CN103113594B - 琼脂糖-聚乙烯亚胺-透明质酸接枝物及其制备方法与应用 - Google Patents
琼脂糖-聚乙烯亚胺-透明质酸接枝物及其制备方法与应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103113594B CN103113594B CN201310030896.3A CN201310030896A CN103113594B CN 103113594 B CN103113594 B CN 103113594B CN 201310030896 A CN201310030896 A CN 201310030896A CN 103113594 B CN103113594 B CN 103113594B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- agarose
- polymine
- hyaluronic acid
- preparation
- degraded
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 title claims abstract description 45
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 title claims abstract description 45
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 19
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 claims abstract description 77
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 claims abstract description 20
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 36
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 33
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 30
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 28
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 27
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 26
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 26
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 claims description 24
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 24
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims description 18
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 16
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 claims description 13
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 claims description 12
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims description 12
- 229960004756 ethanol Drugs 0.000 claims description 10
- 229960000935 dehydrated alcohol Drugs 0.000 claims description 8
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 8
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 claims description 6
- 239000005457 ice water Substances 0.000 claims description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 11
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 10
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 6
- 230000008685 targeting Effects 0.000 abstract description 5
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 abstract description 4
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 abstract description 4
- 239000012876 carrier material Substances 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 abstract description 2
- 238000006065 biodegradation reaction Methods 0.000 abstract 1
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 abstract 1
- PFKFTWBEEFSNDU-UHFFFAOYSA-N carbonyldiimidazole Chemical compound C1=CN=CN1C(=O)N1C=CN=C1 PFKFTWBEEFSNDU-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 abstract 1
- 238000002329 infrared spectrum Methods 0.000 description 6
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 5
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 239000003519 biomedical and dental material Substances 0.000 description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 description 3
- 239000002861 polymer material Substances 0.000 description 3
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 3
- 229920001897 terpolymer Polymers 0.000 description 3
- IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N Ethylene oxide Chemical compound C1CO1 IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 206010072170 Skin wound Diseases 0.000 description 2
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 2
- 230000008614 cellular interaction Effects 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 2
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 241000512259 Ascophyllum nodosum Species 0.000 description 1
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000195474 Sargassum Species 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- -1 carbon diimine amine Chemical class 0.000 description 1
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 1
- 229920006317 cationic polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 238000007334 copolymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 229920006237 degradable polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 229910000071 diazene Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000012637 gene transfection Methods 0.000 description 1
- 229920000578 graft copolymer Polymers 0.000 description 1
- 231100000652 hormesis Toxicity 0.000 description 1
