CN103131712A - 一种具有启动苜蓿质体蓝素特异表达的光诱导启动子及一对快速克隆该启动子的引物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种具有启动苜蓿质体蓝素表达的光诱导特异性及叶片组织特异性启动子序列及一对快速克隆该启动子的引物。文献报道质体蓝素是一种与植物光合作用有关的质体蛋白，已被验证是一种光诱导表达蛋白；而该苜蓿质体蓝素启动子具有TATAbox、CAATbox等启动子必需元件、与光应答有关的特异元件G-box(ctttatca)及与组织特异性表达有关的GT-1基序(aatccaca)等9个特异元件；并已通过试验验证此启动子具有一定光诱导特异性及叶片组织特异性，可驱动报告基因GUS在转基因苜蓿叶片中特异表达。而该引物是参照蒺藜苜蓿基因组相关序列而设计的特异性引物适用于采用PCR方法快速克隆苜蓿质体蓝素启动子。

Description

一种具有启动苜蓿质体蓝素特异表达的光诱导启动子及一对快速克隆该启动子的引物
技术领域
本发明属于医药技术领域，涉及一种具有启动苜蓿质体蓝素特异表达的光诱导启动子序列及一对快速克隆该启动子的引物。
 
背景技术
利用转基因植物作为生物反应器，将外源基因导入植物中表达外源重组蛋白，生产药用蛋白或疫苗成为转基因植物研究的热点。但是外源基因在受体植物表达过程中，往往会出现表达效率低、表达产物不稳定、甚至基因失活或沉默等不良现象，导致转基因植物无法投入实际应用。因此，常常需要构建一种能高水平表达异源蛋白质的表达载体。为了更好的增加外源基因的表达活性，植物表达载体中的启动子起关键作用，其对外源基因的表达水平影响很大，是植物基因工程表达载体的重要元件。在双子叶植物遗传转化研究中多使用花椰菜花叶病毒(CaMV) 35S启动子，在这种组成型启动子的控制下，外源基因在植物的所有部位和每个发育阶段都会表达。然而，外源基因在受体植物内持续、高效的表达，往往会引起植物的变异，影响植物的正常生长发育。而对于植物特异诱导型启动子能调控外源基因在转基因植物体内表达的时空秩序特异性或外源诱导因子特异性，一方面能提高外源基因的表达效能及水平；另一方面可以节省生物能耗，减少外源基因对植物本身的影响。
目前植物启动子常用的克隆方法有：利用启动子探针载体筛选启动子、利用PCR技术克隆启动子、环状PCR、利用接头连接介导的PCR散步法、TAIL-PCR。近年来人们大多采用PCR方法克隆植物基因启动子。根据已经发表的基因序列设计引物，克隆所需基因的启动子。该方法简便、快捷、操作简单。
发明内容
    本发明的目的在于提供一种具有启动苜蓿质体蓝素特异表达的光诱导启动子序列及一对快速克隆该启动子的引物。此苜蓿质体蓝素启动子具有TATAbox、CAATbox等启动子必需元件、与光应答有关的特异元件G-box (ctttatca)及与组织特异性表达有关的GT1基序(aatccaca)等9个特异元件；并已通过试验验证此启动子具有一定光诱导特异性及叶片组织特异性，可驱动报告基因GUS在转基因苜蓿叶片中特异表达。该引物是参照蒺藜苜蓿基因组相关序列而设计的特异性引物适用于采用PCR方法快速克隆苜蓿质体蓝素启动子。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施：
本发明的启动子具有如图1所示的序列：
该启动子序列包括苜蓿质体蓝素编码基因起始密码子ATG上游共719bp。在起始密码子ATG上游大约-97bp和-118bp位置有TATA-box和CAAT-box，其参与决定转录的方向，指导RNA聚合酶结合到启动子上，使其在正确的位置开始转录，是大部分植物启动子正确转录必须的；在启动子上游部分还包含了9个与光诱导有关的调控元件。LAMP-element 是质体蓝素启动子的保守序列，也是光诱导启动子的标志性序保列，并且位置通常临近于TATA-box上游。 GT1-motif 则是一种组织特异性启动子的守序列，其控制基因在植物的叶片中表达，这个元件也与光诱导表达有一定的关系。Box II 是GT-1蛋白的集合位点，其是在豌豆rbcS-3A 基因启动子中被发现的，被认为是一种光诱导表达元件。Pc-CMA2a，Pc-CMA2b， Pc-CMA2c 这3个元件才、构成了一个大的质体蓝素保守DNA排列（Pc-CMA）并且与光诱导调控相关。之后的G-box，ATCT-motif，GAG-motif，也都通过文献报道确定其为与光诱导有关的调控元件。 
本发明的启动子通过如下方法得到：
（1）PCR法克隆启动子序列；包括a)反应体系；b)反应条件；c)双向引物；其特征是：a)灭菌去离子水33.75ul，苜蓿基因组DNA5ul，10×PCRbuffer5ul，dNTPmix4ul，上、下游引物各1ul，rTaq0.25ul，b)预变性95℃2min，变性95℃30s，退火53℃30s，延伸72℃1min，循环30次，延伸72℃10min，c)上游引物5’-CCCAAGCTTAAAATAATAATGTGTGTTATGAGA-3’，下游引物5’-cgggatccgctctgacacaaagcctt-3’。
（2）琼脂糖凝胶电泳检测PCR反应产物并送交基因公司测序并分析序列。
（3）构建转化重组质粒；包括a)提取质粒；b)酶切；c)酶联；其特征是：a)SDS碱变性法提取大肠杆菌中pBI121质粒；b)通过Hind Ⅲ-BamHⅠ双酶切pBI121质粒，去除质粒中CaMV35S启动子；c)将酶切大片段与PCR产物酶联，构建含有苜蓿质体蓝素启动子启动GUS基因表达的新重组质粒pBI121-P。
（4）重组质粒转染根癌农杆菌。
（5）浸种法侵染苜蓿，再生后的转基因苜蓿叶片中含有GUS表达的葡萄糖苷酶（β-glucuronidase），该种水解酶可以催化多种β-葡萄糖苷酯类物质的水解，经过组织化学染色在光学显微镜下观察检测，能够将无色的底物X-gluc（5-溴-4-氯-3-吲哚葡萄糖苷）催化生成蓝色物质。
    试验结果表明，此启动子具有一定光诱导特异性及叶片组织特异性，可驱动报告基因GUS在转基因苜蓿叶片中特异表达。
附图说明
图1为本发明的启动子序列。
图2为克隆本发明启动子的引物。
具体实施方式
实施例1：
（1）       PCR法克隆启动子序列；
a)       反应体系；
灭菌去离子水33.75ul，苜蓿基因组DNA5ul，10×PCRbuffer5ul，dNTPmix4ul，上、下游引物各1ul，rTaq0.25ul；
b) 反应条件：预变性95℃2min，变性95℃30s，退火53℃30s，延伸72℃1min，循环30次，延伸72℃10min；
c) 双向引物上游引物5’-CCCAAGCTTAAAATAATAATGTGTGTTATGAGA-3’，下游引物5’-cgggatccgctctgacacaaagcctt-3’。
（2）琼脂糖凝胶电泳检测PCR反应产物并送交基因公司测序并分析序列；
（3）构建转化重组质粒；包括a)提取质粒；b)酶切；c)酶联；其特征是：a)SDS碱变性法提取大肠杆菌中pBI121质粒；b)通过Hind Ⅲ-BamHⅠ双酶切pBI121质粒，去除质粒中CaMV35S启动子；c)将酶切大片段与PCR产物酶联，构建含有苜蓿质体蓝素启动子启动GUS基因表达的新重组质粒pBI121-P。
（4）重组质粒转染根癌农杆菌；
（5）浸种法侵染苜蓿，再生后的转基因苜蓿叶片中含有GUS表达的葡萄糖苷酶（β-glucuronidase），该种水解酶可以催化多种β-葡萄糖苷酯类物质的水解，经过组织化学染色在光学显微镜下观察检测，能够将无色的底物X-gluc（5-溴-4-氯-3-吲哚葡萄糖苷）催化生成蓝色物质。
  SEQUENCE LISTING
 
