CN103109797A - 壳聚糖纳米粒、防治甜菜夜蛾的生物农药制剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种由以下重量百分比的原料组成的壳聚糖纳米粒：壳聚糖0.5-5%、助溶剂1-10%、防冻剂0-5%、表面活性剂0.1-1%、乳化剂0.1-0.5%、缓冲液40-60%、余量为水。还提供了一种防治甜菜夜蛾的生物农药制剂及其制备方法，其主要由以下重量百分比的成分组成：（A）0.05-15%的有效成分:针对甜菜夜蛾高效致死靶基因设计合成siRNA，所述siRNA为15-50nt的双链RNA、(B)19.95-55%溶剂、（C）30-80%所述的壳聚糖纳米粒。所述壳聚糖纳米粒使生物农药制剂的稳定性、防治甜菜夜蛾效果更好。

Description

壳聚糖纳米粒、防治甜菜夜蛾的生物农药制剂及其制备方法

技术领域

本发明属于农用杀虫剂技术领域，具体涉及一种生物农药制剂及其制备方法，特别一种壳聚糖纳米粒、含有双链核糖核酸的防治甜菜夜蛾的生物农药制剂及其制备方法。

技术背景

甜菜夜蛾(Spodoptera exigua(Hubner))，又名白菜褐夜蛾，玉米叶夜蛾，属鳞翅目夜蛾科，是一种世界性的多食性、暴食性害虫。甜菜夜蛾除为害粮食作物外，还危害蔬菜、棉、麻、烟草、苜蓿及多种杂草，寄主植物达170种。其中危害最严重的有甘蓝、甜菜、白菜、大葱、苋菜、芹菜、花椰菜等。目前，我国20余个省、市、自治区都有甜菜夜蛾的发生危害。甜菜夜蛾在我国华北地区的危害期为7-9月的高温季节，一般可造成作物减产15%左右，严重者可减产40%，更有甚者达80%以上。1999年甜菜夜蛾在我国黄淮部分地区大面积发生，仅山东省发生面积就达100万hm2以上，造成直接经济损失70多亿人民币。

近年来，防治甜菜夜蛾的措施主要包括：加强预测，为大面积适时防治提供依据；农业防治，清洁田园，破坏甜菜夜蛾生存环境；诱杀成虫，干扰或者减少甜菜夜蛾成熟雄虫与雌虫完成交配，压低下一代害虫虫口密度，可达到减轻其发生危害的目标；生物防治，大力推广应用生物制剂，如性诱剂和甜菜夜蛾核型多角体病毒；保护和利用天敌，充分发挥田间自然生态的控制作用，如白僵菌、绿僵菌、姬蜂等；药剂防治，田间喷施茚虫威、甲氧虫酰肼、拟除虫菊酯类药物可防治甜菜夜蛾病情的蔓延。目前对甜菜夜蛾的防治主要以化学药物控制为主，但是连续喷施化学药物致使抗性问题越来越突出，同时化学药物的残留问题不仅影响环境，并且引发严重食品安全问题。所以，研究高效、绿色、环保、可持续发展农药制剂已是农业生产中非常重要的研究课题。

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指外源或者内源的双链RNA特异性地引起基因沉默的现象，目前被广泛用于鳞翅目害虫基因功能研究。如：Z.-X.Yang等用微注射的方法导入cadherin基因的dsRNA,导致该虫的死亡率和性别比率增加，并且幼虫期出现滞育现象。通过饲喂的方法，导入甜菜夜蛾细胞色素P450（CYP6BG1）基因的dsRNA，致使该虫对除虫菊脂类农药的抗性降低。此外，通过将虫体浸泡在dsRNA溶液中引发基因沉默也是实验室常用的有效手段。RNA干扰技术在鳞翅目害虫防治方面取得的突破性进展为甜菜夜蛾的防治奠定了理论基础，提供了一种新的甜菜夜蛾防治策略，开辟了作物保护新局面。

