CN103110712B - 固公果根提取物在制备治疗炎症性肠病的药物的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了固公果根提取物在制备治疗炎症性肠病的药物的应用。实验证明：固公果根提取物具有治疗炎症性肠病的作用，且疗效确切。本发明挖掘出彝族药材固公果根的新用途。

Description

固公果根提取物在制备治疗炎症性肠病的药物的应用

技术领域

本发明涉及一种植物提取物的用途，特别涉及一种固公果根提取物在制备治疗炎症性肠病的药物的应用。

背景技术

固公果根是彝族民间用药，为蔷薇科植物固公果（Rose odorata Sweet var.gigantea(Coll.etHemsl.)Rehd.et Wils）的根入药。固公果根性平、味酸，具有涩肠止泻的功效，常用于治疗腹泻、菌痢等疾病^[1]。到目前为止尚没有关于固公果根化学成分研究的详尽文献报道，只是通过分析1974年云南地方药品标准（滇Q/WS269-1974）中关于固公果根药材的资料^[2]和目前国家药品监督管理局制定的肠舒片试行标准中关于固公果根药材的定性定量鉴别方法^[3]确定固公果根中含有鞣质和生物碱类化学成分。

炎症性肠病(inflammatoryboweldisease；IBD)是一种慢性、复发性的肠道炎症疾病。病理学检测可见炎性细胞的浸润和粘膜完整性被破坏^[4]。在发达国家，IBD的发病率达到了1/1000^[5]。到目前为止，IBD的病因还没有完全研究清楚，被认为是基因，环境，微生物和机体免疫系统的相互作用造成的^[6]。由于确切的病因不清，常规的治疗策略主要是抗炎和非特异性的抑制免疫反应，包括使用非甾体类抗炎药(5-氨基水杨酸)、皮质激素和免疫抑制剂(6-巯基镖吟)^[7]。但是研究表明非甾体类抗炎药(5-氨基水杨酸)存在一定的副作用，如大剂量使用大剂量不良反应有高热、消化不良、腹泻、转氨酶升高、脂酶水平升高等，皮质激素和免疫抑制剂存在长期使用的剂量依赖性。近年来，学者开始关注中医药治疗炎症性肠病，研究表明中药的疗效稳定，且具有综合性双向调节作用，既可调节免疫功能又能抵御病原微生物的侵袭，并可减轻或缓解症状等优点。本发明选取的固公果根是彝族传统药物，具有悠久的使用历史，具有安全有效的特点。

参考文献：

[1]任洁，何广新.苗药-固公果阿江制剂-“肠康胶囊”的质量标准研究[J]，中国民族民间医药杂志，1998，31：41～42.

[2]固公果根的质量标准，云南地方药品标准1974版.

[3]肠舒片的质量标准，国家药品监督管理局2002-2004年试行标准

[4]Van Assehe G.Emerging drugs to treat Crohn’s disease[J],ExPert Opin Emerg Drugs,2007,12:49-59.

[5]Xavier R.J.Podolsky DKUnravelling the pathogenesis of inflammatory bowel disease[J],Nature,2007,448:427-434.

[61Liehtenstein GR,Hanauer SB,Sandborn WJ.Management of Crohn’s disease in adults[J],Am J.Gastroenterol,2009,104:46-483.

[7]Sandborn WJ,Feagan BG.Review artiele:mild to moderate Crohn’s disease-defining the basis for a newtreatment algorithm[J],Aliment Pharmaeol,2003,18:263-277.

