CN103110938A - 用于消化道瘘封堵的自体生物蛋白胶试剂及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了用于消化道瘘封堵的自体生物蛋白胶试剂及其制备方法和应用。自体生物蛋白胶试剂，包含如下组分：FG组分I——纤维蛋白原，1mg/ml的氨甲环酸溶液，FG组分II——凝血酶；所述的纤维蛋白原和凝血酶均由高浓度血小板血浆制备。所述的用于消化道瘘封堵的自体生物蛋白胶试剂在制备治疗全消化道瘘的药物或医疗器械中的应用。本发明的突出之处在于制备方法简便可行，制作成本低，符合大众需要；生物胶取自病人自身，避免了异源或异体血制品的输血风险，生物相容性更佳，临床试验至今，无不良反应的报道。

Description

用于消化道瘘封堵的自体生物蛋白胶试剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于含肽的医疗用品领域，涉及用于消化道瘘封堵的自体生物蛋白胶试剂及其制备方法和应用。

背景技术

尽管现代医学在外科技术和术前准备方面已经取得了巨大的进步，胃肠道吻合口瘘依然时有发生。吻合口瘘不仅会提高死亡率，对长期生存也有不良影响。因此，瘘的治疗依然是当今医学的难题，传统的手术治疗手段不仅对病人及其家庭带来沉重的经济负担，而且手术风险大。作为全国肠瘘治疗中心，寻求最佳的肠瘘治疗方案，促进肠瘘快速愈合一直是我们研究的方向。肠外瘘病人，经过控制感染、营养支持后，如无梗阻、特异性病变等影响愈合的因素，还有一定的自愈率(40％～60％)。但是，在初步引流至确定性手术需要有一个漫长的等待期，一般为3个月，等待期间病人可以发生内稳态失衡、出血、感染、多脏器功能障碍和营养不良等并发症。因此，如何促进消化道瘘快速愈合，缩短病程是肠瘘研究的趋势。

纤维蛋白胶(FG)可模拟人体凝血级联反应的最后一步形成凝血块，具有良好的生物降解性、生物相容性，已广泛应用于止血、瘘口封堵、加速组织愈合等外科领域。目前商业化的FG产品众多，利用单人份血制备的有CryoSeal和Vivostat，异体同源血制备的有如Tissucol/Tisseel等，国产胶如倍绣等。但是商用的FG多由多人份血浆混合制得，存在导致排斥反应及传播病毒的风险[1]；而另一组分牛或猪来源的凝血酶可能诱导人体产生抗体，从而导致过敏反应[2]。此外，国产商品胶多未添加纤溶酶抑制剂，FG在体内易被组织中的纤维溶解酶消化，快速降解。

血小板可分泌多种生长因子，已证明在创伤愈合过程中扮演重要角色[3，4]。目前的商品胶均采用乏血小板血浆制备，缺乏血小板，因而促进组织愈合的能力有限。除此之外，商品胶在胃肠道的应用尚存在争议，而自体胶在胃肠道手术中应用的安全性已经过证实[5]，因其保留了商品胶血浆中因为高温消毒而被灭活的抗体或补体成分。综上，富含血小板的自体胶可填补商品胶的多项不足。

主要参考文献

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发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供用于消化道瘘封堵的自体生物蛋白胶试剂。

本发明的另一目的是提供该用于消化道瘘封堵的自体生物蛋白胶试剂制备方法。

本发明的又一目的是提供该自体生物蛋白胶试剂的应用。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

用于消化道瘘封堵的自体生物蛋白胶试剂，包含如下组分：FG组分I——纤维蛋白原，1mg/ml的氨甲环酸溶液，FG组分II——凝血酶；所述的纤维蛋白原和凝血酶均由高浓度血小板血浆(PRP)制备，其中所述的1mg/ml的氨甲环酸溶液与纤维蛋白原的体积比为1∶4～7。