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000005389 magnetism Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000012567 medical material Substances 0.000 description 1
- 229940127554 medical product Drugs 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 229920001601 polyetherimide Polymers 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000452 restraining effect Effects 0.000 description 1
- 210000004872 soft tissue Anatomy 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
Landscapes
- Medicinal Preparation (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
Abstract
本发明公开了一种琼脂糖-聚乙烯亚胺-透明质酸接枝物及其制备方法与应用。本发明利用可溶性碳二亚胺和羰基二咪唑将胺羧及胺羟基以酰胺键化学连接，将透明质酸，聚乙烯亚胺和琼脂糖接枝，保留了透明质酸的生物活性和靶向性、聚乙烯亚胺的捕获基因和细胞相互作用特性，并且具有了琼脂糖的成凝胶特性，改善了生物降解性能，得到的微颗粒具有靶向性，在体内循环稳定性好，适用于靶向药物控释载体材料和组织工程支架材料。由于三种聚合物之间以酰胺键连接，容易在细胞以及生理环境下分解，为药物载体在细胞内充分释放所载药物创造条件。
Description
技术领域
本发明高分子材料技术领域，特别涉及一种琼脂糖-聚乙烯亚胺-透明质酸接枝物及其制备方法与应用。
背景技术
生物材料在临床医学技术水平的提高中扮演了极其重要的角色，用其制成的各种组织工程支架、人工器官、药物释放系统、医用敷料等应用几乎涉及临床的各个领域。伴随着医疗技术水平的提高，结构与性能单一的生物医学材料已不能满足医学发展的需要，设计开发新型多功能生物医学材料是当前的迫切需要。其中降解性活性组织工程支架材料和靶向药物/基因控释载体材料，是未来生物医学材料研究的重要方向。
目前作为可降解支架和控制释放体系的药物载体大多是高分子聚合物材料。可降解聚合物在一定时间内能被水解或酶解成小分子，通过生理途径代谢排出体外，因此比非降解材料更安全、更可靠，有更好的生物相容性，成为支架以及药物载体的首选材料。可降解高分子聚合物主要有天然可生物降解高分子和人工合成可降解高分子，或通过特殊的键结构结合非降解性小分子，使降解产物容易清除掉，达到降解的目的。而且通过多组分组和，可得到新型多功能材料用于生物医学,它有着单一材料无法比拟的优势。
透明质酸和琼脂糖是被广泛用于药物控释载体和组织工程支架的两种天然大分子物质，聚乙烯亚胺（PEI）广泛应用于负载基因的合成高分子。透明质酸作为生物大分子具有靶向特定细胞核组织作用，以及对细胞的刺激作用，但它的某些性质，如极易溶于水，稳定性差，容易发生降解等，大大限制了透明质酸在生物医学上的应用。因此，需要对透明质酸进行化学改性以降低水溶性，减缓在人体中的吸收速度。PEI作为阳离子聚合物，能有效捕获基因和与细胞相互作用，但它不降解以及分子量大的PEI有细胞毒性，有必要采用分子链上连接多个小分子PEI的方法达到大分子PEI的功能。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种琼脂糖-聚乙烯亚胺-透明质酸接枝物的制备方法。
本发明的另一目的在于提供由上述制备方法得到的琼脂糖-聚乙烯亚胺-透明质酸接枝物。
本发明的再一目的在于提供所述的琼脂糖-聚乙烯亚胺-透明质酸接枝物的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种琼脂糖-聚乙烯亚胺-透明质酸接枝物的制备方法，包括如下步骤：
（1）将琼脂糖按质量比0.5：99.5～5：95溶于90～95℃热水中，降温至45～60℃，加入10～30wt%过氧化氢，使琼脂糖的体积浓度为0.3～3%，45～60℃恒温反应3～15h，得到混合液；
（2）将步骤（1）的混合液于50～70℃减压浓缩，得到浓缩液；往浓缩液中加入乙醇，离心，取沉淀；将沉淀按质量百分比5～10%溶于水中，得到溶液，用无水乙醇沉淀2～3次，离心，得到降解琼脂糖沉淀；将降解琼脂糖沉淀按质量百分比5～10%溶于水中，于-20～-65℃冷冻干燥10～17h，得降解琼脂糖（AG）粉末；
（3）将步骤（2）的降解琼脂糖（AG）粉末按2～10%质量百分比溶于二甲亚砜（DMSO），加入N,N′-羰基二咪唑（CDI），N,N′-羰基二咪唑在二甲亚砜中的浓度为1～3mM，室温反应1～5小时，得到反应液；用冷乙醇沉淀反应液，取沉淀，得到AG-CDI；将AG-CDI按质量百分比3～10%溶于二甲亚砜中，得到AG-CDI溶液，4℃储存备用；将聚乙烯亚胺（PEI）按质量百分比3～10%溶于二甲亚砜，加入AG-CDI溶液，降解琼脂糖/聚乙烯亚胺质量比为1：1～1：5，冰水浴中混合后于1.5小时内加入三乙胺，于40～70℃反应5h后室温透析5～10天，-20～-65℃冷冻干燥10～17小时，得到琼脂糖接枝聚乙烯亚胺（AG-PEI）；降解琼脂糖与N,N′-羰基二咪唑的质量比为2：1～1：5；降解琼脂糖与聚乙烯亚胺的质量比为1：1～1：15；三乙胺的质量为降解琼脂糖的质量的1～5%；
