CN103134714A

CN103134714A - 一种适用于双向电泳的甘蔗蛋白质提取方法

Info

Publication number: CN103134714A
Application number: CN2013100675587A
Authority: CN
Inventors: 徐景升; 朱海龙; 林庆良; 董萌; 阙友雄; 郭晋隆; 高世武; 许莉萍; 陈如凯
Original assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Current assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Priority date: 2013-03-04
Filing date: 2013-03-04
Publication date: 2013-06-05

Abstract

本发明涉及一种适用于双向电泳的甘蔗蛋白质提取方法。本发明对甘蔗蛋白质提取体系进行优化，将冰浴超声与漩涡震荡交替使用，提高了蛋白质得率。本发明的方法具有药品配制简单、操作方便、蛋白得率高、杂质少的优点。该方法比较适用于稀有材料或蛋白质提取纯化较困难的材料。使用本方法得到的蛋白占粗蛋白粉末的48%-60%，显著高于传统方法的8%-15%，同时所得粗蛋白粉末质量好，完全满足双向电泳的要求，对甘蔗蛋白质组学的研究具有重要意义。

Description

一种适用于双向电泳的甘蔗蛋白质提取方法

技术领域

本发明涉及一种蛋白质的提取方法，具体涉及一种适用于双向电泳的甘蔗蛋白质提取方法，属于生物技术领域。

背景技术

甘蔗是全球最重要的糖料作物和能源作物，蔗糖和甘蔗乙醇分别占世界食糖的77%和生物质乙醇的42%。在我国，蔗糖占食糖总量的92%。蔗糖是大宗农产品，关系到国计民生，建国以来，我国食糖基本处于供不应求的状态。目前，我国食糖人均为10公斤，仅为世界平均水平的一半。近年来，由于食品结构变化和食品工业的发展，食糖供需缺口逐渐加大，2012年我国进口食糖比2011年增加28%。我国甘蔗立地条件差，80%以上为坡地或旱坡地。干旱是制约我国甘蔗产业发展的主要因素之一，每年因干旱造成的甘蔗减产高达20-30%。甘蔗病虫害频发，黑穗病、花叶病、黄叶病、宿根矮化病等，每年造成大量的损失；在甘蔗虫害中，甘蔗螟虫危害最大，部分重灾区螟害节率高达60%。近年来，劳动力成本激增，甘蔗机械化已经迫在眉睫，而现有品种却不适应机械化作业。如何在有限的耕地和立地条件下，培育高产、高糖、抗旱、宿根型好、适于机械化采收的甘蔗品种，是我国甘蔗育种面临的主要问题。要攻克这些问题，必须了解甘蔗碳代谢机制，如光合作用、蔗糖积累调控、抗逆机制等。甘蔗是高度杂合的多倍体或非整倍体，是迄今人类驯化作物中基因组最为复杂的作物。甘蔗染色体遗传行为怪异，F1代和BC1代大多以2n+n的方式遗传，BC2则一般为n+n，因此甘蔗的遗传育种研究远落后于其他作物。双向电泳技术是在蛋白质水平上研究基因表达的最有效方法之一，是研究甘蔗碳代谢、逆境应答等生物学过程和机理的重要手段。蛋白质样品的制备是双向电泳的关键步骤，直接关系到双向电泳蛋白分离的效率、可靠性和重演性。