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供固公果根提取物在制备治疗炎症性肠病的药物的应用。

本发明的技术方案概述如下：

固公果根提取物在制备治疗炎症性肠病的药物的应用。

所述固公果根提取物的剂型优选为硬胶囊剂、软胶囊剂、散剂、颗粒剂、片剂、丸剂、蜜膏剂、口服液、栓剂、酒剂或注射剂。

固公果根提取物的制备方法，包括如下步骤：

（1）采用下述方法之一种进行提取：

方法一：以质量比为1：4－8的比例，将原料固公果根加入到pH为2-3的酸性水溶液中，在60－80℃浸泡提取6-8小时，提取2-3次，过80-120目筛，得提取液；

方法二：以质量比为1：4－8的比例，将原料固公果根加体积百分比浓度为10%~60%的pH为2-3的乙醇酸性水溶液或体积百分比浓度为10%~60%的pH为2-3的甲醇酸性水溶液中，在60－80℃浸泡提取6-8小时，提取2-3次，过80-120目筛，得提取液，在温度30-50℃，真空度为0.06~0.08MPa减压浓缩至糖度2-10，得到提取物，将所述提取物以质量比为1:1~5的比例分散至水中；

（2）将所述步骤（1）获得的的产物经大孔树脂吸附，用水及体积百分比浓度为30%~60%的乙醇水溶液洗脱，或水及体积百分比浓度为30%~60%的甲醇水溶液洗脱，洗脱体积为2-5倍柱床体积，弃水洗脱液；收集醇洗脱液，洗脱液在温度30-60℃，真空度为0.06~0.08MPa减压浓缩，得糖度为10~40的浓缩物，干燥，得到固公果根中治疗腹泻的有效部位。

所述酸为盐酸、硫酸、冰醋酸、磷酸或甲酸。

所述大孔树脂的型号为AB-8型、HP20型、HPD100型、HPD100A型、HPD300型、X-5型、NKA-Ⅱ型、D101型或DA201型。

实验证明：固公果根提取物具有治疗炎症性肠病的作用，且疗效确切。挖掘出彝族药材固公果根的新用途。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1

鞣质含量测定方法

仪器：岛津1601分光光度计；HZQ-QX型电动振荡机（东联电子技术开发有限公司）

标准品与试剂：没食子酸对照品（含量98%）；干酪素(化学纯)；碳酸钠；钨酸钠；钼酸钠；硫酸锂（以上试剂均为分析纯）。

磷钼钨酸试剂的配制：取钨酸钠100g，钼酸钠25g，加水700mL使溶解，加盐酸100mL，磷酸50mL，加热回流10h，放冷，再加硫酸锂150g，水50mL和溴0.2mL，煮沸除去残留的溴(约15min)，冷却，加水稀释至1000mL，滤过，即得。

干酪素法标准曲线的绘制

对照品溶液的配制

精密称取没食子酸标准品0.050g，置于100mL棕色容量瓶中，加水溶解，定容，混匀后，精密吸取5.0mL置于100mL棕色容量瓶中，定容，混匀，备用(每mL含没食子酸0.025mg)。

标准曲线的绘制

精密量取对照品溶液0.5mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL分别置于25mL棕色容量瓶中，各加入磷钼钨酸试液1mL，再分别加入水11.5mL、11mL、10mL、9mL、8mL、7mL，用29％碳酸钠溶液稀释至刻度，摇匀，放置30min,以相应试剂为空白，按照紫外－可见分光光度法(中国药典2005年版二部附录ⅣA)，在760nm的波长处测定吸光度，以浓度(mg/mL)为横坐标，吸光度(A)为纵坐标，绘制标准曲线。

线性回归方程为Y＝4.0662X－0.0434(R＝0.9997)

鞣质含量的测定

总酚的测定：取固公果根提取液1.0mL，稀释400倍后，精密量取2.0mL置于25mL棕色容量瓶中，照标准曲线的制备项下的方法，自“加入磷钼钨酸试液1mL”起，再分别加入水10mL，依法测定吸光度，代入线形回归方程，计算，即得。

不被吸附的多酚的测定：精密量取供试品溶液25mL，加至已盛有干酪素0.6g的100mL具塞锥形瓶中，密塞，置于30℃水浴中保温1h，时时振摇，取出，放冷，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液2.0mL，置于25mL棕色量瓶中，照标准曲线的制备项下的方法，自“加入磷钼钨酸试液1mL”起，再分别加入水10mL，依法测定吸光度，代入线形回归方程，计算，即得。