<110>  沈阳药科大学
<120>  一种具有启动苜蓿质体蓝素特异表达的光诱导启动子序列及一对快速克隆该启动子的引物
<130>  2012
<160>  1    
<170>  PatentIn version 3.3
<210>  1
<211>  858
<212>  DNA
<213>  紫花苜蓿
<400>  1
cccaagctta aaataataat gtgtgtatga gagagaaagt tgtacaaaag ttgtaccaaa     60
atggttgtac aaatatcatt gaggaatttg acaaaagcta cacaaataag ggttaattgc     120
tgtaaataaa taaggatgac gcattagaga gatgtaccat tagagaattt ttggcgagtc     180
attaaaaaga aagaataaat tatttttaaa attaaaagtt gagtcatttg attaaacatg       240
tgattattta atgaattgat gagagagttg gattaaagtt gtattaataa ttagaatttg        300
gtgtcaaatt taatttgaca tttgatcttt tcctatatat tgccccatag agtcagttaa         360
ctcattttta tatttcatag atcaaataag agaaataacg gtatattaat ccctccaaca        420
aaaaaaaaaa aaaaacggta tatttactaa aaaatctaag ccacgtagga ggataacatc     480
caatccaacc aatcacaaca atcctgatga gataacccac tttaagccca cgcactctgt     540
ggcacatcta cattatctaa atcacacatt cttccacaca tctgagccac acaaaaacca      600
atccacatct ttatcatcca ttctataaaa aatcacactt tgtgagtcta cactttgatt          660
cccttcaaac acatacaaag agaagagact aattaattaa ttaatcatct tgagagaaaa      720
tggccaccgt tacttccacc accgttgcta ttccatcatt cacaggcctt aaggcaaacg      780
caagcaaagt taatgccata gctaaggttc caacttcaac ttctcaattg ccaaggcttt    840
gtgtcagagc ggatcccg                                        858
 

Claims (2)

1.一种具有启动苜蓿质体蓝素特异表达的光诱导启动子序列，其特征是：其序列如SEQ ID NO：1所示。
2.一对快速克隆权利要求1所述的苜蓿质体蓝素启动子的引物，其特征是：上游引物为5’-CCCAAGCTTAAAATAATAATGTGTGTTATGAGA-3’，下游引物为5’-cgggatccgctctgacacaaagcctt-3’。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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