其中，所述的高浓度血小板血浆通过如下方法制备：向全血中加入14g/100ml柠檬酸磷酸葡萄糖腺嘌呤抗凝液(即每100ml全血中加入14g柠檬酸磷酸葡萄糖腺嘌呤抗凝液)，23～28℃，1000g离心6-8min，分离出最上层的血浆，血浆在相同离心条件下重复离心一次，分离出最上层的血浆即为高浓度血小板血浆。

所述的纤维蛋白原由高浓度血小板血浆通过冷沉淀法制备得到，具体方法是：高浓度血小板血浆在-80℃条件下冷冻1-6h，然后在4℃下解冻30min或至血浆全部融化，再4000rpm/min离心5min，吸出上清液，保留底部沉淀物，即得到浓缩的纤维蛋白原；所述的凝血酶通过如下方法制备：将高浓度血小板血浆加入2.84mM柠檬酸中稀释，4℃下3000g离心5min，弃去上清液，沉淀中加入GaCl₂，加入NaHCO₃调节PH值至中性，待凝血块完全形成，吸出液态的凝血酶；其中所述的高浓度血小板血浆与柠檬酸溶液的体积比为1∶8～9.5；加入的CaCl₂与高浓度血小板血浆的质量比为0.0005～0.001∶1。

1mg/ml的氨甲环酸溶液与纤维蛋白原的体积比优选1∶5。

使用所述的自体生物蛋白胶试剂进行消化道堵瘘时，将-20℃保存的各组分在37℃恒温水浴至恢复液态，向纤维蛋白原中加入相当于纤维蛋白原1/5体积的1mg/ml氨甲环酸溶液混合均匀，使用双联注射器分别吸取等体积FG组分I(纤维蛋白原与氨甲环酸混合物)和FG组分II(凝血酶)，同时推出至使用部位，等待蛋白胶形成。

作为本发明所述的用于消化道瘘封堵的自体生物蛋白胶试剂的另一种优选方式，所述的FG组分I除纤维蛋白原，1mg/ml的氨甲环酸溶液外，还包含浓度为1×10⁶个/ml人脂肪干细胞，FG组分II——凝血酶；所述的纤维蛋白原和凝血酶均由高浓度血小板血浆制备，其中所述的1mg/ml的氨甲环酸溶液与纤维蛋白原的体积比为1∶4～7。

使用所述的自体生物蛋白胶试剂进行消化道堵瘘时，将-20℃保存的各组分在37℃恒温水浴至恢复液态，向纤维蛋白原中加入相当于纤维蛋白原1/5体积的1mg/ml氨甲环酸溶液和人脂肪干细胞，混合均匀，使人脂肪干细胞在纤维蛋白原中的浓度为2.0～3.0×10⁵个/ml；使用双联注射器分别吸取等体积FG组分I(纤维蛋白原与氨甲环酸以及脂肪干细胞的混合物)和FG组分II(凝血酶)，同时推出至使用部位，等待蛋白胶形成。

作为本发明所述的用于消化道瘘封堵的自体生物蛋白胶试剂的又一种优选方式，所述的用于消化道瘘封堵的自体生物蛋白胶试剂中，所述的FG组分I除纤维蛋白原，1mg/ml的氨甲环酸溶液外，还包含15nm的纳米银溶液，FG组分II——凝血酶；所述的纤维蛋白原和凝血酶均由高浓度血小板血浆制备，其中所述的1mg/ml的氨甲环酸溶液与纤维蛋白原的体积比为1∶4～7。

使用所述的自体生物蛋白胶试剂进行消化道堵瘘时，将-20℃保存的各组分在37℃恒温水浴至恢复液态，向纤维蛋白原中加入相当于纤维蛋白原1/5体积的1mg/ml氨甲环酸溶液和纳米银溶液，混合均匀，使粒径为15nm的纳米银在纤维蛋白原中的浓度为25-500μg/ml；使用双联注射器分别吸取等体积FG组分I(纤维蛋白原与氨甲环酸以及纳米银的混合物)和FG组分II(凝血酶)，同时推出至使用部位，等待蛋白胶形成。