虽然基因沉默技术开启了甜菜夜蛾防治的新篇章，该技术手段对甜菜夜蛾的杀灭作用已被证明，但是目前大量的尝试仅限于实验室范围，还未实现实际操作应用，基于RNAi的生物农药制剂还未见报道。限制该技术广泛应用的因素主要是：（一）没有开发出能增强dsRNA有效成分稳定性、维持其杀虫效果、适合规模化应用的成熟稳定的先进农药制剂；（二）没有探究出简单便捷、具可操作性的规模化生产工艺。

先进农药制剂的标志是高效、环境友好和控释。高效取决于有效成分本身和它在剂型中的微粒尺寸，尺寸越小，表面积越大，效率就越高。水基化农药制剂如水剂、乳化剂、水乳剂、悬浮剂、悬乳剂等被认为是环境友好剂型，其农药的微粒尺寸由纳米到微米依次增大，但都不具有控释作用。为了减小农药的尺寸和实现缓释，文献报到将农药制成纳米晶粒，或者在纳米粒外部用合成高分子涂敷，或将液体农药包括成微胶囊，以及用多入口旋涡混合器将联苯菊酯制成纳米颗粒，用海藻酸钠和壳聚糖通过层层组装将吡虫啉包裹等，但这些方法烦琐，并不简单，不易进行大规模生产。

壳聚糖纳米粒作为一种新型药物载体，在医学上已成为国内外研究开发的热点。邬思辉（2009）等将壳聚糖制成纳米粒负载胰岛素，控制药物释放、延长药物疗效、降低药物毒副作用，可以提高疏水性药物对细胞膜的通透性和药物稳定性及改变给药途径，还可以加强制剂的靶向给药能力。刘慧（2007）等研究壳聚糖纳米粒的制备并检测其性能，希望得到一种能在黏膜给药体系应用的药物载体，从而实现抗菌药物的持续释放，达到长期疗效的目标。苏丹（2007）等以壳聚糖纳米粒为载体负载siRNA穿过细胞膜，进入细胞质中的RNAi通路，为人类疾病发生机理、疾病基因治疗靶点的鉴别以及新药研发如小分子化合物和抗体类药物的发现提供理论依据，但其研究仅适合医学而不使用于农药研究。壳聚糖纳米粒在医学上的应用已多有报道，但是在农业上的应用报道还不多见。林春梅（2009）等利用壳聚糖带阳离子的特性，使其与带阴离子的三聚磷酸钠发生离于交联，包裹部分阿维菌素颗粒后形成纳米载药颗粒。赵书言（2009）等用壳聚糖纳米粒包埋尿素，使得尿素的释放速度减慢，增强缓释效果。冯博华（2009）等以蓖麻油酸钠和壳聚糖为原料制备纳米粒子包裹鱼藤酮、印楝素植物源农药，避免了大量有机溶剂和助剂的使用。李敏（2011）等通过过氧化氢降解壳聚糖制备低聚物，以吡虫啉、毒死蜱为模型药物，研究纳米粒子的理化性质及不同制备方法形成机理。张子勇（2012）等以壳聚糖和羧甲基壳聚糖为载体，制备印楝素纳米粒子水分散液。尽管上述报道成功制备了农药壳聚糖纳米粒制剂，但是其研发均处于探究阶段，所制备的纳米粒尺寸、粒径分布、药物负载率等理化指标均不稳定，未实现标准化水平，其次工艺烦琐，不易实现规模生产，所以至今局限于实验室研究，并未见转化为产品制剂流通市场。此外，目前成功报道的农药壳聚糖制剂包埋的农药有效成分多为现存化学农药，分子量小，技术操作相对简单。

本发明基于上述现状，发明出首例基于基因沉默技术的防治甜菜夜蛾的生物农药制剂，同时利用一种简捷、规模化的制备方法，研制出适用于有效成分dsRNA大分子的壳聚糖纳米粒助剂。本发明生物农药制剂不仅能高效防治甜菜夜蛾，而且能体外保持dsRNA稳定性，增强其杀虫效果。本发明制剂是一种高效、环境友好和控释的先进农药制剂。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种适用于生物农药制剂的有效成分siRNA的大分子的壳聚糖纳米粒。

