CN103134885A - 一种氨氯地平、缬沙坦和氢氯噻嗪复方制剂溶出度的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种同时检测氨氯地平、缬沙坦和氢氯噻嗪复方制剂中三种组分溶出度的方法：以pH6.8的磷酸盐缓冲液为溶出介质，采用HPLC法测定溶出介质中三组分的含量，色谱条件为：C₁₈色谱柱，磷酸盐水溶液-乙腈混合溶液为流动相，其中磷酸盐水溶液的pH值为3.0-5.0，磷酸盐水溶液与乙腈体积比为50:50-60:40，检测波长为220-240nm。本发明方法可实现三组分有效分离，快速、准确检测三组分在溶出介质中的含量，进一步计算出溶出度。

Description

一种氨氯地平、缬沙坦和氢氯噻嗪复方制剂溶出度的检测方法

技术领域

本发明涉及一种高效液相色谱检测方法，具体涉及一种同时检测氨氯地平、缬沙坦和氢氯噻嗪复方制剂中三种组分溶出度的高效液相色谱法。

背景技术

高血压是最常见的心血管疾病之一。氨氯地平、缬沙坦和氢氯噻嗪作为高血压治疗领域的常用药物，其治疗效果已得到众多患者肯定。同时三种活性成分的联合使用不仅降压效果优于任两种联用，而且降低了单方降压药的副作用，为众多高血压患者带来了新的选择。

瑞士诺华公司开发的苯磺酸氨氯地平、缬沙坦和氢氯噻嗪复方制剂Exforge HCT，已被美国FDA批准为需要多种药物治疗以使血压达标的高血压患者的一线用药。

溶出度是药典规定的口服固体制剂质量控制的重要指标之一。溶出度的测定包括溶出和溶出量测定两个阶段，即首先将制剂按照药典规定的溶出方法在溶出介质中溶出，然后将含有药物成分的溶出介质按照药典规定的溶出量测定方法进行测定，进而计算出制剂的溶出度。

目前，现有技术中没有关于氨氯地平、缬沙坦和氢氯噻嗪复方制剂溶出度测定方法的相关报道，只在美国药典中，公开了对缬沙坦和氢氯噻嗪复方片剂的溶出度测定方法如下：溶出阶段，以0.05MpH6.8的磷酸盐缓冲液为溶出介质，桨法，使片剂溶出；溶出量测定阶段，取溶有药物的溶出介质稀释成适宜的浓度后，采用分光光度法分别测算氢氯噻嗪、缬沙坦在272nm、250nm的吸光度，进而计算缬沙坦、氢氯噻嗪的溶出度。分光光度法为常用的物质定性定量方法，但该方法更适合单方制剂，用于复方时需分别在多种不同波长下测定，造成操作繁琐、耗时，尤其涉及多种组合物时更是如此。而且氨氯地平、缬沙坦和氢氯噻嗪复方制剂中氨氯地平含量很小，紫外分光光度计检测响应较低，因此，针对该三方制剂，紫外分光光度法的不足愈加明显。

同时，现有技术中也没有关于同时测定溶液中氨氯地平、缬沙坦和氢氯噻嗪三种药物成分含量的方法公开，只有部分关于单成分或两成分的含量测定方法的公开。如美国药典中测定缬沙坦和氢氯噻嗪片剂的含量时采用了三氟乙酸水溶液-乙腈作为流动相的高效液相色谱法（HPLC）(USP34–NF29 Page 4563)；中国药典中记载测定氢氯噻嗪含量时也采用了HPLC法，选用的流动相为磷酸盐缓冲液（pH=3.0）-乙腈=9:1(中国药典，2010, VolⅡ:555) ；有学者在研究复方缬沙坦片中苯磺酸氨氯地平和缬沙坦含量时采用了HPLC法，其中以磷酸盐缓冲液-甲醇作为流动相(中国医药工业杂志，2011, 42(4): 292)。当氨氯地平、缬沙坦和氢氯噻嗪的复方制剂在溶出介质中溶出后，使用上述色谱条件的HPLC法进行溶出量测定时发现，或在色谱图中出现了明显的溶剂峰，即溶出介质的峰，对氢氯噻嗪的色谱峰形成干扰；或三种组分不能实现分离，均不能达到同时准确测定三种组分溶出度的目的。

