CN103127504A - 局部产生一氧化氮的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种生物相容的双组成的一氧化氮输送系统和方法。一个组分包含亚硝酸钠或其它亚硝酸源，另一个组分包含还原剂、酸和碱(虽然在一些实施例中酸和还原剂由一个组分担当)。两个组分在局部的身体部位直接混合或者在立即应用前混合，混合物产生局部应用的一氧化氮。这个系统可以在很多情况下医用治疗，包括促进伤口愈合、消毒、生发和治疗男女性功能障碍。

Description

局部产生一氧化氮的组合物和方法

技术领域

本发明涉及用于局部产生一氧化氮的组合物和方法。 

背景技术

不限制本发明的范围的情况下，它的背景是描述的有关一氧化氮应用在医学上的指征和局部产生一氧化氮(NO)的组合物和方法。 

NO的生物学重要性已被证实(Lancaster JR，内生一氧化氮的扩散和反应的模拟，Proc Natl Acad Sci(1996)91：8137-41；Ignarro et al，从动脉和静脉产生及释放的内皮来源的舒张因子为一氧化氮，Proc Natl Acad Sci(1987)84：9265-69；reviewed in Bredt DS，一氧化氮信号专一性——心脏的问题，J Cell Science(2003)116：9-15；reviewed in Murad F，在细胞信号和药物开发中的一氧化氮和环磷酸鸟苷，N Engl J Med(2006)355：2003-11.)。在哺乳动物中，通过内源性NO调节神经系统、免疫系统和心血管系统。这些作用包括血管平滑肌松弛，导致动脉的血管舒张和血流增加。NO是一种神经递质，与神经元的活动和各种功能有关，如回避学习。NO也具有调节局部巨噬细胞对微生物和肿瘤细胞的细胞毒性作用。NO除了介导正常的生理功能外，还涉及感染性休克、高血压、中风和神经退行性疾病等不同的病理生理状态。 

NO以各种形式应用在药理学上。见Butler and Feelisch，Circulation(2008)117：2151-59。无机硝酸盐作为NO供体，如硝酸甘油和硝普钠已长期使用纠正NO缺乏状态或调节许多组织的活动。局部应用可以帮助创伤和烧伤的伤口愈合、毛发生长、阳痿、以及在需要的地方导致血管扩张(例如，在孕期成熟的子宫颈)。局部高浓度的NO(眼睛、皮肤等)会产生耐受。史密斯等人介绍了聚合物的一氧化氮来源促进愈合被认为是有用的(U.S.Pat.No.5,519,020)。 

两种类型的一氧化氮合酶(诱导型和组成型)在生物体内通过L-精氨酸产生NO。众所周知为了增加NO的生成可以输送L-精氨酸，包括Fossel的美国专利7914814公开的，通过局部输送治疗勃起功能障碍和毛发生长。 

合成NO供体也有两种不同的类型：一种是由化学前体物自发生成一氧化氮，另一种释放一氧化氮需要新陈代谢的氧化还原过程。见Scatena et al.Current Medicinal Chemistry(2010)17：61-73。第一种类型的NO合成供体包括在微酸性、中性或微碱性水相环境中缓慢释放NO的化学前体。这些化学前体包括Smith在美国专利5691423和相关专利中公开的N2O2基团、Hrabie and Keefer在美国专利5683668中公开的多胺/NO加合物、Keefer及其同事广泛研究并在美国专利比如7226586中描述的一大类多胺衍生的偶氮锚二醇盐、其他比如Smith的美国专利6147068中的偶氮鎓二醇钠盐和比如Garfield的美国专利5698738的N-亚硝基-N-羟胺取代物。 

在美国专利申请2009/0081279中，Jenek公开了一种伤口敷料，其中，通过含有S-亚硝基硫醇的聚合物和在其上覆盖的含有亚硝酸盐的聚合物之间扩散，在原位生成的NO供体S-亚硝基谷胱甘肽。S-亚硝基谷胱甘肽的产生是缓慢的，是通过缓冲作用控制的。在随后的应用中，美国专利申请2011/0070318，Jenek公开了非硫醇非酸还原剂的使用，如所例举的对苯二酚，限制从酸化亚硝酸盐的混合物中生产二氧化氮。在美国专利申请2003/0039697中，Zhao等人同样在一个模型中描述了NO供体S-亚硝基谷胱甘肽或硝普钠与还原剂之间的相互作用生成了NO，如抗坏血酸。这些需要氧化还原的代谢过程(一般从更高的氧化态)释放NO，或刺激内源性NO的产生的NO供体，包括有机硝酸盐如硝酸甘油(通常称为硝酸甘油)和硝酸异山梨酯已长期用于医药，但已知会产生耐受性，需要逐步增加剂量，以便获得恒定的效果。虽然局部的配方已经被Russel描述(美国专利6287601)，这些也被认为可以产生不良的副作用(如头痛)。其他合成NO供体放在第二类中，包括一些脒衍生物，如Currie等人在美国专利号5674894公开的和3-(硝基氧基甲基) 苯基2-羟基苯甲酸(简称为B-NOD)，如由Bing在美国专利号6538033公开的。还包括在一些美国专利中描述的一氧化氮合酶刺激物，例如Strobel等人的美国专利7179839。 

一氧化氮在大气中自然存在的浓度为10..100每十亿份。因为NO是燃烧的产物，NO在呼出的烟草烟雾中每百万(ppm)的浓度存在400至1000份。在治疗上，吸入NO已给药的剂量，剂量通常为每百万份空气中的20至40份，对人类呼吸问题，和由于其支气管扩张和血管舒张活性的有益效果。在1999年，美国FDA批准吸入NO(iNO)，对传统呼吸机治疗失败的近足月儿和新生儿的低氧性呼吸衰竭的治疗。吸入NO已给予无标记的成人肺动脉高压和右心衰竭等疾病进行治疗。 

然而，无色气体NO与(在一定条件下)大气中的氧气可以迅速反应产生二氧化氮(NO2)，红棕色的二氧化氮气体比NO有更高的毒性。此外，当长时间在高的水平(＞80ppm)给药时，吸入NO将携氧血红蛋白转换成高铁血红蛋白，这可能会导致受损组织输送氧气。参见BWeinberger，et al.The Toxicology of Inhaled Nitric Oxide，Toxicological Sciences 59(2001)5-16。 