2008年郭晋龙等人以甘蔗品种福农95-1702为供试材料提取叶片总蛋白，按鲜重的10％加入PVP，研成粉状后，再加人10倍体积的-20℃预冷丙酮（含体积比10％TCA和体积比0.07％的β-巯基乙醇）。涡旋后静置于-20℃，沉降过夜；随后在4℃，30000 g离心20 min，弃上清液。重悬沉淀于含0.07％的β-巯基乙醇的等体积冰预冷丙酮溶液里1-2次；4℃，30000 g，离心20 min后真空干燥沉淀。裂解后用24 cm，线性pH4-7胶条对所提蛋白进行双向电泳分离，经考马斯亮蓝染色后得到约800个点。2011年张燕、何文锦等人以甘蔗品种福农28为供试材料提取叶片总蛋白，将叶片研磨成粉末后加到含有100 mmol/L Tris、50 mmol/ L抗坏血酸、100 mmol/ L氯化钾、50 mmol/ L硼砂、体积比1%的TritonX-100、体积比2%的β-巯基乙醇的酚抽液中，漩涡，离心。取上层加入到0.1 mol/L乙酸铵甲醇溶液中-20 ℃过夜，之后用甲醇洗涤一次再用丙酮（含体积分数2%的β-巯基乙醇）洗涤2次，真空烘干沉淀。裂解后用24 cm，线性pH4-7胶条对所提蛋白进行双向电泳分离，经考马斯亮蓝染色得到约1000个点。但是甘蔗叶片中含有酚、醌、色素等一些次生代谢产物，导致双向电泳本底较高，影响分析结果。应用文献报道的方法提取甘蔗蛋白繁琐或不能很有效的去除干扰物质，本发明在此基础上，对蛋白提取配方及方法进行了优化，增加了超声波处理，对细胞进行了有效破碎；有效去除了干扰物质，从而建立了一种适合双向电泳的甘蔗蛋白质提取方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种适用于双向电泳的甘蔗蛋白质提取方法，是一种以甘蔗正一叶为原料提取甘蔗蛋白质的方法。本方法流程简单，提取效率高，为蛋白质组学研究后续工作提供良好的基础。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的。

本发明的一种适用于双向电泳的甘蔗蛋白质提取方法，其特征在于操作步骤如下：

（1）取甘蔗正一叶位的新鲜叶片，清洗干净后剪碎，秤取2.0 g，置于盛有液氮的研钵中，加入0.2 g PVP，研磨成粉末；

（2）将粉末全部转入50 mL离心管中，加入4 ℃预冷的提取缓冲液5 mL，使用时加入0.2 mL β-巯基乙醇；所述提取缓冲液配制方法为：取蔗糖150 g，SDS 7.5 g，用pH8.8的Tris-HCl 缓冲液定容至500 mL； pH8.8的Tris-HCl缓冲液的配制方法为：取181.5 g Tris溶于800 mL水中，用4N的HCl调节pH至8.8，用水定容至1000 mL；

（3）漩涡振荡5 min后，冰浴条件下重复超声2次，每次超声5-10 min，期间摇匀，超声强度为0.4 -0.6 w/cm²；

（4）加入5 mL pH8.8的Tris饱和酚，漩涡5 min，冰浴条件下重复超声2次，每次超声5-10 min，期间摇匀，超声强度为0.4 -0.6 w/cm²；

（5）静置30 min后分层，12000 rpm离心25 min，取上层酚相加5倍体积的-20 ℃预冷甲醇-醋酸铵溶液，混匀，-20℃处理10-16 h；所述甲醇-醋酸铵溶液配制方法：取3.854 g醋酸铵，加入0.35 mL β-巯基乙醇，用甲醇定容至500 mL；

（6）4 ℃ 12000 rpm离心30 min弃上清液，加入5 mL -20 ℃预冷的甲醇-醋酸铵溶液洗涤，收集沉淀，置于-20 ℃冰箱3-5 h；

（7）用-20 ℃预冷的丙酮洗涤沉淀3次， 0 ℃条件下真空干燥1.5 h，获得粗蛋白粉末。

本发明中所使用的试剂均为分析纯，水为蒸馏水。

本发明的有益效果如下：

1、步骤（2）优化了缓冲液配方，可有效的去除甘蔗中的多糖和盐离子。

2、步骤（3）增加了2次超声波处理，最佳条件为0.5 w/cm²，每次处理5 min。超声波处理可有效促进细胞破裂且不影响蛋白质质量，增加蛋白质得率；冰浴处理吸收降低超声波产生的热量，使样品处于低温，有效防止氧化。

3、步骤（4）加入pH8.8的Tris饱和酚，可以防止蛋白质被氧化，同时可去除更多杂质，提高蛋白质得率和质量。

4、步骤（5）甲醇-醋酸铵可溶解多种无机盐并防止蛋白质氧化，同时可打开蛋白质的结构，利于蛋白质分析。

5、步骤（6）可去除痕量无机盐，提高蛋白质纯度。

6、步骤（7）使用冷丙酮可有效除去油脂类物质，进一步纯化蛋白质的作用。

7、步骤（8）可保证样品在电泳过程中保持溶解状态。

综上所述，本发明对甘蔗蛋白质提取体系进行了优化，建立了一套新的甘蔗组织蛋白质提取方法。与传统方法相比，该方法具有药品配制简单、操作方便、蛋白得率高、杂质少等优点，另外，该方法将冰浴超声与漩涡震荡交替使用，提高了蛋白质得率。该方法比较适用于稀有材料或蛋白质提取纯化较困难的材料，使用本方法得到的蛋白占粗蛋白粉末的48%-60%，显著高于传统方法的8%-15%，同时所得粗蛋白粉末质量好，完全满足双向电泳的要求，对甘蔗蛋白质组学的研究具有重要意义。

