CN103120123A - 用于提高铁皮石斛结实率的培养基及该培养基的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于提高铁皮石斛结实率的培养基，其特征在于：包括改良MS+白糖25~40g/L+琼脂粉5.5~10g/L+NAA0.2~0.5mg/L+土豆汁30~50ml/L+红薯汁30~50ml/L+活性炭粉0.5~0.8g/L；其中，改良MS培养基中KNO3、KH2PO4和H3BO3用量为MS培养基中KNO3、KH2PO4和H3BO3用量的三倍，其余组分含量不变。该培养基通过采用特定含量的铁皮石斛改良MS培养基、NAA、土豆汁和红薯汁的共同协同作用，不仅为铁皮石斛的结实培养提供丰富的氮、磷等营养元素，成本低，并且显著激活铁皮石斛结实的关键因子，从而大大提高铁皮石斛的结实率。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于提高铁皮石斛结实率的培养基及该培养基的制备方法。
背景技术
铁皮石斛又称黑节草, 属兰科附生兰类，为多年生草本植物。铁皮石斛是石斛中的极品，因其表皮呈铁绿色而得名，是著名的观赏兼药用兰花；现有技术中，对铁皮石斛的培养阶段中，大多对外植体原球茎进行诱导培养、增殖、分化、生化培养，得到小苗，但是对后期的试管结实的研究比较少；铁皮石斛对生境条件要求苛刻，难结实，因此，对铁皮石斛结实的培养对提高植物结实机理研究具有非常重要的意义；而现有的铁皮石斛结实过程中，授粉后植株一般没有单独特殊的营养供应导致营养元素不充足，直接影响果实发育，造成果夹小，结实率低；
并且，通常情况下，培养基的制备过程中一般采用热灌装的方式，即白糖和琼脂粉均是经加热煮沸后倒入灌装机中灌装，该方法制备出的培养基营养元素流失严重，灌装不均匀，不便于结实的培养。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于提高铁皮石斛结实率的培养基及该培养基的制备方法，该培养基克服现有技术中铁皮石斛结实阶段营养不良导致结实率低、果夹小的问题，诱导铁皮石斛结实，提高铁皮石斛结实率。
为了达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是：提供一种用于提高铁皮石斛结实率的培养基，其特征在于：包括
改良MS+白糖25~40g/L+琼脂粉5.5~10 g/L+NAA 0.2~0.5mg/L+土豆汁30~50ml/L+红薯汁30~50ml/L+活性炭粉0.5~0.8g/L；其中，改良MS培养基中 KNO3、KH2PO4和H3BO3用量为MS培养基中KNO3、KH2PO4和H3BO3用量的三倍，其余组分含量不变。
本发明的用于提高铁皮石斛结实率的培养基，包括
改良MS+白糖25g/L+琼脂粉5.5g/L+NAA 0.2mg/L+土豆汁30ml/L+红薯汁30ml/L+活性炭粉0.5g/L；其中，改良MS培养基中 KNO3、KH2PO4和H3BO3用量为MS培养基中KNO3、KH2PO4和H3BO3用量的三倍，其余组分含量不变。
本发明的用于提高铁皮石斛结实率的培养基中，每升改良MS培养基中含有的组分及各组分的重量如下：NH4NO3165mg、KNO3 5700mg、CaCl2·2H2O 440mg、MgSO4·7H2O 370mg、KH2PO4 510mg、KI 0.83mg、H3BO3 18.6mg、MnSO4·H2O 16.9mg、ZnSO4·7H2O 8.6mg、Na2MoO4·2H2O 0.25mg、CuSO4·5H2O 0.025mg 、CoCl2·6H2O 0.025mg、 FeSO4·7H2O 27.8mg、Na2-EDTA·2H2O 37.3mg、肌醇100 mg、烟酸0.5 mg、盐酸吡哆醇0.5 mg、盐酸硫胺素0.1 mg、甘氨酸2 mg；这种改良的MS培养基通过将NH4NO3、KH2PO4和H3BO3的用量增加，使氮和磷的元素含量大大增加，更有利地促进果实的发育。