亚硝酸(pKa＝3.37)由经酸(HA)处理的无机亚硝酸盐产生。亚硝酸在低温水溶液下稳定，但在室温下容易分解成NO和NO2，根据方程(1)和(2)： 

2HA+2NaNO2→2HNO2+2NaA   (1) 

2HNO2→NO+NO2+H2O (2) 

采用亚硝酸钠缓冲溶液，改良上述反应(1)后，生成携带低浓度(＜100ppm)一氧化氮的气体，进一步纯化后，除去有毒的亚硝酸和二氧化氮，源源不断输送一氧化氮气体用于吸入治疗肺动脉高血压。见Fineet al.U.S.Patent No.7,040,313。 

根据美国农业部目前的使用亚硝酸盐对于腌制肉类(尤其是腊肉)加工和赋予其粉红色规定，亚硝酸钠或亚硝酸钾与还原剂结合使用如抗坏血酸钠或异抗坏血酸钠，以加速肉类的熟化过程并减少最终存在于肉内的亚硝酸盐含量(9 CFR Vol 2，Subpart C，§424.21；Mirvish SS，Toxicol Appl Pharmacol(1975)31：325-51；McCutchen JW.Public Health Reports(1984)99：360-64)。然而，上述用途，先于发现NO是一个重要的生理介质，到现在为止，发明人对于本发明所选择的方法和步骤，没有用于一氧化氮局部给药的治疗方法。 

一氧化氮(NO)起到了重要的生理表现和治疗的条件，其中包括： 

·心血管系统：高血压、心绞痛、动脉粥样硬化、子痫前期(妊娠高血压综合征)、毒血症、子痫、HELLP综合征、血管电导调节、血流量调节、血压调节、心肌缺血、血液凝固及支架植入后的再狭窄。 

·癌症治疗：控制结合化疗和放射治疗的氧化损伤。 

·胃肠道反应：改变胃肠运动和幽门狭窄。 

·肺功能：哮喘、治疗早产儿增加肺功能和肺动脉高压。 

·炎症：自身免疫性疾病和免疫系统疾病、急性炎症、关节炎、对感染的抵抗力、癌症、系统性红斑狼疮、过敏性反应和移植排斥反应。 

·中枢神经系统：行为、癫痫、阿尔茨海默症、中风和生长激素障碍(如肢端肥大症)。 

·胰腺：糖尿病。 

·女性生殖系统：排卵期、女性的性唤起障碍、植入/体外受精、经前期综合征、痛经、子宫收缩异常、早产、宫颈扩张术、避孕、更年期症状、骨质疏松症、内分泌失调以及激素替代疗法。 

·男性生殖系统：阳痿、勃起功能障碍、男性更年期症状、内分泌失调、骨质疏松症和前列腺增生。 

·膀胱和肾脏：大小便失禁、肾动脉狭窄以及高血压。 

·皮肤：湿疹(皮肤反应异物)、自身免疫性皮肤病、局部脱发、痤疮、创伤和烧伤。 

·抗菌性：NO是一种有效的杀菌剂，可以有效的对抗生素有抗药性的细菌。 

本发明包括用于治疗上述列出系统和环境疾病的组成和方法，通过局部应用酸化亚硝酸盐直接在原位释放NO气体。 

发明内容

本发明提供了一种酸化亚硝酸盐组合物，其可在从法律法规和医学的观点来看可以接受的pH下，局部药物应用有效量的NO。本发明的发明人惊奇地发现，酸化亚硝酸盐组合物包含碱，优选的其中酸化采用酸的共轭碱，可以在pH值大于4时产生大量的NO，。本发明产生NO的酸化亚硝酸盐的混合物包含亚硝酸盐、还原剂、弱酸和弱碱。优选的，亚硝酸盐和碱为水溶性盐。在一个实施例中，这些组分被结合在抑制扩散的介质中，所述介质控制一氧化氮的释放率，达到足够局部应用的粘度。 

可以使用各种亚硝酸盐，最常用的无机盐为亚硝酸钠，虽然亚硝酸钾、亚硝酸钙、任何碱或碱涂金属的亚硝酸盐均可使用。优选的还原剂是具有还原能力，能够防止或减缓一氧化氮(NO)氧化成二氧化氮(NO2)，并且还具有直接还原NO2为NO，从而使由所述组分中释放的气体主要是NO。适合的还原剂包括抗坏血酸及其衍生物、抗坏血酸盐、生育酚(包括特别是α-生育酚)、异抗坏血酸、类胡萝卜素、生育三烯酚和硫醇。 

柠檬酸是一种可接受的有机酸。其它酸可包括乳酸、甘油酸、甲酸或其它在本技术领域的技术人员已知的那些有机酸。无机酸如果是生物学上可接受的，有适当pKa值也可以使用，例如硼酸。优选的，碱为使用酸的共轭碱，但也可以是那些在本技术领域的技术人员已知的其它有机或无机碱。介质是为了溶解亚硝酸盐、酸、还原剂和碱，可以是水介质或非水介质。介质的功能是作为所述组分的媒介，并且还可以用来降低化学反应产生NO的速率。一般优选的是含水介质，很容易制备凝胶，虽然有机溶剂、或无机制剂，例如凡士林，也是合适的。 

在另一个实施例中，公开了一种酸化的亚硝酸凝胶，其中抗坏血酸或抗坏血酸衍生物作为有机酸和还原剂。抗坏血酸(维生素C)和其衍生物是一种生物相容的还原剂，其衍生物，包括但不限于，3-O-乙基抗坏血酸、3-烷基抗坏血酸、6-O-辛酰基-抗坏血酸，6-O-十二烷酰基-抗坏血酸，6-O-十四烷酰基-抗坏血酸，6-O-十八烷酰基-抗坏血酸及6-O-癸 二酰-抗坏血酸。 