本发明所述的用于消化道瘘封堵的自体生物蛋白胶试剂的制备方法，包含如下步骤：

(1)制备高浓度血小板血浆：向全血中加入14g/100ml柠檬酸磷酸葡萄糖腺嘌呤抗凝液，23～28℃，1000g离心6-8min，分离出最上层的血浆，血浆在相同离心条件下重复离心一次，分离出最上层的血浆即为高浓度血小板血浆；

(2)制备纤维蛋白原：将步骤(1)制备的高浓度血小板血浆在-80℃条件下冷冻1-6h，然后在4℃下解冻30min或至血浆全部融化，再4000rpm/min离心5min，吸出上清液，保留底部沉淀物，即得到浓缩的纤维蛋白原；

(3)制备凝血酶：将步骤(1)制备的高浓度血小板血浆加入2.84mM柠檬酸中稀释，4℃下3000g离心5min，弃去上清液，沉淀中加入CaCl₂，加入NaHCO₃调节PH值至中性，待凝血块完全形成，吸出液态的凝血酶；其中所述的高浓度血小板血浆与柠檬酸溶液的体积比为1∶8～9.5；加入的CaCl₂与高浓度血小板血浆的质量比为0.0005～0.001∶1；

(4)试剂组装：将所述的纤维蛋白原，凝血酶，以及1mg/ml的氨甲环酸溶液分别分装于不同容器中，-20℃保存；其中所述的纤维蛋白原的体积和所述的凝血酶的体积根据实际情况有多个规格，一般分别在0.5～5ml，所述的1mg/ml的氨甲环酸溶液与纤维蛋白原的体积比为1∶4～7。

所述的步骤(4)试剂组装优选：将所述的纤维蛋白原，凝血酶，以及1mg/ml的氨甲环酸溶液，以及浓度为10×10⁶/ml的人脂肪干细胞分别分装于不同容器中，-20℃保存；其中1mg/ml的氨甲环酸溶液与所述的纤维蛋白原的体积比为1∶4～7，优选1∶5；

或者

将所述的纤维蛋白原，凝血酶，，1mg/ml的氨甲环酸溶液以及15nm的纳米银溶液分别分装于不同容器中，-20℃保存；其中1mg/ml的氨甲环酸溶液与所述的纤维蛋白原的体积比为1∶4～7，优选1∶5。

前期工作显示本发明制胶约耗时24h，平均采血约340±50.71ml，低速离心后得到197±31.25ml PRP，其中50g PRP得到7.1±1.50ml凝血酶，剩余PRP冷沉淀法制得4.0±2.07ml纤维蛋白原。

所述的用于消化道瘘封堵的自体生物蛋白胶试剂在制备治疗全消化道瘘的药物或医疗器械中的应用。

本发明的有益效果：

本发明的突出之处在于自体生物蛋白胶的制备方法简便可行，制作成本低，符合大众需要；用于消化道瘘封堵的自体生物蛋白胶试剂取自病人自身，避免了异源或异体血制品的输血风险，生物相容性更佳，临床试验至今，无不良反应的报道；添加的纤溶酶抑制剂能够有效延长FG体内存在时间；保留了全血中的血小板，补体未被灭活，可安全应用于胃肠道等感染环境中；自体胶是细胞生长的天然培养基，添加的干细胞可协同、强化生物蛋白胶增强组织愈合的优点；添加的加入纳米银等具有抗菌活性的物质，多种成分协同作用，促进组织快速愈合，临床应用前景广阔。

附图说明

图1自体胶与商品胶的扫描电镜。(A)自体胶，可见胶原纤维相互交联，放大5000倍；(B)自体胶，血小板密布，放大10000倍；(C)倍绣商品胶，放大5000倍；(D)放大10000倍可见倍绣的纤维结构。

图2本发明自体胶封堵消化道瘘的类型分布图。

具体实施方式

实施例1

(1)制备高浓度血小板血浆：向200ml全血中加入28g柠檬酸磷酸葡萄糖腺嘌呤抗凝液(CPD)，25℃，1000g离心6min，分离出最上层的血浆，血浆在相同离心条件下重复离心一次，分离出最上层的血浆即为高浓度血小板血浆(PRP)；

