CN103113376A - 一种生物碱及制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种式（Ⅰ）所示生物碱及制备方法和在制备肿瘤细胞多药耐药性逆转剂中的应用，本发明提供一种生物碱，可作为具有逆转肿瘤细胞多药耐药性的新药物或先导化合物，对白血病阿霉素耐药细胞（K562/ADR）、人肺腺癌/顺铂耐药细胞（A549/DDP）和人卵巢癌/顺铂耐药细胞（SK-OV-S/DDP）有很强的逆转作用；本发明的生物碱可以利用微生物进行液体发酵生产，操作工艺简便，周期短，成本低，来源有保证；本发明利用生物法合成，对环境无污染；

Description

一种生物碱及制备方法和应用

（一）技术领域

本发明涉及一种生物碱及制备和应用，具体涉及一种从药用植物黄花蒿（Artemisia annuaLinn.）茎部提取的内生真菌烟曲霉SPS-02（Aspergillusfumigatus）液体发酵物中分离的一种新生物碱及其制备方法与逆转肿瘤细胞多药耐药性的应用，该化合物可以与抗肿瘤药物作用提高逆转效果，从而为临床上治疗多药耐药性肿瘤提供新的方法和手段。

（二）背景技术

微生物与人类息息相关，其活性次生代谢产物如抗生素已被广泛研究和应用。植物内生菌是一种分布广、种类多、具有重要生理和生态作用的特境微生物，其活性次生代谢产物已成为天然产物化学领域和应用微生物领域的研究热点。

恶性肿瘤是威胁人类健康、导致死亡的重要原因之一，化学治疗是其治疗的主要手段，然而肿瘤细胞对化疗药物产生的多药耐药性（multidrugresistance,MDR）是影响化疗效果的重要原因之一。MDR是指肿瘤细胞接触一种抗肿瘤药物后产生耐药性，同时对结构和作用机理不同的多种抗肿瘤药物表现出交叉抵抗现象。MDR是肿瘤细胞耐药的常见方式，也是肿瘤难治疗、易复发的主要原因。理想的MDR逆转剂应具有一定的抗肿瘤活性，且对正常组织细胞毒性小，在体内及肿瘤细胞内能达到有效浓度。然而，一些经典的MDR逆转剂具有严重的毒副作用，如维拉帕米产生心血管疾病、valsodar与细胞色素P₄₅₀同工酶3A4产生竞争性抑制等，所以这些药物无法应用于临床。因此，寻找安全、高效、低毒的肿瘤细胞MDR逆转剂成为当今药物研发的热点之一。植物内生菌具有丰富的生物多样性和化学多样性，能够产生化学结构独特、活性显著的物质。到目前为止，尚未见从黄花蒿内生菌烟曲霉（Aspergillusfumigatus）分离到新逆转肿瘤细胞多药耐药性生物碱的报道。

（三）发明内容

本发明目的是提供一种具有逆转肿瘤细胞多药耐药性的新生物碱，以及该生物碱的提取分离方法，在制备肿瘤细胞多药耐药性逆转剂中的应用。

本发明采用的技术方案是：

本发明涉及一种式（Ⅰ）所示生物碱，命名为16-β-hydroxy-5-N-acetylardeemin（16-β-羟基-5-N-乙酰基-阿迪米）：

本发明还涉及一种用于所述生物碱提取的烟曲霉SPS-02，所述烟曲霉（Aspergillusfumigatus）SPS-02保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏日期为2013年1月13日，保藏编号为CCTCC NO:M2013014。

所述烟曲霉SPS-02（属于内生真菌）分离方法为：取来源于浙江天目山的新鲜健康黄花蒿茎（Artemisia annua Linn.，菊科、蒿属、黄花蒿种），装入保鲜袋中密封标记，24h内进行烟曲霉的分离。黄花蒿茎用清水洗净，切成1cm左右的小段后依次浸泡于体积浓度75%乙醇水溶液1min、质量浓度1%次氯酸钠水溶液10min、体积浓度75%乙醇水溶液1min进行预处理。取预处理后的黄花蒿茎用双抗WA培养基平板培养至菌落从切口处长出，挑取菌落转接至PCA培养基进行内生真菌的分离，经菌落形态学观察、孢子形态和18S rDNA分子鉴定为烟曲霉（Aspergillusfumigatus），命名为烟曲霉（Aspergillusfumigatus）SPS-02。双抗WA培养基终浓度组成：200IU/mL青霉素、150IU/mL链霉素、20g琼脂、1L蒸馏水，自然pH值。PCA培养基终浓度组成：20g马玲薯、20g胡萝卜、20g琼脂、1L蒸馏水，自然pH值。