本发明中一个重要的方面，涉及为了产生NO和控制一氧化氮的释放速率的局部应用的组合物，其应用涉及超过一种凝胶或者其他粘度介质的组分。在一个实施例中，第一水凝胶包含亚硝酸盐，第二水凝胶包含酸和碱来改变凝胶的pH值。第一个或第二个凝胶含有的还原剂帮助保持一氧化氮的生物活性形式。抗坏血酸被单独使用时，可以充当酸和还原剂。然而，如果一种酸，如抗坏血酸是还原剂，它包含在第二凝胶中避免启动NO2的产生。在某些实施例中，碱是酸的共轭碱，这可由所用酸的溶解盐来提供。因此，一种生物相容性的实施例中利用柠檬酸作为酸，柠檬酸钠提供柠檬酸离子碱，还包括起到作为质子供体(酸)和还原剂的作用的抗坏血酸。抗坏血酸作为酸和还原剂使用时，优选的，是抗坏血酸钠。当所述第一个和第二个水凝胶混合在一起时，亚硝酸盐以化学方法转化成一氧化氮。 

凝胶剂包括的物质如羟乙基纤维素、，羟甲基纤维素、明胶、琼脂、天然树胶、淀粉和果胶。 

在另一个实施例中，第一和第二凝胶可以以层的形式结合，优选的，含亚硝酸盐的凝胶层与皮肤接触。如果需要的话，在应用之前，这些凝胶可以由一个不渗透的塑料或金属箔分离。它们可以直接应用在皮肤上，或和一个气体渗透膜一起使用，以避免可能的皮肤刺激。 

局部应用当然包括应用到皮肤上。其他局部应用设想包括腔内应用。粉状亚硝酸钠、抗坏血酸(或其他还原剂)、柠檬酸(或其它有足够强度的有机酸)、和用来产生碱的盐的混合物，加水后立即产生一氧化氮(NO)。为了减缓NO的产生，可由非水介质(例如石蜡油、凡士林)与四个粉末成分(亚硝酸盐、酸、碱和还原剂)制成药膏，外敷在皮肤上，在水渗透介质后释放NO。另外，可替换的，将亚硝酸钠水溶液变换为羟乙基纤维素(或其他形成凝胶的物质或化合物)形成的水凝胶，并与另一个抗坏血酸、柠檬酸和羟乙基纤维素的水凝胶结合，来局部应用(完好的皮肤、烧伤、内腔等)。两种凝胶可以在立即使用前混合，或可通过三明治形式(可能作为透皮贴剂)为了进一步减慢NO的 传递。 

在另一个实施例中，NO通过一种方法来医学应用，此方法将亚硝酸盐、生物相容的还原剂、酸和碱在介质中结合，局部应用到身体部位。这种局部释放一氧化氮的方法是通过以下方法来完成的，包括亚硝酸盐粉末和局部适用的、抑制扩散的介质，和包括还原剂粉末、一种酸、一种产生碱的盐和局部适用的抑制扩散的第二介质，两者混合。有效量的介质应用到身体部位。介质抑制扩散的特性的减慢和控制了亚硝酸盐、酸和碱之间的反应，从而延长一氧化氮的释放。此类组分控制了一氧化氮的释放，有助于局部，例如皮肤或其他体表，的应用。应用这些材料到预定区域的方法是多种多样的，其中一些方法是这里提到的，包括含亚硝酸盐的凝胶或药膏层涂在皮肤或身体的其他部位。之后覆盖包括酸、还原剂和碱的层。这会控制一氧化氮释放接触所需身体表面的速率。这些可以用手敷，或者预先做好的层。在某些情况下，凝胶可以在应用前简单地进行混合，形成一个所有组分充分混合、相对均匀但抑制扩散的药膏或凝胶，充分的减慢和控制一氧化氮的生成速率。 

本发明方法中可用的水凝胶剂，包括琼脂、羟乙基纤维素和许多在本领域的技术人员已知的可用于制备水凝胶的其他材料。优选的，含有本发明的指出的有效成分的凝胶可以预先制备，并由一个不渗透的塑料或金属层的分隔包装，在使用前除去隔离层。除去隔离层后可局部应用，优选的，含有亚硝酸盐的这层紧贴身体部位。在某些情况下，优选的，在应用一氧化氮来源的凝胶或软膏之前，在身体部位上的贴上一个气体渗透膜。这可能会减少对某些人的皮肤刺激。 

在某些实施例中，公开了一种双组份的一氧化氮(NO)配送系统，此系统包括第一腔室和第二腔室。第一腔室包括柱塞和NO供体组合物，所述组合物是包含亚硝酸盐的一氧化氮供体组合物第一凝胶，第二腔室包括柱塞和NO活化组合物，所述组合物是包括至少一种还原剂、至少一种有机酸和至少一种所述有机酸共轭碱混合在一起的第二凝胶。直到想要NO产生之前，两个腔室用来分离保存NO供体组合物和NO活化组合物，想要NO产生时，柱塞同时推入腔室，挤压一定量的供体组合 物和活化组合物进入混合室，混合室混合供体组合物和活化组合物，挤压产生NO的混合物到组织部位。在某些实施例中，NO活化组合物的pH大于3.0，活化组合物和供体组合物的混合物的起始pH大于4.0。双组份的一氧化氮(NO)配送系统的腔室可以预装多个剂量，在某些实施例中，腔室标记单一剂量的刻度，来指示每按一次柱塞释放一个剂量单位。如果需要，可以重复剂量施用到组织部位延长有效量NO暴露的时间。特别是在伤口愈合和头发生长中。在某些实施例中，还包含一个不透气的绷带，和第一第二腔室的NO供体和活化组合物配套包装。 

附图说明

以下附图构成本说明书的一部分，并且包括在进一步证明本发明的某些方面中。通过参考结合这些附图中的一个或多个与此处提出的特定的实施例的描述，可以更好地理解本发明。 

图1A所示，不同量的柠檬酸钠凝胶混合物，NO的总量和时间依赖性变化。表1为凝胶组分说明，是柠檬酸钠的重量百分比。曲线是由相同的任意单位绘制。 

图1B所示，实施例3.1的测量步骤中酸和亚硝酸盐凝胶混合所产生泡沫的测定量的变化。所示的数据，是表2混合物凝胶4，含有柠檬酸钠10％(重量)。酸和亚硝酸盐的凝胶在两秒钟内混合，因为它们是在指定的时间被注入到量筒中。 

