagcata 6300 cctcacgatg tgggtgaagt aaaattattt aacaaatata ttttgaaaaa ttgataaaaa 6360 tactaaatga ggttttggtt gaatagtaag atataattat tacaaattat aaatatgtag 6420 gttcaaaatc tatcatgtgt atatttgtac tattattcta tataaattga taaccttata 6480 aaagtatcta atttagttta tggttgattg atcgataata ccaaatttat taaaaattaa 6540 tattagtaaa gatatatagt acaaaactaa acataaaatt ttatatgtta aggaaatagc 6600 ggaaaaaata tcatatttgt agaactgttt agcagtgtgg gagaatggga tcattacaag 6660 gaaaaatgaa atatatatca ttaataccaa acataaaaga aagcgtcttt tgataaagtt 6720 gttattggtg taatgtgaag ggaccacaat catcaccatt caccacttgc tcctaattga 6780 gttgaaatct ttttacaaca tagaaaacta gaagatcgcc ctttcttgct tcatatatat 6840 agattttgta tcatcgcaat ttcacatcac acacacaagt aaagcattag caaccatagc 6900 catgtgcgga attgttggtg ctatcgccca aagagacgtt gctgagattt tgttagaggg 6960 tctgcgaagg ctagagtata gaggatatga ctccgctggt ctggctgtcg ttgatgctga 7020 gggtcatatg acaaggctaa gaaggttagg aaaggttcag atgcttgctc aggcagctga 7080 ggaacatcca ttgcatggag gtactggtat tgcacatacc aggtgggcta ctcatgggga 7140 gccatcagaa gttaatgctc atccacatgt gagtgagcat atcgttgtag ttcacaatgg 7200 gataattgaa aaccacgaac cattgaggga agagttaaag gcaagaggat atacttttgt 7260 gagtgagact gacactgagg ttattgcaca tttagtgaac tgggaactca aacagggggg 7320 cacattgcgt gaggctgtgt taagagctat tcctcaactt agaggtgcat acggtactgt 7380 tattatggat tcaagacacc cagatactct ccttgcagct agatcaggta gtcccttggt 7440 cataggactt ggaatgggtg aaaattttat cgctagcgac caattggcct tattgccagt 7500 tacaagacga tttattttcc ttgaagaggg cgatattgct gagattacta gaaggtctgt 7560 gaacatcttt gataagactg gcgctgaggt taaacgtcag gatatcgagt ctaaccttca 7620 atacgatgct ggtgataaag gaatttacag gcattatatg caaaaggaaa tttatgaaca 7680 accaaatgct atcaaaaaca cacttactgg ccgtatttct catggacagg tcgatttaag 7740 cgagcttggt cctaatgcag acgaactgct atcaaaagtt gagcacatac agatactggc 7800 atgcggaact agttataatt caggaatggt gtctagatac tggttcgaaa gcttggcagg 7860 tataccttgt gatgtagaga tcgcttctga gtttaggtat agaaagtctg ctgtgcgtag 7920 aaattcatta atgattacat tatctcaatc cggagaaaca gcagatacac tggctggatt 7980 gaggctttct aaggaactcg gatatctggg ttcacttgct atttgtaatg taccaggttc 8040 ctcattggtt cgtgaatcag atctagcact tatgacaaat gcaggaactg aaataggtgt 8100 ggcaagtacc aaggctttca caacccaact gaccgtactt ttaatgttgg tagcaaaact 8160 cagtcgatta aaggggctag atgcatctat cgaacatgat attgttcacg ggcttcaagc 8220 tctcccttca agaattgaac aaatgctttc acaagataag agaatagagg cattggctga 8280 agatttttcc gacaaacatc acgcattgtt tcttggacgt ggcgatcaat atccaattgc 8340 attggaagga gctttgaagt tgaaagaaat aagttacatt cacgcagaag catatgcagc 8400 tggagaactc aagcatggtc ctttggcact catcgacgct gacatgcccg tgatcgtagt 8460 ggctcctaat aacgaactgc tcgaaaagct taaatcaaat atcgaagagg ttcgagctag 8520 aggaggtcag ctttacgttt tcgctgaaca agatgctgga ttcgtgtcaa gcgataatat 8580 gcatataatt gaaatgcctc acgttgaaga agtgattgca cctatatttt atacagtccc 8640 attgcaactt