(2)制备纤维蛋白原：将步骤(1)制备的高浓度血小板血浆(PRP)在-80℃条件下冷冻1-6h，然后在4℃下解冻30min或至血浆全部融化，再4000rpm/min离心5min，吸出上清液，保留底部沉淀物，即得到浓缩的纤维蛋白原；

(3)制备凝血酶：以10g PRP为例，将步骤(1)制备的10g PRP移至150ml血袋中，加入90ml柠檬酸(2.84mM)稀释，4℃下3000g离心5min，弃去上清液，沉淀中加入0.65ml CaCl₂(0.1M)，加入NaHCO₃调节PH值至中性，此时凝血酶前体转变成凝血酶。待凝血块完全形成(需20-30min)，及时吸出液态的凝血酶；

(4)试剂组装：将所述的纤维蛋白原2ml，凝血酶2ml，以及1mg/ml的氨甲环酸溶液0.5ml分别分装于不同容器中，-20℃保存；其中1mg/ml的氨甲环酸溶液与所述的纤维蛋白原的体积比为1∶4～7；

(5)复温：使用前将所述的纤维蛋白原，凝血酶，以及1mg/ml的氨甲环酸溶液37℃恒温水浴至恢复液态，向2ml纤维蛋白原中加入0.4ml 1mg/ml的纤溶酶抑制剂氨甲环酸混合均匀；(6)使用方法：双联注射器分别吸取等体积的FG组分I——加入氨甲环酸的纤维蛋白原与FG组分II——凝血酶，同时推出至使用部位，等待蛋白胶形成。

对比本发明自体生物蛋白胶试剂与商品胶(倍绣，广州倍绣生物技术有限公司)的生化特性(表1)，发现两者纤维蛋白原的含量没有显著性差异(P＞0.05)，而自体胶血小板、纤维连接蛋白等促进组织愈合的指标显著高于商品胶(P＜0.001)；凝血酶效价方面，自体胶显著低于商品胶，但是前期临床试验及血栓弹力图结果证实两者在凝固时间方面不存在显著差异(P＞0.05)。

表1本发明自体生物蛋白胶试剂与商品胶的生化特性

^a产品说明书

机械性能方面，主要采用血栓弹力图(TEG)来评价。其中最大幅度(MA)、血凝块强度(G)、α角度、弹性常数(ε)可反映出纤维蛋白胶的机械强度，由纤维蛋白原含量决定；反应时间(R)、凝固时间(K)则体现了凝血酶的效价。表2可见本发明用于消化道瘘封堵的自体生物蛋白胶试剂与商品胶的以上各指标均不存在显著性差异(P＞0.05)。

表2本发明自体生物蛋白胶试剂与商品胶的TEG结果

形态学研究方面，采用扫描电镜观察(图1)，标本经PBS缓冲液冲洗、戊二醛固定、凝固态干燥以及镀金等处理。结果显示本发明自体生物蛋白胶试剂表现出明显的胶原相互交联，并可见血小板密集分布；商品胶的超微结构则未见明显的胶原结构，亦无血小板等细胞成分。

实施例2

按照实施例1方法制备的富含血小板的生物蛋白胶已在南京军区南京总医院肠瘘病区开展临床应用，病人的入选标准为手术后或外伤后肠外瘘；低流量瘘(瘘量＜200ml/d)；窦道长度＞2cm；一般情况良好；年龄＞18岁。排除标准包括：瘘的远端肠管有梗阻，肠管已完全或断裂超过1/3；有重度肝硬化、糖尿病等代谢障碍性疾病；有肿瘤、特异性感染或肠道炎性疾病；肠瘘窦道复杂，存在2个或以上分叉；周围存在脓腔；肠瘘黏膜完全外翻并与周围皮肤黏着形成唇状瘘，完全没有自愈希望；献血禁忌(高血压、献血反应等)。