上述用于提高铁皮石斛结实率的培养基的配制方法包括以下步骤：
a、首先将白糖和琼脂粉进行预处理：将白糖和琼脂粉混合，再加入蒸馏水溶解，静置4~6小时；其中，混合后的白糖和琼脂粉与蒸馏水的重量比为1:10；
b、改良MS培养基母液的配制，包括母液A1、母液A2、母液A3、母液A4、母液B、母液C和母液D的配制，其中
母液A1的配制：称取255g KH2PO4置于烧杯中，加入蒸馏水搅拌溶解，定容至5000ml，保存到棕色磨合瓶中；
母液A2的配制：称取2850g KNO3置于烧杯中，加入蒸馏水搅拌溶解，定容至5000ml，保存到棕色磨合瓶中；
母液A3的配制：称取825g NH4NO3、185g MgSO4·7H2O置于烧杯中，加入蒸馏水搅拌溶解，定容至5000ml，保存到棕色磨合瓶中；
母液A4的配制：称取220mg CaCl2·2H2O置于烧杯中，加入蒸馏水搅拌溶解，定容至5000ml，保存到棕色磨合瓶中；
母液B的配制：分别称量0.83g KI、18.6g H3BO3、16.9g MnSO4·H2O、8.6g ZnSO4·7H2O、0.25g Na2MoO4·2H2O、0.025g CuSO4·5H2O和0.025g CoCl2·6H2O，加入烧杯中溶解，定容至5000ml，保存到棕色磨合瓶中；
母液C的配制：分别称量100 g肌醇、0.5 g烟酸、0.5 g盐酸吡哆醇、0.1 g盐酸硫胺素和2 g甘氨酸，加入烧杯中溶解，定容至5000ml，保存到棕色磨合瓶中；
母液D的配制：分别称量27.8g FeSO4·7H2O、37.3g Na2-EDTA·2H2O分别加入1500ml蒸馏水溶解，然后将两种溶液混合，加热煮沸15分钟，并不断搅拌，充分螯合，再定容至5000ml，保存到棕色磨合瓶中；
c、分别称取土豆和红薯，洗净，削皮，切片，加入水煮沸20分钟，并不断搅拌，过滤取其汁液，分别得到土豆汁和红薯汁，冷却至40℃以下备用；
d、将预处理的白糖和琼脂水溶液、10ml母液A1、A2、A3、A4和5 ml母液B、C、D分别倒入灌装机中，再加入NAA、土豆汁、红薯汁及活性炭粉，加水定容，并搅拌，调节pH值至5.8，搅拌15min后灌装，在121℃、0.16MPa的条件下灭菌25分钟，冷凝后制得；其中，灌装时间为11s，间歇时间为0.8s。
本发明的用于提高铁皮石斛结实率的培养基通过采用特定含量的铁皮石斛改良MS培养基、NAA、土豆汁和红薯汁的共同协同作用，不仅为铁皮石斛的结实培养提供丰富的氮、磷等营养元素，成本低，并且显著激活铁皮石斛结实的关键因子，从而大大提高铁皮石斛的结实率；本发明提供的用于提高铁皮石斛结实率的培养基的制备方法通过将琼脂粉及白糖进行预处理及采用冷灌装方式，可大大减少微量元素、维生素及植物激素等营养元素的损失，并且制备的培养基硬度适中，颜色白中透亮，为铁皮石斛结实提供了关键的培养基条件；经该培养基培养后的铁皮石斛果夹直径可达0.8~1cm，结实率高达90%。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细的描述，但它们不是对本发明的进一步限制。
实施例1
该用于提高铁皮石斛结实率的培养基的配方为： 改良MS+白糖25g/L+琼脂粉5.5g/L+NAA 0.2mg/L+土豆汁30ml/L+红薯汁30ml/L+活性炭粉0.5g/L；