按下式计算鞣质的含量：鞣质含量＝总酚量－不被吸附的多酚量

实施例2

固公果根中总三萜含量测定方法

试验材料：无水乙醇、95%乙醇、冰乙酸、高氯酸、香草醛、浓硫酸等均为分析纯试剂;熊果酸标准对照品(中国药品生物制品检定所)；UV-1601紫外可见分光光度计(日本岛津公司)。

试验方法：(1)熊果酸对照品最佳检测波长的确定及标准曲线的绘制。精确称取烘至恒重的熊果酸对照品4.0mg,加无水乙醇溶解后定容至50mL,质量浓度为0.08mg/mL。取一定量的熊果酸对照品溶液于10mL的试管中,加入新配置的香草醛-5%冰醋酸0.2ml及高氯酸0.8ml60C时水浴加热15min，冰水冷却，加冰醋酸5ml，静置，UV-1601型紫外分光光度计在200～700nm波长范围内扫描,显示熊果酸在550nm处有最大的吸光度。然后分别精密吸取对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL按相同方法处理,在550nm处测定其吸光度,以吸光度(A)与熊果酸质量求得回归方程并绘制出熊果酸对照品的标准曲线。通过线性回归计算,得出回归方程为:y=0.1015x+0.0065,线性相关系数r=0.9992,熊果酸质量在0.016～0.096mg范围内与吸光度呈现良好的线性关系

(2)提取物样品溶液的配制和含量测定。称取50mg固公果根提取物置于100mL容量瓶中，用95%乙醇溶解并定容至刻度。准确移取1.0mL于25mL容量瓶中,95%乙醇定容,即为样品待测液,然后准确移取0.5mL待测液按(1)方法测定其吸光度,通过回归方程求出吸光度对应的三萜质量，计算总三萜含量。

实施例3

一种固公果根提取物的制备方法，由如下步骤组成：

（1）以固公果根500g为原料，加入所述原料质量4倍的盐酸水溶液（pH=2），在60℃浸泡提取8小时，过滤，滤渣再加盐酸水溶液，共提取3次，每次6小时，过80目筛，得提取液；

（2）将所述步骤（1）获得的产物进行大孔树脂吸附，大孔树脂的型号为AB-8型，分别用水洗脱3倍柱床体积、体积百分比浓度为30%的乙醇水溶液洗脱5倍柱床体积，弃水洗脱液，收集醇洗脱液，收集富含鞣质和三萜的组分，将其合并，在温度60℃，真空度为0.06~0.08MPa减压浓缩，得糖度为20的浓缩物，干燥，得到固公果根中治疗腹泻的有效部位，其中鞣质含量为61%，得率为91.1%，总三萜含量为12.1%,得率为70.1%。

实施例4

一种固公果根提取物的制备方法，由如下步骤组成：

（1）以固公果根500g为原料，加入所述原料质量8倍的冰醋酸水溶液（pH=3），在80℃提取2次，每次6小时，过120目筛，得提取液；

（2）将所述步骤（1）获得的产物进行大孔树脂吸附，大孔树脂的型号为HP20型，分别用水洗脱2倍柱床体积、体积百分比浓度为60%的乙醇水溶液洗脱2倍柱床体积，弃水洗脱液，收集醇洗脱液，洗脱液通过薄层层析方法并结合分析型HPLC检测，收集富含鞣质和三萜的组分，将其合并，在温度30℃，真空度为0.06~0.08MPa减压浓缩，得糖度为40的浓缩物，干燥，得到固公果根中治疗腹泻的有效部位，其中鞣质含量为66%，得率为90,1%；总三萜含量为13.5%，得率为72.3%。