因此，迫切需要探索一种简便、快速、准确，可同时检测氨氯地平、缬沙坦和氢氯噻嗪复方制剂中三种组分溶出度的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种简便、快速、准确，可同时检测氨氯地平、缬沙坦和氢氯噻嗪复方制剂中三种组分溶出度的方法。

本发明提供的可同时检测氨氯地平、缬沙坦和氢氯噻嗪复方制剂中三种组分溶出度的方法，采用高效液相色谱法测定溶出介质中三组分的含量，其中所述的溶出介质为pH6.8的磷酸盐缓冲液，色谱条件选用C₁₈色谱柱，磷酸盐水溶液-乙腈混合溶液为流动相，其中磷酸盐水溶液 pH值为3.0-5.0，磷酸盐水溶液-乙腈体积比为50:50-60:40，检测波长为220-240nm。

更进一步的，磷酸盐水溶液-乙腈体积比优选为55:45；磷酸盐水溶液pH值优选为3.2-4.5，更优选为3.5；磷酸盐水溶液可选自磷酸氢二钠溶液、磷酸二氢钠溶液、磷酸氢二钾溶液、磷酸二氢钾溶液和磷酸二氢铵溶液中的一种或两种以上。

并且，在实验过程中发现当检测波长为225nm时，三组分的响应值和灵敏度均较高。

最优选的色谱条件为：色谱柱C₁₈（4.6 mm×250 mm，5 μm），磷酸二氢钾溶液（pH3.5）：乙腈=55:45（v/v），流速1.0 mL · min^-1；检测波长225 nm；进样20 μL；柱温室温。

按照中国药典2010版二部附录XC溶出度测定法，采用上述溶出介质和色谱条件，可以进行氨氯地平、缬沙坦和氢氯噻嗪复方制剂中三种组分溶出度的检测。具体的供试品溶出液制备、对照品溶液配制、高效液相色谱法检测及溶出度计算过程可参考以下操作，但不仅限于此。

供试品溶出液制备

取氨氯地平、缬沙坦和氢氯噻嗪复方制剂，桨法，以磷酸盐缓冲液（pH6.8）900 mL 为溶出介质，转速为50 r · min^-1，经30 min取溶液10 mL，滤过，即得供试品溶出液。

对照品溶液配制

取氢氯噻嗪对照品约31 mg和苯磺酸氨氯地平对照品约17 mg，精密称定，置50mL 量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，精密移取5 mL 置另一精密称有40mg缬沙坦对照品的50 mL 量瓶中，加溶出介质稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液。精密量取对照品储备液10 mL 到50 mL 量瓶中加溶出介质稀释至刻度，作为对照品溶液。

高效液相色谱法检测

分别取供试品溶出液和对照品溶液，在上述色谱条件下进样，进行高效液相色谱法检测，记录色谱图。

溶出度计算

根据如下公式计算溶出度：溶出度=A×Wt×S×100%/（At×W×St）

A：供试品溶出液峰面积

Wt：对照品取用量

S：供试品溶出液的稀释倍数

At：对照品溶液峰面积

W：供试品平均片重或平均装量

St：对照溶液稀释倍数。

本发明提供的溶出度检测方法，不仅在溶出量检测方面可同时测定氨氯地平、缬沙坦和氢氯噻嗪三组分在磷酸盐缓冲液中的含量，检测效果快速准确，并且该方法具有方法学意义。

溶出介质中含量检测方面

发明人对HPLC色谱条件进行了摸索研究，在得到的检测条件下，各组分得到有效分离，并可准确测定其含量，进而计算溶出度。

在高效液相色谱分析中，理论板数（n）、分离度（R）、拖尾因子(T)是分离检测效果重要指标。色谱图中体现在色谱峰之间的相对位置和峰形上，峰窄而间距大的分离是令人满意的。因此，各组分峰之间、溶剂峰与各组分峰之间相互无干扰，各组分间分离度符合要求（1.5以上）是首先要考虑的问题（由于缬沙坦保留时间明显长于其他两组分，因此首先考虑氢氯噻嗪和氨氯地平两种组分的分离度R1，兼顾氨氯地平与缬沙坦之间的分离度R2），在达到分离要求基础上，可进一步改善峰形，调整保留时间等。