图2A所示，不同凝胶混合物相对NO的释放，是依照如图1A从t＝0至20分钟的时间集合曲线。表1为凝胶组分说明，包括柠檬酸钠的重量百分比，并将柠檬酸钠的数量标识在图上。曲线是由相同的任意单位绘制。 

图2B所示，实施例3.1的测量步骤所测定的，不同的酸凝胶和亚硝酸盐凝胶混合物的NO释放。所用的酸凝胶组合物，如表2所示，是柠檬酸钠的重量百分比。纵轴表示该混合物中的每毫升亚硝酸盐凝胶的NO气体释放量。 

图3所示，在皮肤测试区域局部应用凝胶的有NO和无NO的血液 灌注测量值。 

图4A描述了利用双管混合注射器和静态混合器喷嘴的NO生成系统的实施例。图4B描述了从预先测量容器分隔提供NO供体和活化组合物，应用到所需的组织部位的NO生成系统的实施例。 

附图标记 

刻度8、混合注射器10、第一腔室12、第二腔室14、柱塞16、混合室18、静态混合元件20、帽子21、其它容器22，24、其它局部位置26、绷带28。 

具体实施方式

美国专利6103275公开了局部产生一氧化氮的双组分体系，其特征在于酸化亚硝酸盐组分由亚硝酸盐、无缓冲酸，特别是pKa 1.83的马来酸，连同作为还原剂的抗坏血酸(pKa4.1)混和。本发明公开了一种有效的双组分系统，该系统在令人惊讶的高pH值产生NO，此pH是生物相容的，减少刺激的，从而更适合某些适应症。 

本发明公开了一个简单的通过水或生物体液和生物相容性试剂产生一氧化氮(NO)的方法，还包括把这些试剂的水溶液变换为软膏或凝胶来用于局部应用和减缓NO的传递。组合物中含有还原剂的话，NO将是主要产物，这构成本发明的一个方面。 

本文所述的，用于产生一氧化氮(NO)生物相容性的系统和步骤，特别适用于局部应用。 

本文在此描述的方法包括，在过量的抗坏血酸和用来增加溶液的pH值相同量的柠檬酸钠存在的条件下，混合亚硝酸钠的水溶液与等摩尔量的柠檬酸的水溶液，。优选的亚硝酸钠是与酸性成分分开存放的。在一个优选的实施例中，本过程的特点是，采用三个安全、廉价的化合物，很方便的产生NO，没有残留，避免生物学副作用(有许多潜在的合成NO供体的情况下会有残留)，并且不需要导致耐药性的酶促反应(如果用有机硝酸盐作为NO供体的情况下产生耐药性)。 

此前认为，用于局部应用治疗的酸化亚硝酸盐的组合物，只有在混 合物的pH值小于4才会释放NO。例如U.S.Patent No.6,709,681，在pH低于3时，大大减少NO产生，而且亚硝酸钠与酸的混合物在缓冲液pH值超过4时，没有检测到大量的NO的产生。同样，Jezek的美国专利申请2011/0070318中，使用盐酸来实现达到活化的pH值。此申请的说明书中指定使用的非硫醇(不是酸)。亚硝酸盐的缓冲作用是用于维持适宜的的pH值在3-4之间。虽然这样低的pH值组分会释放NO，然而低pH值有太强的刺激性，不利于治疗。 

本文所公开了在本文描述的酸化亚硝酸盐凝胶组合物的发现基础上改进的组合物，可以pH值在4.0以上产生大量的NO。此外，发明者不知道有报道、销售或使用，包括：(1)亚硝酸盐，(2)足够强度的有机酸，(3)还原剂，(4)产碱的盐，四种成分都是生物相容性的的组合物。很少有机酸或其它酸在需要的强度是生物耐受的。在缺乏还原剂如抗坏血酸的情况下，有害的二氧化氮连同NO一起产生，如反应式(2)。因此可以断言，就必然具有由本发明人选择的四种类型的成分，以及这些类型的代表的优选而言，本文描述的方法和步骤是唯一的。 

发生的化学反应方程式： 

2HA+2NaNO2→2HNO2+2NaA(1)， 

HA是柠檬酸一样的有机酸 

2HNO2→NO+NO2+H2O(2)， 

亚硝酸分解产生二氧化氮 

NO+NO2+H2O+Asc(OH)2→2 NO+2H2O+AscO2(3)， 

抗坏血酸用来移除产生的二氧化氮 

通过反应(1)和(2)中，H+从溶液中除去，并且混合物的pH值随着反应的进行而增加。因此，混合后立即观察得到的混合物初始pH值，是最低的pH值。 

两个凝胶传递NO的方法具有下列性质。通过调节亚硝酸盐和酸的数量，可以简单地控制剂量(总数)。通过调节凝胶的粘度，可以独立地控制NO的释放率。因此，根据需要，高总剂量可以长时间段传递，或低总剂量可以迅速传递。例如，可以形成多层夹心结构，通过去除连 续凝胶之间的障碍激活每一个连续层(它们甚至可以有不同的强度)。因此，伤口经几次治疗后，仍可以保持覆盖。凝胶的另一个特征是它是兼容的，可以添加各种试剂，如杀菌化合物和抗生素。 

应用的其他机制(除了局部)是可能的。这种技术可能被用来作为喷雾剂、栓剂、(耳、鼻、阴道或直肠给药)，甚至或者是注射的形式来控制许多生物学功能。它也可以滴管的形式分别用于眼睛、耳朵、鼻子或喉咙。几乎所有的这些应用都涉及到炎症的治疗。静脉应用可能会用于急性心绞痛和调节心血管系统。 