（4）将步骤（3）的琼脂糖接枝聚乙烯亚胺溶于水中，配制成3～10wt%溶液，调节酸度至pH4～6，加入透明质酸（HA）和碳二亚胺-N-羟基琥珀酰亚胺（EDC-NHS），于室温、氮气保护下反应3～5h后透析5～10天，-20～-65℃冷冻干燥10～17小时，得到琼脂糖-聚乙烯亚胺-透明质酸接枝物（AG-PEI-HA）；所述的降解琼脂糖与透明质酸的质量比为1：1～1：10，降解琼脂糖与碳二亚胺-N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为3：1～1：5；
步骤（1）中：
所述的琼脂糖的分子量为100～300kDa，优选为200kDa；
所述的琼脂糖优选按质量比3：97溶于90～95℃热水中；
所述的琼脂糖的体积浓度优选为2%；
步骤（2）中：
所述的浓缩液的体积为混合液体积的10～15%，优选为13.4%；
所述的乙醇的体积为浓缩液体积的2～5倍，优选为2倍；
所述的离心的条件为于室温、1500～4000转/分离心2～5分钟；
所述的无水乙醇的体积为溶液体积的2～3倍，优选为2倍；
步骤（3）中：
所述的冷乙醇的体积优选为反应液体积的1～3倍；
所述的聚乙烯亚胺（PEI）的分子量优选为1～10kDa；
所述的透析优选在双蒸水中、用截留2～5kDa分子量的透析袋进行透析；
所述的N,N′-羰基二咪唑在二甲亚砜中的浓度优选为3mM；
所述的降解琼脂糖/聚乙烯亚胺质量比优选为1：3.6；
所述的三乙胺的质量优选为降解琼脂糖的质量的4%；
所述的降解琼脂糖与N,N′-羰基二咪唑的质量比优选为1：1；
所述的降解琼脂糖与聚乙烯亚胺的质量比优选为5：18；
步骤（4）中：
所述的酸度的调节采用0.01～0.05wt%盐酸进行调节，优选采用0.05wt%盐酸进行调节；
所述的透明质酸的分子量为1～50kDa，优选为5kDa；
所述的降解琼脂糖与透明质酸的质量比优选为1：1，降解琼脂糖与碳二亚胺-N-羟基琥珀酰亚胺的质量比优选为1：1；
所述的透析优选在双蒸水中、用截留2～5kDa分子量的透析袋进行透析；
可以根据使用要求，选择不同分子量的材料进行接枝，得到颗粒、凝胶或多孔支架灯形状的接枝物；如可选用分子量为5kDa AG、1.2kDa PEI和5kDa HA制备转基因载体，可选用20kDa AG、1.2kDa PEI和20kDa HA制备支架；
一种琼脂糖-聚乙烯亚胺-透明质酸接枝物，由上述制备方法得到；
所述的琼脂糖-聚乙烯亚胺-透明质酸接枝物可应用于制备靶向药物控释载体或组织工程支架。
本发明的发明机理：本发明利用可溶性碳二亚胺和羰基二咪唑将胺羧及胺羟基以酰胺键化学连接，使三个功能高分子接枝共聚，并在共聚物中保持它们自身的功能，最终这种新型共聚高分子用于靶向载体和组织再生支架。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
（1）将透明质酸，PEI和琼脂糖接枝，获得一种新型的生物医学材料，保留了透明质酸的生物活性和靶向性，PEI的捕获基因和细胞相互作用特性，并且具有了琼脂糖的成凝胶特性，改善了生物降解性能，同时具有一定的稳定性，适用于靶向药物控释载体材料和组织工程支架材料。由于三种聚合物之间以酰胺键连接，容易在细胞以及生理环境下分解，这位药物载体在细胞内充分释放所载药物创造条件。同时由于显著提高海藻多糖-琼脂的附加价值，使大型海藻养殖的吸引力进一步提高，可望在近海生态修复中发挥积极作用。可望得到新型医学产品带来广泛的经济效益和社会效益，环境效益。
（2）本发明方法得到的微颗粒具有靶向性，在体内循环稳定性好，在胞内可快速降解，适于作为靶向药物控释、基因转染载体、支架或薄膜。
附图说明
图1是实施例2的纳米粒子的TEM图。
图2是实施例3的AG-PEI-HA三元共聚物多孔支架的SEM图。
图3是实施例1的产物的红外谱图；其中：a为琼脂糖的红外谱图；b为聚乙烯亚胺的红外谱图；c为琼脂糖接枝聚乙烯亚胺的的红外谱图；d为琼脂糖-聚乙烯亚胺-透明质酸接枝物的红外谱图；e为透明质酸的的红外谱图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
（1）将3g 200kDa琼脂糖溶于90℃ 97g热水中，降温至45℃，加入30wt%过氧化氢50ml，使琼脂糖的体积浓度为2%，45℃恒温反应4h，得到混合液；
（2）将步骤（1）的混合液70℃减压浓缩0.5h至20ml，得到浓缩液；往浓缩液中加入40ml乙醇，4000转/分、室温离心3分钟，取沉淀；将1g沉淀溶于20ml水中，重复用40ml无水乙醇沉淀，得到降解琼脂糖沉淀；将1g降解琼脂糖沉淀溶于20ml水中，于-65℃冷冻干燥17h，得降解琼脂糖（AG）粉末；降解琼脂糖粉末为20kDa；
（3）将0.5g步骤（2）的降解琼脂糖（AG）粉末溶于20ml二甲亚砜，加入0.5g N,N′-羰基二咪唑（CDI，CDI在DMSO中浓度为3mM），室温反应5h，60ml冷乙醇沉淀，得到AG-CDI，将AG-CDI溶于20ml DMSO中，4℃储存备用；将1.8g 1.2kDa聚乙烯亚胺（PEI）溶于20ml DMSO，与0.8g AG-CDI在冰水浴中混合，1.5小时内加入0.02g三乙胺，然后45℃反应5h，产物透析（截留分子量3kDa）10天，于-65℃冷冻干燥10h，得到琼脂糖接枝聚乙烯亚胺（AG-PEI）；