实验筛选过程：实验过程中供试品、对照品溶液配制后，按照设计的色谱条件进行高效液相色谱法检测及效果评价，最终选择可达到分离目的的色谱条件。

供试品溶出液制备

取氨氯地平、缬沙坦和氢氯噻嗪复方片剂（在本实验中所使用的供试品均为石药集团中奇制药技术有限公司生产的复方片剂，批号：20100501），桨法，以磷酸盐缓冲液（pH6.8）900 mL 为溶出介质，转速为50 r · min^-1，经30 min取溶液10 mL，滤过，即得供试品溶出液。

对照品溶液配制

取氢氯噻嗪对照品约31 mg和苯磺酸氨氯地平对照品约17 mg，精密称定，置50mL 量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，精密移取5 mL 置另一精密称有40mg缬沙坦对照品的50 mL 量瓶中，加溶出介质稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液。精密量取对照品储备液10 mL 到50 mL 量瓶中加溶出介质稀释至刻度，作为对照品溶液。

色谱条件中流动相种类及配比筛选

色谱柱为Inertsil ODS-3 C₁₈（4.6 mm×250 mm，5 μm），流速1.0 mL · min^-1；进样20 μL；柱温室温。

检测波长的选择：由于氨氯地平、缬沙坦和氢氯噻嗪三组分在复方制剂中的含量差异较大，为了避免三组分在同一检测波长下响应峰高悬殊，将检测波长选定在220-240nm之间。最终考虑本品中氨氯地平含量最小且溶出量较低，选用225nm作为检测波长，不仅氨氯地平响应较高，同时还可满足含量亦较低的氢氯噻嗪的检测灵敏度。

流动相配制：分别按照表1中使用的溶剂及比例配制流动相（流动相组成及pH值都可能是分离检测效果的影响因素。为了考察流动相组成，首先确定了流动相组分磷酸二氢钾的 pH值，在参考了现有技术氢氯噻嗪的含量测定条件基础上，将其确定为3.0）

表1流动相中各组分配比关系

 高效液相色谱法检测及效果

取供试品和对照品溶液，分别在流动相1-20的色谱条件下进样，进行高效液相色谱法检测，记录色谱图。各条件下的分离效果如下（见表2）

 表2 各流动相条件下分离效果

上述实验结果表明：磷酸二氢钾溶液与乙腈组成的流动相，在检测过程中，色谱图中未出现溶剂峰干扰，其他溶剂组成的流动相，或出现明显的溶剂峰，干扰氢氯噻嗪色谱峰的测定或不能实现三组分的分离。其中当磷酸二氢钾溶液（pH3.0）：乙腈=50:50-60:40（v/v）时，色谱图中三组分峰形陡直，基本实现对三组分的分离和含量测定。

进一步的，对流动相比例进行了深入研究，发现当流动相磷酸二氢钾溶液（pH3.0）：乙腈=50:50-60:40（v/v）范围之间时，尤其为55:45时，色谱图中三组分峰形陡直，氨氯地平和氢氯噻嗪的分离度达到2.0，但缬沙坦的保留时间没有明显变化，约在15min左右。

在溶出度测定过程中，由于样品量大，过长的测定时间不仅耗时，而且导致测定误差加大，因此，发明人针对上述问题对色谱条件进行了进一步的优化。

发明人以磷酸盐水溶液：乙腈=55:45（v/v）作为流动相为例，分别考察了磷酸盐水溶液种类、磷酸盐水溶液pH值、溶液浓度、柱温等对结果的影响。实验结果表明，除pH值外，其他因素对检测效果影响不大。具体pH值考察实验筛选（见表3）及检测效果如下

表3 pH值不同的磷酸二氢钾溶液组成的流动相色谱条件

对照品溶液、供试品溶出液制备同流动相种类及配比筛选实验。

高效液相色谱法检测及效果

分别在流动相21-26的色谱条件下进样，进行高效液相色谱法检测，记录色谱图。各条件下的分离效果见表4

表4 pH值不同的磷酸盐水溶液组成的流动相色谱条件检测效果

上述实验结果表明：pH值显著改变了缬沙坦和氨氯地平的保留行为：随pH值升高，缬沙坦保留时间缩短，氨氯地平保留时间延长。pH值低于3.0时，导致氨氯地平和氢氯噻嗪保留时间接近，色谱峰重叠；pH值高于5.0时，导致缬沙坦和氨氯地平保留时间接近，且缬沙坦出现峰展宽，与氨氯地平峰出现重叠；pH值在3.2-4.5之间时，三组分分离度良好，氨氯地平与氢氯噻嗪的分离度得到提高，达到4左右且缬沙坦峰形陡直，保留时间在9-12min。pH变化与三组分的保留时间关系见附图1。