ctagcttacc atgttgcact tattaaagga actgatgttg atcagcctag 8700 aaacctagca aaatctgtaa cagtcgaata aacgcgtggc gcgccgaagc agatcgttca 8760 aacatttggc aataaagttt cttaagattg aatcctgttg ccggtcttgc gatgattatc 8820 atataatttc tgttgaatta cgttaagcat gtaataatta acatgtaatg catgacgtta 8880 tttatgagat gggtttttat gattagagtc ccgcaattat acatttaata cgcgatagaa 8940 aacaaaatat agcgcgcaaa ctaggataaa ttatcgcgcg cggtgtcatc tatgttacta 9000 gatcggaatt cgatatcatt accctgttat ccctaaagct tattaatata acttcgtata 9060 gcatacatta tacgaagtta tgtttcctac gcagcaggtc tcatcaagac gatctacccg 9120 agtaacaatc tccaggagat caaatacctt cccaagaagg ttaaagatgc agtcaaaaga 9180 ttcaggacta attgcatcaa gaacacagag aaagacatat ttctcaagat cagaagtact 9240 attccagtat ggacgattca aggcttgctt cataaaccaa ggcaagtaat agagattgga 9300 gtctctaaaa aggtagttcc tactgaatct aaggccatgc atggagtcta agattcaaat 9360 cgaggatcta acagaactcg ccgtgaagac tggcgaacag ttcatacaga gtcttttacg 9420 actcaatgac aagaagaaaa tcttcgtcaa catggtggag cacgacactc tggtctactc 9480 caaaaatgtc aaagatacag tctcagaaga ccaaagggct attgagactt ttcaacaaag 9540 gataatttcg ggaaacctcc tcggattcca ttgcccagct atctgtcact tcatcgaaag 9600 gacagtagaa aaggaaggtg gctcctacaa atgccatcat tgcgataaag gaaaggctat 9660 cattcaagat gcctctgccg acagtggtcc caaagatgga cccccaccca cgaggagcat 9720 cgtggaaaaa gaagacgttc caaccacgtc ttcaaagcaa gtggattgat gtgacatctc 9780 cactgacgta agggatgacg cacaatccca ctatccttcg caagaccctt cctctatata 9840 aggaagttca tttcatttgg agaggacacg ctgaaatcac cagtctctct ctataaatct 9900 atctctctct ctataacaat ggacccagaa cgacgcccgg ccgacatccg ccgtgccacc 9960 gaggcggaca tgccggcggt ctgcaccatc gtcaaccact acatcgagac aagcacggtc 10020 aacttccgta ccgagccgca ggaaccgcag gagtggacgg acgacctcgt ccgtctgcgg 10080 gagcgctatc cctggctcgt cgccgaggtg gacggcgagg tcgccggcat cgcctacgcg 10140 ggcccctgga aggcacgcaa cgcctacgac tggacggccg agtcgaccgt gtacgtctcc 10200 ccccgccacc agcggacggg actgggctcc acgctctaca cccacctgct gaagtccctg 10260 gaggcacagg gcttcaagag cgtggtcgct gtcatcgggc tgcccaacga cccgagcgtg 10320 cgcatgcacg aggcgctcgg atatgccccc cgcggcatgc tgcgggcggc cggcttcaag 10380 cacgggaact ggcatgacgt gggtttctgg cagctggact tcagcctgcc ggtaccgccc 10440 cgtccggtcc tgcccgtcac cgagatctga gatcacccgt tctaggatcc gaagcagatc 10500 gttcaaacat ttggcaataa agtttcttaa gattgaatcc tgttgccggt cttgcgatga 10560 ttatcatata atttctgttg aattacgtta agcatgtaat aattaacatg taatgcatga 10620 cgttatttat gagatgggtt tttatgatta gagtcccgca attatacatt taatacgcga 10680 tagaaaacaa aatatagcgc gcaaactagg ataaattatc gcgcgcggtg tcatctatgt 10740 tactagatcg aaacataact tcgtatagca tacattatac gaagttatat tcgagcatgg 10800 agccatttac aattgaatat atcctgccg 10829

Claims

i. 1. 식물 발현성 프로모터;
2. 골지체 막에 표적용 신호 고정 서열에 융합된 뿌리혹 형성 C 단백질을 암호화하는 DNA 영역; 및
3. 전사 종결 및 폴리아데닐화 영역
을 포함하는 키메릭 유전자를 상기 식물 세포에 도입시키거나 제공함
을 포함하는,
식물 세포벽, 특히 식물 세포의 2 차 세포벽에서 양으로 하전된 올리고당의 제조 방법.