（4）将1g步骤（3）的AG-PEI溶于19ml水中，配制成5wt%溶液，用0.05%盐酸调节酸度至pH 6，加入0.5g 5kDa透明质酸（HA）及0.5g碳二亚胺-N-羟基琥珀酰亚胺（EDC-NHS），在室温、氮气保护下反应5h，双蒸水中用截留2kDa的透析袋透析10天，于-65℃冷冻干燥15h，得到琼脂糖-聚乙烯亚胺-透明质酸接枝物（AG-PEI-HA）。
实施例2：靶向控释药物/基因转染载体
（1）将3g 200kDa琼脂糖溶于92℃ 97g热水中，降温至55℃，加入20wt%过氧化氢50ml，使琼脂糖的体积浓度为2%，55℃恒温反应15h，得到混合液；
（2）将步骤（1）的混合液60℃减压浓缩0.5h至20ml，得到浓缩液；往浓缩液中加入40ml乙醇，3500转/分、室温离心4分钟，取沉淀；将1.5g沉淀溶于20ml水中，重复用40ml无水乙醇沉淀，得到降解琼脂糖沉淀；将1.5g降解琼脂糖沉淀溶于20ml水中，于-20℃冷冻干燥10h，得降解琼脂糖（AG）粉末；降解琼脂糖粉末为5kDa；
（3）将0.5g步骤（2）的降解琼脂糖（AG）粉末溶于20ml二甲亚砜，加入0.5g N,N′-羰基二咪唑（CDI，CDI在DMSO中浓度为3mM），室温反应3h，60ml冷乙醇沉淀，得到AG-CDI，将AG-CDI溶于20ml DMSO中，4℃储存备用；将1.8g1.2kDa聚乙烯亚胺（PEI）溶于20ml DMSO，与0.8g AG-CDI在冰水浴中混合，1.5小时内加入0.02g三乙胺，然后40℃反应5h，产物透析（截留分子量2kDa）5天，于-20℃冷冻干燥15h，得到琼脂糖接枝聚乙烯亚胺（AG-PEI）；
（4）将1g步骤（3）的AG-PEI溶于19ml水中，配制成5wt%溶液，用0.05%盐酸调节酸度至pH 5，加入0.5g 5kDa透明质酸（HA）及0.5g碳二亚胺-N-羟基琥珀酰亚胺（EDC-NHS），在室温、氮气保护下反应4h，双蒸水中用截留2kDa的透析袋透析8天，于-45℃冷冻干燥15h，得到琼脂糖-聚乙烯亚胺-透明质酸接枝物（AG-PEI-HA）；
上述制备AG-PEI-HA三元共聚物，将抗癌siRNA药物与载体在PBS溶液中复合形成纳米粒子（琼脂糖/siRNA=10:1-100:1），粒径200-300nm。体外对肿瘤细胞的抑制率超过90%；通过静脉周期性注射入裸鼠，一个月后皮下肿瘤组织增殖受到明显抑制作用。
实施例3：多孔复合支架制备及皮肤敷料
（1）将3g 200kDa琼脂糖溶于95℃ 97g热水中，降温至60℃，加入10wt%过氧化氢50ml，使琼脂糖的体积浓度为2%，60℃恒温反应3h，得到混合液；
（2）将步骤（1）的混合液50℃减压浓缩0.5h至20ml，得到浓缩液；往浓缩液中加入40ml乙醇，1500转/分、室温离心5分钟，取沉淀；将2g沉淀溶于20ml水中，重复用40ml无水乙醇沉淀，得到降解琼脂糖沉淀；将2g降解琼脂糖沉淀溶于20ml水中，于-45℃冷冻干燥17h，得降解琼脂糖（AG）粉末；降解琼脂糖粉末为30kDa；
（3）将0.5g步骤（2）的降解琼脂糖（AG）粉末溶于20ml二甲亚砜，加入0.5g N,N′-羰基二咪唑（CDI，CDI在DMSO中浓度为3mM），室温反应1h，60ml冷乙醇沉淀，得到AG-CDI，将AG-CDI溶于20ml DMSO中，4℃储存备用；将1.8g1.2kDa聚乙烯亚胺（PEI）溶于20ml DMSO，与0.8g AG-CDI在冰水浴中混合，1.5小时内加入0.02g三乙胺，然后70℃反应5h，产物透析（截留分子量3kDa）8天，于-45℃冷冻干燥17h，得到琼脂糖接枝聚乙烯亚胺（AG-PEI）；
（4）将1g步骤（3）的AG-PEI溶于19ml水中，配制成5wt%溶液，用0.05%盐酸调节酸度至pH 4，加入0.5g20kDa透明质酸（HA）及0.5g碳二亚胺-N-羟基琥珀酰亚胺（EDC-NHS），在室温、氮气保护下反应3h，双蒸水中用截留5kDa的透析袋透析5天，于-20℃冷冻干燥17h，得到琼脂糖-聚乙烯亚胺-透明质酸接枝物（AG-PEI-HA）；
选用上述制备的AG-PEI-HA三元共聚物制备多孔支架直径1.5厘米，厚3-4毫米，环氧乙烷消毒备用。以兔皮肤创面为模型，造1.5厘米直径缺损,缝合固定,植入两-三周后皮肤修复完成，支架降解。或制备复合膜材料直径1.5厘米，厚3毫米，环氧乙烷消毒备用。以兔皮肤创面为模型，造1.5厘米直径缺损,缝合固定，植入三周后皮肤修复完成，支架降解。
实施例4：脂肪组织工程支架
（1）将3g 200kDa琼脂糖溶于90℃ 97g热水中，降温至45℃，加入30wt%过氧化氢50ml，使琼脂糖的体积浓度为2%，45℃恒温反应3h，得到混合液；
（2）将步骤（1）的混合液70℃减压浓缩0.5h至20ml，得到浓缩液；往浓缩液中加入40ml乙醇，4000转/分、室温离心2分钟，取沉淀；将1g沉淀溶于20ml水中，重复用40ml无水乙醇沉淀，得到降解琼脂糖沉淀；将1g降解琼脂糖沉淀溶于20ml水中，于-65℃冷冻干燥15h，得降解琼脂糖（AG）粉末；降解琼脂糖粉末为30kDa；