实现上述目的的技术方案如下：

一种壳聚糖纳米粒，其由以下重量百分比的原料组成：

壳聚糖0.5-5%、助溶剂1-10%、防冻剂0-5%、表面活性剂0.1-1%、乳化剂0.1-0.5%、缓冲液40-60%、余量为水。

壳聚糖纳米粒中的助溶剂用于增加壳聚糖的溶解性，优选地，为聚乙二醇200、聚乙二醇400、乙醇、丙二醇中的一种或者几种混合物。

壳聚糖纳米粒中的防冻剂用于保护制剂成分免于低温造成的物理损害，优选地，所述防冻剂为丙三醇、乙二醇、异丙醇、二甘醇中的一种或者几种混合物。

壳聚糖纳米粒中的表面活性剂用于降低了溶液的表面张力，增强了制剂在植物或害虫体表的润湿、展布以及附着力，从而提高药效。优选地，所述表面活性剂为吐温20、吐温40、吐温60、吐温80中的一种或者几种混合物。

壳聚糖纳米粒中的乳化剂用于提高胶溶、乳化、分散、交联，优选地，所述乳化剂为三聚磷酸钠、农乳400#（苄基二甲基酚聚氧乙烯醚）、农乳500#（烷基苯磺酸钙）、农乳600#（苯乙基酚聚氧乙烯醚）、农乳700#（烷基酚聚氧乙烯醚甲醛缩聚物）、农乳1600#（苯乙基酚聚氧乙烯聚氧丙烯醚）、NP系列磷酸酯（壬基酚聚氧乙烯醚磷酸酯）、苯乙基聚氧乙烯醚硫酸铵盐、烷基联苯醚二磺酸镁盐中的一种或者几种混合物。

壳聚糖纳米粒中的缓冲液用于制剂酸碱调节、增加助剂溶解性。优选地，所述缓冲液为醋酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液或柠檬酸盐缓冲液的一种或者几种混合物。

所述壳聚糖纳米粒是有别于现存纳米粒的可以包裹大分子的农用纳米粒，其粒径为100-600nm。

本发明的另一个目的是提供一种防治鳞翅目害虫甜菜夜蛾的生物农药制剂，该生物农药制剂可有效控制甜菜夜蛾，是可持续发展的绿色农药。

具体方案如下：

一种防治甜菜夜蛾的生物农药制剂，其主要由以下重量百分比的成分组成：

（A）0.05-15%的有效成分:针对甜菜夜蛾高效致死靶基因设计合成siRNA，所述siRNA为15-50nt（更优选为17-25nt）的双链RNA、

（B）19.95-55%用于溶解有效成分双链核糖核酸的溶剂、

（C）上述30-80%壳聚糖纳米粒。

所述有效成分双链核糖核酸，是，通过基因沉默机制杀灭有害昆虫。

优选地，所述甜菜夜蛾高效致死靶基因为钙粘蛋白基因、肌动蛋白基因、细胞色素P450基因、G-蛋白偶联受体基因。更优选地，所述siRNA为选自针对钙粘蛋白基因的双链核糖核酸为SEQ ID NO.1及SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3及SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.6；针对肌动蛋白基因的双链核糖核酸为SEQ ID NO.7及SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9及SEQ ID NO.10中；针对细胞色素P450基因的双链核糖核酸为SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16；和针对G-蛋白偶联受体基因的双链核糖核酸为SEQ ID NO.17及SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19及SEQ ID NO.20、SEQ IDNO.21及SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28中的一对或多对。