可见，选用以磷酸盐水溶液-乙腈混合溶液为流动相，其中磷酸盐水溶液的 pH值为3.0-5.0，磷酸盐水溶液与乙腈体积比为50:50-60:40时，与其他溶剂组成的流动相色谱条件相比，没有溶出介质峰干扰，各组分实现有效分离；尤其当磷酸盐水溶液的 pH值为3.2-4.5时，三组分的分离度、峰形及保留时间均得到大幅度改善。

方法学验证方面

发明人将上述试验得出的最优的色谱条件即：色谱柱Inertsil ODS-3 C₁₈（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相磷酸二氢钾溶液（磷酸调pH值3.5）：乙腈=55:45，流速1.0 mL · min^-1；进样20 μL；检测波长225nm，进行了方法学验证。

（1）系统适用性试验结果：

系统适用性试验结果表明氨氯地平、缬沙坦、氢氯噻嗪分离度良好，R1=3.8，出峰顺序为氢氯噻嗪、氨氯地平、缬沙坦，缬沙坦保留时间为11min左右，溶出介质、辅料、苯磺酸不干扰主成分的测定（见附图2）。

（2）线性关系

 以峰面积( A )相对应浓度( C )进行线性回归处理，得氨氯地平、缬沙坦、氢氯噻嗪的回归方程分别为：A =42.979C+4.0609  r =0.9999；A =62.499C-73.422  r =0.9999；A =129.24C+32.066  r =1.0000。

（3）精密度试验

精密吸取对照品溶液20 μL，连续进样6次，计算氨氯地平、缬沙坦和氢氯噻嗪峰面积RSD分别为0.6%，0.3%，0.3%。

（4）回收率试验

回收率试验结果显示氨氯地平、缬沙坦、氢氯噻嗪平均回收率（n = 9）分别为100.5%（RSD = 0.8%），100.6%（RSD = 0.5%），100.4%（RSD = 0.5%）。

（5）稳定性试验

取供试品溶出液分别于0，2，4，6，8 h，按上述色谱条件进行测定，氨氯地平、缬沙坦和氢氯噻嗪峰面积RSD分别为0.8%，0.4%，0.8%，表明溶液在8h内稳定。

发明人又对流动相为磷酸二氢钾溶液-乙腈体积比在50:50-60:40范围之间，磷酸二氢钾溶液pH值3.0-5.0之间的其他色谱条件进行了方法学验证。试验结果表明，上述色谱条件下的HPLC法，均显示出较好的系统适用性、线性、精密度、重复性、准确度和稳定性，尤其是磷酸二氢钾溶液（pH=3.5）：乙腈=55:45为流动相的色谱条件表现出了最优的系统适用性、线性、精密度、重复性、准确度和稳定性。

氨氯地平、缬沙坦和氢氯噻嗪三方制剂在磷酸盐缓冲液中溶出后，采用本发明建立的方法可准确、快速检测出溶出介质中三种药物成分的含量，进而计算出溶出度。实验表明，一方面，该HPLC检测条件下，溶出介质中三种组分得到很好的分离，溶出度得到准确测定；另一方面，该HPLC检测方法具有良好的系统适用性、线性、精密度、重复性、准确度和稳定性，具有方法学意义。

附图说明

图1 pH变化与三组分的保留时间关系。

图2 系统适应性试验结果。

图3 色谱条件3下的分离图谱。

图4 色谱条件8下的分离图谱。

具体实施方式

仪器与试药

Agilent 1100高效液相色谱仪；ZRS-8智能溶出试验仪（天津大学无线电厂）。氨氯地平、缬沙坦和氢氯噻嗪复方片剂（石药集团中奇制药技术有限公司，批号：20100501），对照品苯磺酸氨氯地平、缬沙坦、氢氯噻嗪均购自中国药品生物制品检定所。