（3）将0.5g步骤（2）的降解琼脂糖（AG）粉末溶于20ml二甲亚砜，加入0.5g N,N′-羰基二咪唑（CDI，CDI在DMSO中浓度为3mM），室温反应5h，60ml冷乙醇沉淀，得到AG-CDI，将AG-CDI溶于20ml DMSO中，4℃储存备用；将1.8g 1.2kDa聚乙烯亚胺（PEI）溶于20ml DMSO，与0.8g AG-CDI在冰水浴中混合，1.5小时内加入0.02g三乙胺，然后45℃反应5h，产物透析（截留分子量5kDa）10天，于-65℃冷冻干燥10h，得到琼脂糖接枝聚乙烯亚胺（AG-PEI）；
（4）将1g步骤（3）的AG-PEI溶于19ml水中，配制成5wt%溶液，用0.05%盐酸调节酸度至pH 6，加入0.5g 30kDa透明质酸（HA）及0.5g碳二亚胺-N-羟基琥珀酰亚胺（EDC-NHS），在室温、氮气保护下反应5h，双蒸水中用截留5kDa的透析袋透析10天，于-65℃冷冻干燥10h，得到琼脂糖-聚乙烯亚胺-透明质酸接枝物（AG-PEI-HA）；
选用上述聚合物材料制备水凝胶支架直径0.8厘米，厚3-4毫米。扩增成体脂肪干细胞800万，种于支架中、风干三小时细胞贴附后加常规培养液（补充10ng/ml bFGF），三周后成脂肪样软组织，支架降解。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种琼脂糖-聚乙烯亚胺-透明质酸接枝物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)将琼脂糖按质量比0.5：99.5～5：95溶于90～95℃热水中，降温至45～60℃，加入10～30wt％过氧化氢，使琼脂糖的体积浓度为0.3～3％，45～60℃恒温反应3～15h，得到混合液；
(2)将步骤(1)的混合液于50～70℃减压浓缩，得到浓缩液；往浓缩液中加入乙醇，离心，取沉淀；将沉淀按质量百分比5～10％溶于水中，得到溶液，用无水乙醇沉淀2～3次，离心，得到降解琼脂糖沉淀；将降解琼脂糖沉淀按质量百分比5～10％溶于水中，于-20～-65℃冷冻干燥10～17h，得降解琼脂糖粉末；
(3)将步骤(2)的降解琼脂糖粉末按2～10％质量百分比溶于二甲亚砜，加入N,N'-羰基二咪唑，N,N'-羰基二咪唑在二甲亚砜中的浓度为1～3mM，室温反应1～5小时，得到反应液；用冷乙醇沉淀反应液，取沉淀，得到AG-CDI；将AG-CDI按质量百分比3～10％溶于二甲亚砜中，得到AG-CDI溶液，4℃储存备用；将聚乙烯亚胺按质量百分比3～10％溶于二甲亚砜，加入AG-CDI溶液，降解琼脂糖/聚乙烯亚胺质量比为1：1～1：5，冰水浴中混合后于1.5小时内加入三乙胺，于40～70℃反应5h后室温透析5～10天，-20～-65℃冷冻干燥10～17小时，得到琼脂糖接枝聚乙烯亚胺；降解琼脂糖与N,N'-羰基二咪唑的质量比为2：1～1：5；三乙胺的质量为降解琼脂糖的质量的1～5％；
(4)将步骤(3)的琼脂糖接枝聚乙烯亚胺溶于水中，配制成3～10wt％溶液，调节酸度至pH4～6，加入透明质酸和碳二亚胺-N-羟基琥珀酰亚胺，于室温、氮气保护下反应3～5h后透析5～10天，-20～-65℃冷冻干燥10～17小时，得到琼脂糖-聚乙烯亚胺-透明质酸接枝物；降解琼脂糖与透明质酸的质量比为1：1～1：10；降解琼脂糖与碳二亚胺-N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为3：1～1：5。
2.根据权利要求1所述的琼脂糖-聚乙烯亚胺-透明质酸接枝物的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的琼脂糖的分子量为100～300kDa。
3.根据权利要求1所述的琼脂糖-聚乙烯亚胺-透明质酸接枝物的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述的浓缩液的体积为混合液体积的10～15％；所述的乙醇的体积为浓缩液体积的2～5倍。
4.根据权利要求1所述的琼脂糖-聚乙烯亚胺-透明质酸接枝物的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述的离心的条件为于室温、1500～4000转/分离心2～5分钟；所述的无水乙醇的体积为溶液体积的2～3倍。
5.根据权利要求1所述的琼脂糖-聚乙烯亚胺-透明质酸接枝物的制备方法，其特征在于：步骤(3)中所述的聚乙烯亚胺的分子量为1～10kDa。
6.根据权利要求1所述的琼脂糖-聚乙烯亚胺-透明质酸接枝物的制备方法，其特征在于：步骤(3)中所述的冷乙醇的体积为反应液体积的1～3倍；所述的透析在双蒸水中、用截留2～5kDa分子量的透析袋进行透析。
7.根据权利要求1所述的琼脂糖-聚乙烯亚胺-透明质酸接枝物的制备方法，其特征在于：步骤(4)中所述的透明质酸的分子量为1～50kDa。
8.根据权利要求1所述的琼脂糖-聚乙烯亚胺-透明质酸接枝物的制备方法，其特征在于：步骤(4)中所述的酸度的调节采用0.01～0.05wt％盐酸进行调节；所述的透析在双蒸水中、用截留2～5kDa分子量的透析袋进行透析。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310030896.3A CN103113594B (zh) | 2013-01-25 | 2013-01-25 | 琼脂糖-聚乙烯亚胺-透明质酸接枝物及其制备方法与应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310030896.3A CN103113594B (zh) | 2013-01-25 | 2013-01-25 | 琼脂糖-聚乙烯亚胺-透明质酸接枝物及其制备方法与应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103113594A CN103113594A (zh) | 2013-05-22 |