实施例5

一种固公果根提取物的制备方法，由如下步骤组成：

（1）以固公果根500g为原料，加入所述原料质量8倍的体积百分比浓度为60%的乙醇磷酸水溶液（pH=2.5），在70℃提取3次，每次7小时，过80目筛，得提取液，在温度40℃，真空度为0.06~0.08MPa减压浓缩至糖度10，得到提取物，将所述提取物以质量比为1:5的比例分散至水中；

（2）将所述步骤（1）获得的产物进行大孔树脂HPD100型吸附，分别用水洗脱3倍柱床体积、再用体积百分比浓度为40%的乙醇水溶液梯度洗脱，弃水洗脱液，收集醇洗脱液，洗脱液通过薄层层析方法并结合分析型HPLC检测，收集富含鞣质和三萜的组分，将其合并，在温度40℃，真空度为0.06~0.08MPa减压浓缩，得糖度为10的浓缩物，干燥，得到固公果根中治疗腹泻的有效部位，其中鞣质含量为71%，得率为92%；总三萜含量为12.6%。得率为71.8%

实施例6

一种固公果根提取物的制备方法，由如下步骤组成：

（1）以固公果根500g为原料，加入所述原料质量4倍的体积百分比浓度的10%的乙醇硫酸水溶液（pH=2），在80℃提取3次，每次6小时，过80目筛，得提取液，在温度50℃，真空度为0.06~0.08MPa减压浓缩至糖度2，得到提取物，将所述提取物以质量比为1:1的比例分散至水中；

（2）将所述步骤（1）获得的产物进行大孔树脂HPD100A型吸附，先用水洗脱4柱床体积，再用体积百分比浓度为50%的乙醇水溶液梯度洗脱3倍柱床体积，弃水洗脱液，收集醇洗脱液，洗脱液通过薄层层析方法并结合分析型HPLC检测，收集富含鞣质和三萜的组分，将其合并，在温度50℃，真空度为0.06~0.08MPa减压浓缩，得糖度为30的浓缩物，干燥，得到固公果根中治疗腹泻的有效部位，其中鞣质含量为62.4%，得率为91.4%，总三萜含量为12.3%，得率为71.5%。

实施例7

一种固公果根提取物的制备方法，由如下步骤组成：

（1）以固公果根500g为原料，加入所述原料质量6倍的体积百分比浓度为30%的乙醇甲酸水溶液（pH=3）为提取溶剂，在70℃提取1次，每次7小时，过120目筛，得提取液，在温度30℃，真空度为0.06~0.08MPa减压浓缩至糖度4，得到提取物，将所述提取物以质量比为1:4的比例分散至水中；；

（2）将所述步骤（1）获得的产物进行大孔树脂HPD300型吸附，先用水洗脱3倍柱床体积、再用体积百分比浓度为30%的乙醇水溶液梯度洗脱，弃水洗脱液，收集醇洗脱液，洗脱液通过薄层层析方法并结合分析型HPLC检测，收集富含鞣质和三萜的组分，将其合并，在温度≤60℃，真空度为0.06~0.08MPa减压浓缩，得糖度为30的浓缩物，干燥，得到固公果根中治疗腹泻的有效部位，其中鞣质含量为60.4%%，得率为93.1%，总三萜含量为12.1%，得率为72.9%。

实施例8

一种固公果根提取物的制备方法，由如下步骤组成：

（1）以固公果根500g为原料，加入所述原料质量8倍的10%的甲醇盐酸水溶液（pH=2）为提取溶剂，在80℃提取2次，每次6小时，过100目筛，得提取液，在温度50℃，真空度为0.06~0.08MPa减压浓缩至糖度2，得到提取物，将所述提取物以质量比为1:1的比例分散至水中；

（2）将所述步骤（1）获得的产物进行大孔树脂D101型吸附，用水洗脱2倍柱床体积，再用体积百分比浓度为60%的乙醇水溶液梯度洗脱3倍柱床体积，弃水洗脱液，收集醇洗脱液，洗脱液通过薄层层析方法并结合分析型HPLC检测，收集富含鞣质和三萜的组分，将其合并，在温度60℃，真空度为0.06~0.08MPa减压浓缩，得糖度为10的浓缩物，干燥，得到固公果根中治疗腹泻的有效部位，其中鞣质含量为61.2%，得率为90.2%,总三萜含量为13.9%,得率为70.8%。