제 1 항에 있어서,
식물로의 식물 세포의 재생 단계를 더 포함하는, 방법.
제 2 항에 있어서,
식물의 뿌리 길이가 뿌리혹 형성 C 단백질을 포함하지 않은 야생형 식물의 뿌리 길이와 본질적으로 동일한 것이 특징인, 방법.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
양으로 하전된 올리고당이 2 내지 10의 중합도로 β-1-4 결합된 N-아세틸글루코사민으로 구성된, 방법.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
신호 고정 서열이 쥐 시알릴 트랜스퍼라제의 신호 고정 서열, 인간 갈락토실 트랜스퍼라제의 신호 고정 서열, 효모 HDEL 수용체(AtERD2)의 아라비돕시스(Arabidopsis) 동족체의 신호 고정 서열, α-2,6-시알릴트랜스퍼라제의 신호 고정 서열, 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)로부터의 β-1,2-자일로실트랜스퍼라제의 신호 고정 서열, 담배로부터의 N-아세틸글루코사미닐 트랜스퍼라제 I의 신호 고정 서열 또는 아미노산 서열 YYHDL 또는 LKLEI로부터 선택된, 방법.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
DNA 영역이 라이조비움(Rhizobium) 종, 아조라이조비움(Azorhizobium) 종, 브라디라이조비움(Bradyrhizobium) 종, 메조라이조비움(Mesorhizobium) 종, 랄스토니아(Ralstonia) 종, 스트렙토마이세스(Streptomyces) 종, 부르콜데리아(Burkholderia) 종, 쿠프리아비두스(Cupriavidus) 종, 시노라이조비움(Sinorhizobium) 종, 디설포박테리움(Desulfobacterium) 종, 독도니아(Dokdonia) 종, 메틸로박테리움(Methylobacterium) 종, 필로박테리움(Phyllobacterium) 종 또는 사이크로플렉수스(Psychroflexus) 종으로부터 수득가능한 뿌리혹 형성 C 단백질을 암호화하는, 방법.
제 6 항에 있어서,
뿌리혹 형성 C 단백질이 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6, 서열 번호 7, 서열 번호 8, 서열 번호 9, 1615305C, 1615305D, 1615305E, AAA26226, AAA63602, AAB16897, AAB24745, AAB34509, AAB47353, AAB51164, AAB71694, AAB91695, AAB95329, AAC80567, AAD11313, AAD11315, AAD11317, AAD11319, AAD11321, AAD11323, AAD11325, AAD11327, AAD11329, AAD11331, AAD11333, AAD11335, AAD11337, AAD11339, AAD11341, AAD11343, AAD11345, AAD11347, AAD11349, AAD11351, AAD11353, AAD11355, AAD11357, AAD11359, AAD11361, AAD11363, AAD11365, AAD11367, AAD11369, AAD11371, AAD11373, AAD11375, AAD11377, AAD11379, AAD11381, AAD11383, AAD11385, AAD11387, AAD11389, AAD11391, AAD11393, AAD11395, AAD11397, AAD11399, AAD11401, AAD11403, AAD11405, AAG60998, AAK00157, AAK39956, AAK39957, AAK39958, AAK39959, AAK39960, AAK39961, AAK39962, AAK39963, AAK39964, AAK39965, AAK39966, AAK39967, AAK50872, AAK65131, AAL88670, AAN62903, AAS91748, AAU11338, AAU11339, AAU11340, AAU11341, AAU11342, AAU11343, AAU11344, AAU11345, AAU11346, AAU11347, AAU11348, AAU11349, AAU11350, AAU11351, AAU11352, AAU11353, AAU11354, AAU11355, AAU11356, AAU11357, AAU11358, AAU11359, AAU11360, AAU11361, AAU11362, AAU11363, AAU11364, AAU11365, AAX30049, AAX30050, AAY44091, AAY44092, AAY44093, AAY89044, AAZ81541, ABC40958, ABC67303, ABD39006, ABD39007, ABD39008, ABD39009, ABD39010, ABD39011, ABD39012, ABD39013, ABD39014, ABD39015, ABD39016, ABD39017, ABD39018, ABD39019, ABD39020, ABD39021, ABD39022, ABD39023, ABD39024, ABD39025, ABD39026, ABD39027, ABD39028, ABD39029, ABD39030, ABD39031, ABD39032, ABD39033, ABD39034, ABD39035, ABD39036, ABD39037, ABD39038, ABD67413, ABD67416, ABD67419, ABD67422, ABD67425, ABD67428, ABD67431, ABD67434, ABD73319, ABD73320, ABD73321, ABD73322, ABD73323, ABD73324, ABD73325, ABD73326, ABD73327, ABD73328, ABD73329, ABD73330, ABD94161, ABD94162, ABD94163, ABD94164, ABD94165, ABF93198, ABF93199, ABF93200, ABF93201, ABF93202, ABM69186, ABM69187, ABM69188, ABM69189, ABM69190, ABN09217, ABN09218, ABN09219, ABN11177, ABN11178, ABN11179, ABP93834, ABS85176, ABS85177, ABS85178, ABS85179, ABS85180, ABS85181, ABS85182, ABU69044, ABU69045, ABU69046, ABU69047, ABU69048, ABU69049, ABU69050, ABU69051, ABU69052, ABU69053, ABU69054, ABU69055, ABU69056, ABU69057, ABU69058, ABU69059, ABU69060, ABU69061, ABU89879, ABV25689, ABV25690, ABV25691, ABV25692, ABV25693, ABV25694, ABW96196, ABW96197, ABW96198, ABW96199, ABW96200, ABW96201, ABW96202, ABW96203, ABW96204, ABW96205, ABW96206, ABW96207, ABW96208, ABW96209, ABW96210, ABW96211, ABY59633, ABY59634, ABY59635, ABY59636, ABY59637, ACA80309, ACA80310, ACA80311, ACA80312, ACA80313, ACC77565, ACD39337, ACD39338, ACD39339, ACD39340, ACD39341, ACD39342, ACD39343, ACD39344, ACD39345, ACD39346, ACD39347, ACD62595, ACD63093, ACD63094, ACD63095, ACD63096, ACD63097, ACD63098, ACD63099, ACD63100, ACD63101, ACD63102, ACD63103, ACD63104, ACF19762, ACF19763, ACF19764, ACF19765, ACF19766, ACF19767, ACF19768, ACF19769, ACF19770, ACH91221, ACH91222, ACH91223, ACH91224, ACH91225, ACH91226, ACH91227, ACH91228, ACH91229, ACH91230, ACH91231, ACH91232, ACH91233, ACH91242, ACH91243, ACH91244, ACH91245, ACH91246, ACH91247, ACH91248, ACH91249, ACI47333, ACI47334, ACI47335, ACI47336, ACI47337, ACI47338, ACI47339, ACI47340, ACI47341, ACI47342, ACI47343, ACI47344, ACI47345, ACL12058, ACL12059, ACL50517, ACL50518, ACL50519, ACL50520, ACL50521, ACL50522, ACL50523, ACM69382, ACM79634, ACM79635, ACM79636, ACM79637, ACM79638, ACM79639, ACM79640, ACM79641, ACM79642, ACM79643, ACM79644, ACM79645, ACM79646, ACN17701, ACN69201, ACN69202, ACN69203, ACN69204, ACN69205, ACN69206, ACN69207, ACN69208, ACN69209, ACN69210, ACN69211, ACN69212, ACN69213, ACO58664, ACO58665, ACO58666, ACO58667, ACO58668, ACO58669, ACO58670, ACO58671, ACO58672, ACO58673, ACO58674, ACO58675, ACP40990, ACS35430, ACS35434, ACT34091, ACT34094, ACT34097, ACT34100, ACT34101, ACT34104, ACT34107, ACT34110, ACT34113, ACT34116, ACT34119, ACT34122, ACT34125, ACT34128, ACT34131, ACT34134, ACT34137, ACT34140, ACT34143, ACV52950, ACV52951, ACV52952, ACV52953, ACV52954, ACV52955, ACX47326, ACX47327, ACX47328, ACX47329, ACX47330, ACX47331, ACX47332, ACX47333, ACX47334, ACY02884, ACY78518, ACZ52692, ACZ52693, ACZ52694, ACZ52695, ACZ52696, ACZ52697, ADD20957, ADD20958, ADD20959, ADD20960, ADD20961, ADD