附图说明

图1为甘蔗正一叶蛋白质双向电泳图谱。图1中的黑点为分离的蛋白点，可分辨的点数为1232个。

具体实施方法：

为了进一步阐明本发明而不是限制本发明，以下结合实施例加以说明。

实例1：一种适用于双向电泳的甘蔗蛋白质提取方法，包括以下步骤：

（1）取甘蔗正一叶位的新鲜叶片，清洗干净，用体积浓度为75%酒精消毒后，用吸水纸吸干，剪碎，秤取2.0 g，置于盛有液氮的研钵中，加入0.2 g PVP，研磨成粉末；

（2）将粉末全部转入50 mL离心管中，加入4 ℃预冷的提取缓冲液5 mL，使用时加入0.2 mL β-巯基乙醇；

（3）漩涡振荡5 min后，冰浴条件下重复超声2次，每次超声5 min，期间摇匀，超声强度为0.5 w/cm²；

（4）加入5 mL pH8.8的Tris饱和酚，漩涡5 min，冰浴条件下重复超声2次，每次超声5 min，期间摇匀，超声强度为0.5 w/cm²；

（5）静置30 min后分层，12000 rpm离心25 min，取上层酚相加5倍体积的-20 ℃预冷甲醇-醋酸铵溶液，混匀，-20℃处理12 h；

（6）4 ℃ 12000 rpm离心30 min弃上清液，加入5 mL预冷的甲醇-醋酸铵溶液洗涤，收集沉淀，置于-20 ℃冰箱3-5 h；

（7）沉淀用-20 ℃预冷的丙酮溶液洗涤3次， 0 ℃条件下真空干燥1.5 h，获得粗蛋白粉末；所述真空干燥的真空度为0.1 MP；

（8）取10 mg 粗蛋白粉末加入800 μL裂解液混合，涡旋振荡5 min，冰浴条件下0.5w/cm²超声5 min，在4 ℃下12000 rpm离心15 min，上清即为蛋白质样品液；所述裂解液的配制方法为：7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，80 mmol/L 二硫苏糖醇，体积浓度为4%的CHAPS和体积浓度为1% 的IPG；

（9）用Bradford法检测蛋白浓度。所述Bradford法，参照马文丽编著的人民军医出版社2011年6月1日出版的《分子生物学实验手册》。

检测结果如图1所示，图1中可分辨的蛋白点数为1232个，表明甘蔗正一叶蛋白质的分离效果良好，蛋白占粗蛋白粉末总重量的54.1%。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims

1. 一种适用于双向电泳的甘蔗蛋白质提取方法，其特征在于操作步骤如下：

（2）将粉末全部转入50 mL离心管中，加入4 ℃预冷的提取缓冲液5 mL，使用时加入0.2 mL β-巯基乙醇；所述提取缓冲液配制方法为：取蔗糖150 g，SDS 7.5 g，用pH8.8的Tris-HCl 缓冲液定容至500 mL；

（3）漩涡振荡5 min后，冰浴条件下重复超声2次，每次超声处理 5-10 min，期间摇匀，超声强度为0.4 -0.6w/cm²；

（4）加入5 mL pH8.8的Tris饱和酚，漩涡5 min，冰浴条件下重复超声2次，每次超声处理5-10 min，期间摇匀，超声强度为0.4 -0.6 w/cm²；

（5）静置30 min后分层，12000 rpm离心25 min，取上层酚相加5倍体积的-20 ℃预冷甲醇-醋酸铵溶液，混匀，-20℃处理10-16 h；

2.根据权利要求1所述的一种适用于双向电泳的甘蔗蛋白质提取方法，其特征在于超声处理时间为5 min。

3.根据权利要求1或2所述的一种适用于双向电泳的甘蔗蛋白质提取方法，其特征在于超声处理的强度为0.5 w/cm²。