烟曲霉SPS-02菌落形态和孢子形态为：菌落在PDA培养基表面蔓延迅速，深绿色，粉末状。分生孢子头的顶囊烧瓶状、小梗单层，布满顶囊。

该菌18S rRNA序列为SEQ ID NO.1所示。

本发明提供一种所述生物碱的制备方法，所述方法为：将烟曲霉SPS-02发酵培养获得的培养液过滤或离心，取滤液或上清液用乙酸乙酯在室温下进行萃取，取有机层低温真空浓缩，获得浸膏F，将浸膏F进行分离纯化，获得所述生物碱所述浸膏F分离纯化方法为（1）将浸膏F进行硅胶柱层析，用10~15倍柱体积的氯仿进行洗脱，收集所有洗脱液，低温真空浓缩，获得浸膏F1；（2）将浸膏F1进行硅胶柱层析，用3~5倍柱体积的氯仿进行洗脱，合并所有洗脱液，低温真空浓缩，获得浸膏F2；（3）利用葡聚糖凝胶Sephadex LH-20对浸膏F2进行柱层析，洗脱剂为体积比1:1的氯仿和甲醇混合液，TLC跟踪检测含有蓝色荧光点的部分，收集该部分洗脱液，合并洗脱液后低温真空除去洗脱剂，得到浸膏F3；（4）浸膏F3采用反相高效液相色谱分离，流动相为体积比1:1.5的双蒸水和甲醇混合液，收集最后一个峰（保留时间约11min）的洗脱液，低温真空除去流动相得到式（Ⅰ）所示的生物碱。

进一步，所述培养液的制备方法为：（1）斜面培养：将烟曲霉SPS-02接种至斜面培养基，28~30℃培养7~10天，获得菌体斜面；所述斜面培养基终浓度组成为：马铃薯20g/L、琼脂20g/L，溶剂为水，自然pH值；（2）种子培养：从菌体斜面挑取一接种环菌体接种至PD培养基，在100~150rpm、28~30℃条件下摇床培养3天，获得种子液；所述PD培养基终浓度组成为：土豆200g/L，葡萄糖20g/L，溶剂为水，自然pH值；（3）发酵培养：将步骤（2）获得的种子液以体积比1:10的接种量接种至发酵培养基，在100~150rpm、28~30℃（优选140rpm、28℃）条件下摇床培养15天，获得发酵培养液；所述发酵培养基终浓度组成为：蔗糖30g/L，NaNO₃3g/L，K₂HPO₄1g/L，酵母膏1g/L，KCl0.5g/L，MgSO₄·7H₂O0.5g/L，FeSO₄·7H₂O0.01g/L，溶剂为水，自然pH值。

本发明还涉及一种所述生物碱在制备肿瘤细胞多药耐药性逆转剂中的应用，优选所述生物碱在制备白血病阿霉素耐药细胞、人肺腺癌顺铂耐药细胞或人卵巢癌顺铂耐药细胞耐药性逆转剂中的应用。

更进一步，所述生物碱在肿瘤细胞多药耐药性逆转剂中的浓度为5~10μM，优选5μM。

本发明得到的新生物碱对白血病阿霉素耐药细胞（K562/DOX）、人肺腺癌/顺铂耐药细胞（A549/DDP）和人卵巢癌/顺铂耐药细胞（SK-OV-S/DDP）有很强的逆转作用，所以该生物碱可作为具有逆转肿瘤细胞多药耐药性作用的化合物，有望在制备抗癌药物中得到应用。

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：

（1）本发明提供一种新化合物--生物碱，可作为具有逆转肿瘤细胞多药耐药性的新药物或先导化合物，对白血病阿霉素耐药细胞（K562/DOX）、人肺腺癌/顺铂耐药细胞（A549/DDP）和人卵巢癌/顺铂耐药细胞（SK-OV-S/DDP）有很强的逆转作用；

（2）本发明的生物碱可以利用微生物进行液体发酵生产，操作工艺简便，周期短，成本低，来源有保证；

（3）本发明利用生物法合成，对环境无污染。

（四）具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：烟曲霉SPS-02（Aspergillusfumigatus）的分离与纯化