目前已用于29例消化道瘘病人，其中小肠瘘12例，十二指肠瘘10例，结肠瘘8例，胰瘘6例，直肠瘘2例，胃瘘1例，共39例消化道瘘(图2)。

符合入选标准的病人在胶堵治疗的前一天借助窦道造影明确窦道长度、走行，调整双套管的最佳位置及最适型号，确保双套管的内侧管口接近消化道瘘瘘口，更换型号小于现用型号的新双套管，通过塑料管壁与窦道壁的摩擦，刺激窦道壁肉芽组织的新生。胶堵前30min-6h关闭双套管的冲洗水，只连接负压吸引器保持窦道干燥；拔出双套管，清理窦道及皮肤外瘘口，为胶堵的无菌操作做准备。

使用所述的自体生物蛋白胶试剂(制备方法同实施例1)进行消化道堵瘘时，将-20℃保存的各组分在37℃恒温水浴至恢复液态，向纤维蛋白原中加入相当于纤维蛋白原1/5体积的1mg/ml氨甲环酸溶液混合均匀，使用双联注射器分别吸取等体积FG组分I和FG组分II。根据双套管长度估计实际窦道长度，从而决定Y型延长管伸入窦道内的深度。将双联注射器与Y型延长管连接，同时推出两组分至使用部位，等待蛋白胶形成。高渗生理盐水(10％NaCl)浸湿纱布，敷于皮肤外瘘口，以促进外瘘口皮肤收缩，上层覆盖干纱布。嘱病人静卧、制动24h。

经过3个月的随访观察，成功治愈33例瘘，治愈率为84.62％，胶堵后7.14±1.46天恢复至肠内营养，平均住院时间缩短至43.62±22.33d，其中胶堵后平均15.9±9.57d出院，降低了住院费用，社会效益、经济效益显著，随访过程中无一例不良反应报道。

与国内纤维蛋白胶胶堵消化道瘘的文献报道对比发现，本发明——含血小板的自体纤维蛋白胶适用于全消化道瘘病人，王新波等人分别于2004、2007发表的胶堵肠瘘病例报道中以高位瘘(胃瘘、十二指肠瘘、小肠瘘等)为主，这可能是愈合成功率高的原因之一。与国外研究对比发现，本发明治愈肠瘘的成功率接近或领先国外Tissucol产品，且随访未见不良反应或复发病例。(表3)

表3本发明与国内外文献报道效果对比

主要参考文献

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实施例3

FG作为优良的生物支架，可以为细胞器生长提供合适的环境，并且可以克服人工材料引起异物反应、降解慢、有毒性等缺点。成人干细胞中的骨髓或脂肪来源的间充质干细胞(MSCs)可通过非侵入性操作获取，亦具有多向分化的潜能，可分化为肝圆细胞、肝细胞、胆管细胞、骨骼肌细胞、神经元甚至肾小管上皮细胞等。相对于骨髓干细胞，脂肪干细胞(ADSCs)来源丰富、易于提取，可分化为软骨细胞、脂肪细胞、成骨细胞等，已在临床上获得广泛应用。一种含人脂肪干细胞的自体生物蛋白胶，通过如下方法制备：

(1)制备高浓度血小板血浆：同实施例1；

(2)制备纤维蛋白原：同实施例1；

(3)制备凝血酶：同实施例1；

(4)脂肪干细胞的获得与培养：局麻后通过皮肤小切口将导管伸入皮下脂肪层，吸出脂肪颗粒。PBS缓冲液冲洗提取的脂肪组织，去除血细胞、生理盐水和麻醉剂。随后37℃条件下放入II型胶原酶(0.075％)和平衡盐溶液(5mg/ml)以消化胞外基质，30分钟后加入含10％小牛血清(FBS)的DMEM终止胶原酶的活性。得到的细胞悬浮液250g离心10分钟，细胞转入0.16M NH4Cl，室温下静置10分钟促使红细胞裂解。混合液250g离心后，细胞转入DMEM+10％FBS+1％氨苄青霉素/链霉素，然后转入100mm组织培养皿，使细胞浓度在10-15×10³/cm²。

5％CO₂，37℃条件下培养细胞24h，PBS冲洗培养皿，去除散落的细胞和细胞骨架。同样条件下继续培养细胞直至达到80％共融，每3-4天更换培养基。然后细胞以1∶3的比例转至胰蛋白酶-EDTA，用于治疗的细胞为1-3代，其浓度为1×10⁶/ml。