| CN103113594B true CN103113594B (zh) | 2014-12-31 |
Family
ID=48412018
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201310030896.3A Active CN103113594B (zh) | 2013-01-25 | 2013-01-25 | 琼脂糖-聚乙烯亚胺-透明质酸接枝物及其制备方法与应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103113594B (zh) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107406523B (zh) | 2015-03-20 | 2020-09-22 | 杨达志 | 多糖-聚氨共聚物及其在降低血浆中尿酸浓度的应用 |
| CN109364256B (zh) * | 2018-11-13 | 2021-07-27 | 广西科学院 | 一种琼脂糖胶束药物载体 |
| CN109880108B (zh) * | 2019-03-06 | 2020-12-22 | 武汉轻工大学 | 一种聚乙烯亚胺接枝米糠多糖铁的制备方法及基因载体 |
| CN110218342A (zh) * | 2019-05-13 | 2019-09-10 | 暨南大学 | 琼脂糖-明胶接枝物温敏水凝胶及其制备方法与应用 |
| CN112169013B (zh) * | 2019-07-05 | 2022-07-29 | 香港城市大学 | 一种粒子堆垛型生物胶黏剂及其制备与应用 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20060149392A1 (en) * | 2004-12-07 | 2006-07-06 | Kuo-Huang Hsieh | Biomaterials for guided tissue regeneration and drug delivery |
| CN101134784B (zh) * | 2007-08-16 | 2010-06-16 | 暨南大学 | 琼脂糖与透明质酸接枝物及其制备方法与应用 |
| CN102408498A (zh) * | 2011-09-16 | 2012-04-11 | 大连大学 | 一种透明质酸键合聚乙烯亚胺共聚物、其制备方法及应用 |
-
2013
- 2013-01-25 CN CN201310030896.3A patent/CN103113594B/zh active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103113594A (zh) | 2013-05-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Zhang et al. | Preparation of alginate-based biomaterials and their applications in biomedicine | |
| Xu et al. | Poly (N-isopropylacrylamide)-based thermoresponsive composite hydrogels for biomedical applications | |
| CN103113594B (zh) | 琼脂糖-聚乙烯亚胺-透明质酸接枝物及其制备方法与应用 | |
| Wang et al. | Functional hydrogels and their application in drug delivery, biosensors, and tissue engineering | |
| Kalirajan et al. | A critical review on polymeric biomaterials for biomedical applications | |
| Savina et al. | Design and assessment of biodegradable macroporous cryogels as advanced tissue engineering and drug carrying materials | |
| Raftery et al. | Chitosan for gene delivery and orthopedic tissue engineering applications | |
| Wang et al. | Chitosan-based injectable hydrogels for biomedical applications | |