凝胶也可以与各种各样的试剂结合使用，包括抗生素、麻醉剂、止痛药、抗炎剂(例如皮质类固醇和非类固醇抗炎剂)、抗病毒药、血管扩张剂或血管收缩剂、防晒制剂(PABA)、抗组胺药、以及其他的各种激素试剂(如雌激素、孕激素、雄激素、抗皮脂溢剂)、以及其他心血管药物、肥大细胞稳定剂、抗疥螨药或灭虱药、角质剥脱剂、润滑剂、麻醉剂、洗发剂、痤疮制剂、抗皮脂溢剂、烧伤制剂、清洁剂、除臭剂、脱色剂、尿布疹产品、润肤剂和保湿剂、感光剂、毒藤蔓或毒橡木或毒漆树产品、晒伤制剂、含焦油制剂、疣制剂、湿敷料及伤口护理产品。这将减少过程中引入的任何潜在感染的危险。 

本凝胶技术是局部NO传递系统，是优选的，不是必需的。因此，其他NO(如硝酸甘油)治疗的许多全身性的副作用应该是完全可以避免的。对于某些适应症，这是一个重要的优势。 

凝胶的局部应用进一步的优点是，它是可以自我调节的，当已达到所需的治疗效果时，剩余量的凝胶可以简单地擦去，停止NO的释放。对于其他治疗方法可能有的一些过敏性反应的病人，这种能立即停止的治疗应是有益的。 

除了列表上和潜在的NO用途外，凝胶技术的四个重要的具体应用是值得的更详细讨论的。这些普遍与事实相关的，即凝胶局部产生NO反过来又增强局部循环反应。 

1、由于凝胶的局部应用已被证明可以立即提高局部血流量，凝胶技术在男性和女性的性和生殖问题，尤其是阴茎和阴蒂的勃起、阳痿的 治疗有重要的用途。在这里，直接控制剂量的能力可能是重要的。当然，如果需要的话，这样的凝胶也可以包含抗生素、杀精子剂和/或其它添加剂。 

2、对于头发更换和增长，改善局部循环是非常重要的。凝胶技术可以被用于治疗局部脱发，特别是，由于微循环的缺陷所造成的少部分脱发。 

3、烧伤对于局部应用的NO在动物模型中证明对治疗的反应。见Zhu et al.J Burn Care & Research(2008)29：804-14。凝胶技术与其他化合物一起使用，可应用于轻微烧伤，如晒伤和其他伤口。 

4、NO供体化合物在控制宫颈扩张方面是非常重要的。凝胶技术用于此目的是特别有吸引力的。首先，它可以直接控制的，其次，它纯粹是局部的，而不是全身。 

有许多类型的化合物可能被添加到凝胶中，不改变NO供体性质，增加一些已知的附加功能。这些包括抗生素、类固醇、抗组胺剂、抗感染剂、前列腺素药、退热药、止痛药、抗精神病药物、抗皮脂溢剂、抗牛皮癣剂、止痒剂、局部麻醉剂。此外，他们可结合局部作用的心血管药物，如α或β受体阻滞剂和落建。可能被添加到凝胶中的另一种类型的化合物是血管扩张剂，如α-肾上腺素能受体拮抗剂甲磺酸酚妥拉明或其他性勃起剂。凝胶也可以结合维生素、皮肤软化剂、润肤剂、清除剂、酶和角质层剥脱剂。 

下面的实施例，包括证明本发明的最佳实施例方案。应该理解那些在本技术领域的技术人员的技术中公开的实施例，按照代表技术发挥良好作用，在本发明的实践中发现的技术，并因此可以被认为构成及其实践的优选模式。然而，那些在本技术领域的技术人员应根据本公开的，欣赏具体的实施例，不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以作出许多改变仍能获得相似或类似的结果。 

实施例1：用于局部释放一氧化氮的酸化亚硝酸钠凝胶的制备。 

凝胶包含的亚硝酸钠和酸是分别单独保存的，直到使用前混合。制 备亚硝酸盐凝胶，85毫升的去离子水加热至80℃。加入2克亚硝酸钠，搅拌直到完全溶解。然后，加入2.88克具有均分子量为750000的羟乙基纤维素(HEC)。将混合物搅拌，直到HEC完全凝胶化，然后使其冷却45℃以下。加入去离子水，以补充产品总重量到100g，并搅拌以保证良好的混合。 

制备酸凝胶，70毫升的去离子水加热至80℃。向此溶液中加入5.6克柠檬酸、5.2克抗坏血酸(维生素C)和随意加入一定量的柠檬酸钠，搅拌直到所有成分溶解。在某些实施例中，使用了抗坏血酸衍生物3-O-乙基抗坏血酸。然后，加入2.88克具有均分子量为750000的羟乙基纤维素(HEC)。将混合物搅拌，直到HEC完全凝胶化，然后使其冷却45℃以下。加入去离子水，以补充产品总重量到100g，并搅拌以保证良好的混合。 

等量的两种凝胶在使用前立即混合，在完好的皮肤上应用该混合物，并用胶布绷带覆盖它(或者不覆盖)，NO将局部传递给药。更好的是，两种凝胶不用提前混合，或者在皮肤上进行混合时，使亚硝酸盐凝胶与皮肤接触，另一个凝胶覆盖在它的上面，这是为了减少由于混合物或酸凝胶的低pH值，引起的任何刺激。如果两个凝胶具有足够的粘度，两个凝胶可以剪切成合适大小薄片，做成三明治状，由塑料或金属箔的薄片夹在两种凝胶中间，分离开每个凝胶。使用前去除隔离薄片，可以稍微按压使得两个凝胶薄片贴近，这样来逐步的局部释放NO。需要的话，可以在两个凝胶薄片上覆盖不漏气的绷带。 

更好的是，避免或减少大气和混合物产生的一氧化氮接触，因为在某些条件下，NO可以迅速被空气氧化(除非NO极度稀少)，得到不受欢迎的二氧化氮。 

实施例2：pH值可控的凝胶混合物的制备 

按照上述的实施例1的混合过程，制备加入不同量的柠檬酸钠的四组含有柠檬酸的凝胶。如表1所示，四组凝胶的柠檬酸钠的重量百分数和主要成分的摩尔浓度。每个凝胶含有柠檬酸0.30摩尔/每升、抗坏血 酸0.28摩尔/每升和分子量为750000的羟乙基纤维素4.4×10-5摩尔/每升。包含不同量柠檬酸钠的基于柠檬酸的凝胶，和等体积的亚硝酸盐凝胶混合来产生NO。此亚硝酸盐凝胶含有亚硝酸钠0.32摩尔/每升和分子量为750000的羟乙基纤维素4.4×10-5摩尔/每升。表1还包括酸凝胶和亚硝酸盐凝胶混合物的初始pH值。增加柠檬酸钠的量，会增加酸凝胶的pH值，以及增加酸凝胶和亚硝酸盐混合物的初始pH值。 