(5)试剂组装：将制备的纤维蛋白原3ml，凝血酶3ml，1mg/ml的氨甲环酸溶液0.7ml以及脂肪干细胞分装于不同容器中，-20℃保存；

(6)复温：使用前将制备的纤维蛋白原，凝血酶，以及1mg/ml的氨甲环酸溶液37℃恒温水浴至恢复液态；向3ml纤维蛋白原中加入0.6ml 1mg/ml的纤溶酶抑制剂氨甲环酸以及1ml的脂肪干细胞，混合均匀，得到FG组分I——加入氨甲环酸和脂肪干细胞的纤维蛋白原；

(7)使用方法：双联注射器分别吸取等体积的加入氨甲环酸和脂肪干细胞的纤维蛋白原和FG组分II——凝血酶，同时推出至使用部位，等待蛋白胶形成。

以上制备的含人脂肪干细胞的自体生物蛋白胶应用于消化道瘘具有强化FG促进组织愈合的能力。

实施例4

银离子的抗菌活性已为人类熟知多年。其机制主要是银离子同电荷供体，如硫、氧、硫醇基团等生物分子，结合起来，抑制微生物基本的酶促作用。近年来，由于对纳米技术的深入认识，纳米银(NS)材料成为研究的热点。NS含Ag⁺和Ag⁰，15nmNS中有大约50,000个银原子。联合FG和NS应用于腹部外科，无疑是将FG的促进创伤修复和NS的抗菌能力联合起来。将纳米银(NS，直径15nm，Uni-impex Korea公司，韩国)混入纤维蛋白原中，等量的纤维蛋白原和凝血酶混合后形成NS-PRFG复合物。经过生物安全实验验证安全性后，封堵消化道瘘，可强化FG的抗菌性能。

一种含纳米银的自体生物蛋白胶，通过如下方法制备：

(1)制备高浓度血小板血浆：同实施例1；

(2)制备纤维蛋白原：同实施例1；

(3)制备凝血酶：同实施例1；

(4)试剂组装：将制备的纤维蛋白原2ml，凝血酶2ml，1mg/ml的氨甲环酸溶液0.5ml以及纳米银(NS，直径15nm，Uni-impex Korea公司，韩国)分别分装于不同容器中，-20℃保存；

(5)复温：使用前将制备的纤维蛋白原，凝血酶，以及1mg/ml的氨甲环酸溶液37℃恒温水浴至恢复液态；向纤维蛋白原中加入0.4ml 1mg/ml的纤溶酶抑制剂氨甲环酸以及纳米银溶液，使纳米银浓度为25μg/ml，得到FG组分I——加入氨甲环酸和纳米银的纤维蛋白原；

(6)使用方法：双联注射器分别吸取等体积的加入氨甲环酸和纳米银的纤维蛋白原和FG组分II——凝血酶，同时推出至使用部位，等待蛋白胶形成。

Claims (9)

1.用于消化道瘘封堵的自体生物蛋白胶试剂，其特征在于包含如下组分：FG组分I——纤维蛋白原，1mg/ml的氨甲环酸溶液，FG组分II——凝血酶；所述的纤维蛋白原和凝血酶均由高浓度血小板血浆制备，其中所述的1mg/ml的氨甲环酸溶液与纤维蛋白原的体积比为1∶4～7。

2.根据权利要求1所述的用于消化道瘘封堵的自体生物蛋白胶试剂，其特征在于所述的高浓度血小板血浆通过如下方法制备：向全血中加入14g/100ml柠檬酸磷酸葡萄糖腺嘌呤抗凝液，23～28℃，1000g离心6-8min，分离出最上层的血浆，血浆在相同离心条件下重复离心一次，分离出最上层的血浆即为高浓度血小板血浆。