所述有效成分双链核糖核酸核苷酸数为15-50nt、分子量为8000-40000。在其中一个实施例中，所述siRNA的3’末端设有悬挂碱基。

所述溶剂用于溶解有效成分双链核糖核酸，优选地，所述溶剂为甲醇、二甲亚砜、水、Tris缓冲液中一种或者几种混合物。

本发明的另一目的是提供了一种上述防治甜菜夜蛾的生物农药制剂的制备方法。

具体技术方案如下：

一种上述防治甜菜夜蛾的生物农药制剂的制备方法，包括以下步骤：

（A）溶解：称取所述siRNA，（优选在800-3000r/min的转速下）溶于溶剂，（优选搅拌5-60min），使双链核糖核酸充分溶解；

（B）壳聚糖纳米粒制备：

1）准确称取壳聚糖、助溶剂和防冻剂，加入到缓冲液中，（优选800-3000r/min）搅拌使其充分溶解，得溶液1；

2）将上述溶液（优选以3000-10000rpm）离心（优选10-60min），取上清，加入表面活性剂，充分搅拌，混匀，得溶液2；

3）将乳化剂用水溶解后（优选以10-30ml/min的速度）加入步骤2）溶液2中，混匀后即得壳聚糖纳米粒；

（C）制剂制备：将步骤（A）中所得溶液与步骤（B）所述的壳聚糖纳米粒均匀混合，后继续搅拌即得均一稳定的双链核糖核酸生物农药制剂。

按照上述方法制备的壳聚糖纳米粒及生物农药制剂的粒径分布、药物负载率等理化指标均比较稳定，可进行标准化水平生产。

与现存技术相比，本发明有以下创新点：

第一、本发明农药制剂的载体为壳聚糖纳米粒，是有别于现存纳米粒的可以包裹大分子的农用纳米粒。由于有效成分为双链核糖核酸，平均分子量均在8000-40000之间，分子量大，在壳聚糖纳米粒制备中需要更高的技术来符合大分子有效成分的包埋，所以本发明壳聚糖纳米粒与现存包埋小分子化学农药的纳米粒存在本质区别。

第二、本发明为双链核糖核酸的壳聚糖纳米粒制剂，较以往专利中所涉双链核糖核酸与阳离子化合物的简单配伍物，更有利于提高有效成分稳定性，保持更高的害虫防治效果。

第三、本发明是首例基于基因沉默技术的小菜蛾生物防治剂，在世界范围内属首例剂型成熟的双链核糖核酸农药。基于其特殊杀灭害虫的机制，该制剂是一种环保、绿色、健康的生物农药制剂。

第四、本发明具有一套成熟、简便、工业化操作的工艺流程，所涉生产步骤规范、标准，生产出的纳米粒生物农药制剂的理化性质等指标均为优化标准，易实现工业化大规模操作，利用该制备方法可突破实验室操作规模，实现农药纳米制剂产品的市场化。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明的方法进行说明，但本发明并不限于此。

实施例一

本实施例特别提供了以甜菜夜蛾钙粘蛋白基因双链核糖核酸序列为有效成分的壳聚糖纳米粒生物制剂的制备及其效果研究。

（一）针对甜菜夜蛾钙粘蛋白基因双链核糖核酸原药成分的设计和合成

GeneBank登录号：HM116243.1

Si-Cadherin_001：靶基因TGATG AACTC ACATT CGAA

正义链(5'-3')：5'UGAUG AACUC ACAUU CGAA dTdT3' SEQ ID NO.1

反义链(3'-5')：3'dTdT ACUAC UUGAG UGUAA GCUU5' SEQ ID NO.2

Si-Cadherin_002：ACTGC GTTTA GAAAA CTTT

正义链(5'-3')：5'ACUGC GUUUA GAAAA CUUU dTdT3' SEQ ID NO.3

反义链(3'-5')：3'dTdT UGACG CAAAU CUUUU GAAA5' SEQ ID NO.4

Si-Cadherin_003：CGAAG CCCTT TCAAC GACC

正义链(5'-3')：5'CGAAG CCCUU UCAAC GACC dTdT3' SEQ ID NO.5

反义链(3'-5')：3'dTdT GCUUC GGGAA AGUUG CUGG5' SEQ ID NO.6

上述序列的3’末端设有dTdT的悬挂碱基。按照上述序列设计和合成双链核糖核酸并冷冻干燥成原药粉末。

（二）0.05%双链核糖核酸生物农药制剂的制备

1有效成分溶解：分别称取500mg上述双链核糖核酸，溶于199.5g水中，800r/min搅拌使其充分溶解；

2壳聚糖纳米粒制备

以聚乙二醇200做助溶剂、丙三醇做防冻剂、吐温20做表面活性剂、三聚磷酸钠做乳化剂、磷酸盐缓冲液做缓冲液制备壳聚糖纳米粒。其中壳聚糖、助溶剂、防冻剂、表面活性剂、乳化剂、缓冲液重量百分比为分别5%、10%、5%、1%、0.5%、60%制备壳聚糖纳米粒，余量为水。