实施例9

一种固公果根提取物的制备方法，由如下步骤组成：

（1）以固公果根500g为原料，加入所述原料质量6倍的体积百分比浓度60%的甲醇冰醋酸水溶液（pH=2.5）为提取溶剂，在60℃提取3次，每次7小时，过100目筛，得提取液，在温度30℃，真空度为0.06~0.08MPa减压浓缩至糖度5，得到提取物，将所述提取物以质量比为1:2的比例分散至水中；

（2）将所述步骤（1）获得的产物进行大孔树脂D101型吸附，先用水洗脱5倍柱床体积、再用体积百分比浓度为40%的乙醇水溶液梯度洗脱2倍柱床体积，弃水洗脱液，收集醇洗脱液，洗脱液通过薄层层析方法并结合分析型HPLC检测，收集富含鞣质和三萜的组分，将其合并，在温度30℃，真空度为0.06~0.08MPa减压浓缩，得糖度为40的浓缩物，干燥，得到固公果根中治疗腹泻的有效部位，其中鞣质含量为69.4%，得率为91.5%，总三萜含量为12.8%。得率为70.8%。

实施例10

一种固公果根提取物的制备方法，由如下步骤组成：

（1）以固公果根500g为原料，加入所述原料质量4倍的体积百分比浓度为10%的甲醇水溶液为提取溶剂，在80℃提取2次，每次6小时，过100目筛，得提取液，在温度40℃，真空度为0.06~0.08MPa减压浓缩至糖度2，得到提取物，将所述提取物以质量比为1:1的比例分散至水中；；

（2）将所述步骤（1）获得的产物进行D101型大孔树脂吸附吸附，用水洗脱2倍柱床体积、再用体积百分比浓度为60%的甲醇水溶液梯度洗脱2倍柱床体积，弃水洗脱液，收集醇洗脱液，洗脱液通过薄层层析方法并结合分析型HPLC检测，收集富含鞣质和三萜的组分，将其合并，在温度≤60℃，真空度为0.06~0.08MPa减压浓缩，得糖度为40的浓缩物，干燥，得到固公果根中治疗腹泻的有效部位，其中鞣质含量为62.1%，得率为93.2%，总三萜含量为13.8%，得率为70.1%。

实施例11

一种固公果根提取物的制备方法，由如下步骤组成：

（1）以固公果根500g为原料，加入所述原料质量7倍的体积百分比浓度为50%的甲醇硫酸水溶液（pH=3）为提取溶剂，在70℃提取3次，每次7小时，过80目筛，得提取液，在温度40℃，真空度为0.06~0.08MPa减压浓缩至糖度4，得到提取物，将所述提取物以质量比为1:4的比例分散至水中；；

（2）将所述步骤（1）获得的产物进行DA-201型大孔树脂吸附，先用水洗脱4倍柱床体积、再用体积百分比浓度为30%的甲醇水溶液梯度洗脱5倍柱床体积，弃水洗脱液，收集醇洗脱液，洗脱液通过薄层层析方法并结合分析型HPLC检测，收集富含鞣质和三萜的组分，将其合并，在温度≤60℃，真空度为0.06~0.08MPa减压浓缩，得糖度为20的浓缩物，干燥，得到固公果根中治疗腹泻的有效部位，其中鞣质含量为61.5%，得率为91.1%，总三萜含量为12.4%，得率为71.3%。。