3.根据权利要求2所述的用于消化道瘘封堵的自体生物蛋白胶试剂，其特征在于所述的纤维蛋白原由所述的高浓度血小板血浆通过冷沉淀法制备得到，具体方法是：所述的高浓度血小板血浆在-80℃条件下冷冻1-6h，然后在4℃下解冻30min或至血浆全部融化，再4000rpm/min离心5min，吸出上清液，保留底部沉淀物，即得到浓缩的纤维蛋白原；所述的凝血酶通过如下方法制备：将所述的高浓度血小板血浆加入2.84mM柠檬酸中稀释，4℃下3000g离心5min，弃去上清液，沉淀中加入CaCl₂，加入NaHCO₃调节PH值至中性，待凝血块完全形成，吸出液态的凝血酶；其中所述的高浓度血小板血浆与柠檬酸溶液的体积比为1∶8～9.5；加入的CaCl₂与高浓度血小板血浆的质量比为0.0005～0.001∶1。

4.根据权利要求1所述的用于消化道瘘封堵的自体生物蛋白胶试剂，其特征在于1mg/ml的氨甲环酸溶液与纤维蛋白原的体积比为1∶5。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的用于消化道瘘封堵的自体生物蛋白胶试剂，其特征在于所述的FG组分I除纤维蛋白原，1mg/ml的氨甲环酸溶液外，还包含浓度为1×10⁶个/ml的人脂肪干细胞。

6.根据权利要求1～4中任一项所述的用于消化道瘘封堵的自体生物蛋白胶试剂，其特征在于所述的FG组分I除纤维蛋白原，1mg/ml的氨甲环酸溶液外，还包含15nm的纳米银溶液。

7.权利要求1所述的用于消化道瘘封堵的自体生物蛋白胶试剂的制备方法，其特征在于包含如下步骤：

(1)制备高浓度血小板血浆：向全血中加入14g/100ml柠檬酸磷酸葡萄糖腺嘌呤抗凝液，23～28℃，1000g离心6-8min，分离出最上层的血浆，血浆在相同离心条件下重复离心一次，分离出最上层的血浆即为高浓度血小板血浆；

(2)制备纤维蛋白原：将步骤(1)制备的高浓度血小板血浆在-80℃条件下冷冻1-6h，然后在4℃下解冻30min或至血浆全部融化，再4000rpm/min离心5min，吸出上清液，保留底部沉淀物，即得到浓缩的纤维蛋白原；

(3)制备凝血酶：将步骤(1)制备的高浓度血小板血浆加入2.84mM柠檬酸中稀释，4℃下3000g离心5min，弃去上清液，沉淀中加入CaCl₂，加入NaHCO₃调节PH值至中性，待凝血块完全形成，吸出液态的凝血酶；其中所述的高浓度血小板血浆与柠檬酸溶液的体积比为1∶8～9.5；加入的CaCl₂与高浓度血小板血浆的质量比为0.0005～0.001∶1；

(4)试剂组装：将所述的纤维蛋白原，凝血酶，以及1mg/ml的氨甲环酸溶液分别分装于不同容器中，-20℃保存；其中1mg/ml的氨甲环酸溶液与所述的纤维蛋白原的体积比为1∶4～7，优选1∶5。

8.根据权利要求7所述的用于消化道瘘封堵的自体生物蛋白胶试剂的制备方法，其特征在于所述的步骤(4)试剂组装：将所述的纤维蛋白原，凝血酶，以及1mg/ml的氨甲环酸溶液，以及浓度为1×10⁶/ml的人脂肪干细胞分别分装于不同容器中，-20℃保存；其中1mg/ml的氨甲环酸溶液与所述的纤维蛋白原的体积比为1∶4～7，优选1∶5；或者

步骤(4)试剂组装：将所述的纤维蛋白原，凝血酶，，1mg/ml的氨甲环酸溶液以及15nm的纳米银溶液分别分装于不同容器中，-20℃保存；其中1mg/ml的氨甲环酸溶液与所述的纤维蛋白原的体积比为1∶4～7，优选1∶5。

9.权利要求1～6中任一项所述的用于消化道瘘封堵的自体生物蛋白胶试剂在制备治疗全消化道瘘的药物或医疗器械中的应用。

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