双抗WA培养基终浓度组成：200IU/mL青霉素、150IU/mL链霉素、20g琼脂、1L蒸馏水，自然pH值。

PCA培养基终浓度组成：20g马玲薯、20g胡萝卜、20g琼脂、1L蒸馏水，自然pH值。

取新鲜健康的黄花蒿茎（ArtemisiaannuaLinn.，菊科、蒿属、黄花蒿种），装入保鲜袋中密封标记，24h内进行烟曲霉分离。黄花蒿茎用清水洗净，切成1cm左右的小段后依次浸泡于体积浓度75%乙醇水溶液1min、质量浓度1%次氯酸钠水溶液10min、体积浓度75%乙醇水溶液1min进行预处理。取预处理后的黄花蒿茎用双抗WA培养基平板在28~30℃下培养7~10天后，菌落从切口处长出，挑取菌落转接至PCA培养基进行分离，经菌落形态学观察、孢子形态和18S rDNA分子鉴定为烟曲霉（Aspergillusfumigatus），命名为烟曲霉SPS-02（Aspergillusfumigatus）该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国武汉武汉大学，保藏日期2013年1月13日，保藏编号为CCTCC NO:M2013014。

菌落在PDA培养基表面蔓延迅速，深绿色，粉末状。分生孢子头的顶囊烧瓶状、小梗单层，布满顶囊。

该菌18S rRNA序列为SEQ ID NO.1所示:

  1GCTCTTGGTG ATCATAATAA CTTAACGAAT CGCATGGCCT TGCGCCGGCG ATGGTTCATT

 61CAAATTTCTG CCCTATCAAC TTTCGATGGT AGGATAGTGG CCTACCATGG TGGCAACGGG

121TAACGGGGAA TTAGGGTTCG ATTCCGGAGA GGGAGCCTGA GAAACGGCTA CCACATCCAA

181GGAAGGCAGC AGGCGCGCAA ATTACCCAAT CCCGACACGG GGAGGTAGTG ACAATAAATA

241CTGATACGGG GCTCTTTTGG GTCTCGTAAT TGGAATGAGT ACAATCTAAA TCCCTTAACG

301AGGAACAATT GGAGGGCAAG TCTGGTGCCA GCAGCCGCGG TAATTCCAGC TCCAATAGCG

361TATATTAAAG TTGTTGCAGT TAAAAAGCTC GTAGTTGAAC CTTGGGTCTG GCTGGCCGGT

 421CCGCCTCACC GCGAGTACTG GTCCGGCTGG ACCTTTCCTT CTGGGGAACC TCATGGCCTT

 481CACTGGCTGT GGGGGGAACC AGGACTTTTA CTGTGAAAAA ATTAGAGTGT TCAAAGCAGG

 541CCTTTGCTCG AATACATTAG CATGGAATAA TAGAATAGGA CGTGCGGTTC TATTTTGTTG

 601GTTTCTAGGA CCGCCGTAAT GATTAATAGG GATAGTCGGG GGCGTCAGTA TTCAGCTGTC

 661AGAGGTGAAA TTCTTGGATT TGCTGAAGAC TAACTACTGC GAAAGCATTC GCCAAGGATG

 721TTTTCATTAA TCAGGGAACG AAAGTTAGGG GATCGAAGAC GATCAGATAC CGTCGTAGTC

 781TTAACCATAA ACTATGCCGA CTAGGGATCG GGCGGTGTTT CTATGATGAC CCGCTCGGCA

 841CCTTACGAGA AATCAAAGTT TTTGGGTTCT GGGGGGAGTA TGGTCGCAAG GCTGAAACTT

 901AAAGAAATTG ACGGAAGGGC ACCACAAGGC GTGGAGCCTG CGGCTTAATT TGACTCAACA

 961CGGGGAAACT CACCAGGTCC AGACAAAATA AGGATTGACA GATTGAGAGC TCTTTCTTGA

1021TCTTTTGGAT GGTGGTGCAT GGCCGTTCTT AGTTGGTGGA GTGATTTGTC TGCTTAATTG

1081CGATAACGAA CGAGACCTCG GCCCTTAAAT AGCCCGGTCC GCATTTGCGG GCCGCTGGCT

1141TCTTAGGGGG ACTATCGGCT CAAGCCGATG GAAGTGCGCG GCAATAACAG GTCTGTGATG

1201CCCTTAGATG TTCTGGGCCG CACGCGCGCT ACACTGACAG GGCCAGCGAG TACATCACCT

1261TGGCCGAGAG GTCTGGGTAA TCTTGTTAAA CCCTGTCGTG CTGGGGATAG AGCATTGCAA

1321TTATTGCTCT TCAACGAGGA ATGCCTAGTA GGCACGAGTC ATCAGCTCGT GCCGATTACG

1381TCCCTGCCCT TTGTACACAC CGCCCGTCGC TACTACCGAT TGAATGGCTC GGTGAGGCCT

1441TCGGACTGGC TCAGGGGAGT TGGCAACGA

实施例2：内烟曲霉SPS-02发酵培养液的制备

（1）斜面培养：将烟曲霉SPS-02接种至斜面培养基，28~30℃培养7~10天，获得菌体斜面；所述斜面培养基终浓度组成为：20g马玲薯、20g琼脂、1L蒸馏水，自然pH值；

（2）种子培养：从菌体斜面挑取一接种环菌体接种至PD培养基，在140rpm、28℃条件下摇床培养3天，获得种子液；所述PD培养基终浓度组成为：土豆200g/L，葡萄糖20g/L，溶剂为水，自然pH值；

（3）发酵培养：将步骤（2）获得的种子液以体积比1:10的接种量接种至发酵培养基，在140rpm、28℃条件下摇床培养15天，获得发酵培养液；所述发酵培养基终浓度组成为：蔗糖30g/L，NaNO₃3g/L，K₂HPO₄1g/L，酵母膏1g/L，KCl0.5g/L，MgSO₄·7H₂O0.5g/L，FeSO₄·7H₂O0.01g/L，溶剂为水，自然pH值。

实施例3：生物碱的提取与分离、鉴定

1、生物碱的提取与分离

（1）将实施例2中所得发酵培养液用纱布过滤，滤液用乙酸乙酯（体积比1:1）萃取3次，合并有机层，低温真空浓缩干燥得棕色粗浸膏F20g；

（2）将浸膏F进行硅胶柱层析，用10倍色谱柱保留体积的氯仿进行洗脱，收集洗脱液，低温真空浓缩至无液体流出，获得浸膏F1；

（3）将浸膏F1进行硅胶柱层析，用氯仿溶液洗脱3个保留体积，合并洗脱液，低温真空浓缩至无液体流出，获得浸膏F2；

（4）利用葡聚糖凝胶Sephadex LH-20对浸膏F2进行柱层析，洗脱剂为体积比1:1的氯仿和甲醇混合液，洗脱体积为100mL，TLC跟踪检测含有蓝色荧光点的部分，收集该部分洗脱液，合并洗脱液后低温真空除去洗脱剂，得到浸膏F3；

（5）浸膏F3采用反相高效液相色谱分离，收集最后一个峰（保留时间11min）的洗脱液，低温真空除去流动相得到目标产物（30mg），流动相组成为双蒸水（A）、甲醇（B），体积比A:B=4:6，反相高效液相色谱条件为：流速1.0mL/min，DAD检测波长280nm，C18柱（4.6×250mm，5μm）。

2、生物碱的结构鉴定

将步骤1获得的目标产物进行质谱、核磁共振谱、红外、紫外和旋光测定。

光谱学数据如下：

mp129-131℃；[α]216.58○(c0.205,MeOH)；IR(KBr)v:3435,3024,2968,2928,1684,1471,1456,1419,1385,1220,1162,1127,1096cm^-1;UV(MeOH)λ_max(logε):208(4.72)nm;HR-ESI-MS m/z507.1965[M+Na]⁺(calc.for C₂₈H₂₈H₄O₄Na,507.2003),¹H and¹³C NMR数据见表1。

表1.生物碱的¹H谱和¹³C谱数据（500MHz,CDCl₃）

s-单峰，d-双重峰，t-三重峰，q-四重峰

综上，所述目标产物的结构式为式（Ⅰ）所示：

式（Ⅰ）中1,2,3,4,4a,5a,7,8,10,10a,11,12,13,14,14a,15a,15b,16,16a,16b,17,18,19,20,21,22,23,24为碳原子序号，该化合物命名为16-β-hydroxy-5-N-acetylardeemin（16-β-羟基-5-N-乙酰基-阿迪米）。