实施例12

一种固公果根提取物的制备方法，由如下步骤组成：

（1）以固公果根500g为原料，加入所述原料质量5倍的甲酸水（pH=2）溶液，在50℃提取3次，每次8小时，过120目筛，得提取液；

（2）将所述步骤（1）获得的产物进行X-5型大孔树脂吸附，用水洗脱2倍柱床体积，再用体积百分比浓度为40%的甲醇水溶液梯度洗脱4倍柱床体积，弃水洗脱液，收集醇洗脱液，洗脱液通过薄层层析方法并结合分析型HPLC检测，收集富含鞣质和三萜的组分，将其合并，在温度≤60℃，真空度为0.06~0.08MPa减压浓缩，得糖度为40的浓缩物，干燥，得到固公果根中治疗腹泻的有效部位，其中鞣质含量为67.2%，得率为90.7%，总三萜含量为12.6%，得率为70,4%。

实施例13

一种固公果根提取物的制备方法，由如下步骤组成：

（1）以固公果根500g为原料，加入所述原料质量6倍的体积百分比浓度为60%的乙醇冰醋酸水溶液（pH=2）为提取溶剂，在80℃提取3次，每次7小时，过100目筛，得提取液，在温度≤60℃，真空度为0.06~0.08MPa减压浓缩至糖度30，得到提取物，将所述提取物以质量比为1:4的比例分散至水中；；

（2）将所述步骤（1）获得的产物进行NKA-Ⅱ型大孔树脂吸附，先用水洗脱4倍柱床体积、再用体积百分比浓度为45%的乙醇水溶液梯度洗脱3倍柱床体积，弃水洗脱液，收集醇洗脱液，洗脱液通过薄层层析方法并结合分析型HPLC检测，收集富含鞣质和三萜的组分，将其合并，在温度≤60℃，真空度为0.06~0.08MPa减压浓缩，得糖度为10的浓缩物，干燥，得到固公果根中治疗腹泻的有效部位，其中鞣质含量为64.2%，得率为90.7%，总三萜含量为12.4%，得率为71.3%。

实施例14固公果根提取物抗炎药效试验

（1）二甲苯致小鼠耳廓肿胀试验[4]：

小鼠50只，雌雄各半，随机分5组，灌服固公果根植物提取物（实施例3制备）溶液、阿司匹林水溶液或等容水后1h，于小鼠右耳用微量注射器滴二甲苯0.02ml并令二甲苯浸满鼠耳两面，40min后小鼠拉颈处死，沿鼠耳根部基线用眼科剪剪下两耳，称取左、右耳片重量，以右耳与左耳重量差的mg数表示炎症反应强度，结果见表1。测试结果显示固公果根提取物能够显著抑制二甲苯所致小鼠耳廓肿胀，且呈现量效依赖关系，具有抗炎作用。

表1固公果根提取物对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀的影响

与对照组比较，**P<0.01；采用t检验(n=10)

（2）角叉菜胶致大鼠足肿胀试验：大鼠40只随机分成5组，灌胃给药后1h，于每只大鼠右后脚足跖皮下注射1％角叉菜胶50μL致炎，玻璃容积法测量致炎前及致炎后1、3和5h足容积，计算肿胀度和各组的肿胀抑制率。结果各固公果根提取物（实施例3制备）于致炎后1h与对照组比较均有显著性差异，致炎后3h和5h，高剂量组与对照组比较仍具有显著性差异，且与阳性药阿司匹林组作用相当，提示固公果根提取物对角叉菜胶所致大鼠足肿胀有明显抑制作用，具有显著抗炎作用。结果见表2。