其中，每升改良MS培养基中含有的组分及各组分的重量如下：NH4NO3 165mg、KNO3 5700mg、CaCl2·2H2O 440mg、MgSO4·7H2O 370mg、KH2PO4 510mg、KI 0.83mg、H3BO3 18.6mg、MnSO4·H2O 16.9mg、ZnSO4·7H2O 8.6mg、Na2MoO4·2H2O 0.25mg、CuSO4·5H2O 0.025mg 、CoCl2·6H2O 0.025mg、 FeSO4·7H2O 27.8mg、Na2-EDTA·2H2O 37.3mg、肌醇100 mg、烟酸0.5 mg、盐酸吡哆醇0.5 mg、盐酸硫胺素0.1 mg、甘氨酸2 mg。
上述用于提高铁皮石斛结实率的培养基的配制过程为：
（1）首先将白糖和琼脂粉进行预处理：将白糖和琼脂粉混合，再加入10倍重量的蒸馏水溶解，静置4小时；
（2）改良MS培养基母液的配制，包括母液A1、母液A2、母液A3、母液A4、母液B、母液C和母液D的配制，其中
母液A1的配制：称取255g KH2PO4置于烧杯中，加入蒸馏水搅拌溶解，定容至5000ml，保存到棕色磨合瓶中；
母液A2的配制：称取2850g KNO3置于烧杯中，加入蒸馏水搅拌溶解，定容至5000ml，保存到棕色磨合瓶中；
母液A3的配制：称取825g NH4NO3、185mg MgSO4·7H2O置于烧杯中，加入蒸馏水搅拌溶解，定容至5000ml，保存到棕色磨合瓶中；
母液A4的配制：称取220mg CaCl2·2H2O置于烧杯中，加入蒸馏水搅拌溶解，定容至5000ml，保存到棕色磨合瓶中；
母液B的配制：分别称量0.83g KI、18.6g H3BO3、16.9g MnSO4·H2O、8.6g ZnSO4·7H2O、0.25g Na2MoO4·2H2O、0.025g CuSO4·5H2O和0.025g CoCl2·6H2O，加入烧杯中溶解，定容至5000ml，保存到棕色磨合瓶中；
母液C的配制：分别称量100 g肌醇、0.5 g烟酸、0.5 g盐酸吡哆醇、0.1 g盐酸硫胺素和2 g甘氨酸，加入烧杯中溶解，定容至5000ml，保存到棕色磨合瓶中；
母液D的配制：分别称量27.8g FeSO4·7H2O、37.3g Na2-EDTA·2H2O分别加入1500ml蒸馏水中溶解，然后将两种溶液混合，加热煮沸15分钟，并不断搅拌，充分螯合，再定容至5000ml，保存到棕色磨合瓶中；
（3）分别称取土豆和红薯，洗净，削皮，切片，加入水煮沸20分钟，并不断搅拌，过滤取其汁液，分别得到土豆汁和红薯汁，冷却至40℃以下备用；
（4）将预处理的白糖和琼脂水溶液、10ml母液A1、A2、A3、A4和5 ml母液B、C、D分别倒入灌装机中，再加入NAA、土豆汁、红薯汁及活性炭粉，加水定容，并搅拌，调节pH值至5.8，搅拌15min后进行冷灌装，在121℃、0.16MPa的条件下灭菌25分钟，冷凝后制得该培养基；其中，灌装时间为11s，间歇时间为0.8s。
采用本发明的方法制备的培养基与白糖琼脂粉未预处理制备的培养基及采用热灌装的方式制备的培养基的性能对比如表1：
表1
| 灌装均匀度 | 凝固百分比 | 凝固后颜色 | 凝固后pH值 | 微量元素铁含量测定 | 维生素、植物激素含量测定 | 硬度 | |
| 白糖和琼脂粉预处理及冷灌装 | 均匀 | 94.3% | 白偏透亮 | 5.6~6.0 | 几乎不变 | 几乎不变 | 适中 |
| 白糖和琼脂粉未预处理灌装 | 较均匀 | 86.2% | 透亮，带琼脂粉颜色 | 6.0~6.4 | 几乎不变 | 几乎不变 | 偏硬 |
| 热灌装 | 很均匀 | 97.6% | 白偏淡黄 | 5.2~5.8 | 降低 | 降低 | 偏软 |
注：白糖和琼脂粉经预处理和未预处理的配制过程中，加入的其它成分均相同；热灌装是指白糖琼脂未经预处理，加热煮沸10分钟，待琼脂粉完全溶解后倒入灌装机中灌装；
由上表可以看出，本发明的配制方法中，白糖和琼脂粉经预处理冷灌装后培养基均匀，所含微量元素及维生素几乎不变，培养基的硬度适中，便于铁皮石斛结实的培养。
实施例2