表1 

在酸解离反应中(如下面的实施例2.1所示)，添加柠檬酸钠酸凝胶，提供额外的A-，酸解离平衡移位，如此H+的浓度降低，增加了酸凝胶的pH。最初认为是高pH值的混合物不会释放出足够量的NO。美国专利6103275，局部产生NO的双组分体系，源自酸化亚硝酸盐组合物，使用的是无缓冲的马来酸，马来酸的pKa为1.83。如上所示制备的马来酸组合物，其可与那些使用缓冲柠檬酸的组合物相媲美，其与亚硝酸盐凝胶的混合物最初pH值为2.5。如上所示，目前发明人的工作，显示添加10％的柠檬酸钠会降低NO释放的量不超过2倍，但增加混合产物的pH值从3.41到4.97，减少其酸度35倍。这显著改善了酸化的NO产生混合物的治疗适应症的适应性。 

实施例2.1：pH可控的凝胶混合物的制备 

另一个实施例中，实施例1的混合步骤后，制备具有不同量的柠檬酸钠的五个酸凝胶。如表2所示，这些凝胶的柠檬酸钠的重量百分比和活性成分的摩尔浓度。表2还显示了每个酸凝胶制备后测得的pH值。亚硝酸盐凝胶制备，按照实施例1的混合步骤，得到的亚硝酸盐凝胶，含有亚硝酸钠0.29摩尔/每升和分子量为750000的羟乙基纤维素3.84×10-5摩尔/每升。约1.5毫升的酸凝胶和等量的亚硝酸盐凝胶，分别装入双圆筒中相对应的圆筒内，配备2毫升混合用注射器的静态混合器(4B19注射器和4.6毫米×16静态混合器，二者来购自美国涅狄格州诺里奇康的Plas-pak Industries公司)。操作混合注射器使凝胶流到静态混合器混合。混合注射器的内容物，大约在流过静态混合器后两秒钟迅速完全地混合。逐渐产生气态NO的混合凝胶从该静态混合器流出。混合后立即测定混合凝胶的pH值。同样的步骤，制备其它的酸凝胶，得到的凝胶混合物初始pH，如表2所示。 

表2 

在上述实施例2和实施例2.1的组合物，发生以下的酸解离反应 

解离平衡常数： 

$K_a=\frac{\left[A^{-}\right]\left[H^{+}\right]}{\left[\mathrm{HA}\right]}$

在这里，在这种情况下，HA是柠檬酸和A-是柠檬酸根离子。 

添加柠檬酸钠到酸凝胶中，提供了额外的A-.，酸解离平衡移动，使得H+的浓度降低，增加酸凝胶的pH。进一步的示例实施例2.1表明，添加15％柠檬酸钠降低不超过30％的NO释放量，但提高混合产物pH值从3.59到4.94，降低混合产物酸度(H+浓度)22个因子系数。 

实施例3：用于确定从混合凝胶释放NO的实验步骤。 

在实施例2中，NO的释放被测定如下。等量的含酸和含亚硝酸盐 凝胶在一个恒定流量的氩气下进行混合。凝胶混合物产生的NO被氩气流稀释，该气流中的NO浓度作为时间函数来测量。该浓度测量产生的从凝胶混合物中NO的释放速率结果如图1A所示，每个凝胶混合物NO释放的相对量由如图1A中的从时间t＝0到t＝20分钟的曲线积分确定，产生的结果如图2A所示。令人惊讶的是，本发明人发现，从含有不同量的柠檬酸钠凝胶混合物中NO释放的量，是不强烈依赖于凝胶混合物pH值(在覆盖的pH值范围内)。 

实施例3.1：测定NO从混合凝胶中释放的实验步骤 

实施例2.1的五个不同凝胶，采用一种简单的方法来测量每个凝胶混合物的总气体释放。大约1.5毫升的酸凝胶和相同量的亚硝酸盐凝胶，分别装入双圆筒中相对应的圆筒内，配备2毫升混合用注射器的静态混合器。注射器操作时，凝胶混合物被直接分配到一个小量筒中。凝胶一混合好，就开始产生NO气泡。凝胶混合物足够地粘稠，它形成的泡沫包含大量NO气泡。随着NO生成的继续，量筒中的泡沫体积变大，从顶部的泡沫逸出非常少的NO，这应归于圆筒的小的横截面积和凝胶的高粘度。从泡沫体积增加一直到稳定，测定量筒中泡沫体积。图1B所示，含有实施例2.1的凝胶4(10％柠檬酸钠)的混合物注入到量筒中后，测量的泡沫体积。气泡在量筒中停留大约16小时，这是所有NO逸出所需要的时间，得到量筒中无气泡凝胶的体积。因此，产生的气体的体积，由观察到的最大泡沫体积(这是凝胶体积加上气体体积)，与很多小时后观察到的无气泡的凝胶体积之差得出。如图2B所示，由实施例2.1的每个凝胶组合物产生的NO气体体积，绘制的结果作为使用每毫升亚硝酸盐凝胶产生的气体体积。数据与每ml亚硝酸盐凝胶的反应完全进行的理论计算值6.5ml NO，是高度一致的。在所有的情况下，测得的NO的释放是接近该值，表明产生NO的反应将要完成。此数据明确地显示，大量的NO从pH范围在3.5和5之间混合凝胶组合物中释放。 

实施例4：由含有柠檬酸钠的酸化亚硝酸盐凝胶的局部应用造成的血流量增加的证明。 

凝胶的制备按照实施例1的混合过程，活性成分的量如下。 

EUXYL.PE9010是一种活性成分为苯氧基乙醇的防腐剂(Schülke and Mayr，30 Two Bridges Road Suite 225，Fairfield，NJ 07004，USA).。3-O-乙基抗坏血酸，是抗坏血酸的衍生物，因为其能够保护组合物的长时间的颜色和粘度，而用来代替抗坏血酸。 