（1）称取壳聚糖40g、聚乙二醇20080g、丙三醇40g，溶于480g磷酸盐缓冲液，800r/min转速下搅拌12h，使壳聚糖充分溶解；

（2）将步骤（1）所得溶液在3000r/min下离心10min，取上清，加入8g吐温20，充分搅拌混合均匀；

（3）称取4g三聚磷酸钠溶于156g水中，充分搅拌，然后与步骤（2）所得溶液混合均匀，即得壳聚糖纳米粒，粒径100-600nm。

3制剂制备：将步骤1中有效成分溶液与步骤2所得壳聚糖纳米粒溶液均匀混合，即得。

按照上述方法制备的壳聚糖纳米粒及生物农药制剂的粒径分布、药物负载率等理化指标均比较稳定，可进行标准化水平生产。

（三）0.05%双链核糖核酸生物农药制剂的防治效果

将0.05%生物农药制剂稀释至100mg/L，均匀喷施在接有甜菜夜蛾幼虫的甘蓝盆栽上，每盆喷施5ml，每处理重复三次，72h后统计出现蜕皮未尽症状或者统计死亡率。结果如下表所示。

表 针对甜菜夜蛾钙粘蛋白基因设计合成的双链核糖核酸为有效成分的生物制剂对甜菜夜蛾的防治效果

双链核糖核酸	死亡率（%）
		Si-Cadherin_001	67.32
Si-Cadherin_002	71.00
		Si-Cadherin_003	58.67
CK1	60.22
		CK2	43.67
CK3	14.00

其中CK1为0.05wt%Si-Cadherin_001双链核糖核酸+阳离子聚合物壳聚糖；CK2为0.05wt%Si-Cadherin_001双链核糖核酸+阳离子聚合物聚赖氨酸；CK3为DEPC水。

根据上述生物农药制剂的成分和制备方法，制备浓度为15wt%的双链核糖核酸生物农药制剂（其中，所述壳聚糖纳米粒为35%，水为50%），将15%生物农药制剂稀释至100mg/L，均匀喷施在接有甜菜夜蛾幼虫的甘蓝盆栽上，每盆喷施5ml，每处理重复三次，72h后观察防治效果，结果如下：

双链核糖核酸	死亡率（%）
		Si-Cadherin_001	70.21
Si-Cadherin_002	73.67
		Si-Cadherin_003	55.34
CK1	61.50
		CK2	44.22
CK3	13.55

其中CK1为15wt%Si-Cadherin_001双链核糖核酸+阳离子聚合物壳聚糖；CK2为15wt%Si-Cadherin_001双链核糖核酸+阳离子聚合物聚赖氨酸；CK3为DEPC水。