该用于提高铁皮石斛结实率的培养基的配方为： 改良MS+白糖40g/L+琼脂粉8g/L+NAA0.4mg/L+土豆汁40ml/L+红薯汁40ml/L+活性炭粉0.6g/L；
其中，每升改良 MS基本培养基中含有的组分及各组分的重量如下：NH4NO3 165mg、KNO3 5700mg、CaCl2·2H2O 440mg、MgSO4·7H2O 370mg、KH2PO4 510mg、KI 0.83mg、H3BO3 18.6mg、MnSO4·H2O 16.9mg、ZnSO4·7H2O 8.6mg、Na2MoO4·2H2O 0.25mg、CuSO4·5H2O 0.025mg 、CoCl2·6H2O 0.025mg、 FeSO4·7H2O 27.8mg、Na2-EDTA·2H2O 37.3mg、肌醇100 mg、烟酸0.5 mg、盐酸吡哆醇0.5 mg、盐酸硫胺素0.1 mg、甘氨酸2 mg。
上述用于提高铁皮石斛结实率的培养基的配制过程为：
（1）首先将白糖和琼脂粉进行预处理：将白糖和琼脂粉混合，再加入10倍重量的蒸馏水溶解，静置6小时；
（2）改良MS培养基母液的配制，包括母液A1、母液A2、母液A3、母液A4、母液B、母液C和母液D的配制，其中
母液A1的配制：称取255g KH2PO4置于烧杯中，加入蒸馏水搅拌溶解，定容至5000ml，保存到棕色磨合瓶中；
母液A2的配制：称取2850g KNO3置于烧杯中，加入蒸馏水搅拌溶解，定容至5000ml，保存到棕色磨合瓶中；
母液A3的配制：称取825g NH4NO3、185mg MgSO4·7H2O置于烧杯中，加入蒸馏水搅拌溶解，定容至5000ml，保存到棕色磨合瓶中；
母液A4的配制：称取220mg CaCl2·2H2O置于烧杯中，加入蒸馏水搅拌溶解，定容至5000ml，保存到棕色磨合瓶中；
母液B的配制：分别称量0.83g KI、18.6g H3BO3、16.9g MnSO4·H2O、8.6g ZnSO4·7H2O、0.25g Na2MoO4·2H2O、0.025g CuSO4·5H2O和0.025g CoCl2·6H2O，加入烧杯中溶解，定容至5000ml，保存到棕色磨合瓶中；
母液C的配制：分别称量100 g肌醇、0.5 g烟酸、0.5 g盐酸吡哆醇、0.1 g盐酸硫胺素和2 g甘氨酸，加入烧杯中溶解，定容至5000ml，保存到棕色磨合瓶中；
母液D的配制：分别称量27.8g FeSO4·7H2O、37.3g Na2-EDTA·2H2O分别加入1500ml蒸馏水中溶解，然后将两种溶液混合，加热煮沸15分钟，并不断搅拌，充分螯合，再定容至5000ml，保存到棕色磨合瓶中；
（3）分别称取土豆和红薯，洗净，削皮，切片，加入水煮沸20分钟，并不断搅拌，过滤取其汁液，分别得到土豆汁和红薯汁，冷却至40℃以下备用；
（4）将预处理的白糖和琼脂水溶液、10ml母液A1、A2、A3、A4和5ml母液B、C、D分别倒入灌装机中，再加入NAA、土豆汁、红薯汁及活性炭粉，加水定容，并搅拌，调节pH值至5.8，搅拌15min后进行冷灌装，在121℃、0.16MPa的条件下灭菌25分钟，冷凝后制得该培养基；其中，灌装时间为11s，间歇时间为0.8s。
实施例3
该用于提高铁皮石斛结实率的培养基的配方为：改良MS+白糖40g/L+琼脂粉10g/L+NAA 0.5mg/L+土豆汁50ml/L+红薯汁50ml/L+活性炭粉0.8g/L；
其中，每升改良MS基本培养基中含有的组分及各组分的重量如下：NH4NO3 165mg、KNO3 5700mg、CaCl2·2H2O 440mg、MgSO4·7H2O 370mg、KH2PO4 510mg、KI 0.83mg、H3BO3 18.6mg、MnSO4·H2O 16.9mg、ZnSO4·7H2O 8.6mg、Na2MoO4·2H2O 0.25mg、CuSO4·5H2O 0.025mg 、CoCl2·6H2O 0.025mg、 FeSO4·7H2O 27.8mg、Na2-EDTA·2H2O 37.3mg、肌醇100 mg、烟酸0.5 mg、盐酸吡哆醇0.5 mg、盐酸硫胺素0.1 mg、甘氨酸2 mg。