凝胶“N”，一氧化氮供体成分 

在安慰剂制剂的情况下，上面的亚硝酸钠替换为6.1毫克碳酸氢钠，碳酸氢钠浓度为73mM和重量百分比为0.61％。安慰剂与凝胶A混合，不会释放NO，是如下所示的组分。 

凝胶“A”，一氧化氮激活成分： 

受试者平躺在床上，在整个研究期间，要求保持安静。测试的两个前臂掌侧的皮肤区域(4厘米×5厘米＝20平方厘米)用油墨标记。血流量测量采用双通道激光多普勒血流监测(Moor DRT4)，探针贴到每个前 臂，注意避免与任何的浅静脉接触。灌注监视器的输出是通过笔记本电脑利用定制程序连续不断的记录。记录对照测量双臂约5分钟，测量暂停，小心的移走探针。每一组的两个凝胶分别按1∶1的比例混合(约0.5ml凝胶“N”+0.5ml凝胶“A”的活性组组分；和0.5ml安慰剂凝胶+0.5ml凝胶“A”为安慰剂组组分)，应用于每个前臂的标注区域。安慰剂混合物被涂到右手臂，而活性成分混合物被涂到左手臂。空气干燥1-2分钟后，除去残留的凝胶，探针被重新贴到完全相同的位置，以继续测量。 

如图3所示，在每个测试区域测得的灌注，对于活性凝胶混合物和安慰剂凝胶混合物，其中在该图的顶部的垂直箭头表示的是凝胶的应用时间。垂直轴表示测得的血液灌流的相对值。在应用活性成分凝胶后，血液灌注立即增加。灌注在开始约10分钟以时间常数下降，但在整个测试中一直高于基线。安慰剂混合物显示在血液灌注上没有任何效果。 

这些测试表明凝胶在增强了应用区域的血液循环的处理效果。然而，这只是这项技术的其中的一个应用。本发明展示了本文所述的NO释放系统，和它们引起局部血流量的增加。这个发现可以应用于可以通过增加局部血液循环来治疗的任何情况。 

实施例5：凝胶组合物的应用 

在图4A实施例中，公开了一个通过两个腔室的混合装置，如混合注射器10，来产生NO的装置和方法。NO供体组合物的凝胶(包含亚硝酸盐)，在混合注射器10的第一腔室12预先装载。NO活化组合物的凝胶包含还原剂、至少一种有机酸和至少一种这个有机酸的共轭碱混合在一起，在混合注射器10的第二腔室14预先装载。混合装置用帽子21盖好，里面的组合物是可以稳定存储。需要NO产生的混合物时，按下结合的柱塞16，NO供体组合物和NO活化组合物一起运送通过混合室18。在一个实施例中，混合室18包括一个静态混合元件20，NO的供体和活化组合物两个组合物的混合装置运送时，充分混合。 

混合的组合物可以直接应用到组织部位。在一个实施例中，该混合装置预装载多个剂量。通过每次挤压柱塞16上的刻度8的一个刻度， 得到剂量的基本单位。由于NO的供体和活化组合物混合前分别是稳定的，预先填装多个剂量到混合装置，作为居先的剂量已基本上耗尽其NO生成的能力后，可以重复应用。例如在一个实施例中，该混合装置预先装载12个剂量，能够在一定的间隔时间，比如一天，内应用。如果需要的话，应用的混合好的剂量，盖一个不透气的绷带，防止NO到空气中，将所有的NO直接产生到组织部位上。对于每个重复剂量，绷带提升，更多的剂量运送到绷带下，然后绷带在处理部位贴上。例如，如果从混合装置每小时运送一个新的剂量，组织部位在连续12小时内可以接触NO的覆盖。在某些实施例中，预先装填混合装置装备在一个伤口愈合包中，包中包括预先装填混合装置和绷带，这些放在无菌包中，还包括使用说明。在某些实施例中，单一混合物如抗坏血酸或抗坏血酸衍生物，可以在NO活化组合物中承担还原剂和有机酸的两个作用。在某些实施例中，活化组合物的pH值大于3.0，当与一氧化氮供体混合时，该混合物的初始pH值大于4.0，从而最大限度地减少应用中的疼痛。 

在另一个实施例中，如图4B所描述，局部产生的NO，首先在皮肤或身体的其它局部位置26，应用凝胶形式的NO供体组合物。之后将覆盖NO活化组合物层，其包括酸，还原剂和碱。这样可以控制到所需的身体表面的NO释放速率。如所示，NO供体组合物，从管或其它容器24挤压到该位置。NO活化组合物，从管或其它容器22挤压覆盖到NO供体组合物应用的位置。管或其它容器中预先填入测量好的数量。如果需要的话，覆盖一层不透气的绷带28，导引产生所有的NO到组织部位上。 

所有的在此公开和进行权利要求的组合物和或方法，可以在现有的公开下，不必通过过度的实验就可以得到和实现。本发明的组合物和方法在实施例中已经描述，对于本领域的技术人员来说，可以应用到组合物、和或方法、方法的步骤和步骤的顺序的在此描述的、不脱离发明的概念、精神和发明范围的变动是显而易见的。更具体的说，为了相同或相近作用，一些化学和生理学相关的试剂可以用来替换在此描述的的试剂，这是显而易见的。对于本领域技术人显而易见的、所有的这些相似。 

Claims (28)

1.一种生物相容的双组成的一氧化氮输送系统，所述输送系统包括含亚硝酸盐的一氧化氮供体组合物第一凝胶，和含有至少一种还原剂、至少一种有机酸和至少一种所述有机酸的共轭碱混合在一起的一氧化氮活化组合物第二凝胶，其特征在于，所述的活性组合物的pH值大于3.0，所述的一氧化氮供体组合物和一氧化氮活化组合物单独存储时是稳定的，当混合时形成了一氧化氮的来源，所述混合物初始pH值大于4.0。