表2固公果根提取物对角叉菜胶所致大鼠足肿胀的影响

与对照组比较，^aP<0.01，t检验(n=8)；EV：肿胀程度；EI：肿胀抑制率。

实施例15固公果根提取物对葡聚糖硫酸钠致大鼠实验性结肠病作用

实验方法：

（1）葡聚糖硫酸钠（dextran sulfate sodium，DSS）溶于蒸馏水配制成3%DSS(W/V)水溶液，即配即用。48只大鼠随机分为6组：正常对照组、模型组、固公果根提取物（实施例3制备）高、中、低剂量组(100、50、25mg／kg)和阳性药物组（柳氮磺嘧啶组，220mg/kg)，每组各8只。除正常对照组外，上述各组大鼠均给予3%DSS溶液自由饮用，造模开始分别按上述剂量灌胃给药，正常组和模型组给予等量体积生理盐水。记录每天每只大鼠DSS的应用量，确保各组DSS饮用量大致相等。每日观察大鼠一般状态和体重变化，观察粪便性状改变及便血情况，根据Cooper HS评分标准，进行疾病活动指数(Disease activity index，DAI)评分，评估大鼠结肠粘膜炎症损伤情况。评分标准：体质量不下降者记0分，下降1%～5%为1分，下降5%～10%为2分，下降10%～15%为3分，下降>15%为4分；大便正常为0分，松散为2分，稀便为4分；大便潜血正常为0分，弱阳性为1分，阳性为2分，强阳性为3分，肉眼血便为4分。实验进行8d后，处死大鼠，取下结肠，4%中性福尔马林固定，石蜡包埋切片后进行HE染色，镜下观察肠黏膜损伤情况，根据Cooper HS评分标准，观察15个放大100倍视野，取平均值，观察组织学损伤评分。评分标准：正常结肠黏膜者为0分；结肠隐窝腺体丢失三分之一者为1分；隐窝腺体丢失三分之二者为2分；若隐窝腺体全部丢失，黏膜上皮完整，伴有轻度炎性细胞浸润者为3分；黏膜上皮糜烂、破坏，伴有明显炎性细胞浸润者为4分。

实验结果：

正常对照组大鼠活动自如，反应灵敏，大便正常，毛色光泽，体重增加；模型组大鼠饮用3%DSS8d后出现稀便、血便或脓血便、大便潜血实验阳性，体重减轻，活动进食均减少；各给予固公果根提取物组和阳性药物组大鼠状况好于模型组，其腹泻、便血症状较模型组明显减轻。DAI评分显示模型组组大鼠DAI升高，与正常对照组相比，具有统计学意义(P<0．05)，阳性药物组和固公果根提取物各组DAI评分明显降低，与模型组相比，差异具有统计学意义(P<0.05)。

光镜下观察正常组大鼠结肠黏膜完整连续，腺体排列规则整齐，无炎细胞浸润和溃疡形成。而模型组大鼠结肠充血水肿，粘膜丧失，糜烂、溃疡、出血，腺体排列紊乱，可见大量炎细胞浸润，说明造模成功。阳性药物组和固公果根提取物各组症状改善明显，结肠黏膜较完整，有轻度充血水肿和少量炎细胞浸润，肠腺体排列基本规则，组织学评分示，各治疗组组织学评分显著低于模型组，差异具有统计学意义(P<0.05)。上述实验结果说明固公果根提取物能够明显抑制葡萄酸葡聚糖硫酸钠致大鼠实验性结肠病。

表3各实验组DAI评分和组织学评分比较（n=8，x±s）

注：与正常组比较，a为P<0.05；与模型组比较，b为P<0.05

（2）免疫组化法检测NF—κBp65活性

常规梯度脱水，石蜡包埋切片，脱蜡水化，过氧化氢灭活内源性酶，PBS冲洗，枸橼酸盐缓冲液热抗原修复，PBS冲洗，加一抗NF-κB，稀释度为1:100，PBS作为阴性对照，4℃湿盒过夜。PBS洗涤后，加入生物素化羊抗兔IgG二抗，37℃，30min，PBS洗涤，DAB显色，常规脱水、封片。结果判断：细胞质或细胞核中呈棕黄色为阳性，每张切片取5个不连续20倍视野，计算阳性细胞数，取平均值。实验结果见表4。