上述用于提高铁皮石斛结实率的培养基的配制过程为：
（1）首先将白糖和琼脂粉进行预处理：将白糖和琼脂粉混合，再加入10倍重量的蒸馏水溶解，静置5小时；
（2）改良MS培养基母液的配制，包括母液A1、母液A2、母液A3、母液A4、母液B、母液C和母液D的配制，其中
母液A1的配制：称取255g KH2PO4置于烧杯中，加入蒸馏水搅拌溶解，定容至5000ml，保存到棕色磨合瓶中；
母液A2的配制：称取2850g KNO3置于烧杯中，加入蒸馏水搅拌溶解，定容至5000ml，保存到棕色磨合瓶中；
母液A3的配制：称取825g NH4NO3、185mg MgSO4·7H2O置于烧杯中，加入蒸馏水搅拌溶解，定容至5000ml，保存到棕色磨合瓶中；
母液A4的配制：称取220mg CaCl2·2H2O置于烧杯中，加入蒸馏水搅拌溶解，定容至5000ml，保存到棕色磨合瓶中；
母液B的配制：分别称量0.83g KI、18.6g H3BO3、16.9g MnSO4·H2O、8.6g ZnSO4·7H2O、0.25g Na2MoO4·2H2O、0.025g CuSO4·5H2O和0.025g CoCl2·6H2O，加入烧杯中溶解，定容至5000ml，保存到棕色磨合瓶中；
母液C的配制：分别称量100 g肌醇、0.5 g烟酸、0.5 g盐酸吡哆醇、0.1 g盐酸硫胺素和2 g甘氨酸，加入烧杯中溶解，定容至5000ml，保存到棕色磨合瓶中；
母液D的配制：分别称量27.8g FeSO4·7H2O、37.3g Na2-EDTA·2H2O分别加入1500ml蒸馏水中溶解，然后将两种溶液混合，加热煮沸15分钟，并不断搅拌，充分螯合，再定容至5000ml，保存到棕色磨合瓶中；
（3）分别称取土豆和红薯，洗净，削皮，切片，加入水煮沸20分钟，并不断搅拌，过滤取其汁液，分别得到土豆汁和红薯汁，冷却至40℃以下备用；
（4）将预处理的白糖和琼脂水溶液、10ml母液A1、A2、A3、A4和5 ml母液B、C、D分别倒入灌装机中，再加入NAA、土豆汁、红薯汁及活性炭粉，加水定容，并搅拌，调节pH值至5.8，搅拌15min后进行冷灌装，在121℃、0.16MPa的条件下灭菌25分钟，冷凝后制得该培养基；其中，灌装时间为11s，间歇时间为0.8s。
试验例
将授粉后的铁皮石斛植株转接到本发明实施例1制备的用于提高铁皮石斛结实率的培养基中，采用28瓦日光色灯管作为光源，光照强度为3000lx，在温度为23℃，湿度为50%，光照时间13小时/天的条件下，培养100天；其中，表2为将授粉后的植株转接到本发明培养基中进行结实培养与转接到生根培养基中进行培养后的植株状态的对照：
表2
| 授粉后子房膨大时间 | 授粉结实率 | 果夹大小 | |
| 实施例1制得的培养基 | 4~8天 | 90% | 果夹直径为0.8-1cm果夹长度为1.0~2.0cm |
| 生根培养基 | 5~10天 | 73% | 果夹直径为0.65~0.93cm果夹长度为1.0~1.78cm |
从上表可以看出，采用本发明实施例制得的培养基进行培养后，所结果实的直径增大，并且结实率有了明显提高。
虽然结合具体实施例对本发明的具体实施方式进行了详细地描述，但并非是对本专利保护范围的限定。在权利要求书所限定的范围内，本领域的技术人员不经创造性劳动即可做出的各种修改或调整仍受本专利的保护。
Claims (4)
1.一种用于提高铁皮石斛结实率的培养基，其特征在于：包括