实施例二

本实施例特别提供了针对甜菜夜蛾肌动蛋白基因双链核糖核酸序列为有效成分的壳聚糖纳米粒生物制剂的制备及其效果研究。

（一）针对甜菜夜蛾肌动蛋白基因双链核糖核酸原药成分的设计和合成

GenBank：AY507963.1

Si-actin_001：ACTTG GCTGG TCGCG ACTTG

正义链(5'-3')：5'ACUUG GCUGG UCGCG ACUUG dTdT3' SEQ ID NO.7

反义链(3'-5')：3'dTdT UGAAC CGACC AGCGC UGAAC5' SEQ ID NO.8

Si-actin_002：ACAAC TCCAT CATGA AGTGT

正义链(5'-3')：5'ACAAC UCCAU CAUGA AGUGU dTdT3' SEQ ID NO.9

反义链(3'-5')：3'dTdT UGUUG AGGUA GUACU UCACA5' SEQ ID NO.10

上述序列的3’末端设有dTdT的悬挂碱基。按照上述序列设计和合成双链核糖核酸并冷冻干燥成原药粉末。

（二）15%双链核糖核酸生物农药制剂的制备

1有效成分溶解：称取150g上述双链核糖核酸，溶于350g甲醇，2000r/min搅拌使其充分溶解；

2壳聚糖纳米粒制备

以聚乙二醇400做助溶剂、乙二醇做防冻剂、吐温40做表面活性剂、农乳500#做乳化剂、醋酸盐缓冲液做缓冲液制备壳聚糖纳米粒。其中壳聚糖、助溶剂、防冻剂、表面活性剂、乳化剂、缓冲液重量百分比为分别2%、4%、3%、0.5%、0.5%、45%制备壳聚糖纳米粒，余量为水。

（1）称取壳聚糖10g、聚乙二醇40020g、乙二醇15g，溶于225g醋酸盐缓冲液（pH4-5），1000r/min转速下搅拌24h，使壳聚糖充分溶解；

（2）将步骤（1）所得溶液在2500r/min下离心5min，取上清，加入2.5g吐温40，充分搅拌混合均匀；

（3）称取2.5g农乳500#溶于225g水中，充分搅拌，后与步骤（2）所得溶液混合均匀，即得壳聚糖纳米粒，粒径100-600nm。

3制剂制备：将步骤1中有效成分溶液与步骤2所得壳聚糖纳米粒溶液均匀混合，即得。

按照上述方法制备的壳聚糖纳米粒及生物农药制剂的粒径分布、药物负载率等理化指标均比较稳定，可进行标准化水平生产。

（三）15%双链核糖核酸生物农药制剂的防治效果

将15%生物农药制剂稀释至100mg/L，均匀喷施在接有甜菜夜蛾幼虫的甘蓝盆栽上，每盆喷施5ml，每处理重复三次，72h后统计出现蜕皮未尽症状或者。结果如下表所示。

表 以甜菜夜蛾肌动蛋白基因设计合成的双链核糖核酸为有效成分的生物制剂对甜菜夜蛾的防治效果

双链核糖核酸	出现症状或者死亡率（%）
		Si-actin_001	78.53
Si-actin_002	73.44
		CK1	70.25
CK2	68.72
		CK3	28.50

其中CK1为15wt%Si-actin_002双链核糖核酸+阳离子聚合物壳聚糖；CK2为15wt%Si-actin_002双链核糖核酸+阳离子聚合物聚赖氨酸；CK3为DEPC水。

根据上述生物农药制剂的成分和制备方法，制备浓度为1wt%的双链核糖核酸生物农药制剂（其中，所述壳聚糖纳米粒为74%，甲醇为25%），将其稀释至100mg/L，均匀喷施在接有甜菜夜蛾幼虫的甘蓝盆栽上，每盆喷施5ml，每处理重复三次，72h后观察防治效果，结果如下：

表 以甜菜夜蛾肌动蛋白基因设计合成的双链核糖核酸为有效成分的生物制剂对甜菜夜蛾的防治效果

双链核糖核酸	出现症状或者死亡率（%）
		Si-actin_001	77.50
Si-actin_002	72.31
		CK1	69.89
CK2	65.78
		CK3	30.50

其中CK1为1wt%Si-actin_002双链核糖核酸+阳离子聚合物壳聚糖；CK2为1wt%Si-actin_002双链核糖核酸+阳离子聚合物聚赖氨酸；CK3为DEPC水。