2.如权利要求1所述的输送系统，其特征在于，所述的亚硝酸盐是亚硝酸钠、亚硝酸钾、亚硝酸钙中的一种或多种组合。

3.如权利要求1所述的输送系统，其特征在于，所述的有机酸是柠檬酸、抗坏血酸、乳酸、甘油酸和甲酸中的一种或多种组合。

4.如权利要求1所述的输送系统，其特征在于，所述有机酸是抗坏血酸，抗坏血酸另一个功能是用作至少一种还原剂。

5.如权利要求1所述的输送系统，其特征在于，所述有机酸是一种抗坏血酸衍生物，抗坏血酸衍生物另一个功能是用作至少一种还原剂。

6.如权利要求5所述的输送系统，其特征在于，所述抗坏血酸衍生物是选自下列的一种：3-O-乙基抗坏血酸、3-烷基抗坏血酸，6-O-辛酰基-抗坏血酸、6-O-十二烷酰基-抗坏血酸、6-O-十四烷酰基-抗坏血酸、6-O-十八烷酰基-抗坏血酸，6-O-癸二酰-抗坏血酸，及它们的任意组合。

7.如权利要求5所述的输送系统，其特征在于，所述的抗坏血酸衍生物是3-O-乙基抗坏血酸。

8.如权利要求1所述的输送系统，其特征在于，一氧化氮活化组合物包括：柠檬酸、柠檬酸钠和抗坏血酸或抗坏血酸衍生物。

9.如权利要求1所述的输送系统，其特征在于，其中第一和第二凝胶包括羟乙基纤维素。

10.如权利要求1所述的输送系统，其特征在于，一氧化氮供体组合物和一氧化氮活化组合物预装载在双腔室的混合装置。

11.如权利要求10所述的输送系统，其特征在于，所述双腔室的混合装置还包括一个静态混合器。

12.如权利要求1所述的输送系统，其特征在于，先计算好量的一氧化氮供体组合物和一氧化氮活化组合物隔离分开预装载在容器中，运送到组织部位。

13.如权利要求10-12任一项所述的输送系统，其特征在于，所述系统还包括一个密封绑带，和一氧化氮供体组合物和一氧化氮活化组合物成套包装。

14.一种生物相容的双组成的一氧化氮(NO)输送系统，所述输送系统包含：有柱塞的第一腔室，供体组合物(含有亚硝酸盐)第一凝胶放在其中，和有柱塞的第二腔室，活化组合物第二凝胶(含有至少一个还原剂、至少一个有机酸和至少一个所述有机酸的共轭碱的混合物)放在其中，其特征在于直到想要NO产生之前，两个腔室用来分离保存NO供体组合物和NO活化组合物，想要NO产生时，柱塞同时推入腔室，挤压一定量的供体组合物和活化组合物进入混合室，混合室混合供体组合物和活化组合物，挤压产生NO的混合物到组织部位。

15.如权利要求14所述的输送系统，其特征在于，所述两个腔室固定在一起成为一个隔离腔室的注射器。

16.如权利要求14、15任一项所述的输送系统，其特征在于，所述混合室包括一个静态混合器，在NO供体组合物和活化组合物在运送出释放装置时充分混合两组分。

17.如权利要求14-16任一项所述的输送系统，其特征在于，所述第一和第二腔室预装载多个剂量。

18.如权利要求14-17任一项所述的输送系统，其特征在于，所述腔室标记单一剂量的刻度，来指示每按一次柱塞释放一个剂量单位。

19.如权利要求14-18任一项所述的输送系统，其特征在于，所述系统还包含一个不透气的绷带，和第一第二腔室的NO供体和活化组合物配套包装。

20.如权利要求14-19任一项所述的输送系统，其特征在于，NO活化组合物的pH大于3.0，活化组合物和供体组合物的混合物的起始pH大于4.0。

21.如权利要求14-20任一项所述的输送系统，其特征在于，有机酸是一种抗坏血酸衍生物，抗坏血酸衍生物另一个功能是用作一种还原剂。

22.如权利要求21所述的输送系统，其特征在于，所述抗坏血酸衍生物是选自下列的一种：3-O-乙基抗坏血酸、3-烷基抗坏血酸，6-O-辛酰基-抗坏血酸、6-O-十二烷酰基-抗坏血酸、6-O-十四烷酰基-抗坏血酸、6-O-十八烷酰基-抗坏血酸，6-O-癸二酰-抗坏血酸，及它们的任意组合。

23.如权利要求14-22任一项所述的输送系统，其特征在于，所述的亚硝酸盐是亚硝酸钠、亚硝酸钾、亚硝酸钙中的一种或多种组合。

24.一种生物相容的双组成的一氧化氮(NO)输送系统，所述输送系统包括NO供体组合物，供体组合物含有一定量的亚硝酸盐，和NO活化组合物，活化组合物含有柠檬酸、抗坏血酸或抗环血酸衍生物，两种酸的总摩尔浓度和亚硝酸盐相同，还包括足够增加NO活化组合物的pH到3.0以上的浓度的柠檬酸钠

25.如权利要求24所述的生物相容的双组成的一氧化氮(NO)输送系统，其特征在于，NO供体组合物和活化组合物的形式是凝胶。

26.如权利要求24所述的生物相容的双组成的一氧化氮(NO)输送系统，其特征在于，所述抗坏血酸衍生物是选自下列的一种：3-O-乙基抗坏血酸、3-烷基抗坏血酸，6-O-辛酰基-抗坏血酸、6-O-十二烷酰基-抗坏血酸、6-O-十四烷酰基-抗坏血酸、6-O-十八烷酰基-抗坏血酸，6-O-癸二酰-抗坏血酸，及它们的任意组合。

27.如权利要求24-26任一项所述的生物相容的双组成的一氧化氮(NO)输送系统，其特征在于，所述的亚硝酸盐是亚硝酸钠、亚硝酸钾、亚硝酸钙中的一种或多种组合。

28.如权利要求24-27任一项所述的生物相容的双组成的一氧化氮(NO)输送系统，其特征在于，NO供体组合物和活化组合物按计量预装载在隔离的容器中，混合时，容器输送合适量的NO供体和活化组合物的混合物，来持续释放产生NO。

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