（3）ELISA法检测TNF-α、PGE2和IL-4的表达水平。

摘取结肠组织匀浆离心后，采用酶联免疫吸附法，严格按照试剂盒说明，检测细胞因子TNF-α、PGE2和IL-4的水平。实验结果见表4。

实验结果：

模型组TNF-α和PGE2水平升高，与正常组相比有统计学差异(P<0.05)。阳性药物组和固公果根提取物（实施例3制备）各组TNF-α和PGE2水平与模型组相比显著下降(P<0.05)，其中TNF-α水平随着给药剂量的增加逐渐降低，呈剂量效应关系。各治疗组IL-4水平略有升高趋势。结果见表4。

正常组大鼠结肠粘膜仅微弱表达或不表达NF-κBp65。而模型组中NF-κBp65呈棕褐色颗粒状表达于细胞胞核和细胞质中，其阳性药物组细胞数显著高于正常对照组，二者相比，差异具有统计意义(P<0.05)。各治疗组NF-κBp65表达均减少，阳性药物组和固公果根提取物高、中剂量组降低最明显，与模型组相比，差异具有统计学意义(P<0.05)。而固公果根提取物低剂量组略有降低。详情见表4。上述实验结果说明固公果根提取物能够明显抑制葡萄酸葡聚糖硫酸钠致大鼠实验性结肠病，并且能够提供机体的自身免疫能力，对抗炎症性肠病的发生。

表4结肠组织IL-4、TNF-α、PGE2和NF-κBp65的含量比较（n=8，x±s）

注：与正常组比较，a为P<0.05；与模型组比较，b为P<0.05

实验证明：实施例4-实施例13所获得的固公果根提取物抗炎药效与实施例3的效果相似。其对葡聚糖硫酸钠致大鼠实验性结肠病作用与实施例3的效果相似。综上所述表明：实施例3-13的固公果根提取物可以对抗炎症性肠病的发生。

按常规方法将固果根提取物制备成硬胶囊剂、软胶囊剂、散剂、颗粒剂、片剂、丸剂、蜜膏剂、口服液、栓剂、酒剂或注射剂的剂型，可以方便药物的使用。

Claims (2)

1.固公果根提取物在制备治疗炎症性肠病的药物的应用；所述固公果根提取物是用下述方法制成： 

（1）采用下述方法之一进行提取： 

方法一：以质量比为1：4－8的比例，将原料固公果根加入到pH为2－3的酸性水溶液中，在60－80℃浸泡提取6－8小时，提取2－3次，过80－120目筛，得提取液； 

方法二：以质量比为1：4－8的比例，将原料固公果根加体积百分比浓度为10%－60%的pH为2－3的乙醇酸性水溶液或体积百分比浓度为10%－60%的pH为2－3的甲醇酸性水溶液中，在60－80℃浸泡提取6－8小时，提取2－3次，过80－120目筛，得提取液，在温度30－50℃，真空度为0.06－0.08MPa减压浓缩至糖度2－10，得到提取物，将所述提取物以质量比为1：1－5的比例分散至水中； 

（2）将所述步骤（1）获得的产物经大孔树脂吸附，用水及体积百分比浓度为30%－60%的乙醇水溶液洗脱，或水及体积百分比浓度为30%－60%的甲醇水溶液洗脱，洗脱体积为2－5倍柱床体积，弃水洗脱液；收集醇洗脱液，洗脱液在温度30－60℃，真空度为0.06－0.08MPa减压浓缩，得糖度为10－40的浓缩物，干燥，得到固公果根中治疗炎症性肠病的有效部位。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征是所述酸为盐酸、硫酸、冰醋酸、磷酸或甲酸。

3. 根据权利要求1所述的应用，其特征是所述大孔树脂的型号为AB-8型、HP20型、HPD100型、HPD100A型、HPD300型、X-5型、NKA-Ⅱ型、D101型或DA201型。

4. 根据权利要求1-3之一所述的应用，其特征是所述固公果根提取物的剂型为硬胶囊剂、软胶囊剂、散剂、颗粒剂、片剂、丸剂、蜜膏剂、口服液、栓剂、酒剂或注射剂。