实施例三

本实施例特别提供了针对甜菜夜蛾细胞色素P450基因双链核糖核酸序列为有效成分的壳聚糖纳米粒生物制剂的制备及其效果研究。

（一）针对甜菜夜蛾细胞色素P450基因双链核糖核酸原药的设计和合成

GenBank：HQ340240.1

Si-C_001：TTCCA AAAGA CAGGT TT

正义链(5'-3')：5'UUCCA AAAGA CAGGU UU dTdT3' SEQ ID NO.11

反义链(3'-5')：3'dTdT AAGGT UUUCU GUCCA AA5' SEQ ID NO.12

Si-C_002：CTCCA CGTTA AGTCC AG

正义链(5'-3')：5'CUCCA CGUUA AGUCC AG dTdT3' SEQ ID NO.13

反义链(3'-5')：3'dTdT GAGGU GCAAU UCAGG UC5' SEQ ID NO.14

Si-C_003：TCTCC GATTA TGGCC AC

正义链(5'-3')：5'UCUCC GAUUA UGGCC AC dTdT3' SEQ ID NO.15

反义链(3'-5')：3'dTdT AGAGG CUAAU ACCGG UG5' SEQ ID NO.16

上述序列的3’末端设有两个TT的悬挂碱基。按照上述序列设计和合成双链核糖核酸并冷冻干燥成原药粉末。

（二）5%双链核糖核酸生物农药制剂的制备

1有效成分溶解：称取50g双链核糖核酸，溶于550g二甲亚砜中，3000r/min搅拌使其充分溶解；

2壳聚糖纳米粒的制备

以异丙醇做防冻剂、聚乙二醇200做助溶剂、吐温60做表面活性剂、农乳700#做乳化剂、柠檬酸盐缓冲液做缓冲液制备壳聚糖纳米粒。其中壳聚糖、助溶剂、防冻剂、表面活性剂、乳化剂、缓冲液重量百分比为分别1%、1%、1%、0.1%、0.1%、40%制备壳聚糖纳米粒，余量为水。

（1）称取壳聚糖4g、聚乙二醇2004g、异丙醇4g，溶于160g柠檬酸盐缓冲液，1000r/min转速下搅拌24h，使壳聚糖充分溶解；

（2）将步骤（1）所得溶液在2500r/min下离心5min，取上清，加入0.4g吐温60，充分搅拌混合均匀；

（3）称取0.4g农乳700#溶于227.2g水中，充分搅拌，后与步骤（2）所得溶液混合均匀，即得壳聚糖纳米粒，粒径100-600nm。

3制剂制备：将步骤1中有效成分溶液与步骤2所得壳聚糖纳米粒溶液均匀混合，即得。

按照上述方法制备的壳聚糖纳米粒及生物农药制剂的粒径分布、药物负载率等理化指标均比较稳定，可进行标准化水平生产。

（三）5%双链核糖核酸生物农药制剂的防治效果

将5%生物农药制剂稀释至100mg/L，均匀喷施在接有甜菜夜蛾幼虫的甘蓝盆栽上，每盆喷施5ml，每处理重复三次，48h后统计死亡率。结果如下表所示。

表 针对甜菜夜蛾细胞色素P450基因设计合成的双链核糖核酸为有效成分的生物制剂对甜菜夜蛾的防治效果

双链核糖核酸	死亡率（%）
		Si-C_001	65.34
Si-C_002	67.85
		Si-C_003	67.33
CK1	59.68
		CK2	55.43
CK3	28.74

其中CK1为5WT%Si-G_001双链核糖核酸+阳离子聚合物壳聚糖；CK2为5WT%Si-G_001双链核糖核酸+阳离子聚合物聚赖氨酸；CK3为DEPC水。

根据上述生物农药制剂的成分和制备方法，制备浓度为10wt%的双链核糖核酸生物农药制剂（其中，所述壳聚糖纳米粒为35%，二甲亚砜为55%），将其稀释至100mg/L，均匀喷施在接有甜菜夜蛾幼虫的甘蓝盆栽上，每盆喷施5ml，每处理重复三次，48h后观察其防治效果，结果如下：

表 针对甜菜夜蛾细胞色素P450基因设计合成的双链核糖核酸为有效成分的生物制剂对甜菜夜蛾的防治效果

双链核糖核酸	死亡率（%）
		Si-C_001	64.50
Si-C_002	66.87
		Si-C_003	67.45
CK1	58.55
		CK2	54.67