实施例4：生物碱逆转肿瘤细胞多药耐药性

逆转肿瘤细胞多药耐药性实验是采用water-solute tetrazolium（WST）方法（Journal ofImmunological Methods,2000,238:59-68），每次测定重复三次，测试耐药肿瘤包括白血病阿霉素耐药细胞（K562/DOX）、人肺腺癌/顺铂耐药细胞（A549/DDP）和人卵巢癌/顺铂耐药细胞（SK-OV-S/DDP）（均购于上海拜力生物科技有限公司）。

具体方法如下：三类耐药细胞系A549/DDP、SK-OV-S/DDP和K562/DOX以1×10³个/mL的细胞浓度，每孔100μL接种于96孔培养板中，待细胞贴壁后，每孔加药，实验分组如下：（1）实验组：往每孔内加入10μL相应细胞的所耐药物（DDP或DOX），终浓度分别为0.125μM、0.25μM、0.5μM、1μM4个组（即每类细胞系都分为4个组），且每个组加入20μL5μM的生物碱（实施例3方法制备的生物碱用DMSO配制）。（2）对照组：每孔内加入30μL的相应细胞所耐药物（DDP或DOX），浓度分别为0.125μmol·L^-1、0.25μmol·L^-1、0.5μmol·L^-1、1μmol·L^-1。（3）空白对照组：只加细胞，即只加入三类耐药细胞系A549、SK-OV-S和K562，细胞浓度同实验组，生物碱及相应的所耐药物（DDP或DOX）用等量DMSO替代。所有实验设置3个平行孔，37°C，4%CO₂条件下孵育48小时后，分别加入10μL的水溶性四唑盐（WST）后，同样培养板于37°C，4%CO₂条件下孵育1小时。测定各孔于波长495nm处的吸光度（OD）值。计算在5μmol·L^-1的生物碱的作用下，两类药物的的IC₅₀值，从而计算出逆转倍数。计算逆转倍数的公式为：

$\mathrm{RF}=\frac{{\mathrm{IC}}_{50}A}{{\mathrm{IC}}_{50}B}$ 公式（1）

公式（1）中IC₅₀A为对照组的IC₅₀值，IC₅₀B为实验组的IC₅₀值。结果如表2所示，该生物碱对体外培养的三类耐药细胞有一定程度的逆转效果，对肿瘤细胞A549/DDP、K562/DOX和SK-OV-S/DDP的逆转倍数分别为8.2倍、5.2倍、1.4倍。

表2.生物碱逆转肿瘤多药耐药性细胞作用

SEQUENCE LISTING

 

<110>  浙江工业大学

 

<120>  一种生物碱及制备方法和应用

 

<130> 

 

<160>  1    

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  1469

<212>  DNA

<213>  Aspergillus fumigatus

 

<400>  1

gctcttggtg atcataataa cttaacgaat cgcatggcct tgcgccggcg atggttcatt       60

 

caaatttctg ccctatcaac tttcgatggt aggatagtgg cctaccatgg tggcaacggg      120

 

taacggggaa ttagggttcg attccggaga gggagcctga gaaacggcta ccacatccaa      180

 

ggaaggcagc aggcgcgcaa attacccaat cccgacacgg ggaggtagtg acaataaata      240

 

ctgatacggg gctcttttgg gtctcgtaat tggaatgagt acaatctaaa tcccttaacg      300

 

aggaacaatt ggagggcaag tctggtgcca gcagccgcgg taattccagc tccaatagcg      360

 

tatattaaag ttgttgcagt taaaaagctc gtagttgaac cttgggtctg gctggccggt      420

 

ccgcctcacc gcgagtactg gtccggctgg acctttcctt ctggggaacc tcatggcctt      480

 

cactggctgt ggggggaacc aggactttta ctgtgaaaaa attagagtgt tcaaagcagg      540

 

cctttgctcg aatacattag catggaataa tagaatagga cgtgcggttc tattttgttg      600

 

gtttctagga ccgccgtaat gattaatagg gatagtcggg ggcgtcagta ttcagctgtc      660

 

agaggtgaaa ttcttggatt tgctgaagac taactactgc gaaagcattc gccaaggatg      720

 

ttttcattaa tcagggaacg aaagttaggg gatcgaagac gatcagatac cgtcgtagtc      780

 

ttaaccataa actatgccga ctagggatcg ggcggtgttt ctatgatgac ccgctcggca      840

 

ccttacgaga aatcaaagtt tttgggttct ggggggagta tggtcgcaag gctgaaactt      900

 