实施例1 氨氯地平、缬沙坦和氢氯噻嗪复方片剂溶出度测定

色谱条件：

色谱柱为Inertsil ODS-3 C₁₈（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为磷酸二氢钾溶液（用磷酸调节pH值至3.5）-乙腈=55:45（v/v），流速1.0 mL · min^-1；检测波长225 nm；进样20 μL；柱温室温。

对照品溶液配制

取氢氯噻嗪对照品约31 mg和苯磺酸氨氯地平对照品约17 mg，精密称定，置50mL 量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，精密移取5 mL 置另一精密称有40mg缬沙坦对照品的50 mL 量瓶中，加溶出介质稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液。精密量取对照品储备液10 mL 到50 mL 量瓶中加溶出介质稀释至刻度，作为对照品溶液。

供试品溶出液制备

取氨氯地平、缬沙坦和氢氯噻嗪复方片剂，桨法，以磷酸盐缓冲液（pH6.8）900 mL 为溶出介质，转速为50  r · min^-1，经30 min取溶液10 mL，滤过，即得供试品溶出液。

高效液相色谱法测定溶出量

取对照品溶液、供试品溶出液，按上述色谱条件分别进样，记录色谱图。外标法计算溶出量。

溶出度计算

根据溶出介质中三种组分的含量，利用溶出度计算公式进一步计算溶出度。

溶出度测定结果（%）

实施例2 pH3.5磷酸二氢钾溶液与乙腈不同体积比的溶液为流动相时溶出介质中三组分检测效果及溶出度测定结果

色谱条件：

对照品溶液、供试品溶出液制备同实施例1。

操作：取对照品溶液、供试品溶出液，按色谱条件1-4分别进样，记录色谱图，根据溶出度计算公式进一步计算溶出度。

检测效果：

注：溶出度1、2、3分别代表氢氯噻嗪、氨氯地平和缬沙坦的溶出度，在以下实施例中代表相同含义。

结论：磷酸二氢钾水溶液和乙腈的比例影响分离度及保留时间，当乙腈的含量在35%或55%时，均不能有效分离三组分，两者的比例在50:50-60:40之间是合适的。

实施例3 pH5.0磷酸二氢钾溶液与乙腈不同体积比的溶液为流动相时溶出介质中三组分检测效果及溶出度测定结果

色谱条件：

对照品溶液、供试品溶出液制备同实施例1。

操作：取对照品溶液、供试品溶出液，按色谱条件5、6分别进样，记录色谱图，根据溶出度计算公式进一步计算溶出度。

检测效果：

结论：pH5.0时，流动相磷酸二氢钾溶液：乙腈=50:50-60:40（v/v）可以实现三组分的分离检测。

实施例4 色谱条件磷酸盐溶液选用其它盐溶液时检测效果及溶出度测定结果

色谱条件：

对照品溶液、供试品溶出液制备同实施例1。

操作：取对照品溶液、供试品溶出液，按色谱条件7-10分别进样，记录色谱图，根据溶出度计算公式进一步计算溶出度。

检测效果：

结论：磷酸盐的种类几乎未影响三组分的保留行为。 

Claims (7)

1.一种氨氯地平、缬沙坦和氢氯噻嗪复方制剂中三种组分溶出度的检测方法，其特征在于，采用HPLC测定溶出介质中三组分的含量，其中，所述溶出介质为pH6.8的磷酸盐缓冲液；所述HPLC的色谱条件为：C₁₈色谱柱，磷酸盐水溶液-乙腈混合溶液为流动相，其中磷酸盐水溶液的 pH值为3.0-5.0，磷酸盐水溶液与乙腈体积比为50:50-60:40，检测波长为220-240nm。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，磷酸盐水溶液-乙腈体积比为55:45。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，磷酸盐水溶液的pH值为3.2-4.5。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，磷酸盐水溶液的pH值为3.5。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，磷酸盐水溶液选自磷酸氢二钠溶液、磷酸二氢钠溶液、磷酸氢二钾溶液、磷酸二氢钾溶液和磷酸二氢铵溶液中的一种或两种以上。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，检测波长为225nm。

7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于,色谱条件中流速为1.0 mL · min^-1；进样为20 μL；柱温为室温。

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