| Goodarzi et al. | Injectable drug loaded gelatin based scaffolds as minimally invasive approach for drug delivery system: CNC/PAMAM nanoparticles | |
| Lynch et al. | Advanced strategies for tissue engineering in regenerative medicine: A biofabrication and biopolymer perspective | |
| Nguyen et al. | Tetronic-grafted chitosan hydrogel as an injectable and biocompatible scaffold for biomedical applications | |
| Bao et al. | The influence of solvent formulations on thermosensitive hydroxybutyl chitosan hydrogel as a potential delivery matrix for cell therapy | |
| CN101134784B (zh) | 琼脂糖与透明质酸接枝物及其制备方法与应用 | |
| Chen et al. | Bone regeneration using MMP-cleavable peptides-based hydrogels | |
| CN113633821A (zh) | 一种温敏型可注射型胶原/壳聚糖/掺锌生物玻璃纳米颗粒水凝胶材料及其制备方法 | |
| CN109627463B (zh) | 水凝胶与蛋白质药物 | |
| Tian et al. | Preparation and characterization of galactosylated alginate–chitosan oligomer microcapsule for hepatocytes microencapsulation | |
| CN105524272A (zh) | 硫辛酸修饰的聚乙二醇-聚氨基酸嵌段共聚物的制备和应用 | |
| KR20110076838A (ko) | 수화겔, 이의 제조 방법 및 용도 | |
| Wartenberg et al. | Glycosaminoglycan-based cryogels as scaffolds for cell cultivation and tissue regeneration | |
| Zhao et al. | Natural polymer-based hydrogels: From polymer to biomedical applications | |
| CN102309760A (zh) | 一种阳离子型两亲性壳聚糖纳米药物载体及其制备和应用 | |
| Chen et al. | Structure and properties of gelatin methacryloyl (GelMA) synthesized in different reaction systems | |
| Patil et al. | Alginate/poly (amidoamine) injectable hybrid hydrogel for cell delivery | |
| MohanKumar et al. | Hydrogels: potential aid in tissue engineering—a review |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20160913 Address after: 510530 Guangdong city of Guangzhou province Luogang District jade Yan Road No. 12 Patentee after: GUANGZHOU YUEQING REGENERATION MEDICINE TECHNOLOGY Co.,Ltd. Address before: 510632 Whampoa West Road, Guangdong, Guangzhou, No. 601, No. Patentee before: Jinan University |
|
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: Agarose polyethyleneimine hyaluronic acid graft copolymer and its preparation method and application Effective date of registration: 20231212 Granted publication date: 20141231 Pledgee: CITIC Bank Co.,Ltd. Guangzhou Branch Pledgor: GUANGZHOU YUEQING REGENERATION MEDICINE TECHNOLOGY Co.,Ltd. Registration number: Y2023980070512 |