改良MS+白糖25~40g/L+琼脂粉5.5~10 g/L+NAA 0.2~0.5mg/L+土豆汁30~50ml/L+红薯汁30~50ml/L+活性炭粉0.5~0.8g/L；其中，改良MS培养基中 KNO3、KH2PO4和H3BO3用量为MS培养基中KNO3、KH2PO4和H3BO3用量的三倍，其余组分含量不变。
2.根据权利要求1所述的用于提高铁皮石斛结实率的培养基，其特征在于：包括
改良MS+白糖25g/L+琼脂粉5.5g/L+NAA 0.2mg/L+土豆汁30ml/L+红薯汁30ml/L+活性炭粉0.5g/L；其中，改良MS培养基中 KNO3、KH2PO4和H3BO3用量为MS培养基中KNO3、KH2PO4和H3BO3用量的三倍，其余组分含量不变。
3.根据权利要求1或2所述的用于提高铁皮石斛结实率的培养基，其特征在于：每升改良MS培养基中含有的组分及各组分的重量如下：NH4NO3 165mg、KNO3 5700mg、CaCl2·2H2O 440mg、MgSO4·7H2O 370mg、KH2PO4 510mg、KI 0.83mg、H3BO3 18.6mg、MnSO4·H2O 16.9mg、ZnSO4·7H2O 8.6mg、Na2MoO4·2H2O 0.25mg、CuSO4·5H2O 0.025mg 、CoCl2·6H2O 0.025mg、 FeSO4·7H2O 27.8mg、Na2-EDTA·2H2O 37.3mg、肌醇100 mg、烟酸0.5 mg、盐酸吡哆醇0.5 mg、盐酸硫胺素0.1 mg、甘氨酸2 mg。
4.一种权利要求1所述的用于提高铁皮石斛结实率的培养基的配制方法，其特征在于，包括：
a、首先将白糖和琼脂粉进行预处理：将白糖和琼脂粉混合，再加入蒸馏水溶解，静置4~6小时；其中，混合后的白糖和琼脂粉与蒸馏水的重量比为1:10；
b、改良MS培养基母液的配制，包括母液A1、母液A2、母液A3、母液A4、母液B、母液C和母液D的配制，其中
母液A1的配制：称取255g KH2PO4置于烧杯中，加入蒸馏水搅拌溶解，定容至5000ml，保存到棕色磨合瓶中；
母液A2的配制：称取2850gKNO3置于烧杯中，加入蒸馏水搅拌溶解，定容至5000ml，保存到棕色磨合瓶中；
母液A3的配制：称取825g NH4NO3、185g MgSO4·7H2O置于烧杯中，加入蒸馏水搅拌溶解，定容至5000ml，保存到棕色磨合瓶中；
母液A4的配制：称取220mg CaCl2·2H2O置于烧杯中，加入蒸馏水搅拌溶解，定容至5000ml，保存到棕色磨合瓶中；
母液B的配制：分别称量0.83g KI、18.6g H3BO3、16.9g MnSO4·H2O、8.6g ZnSO4·7H2O、0.25g Na2MoO4·2H2O、0.025g CuSO4·5H2O和0.025g CoCl2·6H2O，加入烧杯中溶解，定容至5000ml，保存到棕色磨合瓶中；
母液C的配制：分别称量100 g肌醇、0.5 g烟酸、0.5 g盐酸吡哆醇、0.1 g盐酸硫胺素和2 g甘氨酸，加入烧杯中溶解，定容至5000ml，保存到棕色磨合瓶中；
母液D的配制：分别称量27.8g FeSO4·7H2O、37.3g Na2-EDTA·2H2O分别加入1500ml蒸馏水溶解，然后将两种溶液混合，加热煮沸15分钟，并不断搅拌，充分螯合，再定容至5000ml，保存到棕色磨合瓶中；
c、分别称取土豆和红薯，洗净，削皮，切片，加水煮沸20分钟，并不断搅拌，过滤取其汁液，分别得到土豆汁和红薯汁，冷却至40℃以下备用；
d、将预处理的白糖和琼脂水溶液、10ml母液A1、A2、A3、A4和5ml母液B、C、D分别倒入灌装机中，再加入NAA、土豆汁、红薯汁及活性炭粉，加水定容，并搅拌，调节pH值至5.8，搅拌15min后灌装，在121℃、0.16MPa的条件下灭菌25分钟，冷凝后制得；其中，灌装时间为11s，间歇时间为0.8s。
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