20962, ADD20963, ADD20964, ADD20965, ADD20966, ADD20967, ADD20968, ADD20969, ADD20970, ADD20971, ADG63645, ADG63646, ADG63647, ADG63648, ADG63649, ADG63650, ADG63651, ADG63652, ADJ18191, ADJ18192, BAA06082, BAA06083, BAA06084, BAA06085, BAA06086, BAA06087, BAA06088, BAA06089, BAA06090, BAA24092, BAB52500, C26813, CAA25810, CAA25811, CAA25814, CAA26310, CAA26311, CAA51773, CAA51774, CAA608779, CAA67139, CAB56055, CAC42489, CAD29949, CAD29950, CAD29951, CAD29952, CAD29953, CAD29954, CAD29955, CAD29956, CAD29957, CAD31533, CAD43933, CAD90257, CAD90583, CAD90584, CAD90585, CAD90586, CAD90587, CAD90588, CAH04369, CAN84684, CAP64017, EAQ38847, EAS72439, NP_106714, NP_435719, NP_443883, P04340, P04341, P04677, P04678, P04679, P06234, P06235, P17862, P24151, P26024, P50357, P53417, P72334, Q07755, Q53513, YP_001796208, YP_002605865, ZP_01050448 또는 ZP_01252570의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
골지 신호 고정 서열에 융합된 NODC가 서열 번호 11의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
식물 발현성 프로모터가 섬유 특이적 프로모터인, 방법.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
식물 발현성 프로모터가 목화로부터의 베타 튜불린 유전자의 섬유 특이적 프로모터, 목화로부터의 액틴 유전자로부터의 섬유 특이적 프로모터, 목화로부터의 지질 전달 단백질 유전자로부터의 섬유 특이적 프로모터, 종피로부터의 프로모터 및 목화로부터의 섬유 특이적 프로테아제, 목화로부터의 섬유 특이적 R2R3 MYB 유전자로부터의 프로모터, 목화로부터의 익스팬신 유전자로부터의 프로모터 또는 목화에서의 키티나아제 유전자로부터의 프로모터로부터 선택된 섬유 특이적 프로모터인, 방법.
제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
식물이 목화, 대마 또는 아마로부터 선택된, 방법.
제 11 항에 있어서,
목화 식물 중의 식물 세포벽이 섬유를 포함하는, 방법.
제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
N-아세틸글루코사민 단량체로 구성된 올리고당을 탈아세틸화하기에 충분한 시간 동안 식물로부터의 세포벽을 알칼리 용액으로 처리함으로써, 또는 키틴 데아세틸라제의 효소 작용을 통해, N-아세틸글루코사민 단량체로 구성된 올리고당을 탈아세틸화하는 단계를 더 포함하는, 방법.
제 2 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
식물로부터 식물 세포벽 또는 섬유를 분리하는 단계를 더 포함하는, 방법.
제 2 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
식물의 세포벽이 2 차 식물 세포벽인, 방법.
제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 기재된 키메릭 유전자.
제 16 항의 키메릭 유전자를 포함하는 식물 세포.
제 17 항의 식물 세포로 본질적으로 구성된 식물.
제 18 항에 있어서,
식물의 뿌리 길이가 NODC를 포함하지 않은 야생형 식물의 뿌리 길이와 본질적으로 동일한 것이 특징인, 식물.
제 18 항 또는 제 19 항에 있어서,
목화인, 식물.
제 20 항의 목화 식물로부터의 섬유.
제 21 항에 따른 면 섬유로부터 만들어진 얀 또는 직물.
식물 세포의 세포벽 중에 양으로 하전된 올리고당의 양을 증가시키기 위한, 또는 이러한 식물 세포벽의 화학적 개질을 위하여 식물 세포벽의 반응성을 증가시키기 위한 제 16 항의 키메릭 유전자의 용도.
식물의 뿌리 길이가 NODC를 포함하지 않은 동질유전자 식물의 뿌리 길이와 본질적으로 동일한 것이 특징인 세포벽 중에 양으로 하전된 올리고당을 갖는 식물을 제조하기 위한 제 16 항의 키메릭 유전자의 용도.
섬유 중에 양으로 하전된 올리고당을 갖는 목화 식물을 제조하기 위한 제 16 항의 키메릭 유전자의 용도.
개선된 반응성, 예컨대 개선된 염색성을 갖는 면 섬유를 제조하기 위한 제 16 항의 키메릭 유전자의 용도.
개선된 반응성, 예컨대 개선된 염색성을 갖는 얀 및 직물을 제조하기 위한 제 16 항의 키메릭 유전자의 용도.
제 21 항의 섬유 또는 제 22 항의 얀 또는 직물을 제공하는 것 및 섬유, 얀 또는 직물에 반응성이 있는 염료를 도포하는 것을 포함하는, 면 섬유, 얀 또는 직물의 염색 방법.