aaagaaattg acggaagggc accacaaggc gtggagcctg cggcttaatt tgactcaaca      960

 

cggggaaact caccaggtcc agacaaaata aggattgaca gattgagagc tctttcttga     1020

 

tcttttggat ggtggtgcat ggccgttctt agttggtgga gtgatttgtc tgcttaattg     1080

 

cgataacgaa cgagacctcg gcccttaaat agcccggtcc gcatttgcgg gccgctggct     1140

 

tcttaggggg actatcggct caagccgatg gaagtgcgcg gcaataacag gtctgtgatg     1200

 

cccttagatg ttctgggccg cacgcgcgct acactgacag ggccagcgag tacatcacct     1260

 

tggccgagag gtctgggtaa tcttgttaaa ccctgtcgtg ctggggatag agcattgcaa     1320

 

ttattgctct tcaacgagga atgcctagta ggcacgagtc atcagctcgt gccgattacg     1380

 

tccctgccct ttgtacacac cgcccgtcgc tactaccgat tgaatggctc ggtgaggcct     1440

 

tcggactggc tcaggggagt tggcaacga                                       1469

 

Claims (8)

1.一种式（Ⅰ）所示生物碱，

2.一种用于权利要求1所述生物碱提取的烟曲霉SPS-02，其特征在于所述烟曲霉（Aspergillusfumigatus）SPS-02保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏日期为2013年1月13日，保藏编号为CCTCCNO:M2013014。

3.一种如权利要求1所述生物碱的制备方法，其特征在于所述方法为：将保藏编号为CCTCC NO:M2013014即烟曲霉SPS-02发酵培养获得的培养液过滤或离心，取滤液或上清液用乙酸乙酯在室温下进行萃取，取有机层低温真空浓缩，获得浸膏F，将浸膏F进行分离纯化，获得所述生物碱；所述浸膏F分离纯化方法为：（1）将浸膏F进行硅胶柱层析，用10~15倍柱体积的氯仿进行洗脱，收集洗脱液，低温真空浓缩，获得浸膏F1；（2）将浸膏F1进行硅胶柱层析，用3~5倍柱体积的氯仿进行洗脱，合并所有洗脱液，低温真空浓缩，获得浸膏F2；（3）利用葡聚糖凝胶Sephadex LH-20对浸膏F2进行柱层析，洗脱剂为体积比1:1的氯仿和甲醇混合液，TLC跟踪检测含有蓝色荧光点的部分，收集该部分洗脱液，合并洗脱液后低温真空除去洗脱剂，得到浸膏F3；（4）浸膏F3采用反相高效液相色谱分离，流动相为体积比1:1.5的双蒸水和甲醇混合液，收集保留时间11min时的洗脱液，低温真空除去流动相得到式（Ⅰ）所示的生物碱。

4.如权利要求3所述生物碱的制备方法，其特征在于所述培养液的制备方法为：（1）斜面培养：将烟曲霉SPS-02接种至斜面培养基，28~30℃培养7~10天，获得菌体斜面；所述斜面培养基终浓度组成为：马铃薯20g/L、琼脂20g/L，溶剂为水，自然pH值；（2）种子培养：从菌体斜面挑取一接种环菌体接种至PD培养基，在100~150rpm、28~30℃条件下摇床培养3天，获得种子液；所述PD培养基终浓度组成为：土豆200g/L、葡萄糖20g/L，溶剂为水，自然pH值；（3）发酵培养：将步骤（2）获得的种子液以体积比1:10的接种量接种至发酵培养基，在140rpm、28℃条件下摇床培养15天，获得发酵培养液；所述发酵培养基终浓度组成为：蔗糖30g/L，NaNO₃3g/L，K₂HPO₄1g/L，酵母膏1g/L，KCl0.5g/L，MgSO₄·7H₂O0.5g/L，FeSO₄·7H₂O0.01g/L，溶剂为水，自然pH值。

5.一种权利要求1所述生物碱在制备肿瘤细胞多药耐药性逆转剂中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述的应用为：所述生物碱在制备白血病阿霉素耐药细胞、人肺腺癌顺铂耐药细胞或人卵巢癌顺铂耐药细胞耐药性逆转剂中的应用。

7.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述生物碱在肿瘤细胞多药耐药性逆转剂中的浓度为5~10μM。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述生物碱在肿瘤细胞多药耐药性逆转剂中的浓度为5μM。