CK3

25.93

其中CK1为10WT%Si-G_001双链核糖核酸+阳离子聚合物壳聚糖；CK2为10WT%Si-G_001双链核糖核酸+阳离子聚合物聚赖氨酸；CK3为DEPC水。

实施例四

本实施例特别提供了针对甜菜夜蛾G-蛋白偶联受体基因双链核糖核酸序列为有效成分的壳聚糖纳米粒生物制剂的制备及其效果研究。

（一）针对甜菜夜蛾G-蛋白偶联受体基因核糖核酸原药的设计和合成：

GenBank:GU784861.1

Si-G_001：GGGAT ACGAC CAGCC TTTGC

正义链(5'-3')：5'GGGAU ACGAC CAGCC UUUGC dTdT3' SEQ ID NO.17

反义链(3'-5')：3'dTdT CCCUA UGCUG GUCGG AAACG5' SEQ ID NO.18

Si-G_002：GCTGC CATCC ACGTT CTACA

正义链(5'-3')：5'GCUGC CAUCC ACGUU CUACA dTdT3' SEQ ID NO.19

反义链(3'-5')：3'dTdT CGACG GUAGG UGCAA GAUGU5' SEQ ID NO.20

Si-G_003：AGTGC GCTGC TACCA ACGTG

正义链(5'-3')：5'AGUGC GCUGC UACCA ACGUG dTdT3' SEQ ID NO.21

反义链(3'-5')：3'dTdT UCACG CGACG AUGGU UGCAC5' SEQ ID NO.22

Si-G_004：ATTTT ATGTT ATGCT AGAAT

正义链（5'-3'）：5'AUUUU AUGUU AUGCU AGAAU dTdT3' SEQ ID NO.23

反义链（3'-5'）：3'dTdT UAAAA UACAA UACGA UCUUA5' SEQ ID NO.24

Si-G_005：TCCAC GCCAT CGGAC ACAGA

正义链(5'-3')：5'UCCAC GCCAU CGGAC ACAGA dTdT3' SEQ ID NO.25

反义链(3'-5')：3'dTdT AGGUG CHHUA GCCUG UGUCU5' SEQ ID NO.26

Si-G_006：ATCCA TTTGC GATGC CATAT

正义链(5'-3')：5'AUCCA UUUGC GAUGC CAUAU dTdT3' SEQ ID NO.27

反义链(3'-5')：3'dTdT UAGGU AAACG CUACG GUAUA5' SEQ ID NO.28

上述序列的3’末端设有dTdT的悬挂碱基。按照上述序列设计和合成双链核糖核酸并冷冻干燥成原药粉末。

（二）5%生物农药制剂的制备

1、以Si-G_001基因siRNA为有效成分配置含有不同防冻剂的双链核糖核酸生物农药制剂

（1）有效成分溶解：称取50g Si-G_001双链核糖核酸溶于550g Tris缓冲液中，3000r/min搅拌使其充分溶解；

（2）壳聚糖纳米粒制备

分别以丙三醇、乙二醇、异丙醇、二甘醇、丙三醇+乙二醇、丙三醇+异丙醇+二甘醇做防冻剂剂，以聚乙二醇200做助溶剂、吐温40做表面活性剂、农乳400#做乳化剂、柠檬酸盐缓冲液做缓冲液制备壳聚糖纳米粒。其中壳聚糖、助溶剂、防冻剂、表面活性剂、乳化剂、缓冲液重量百分比分别为1%、1%、1%、0.1%、0.1%、40%制备壳聚糖纳米粒，余量为水。

1）称取壳聚糖4g、聚乙二醇2004g、防冻剂4g，溶于160g柠檬酸盐缓冲液（pH4-5），1000r/min转速下搅拌24h，使壳聚糖充分溶解；

2）将步骤1）所得溶液在2500r/min下离心5min，取上清，加入0.4g吐温40，充分搅拌混合均匀；

3）称取0.4g农乳400#溶于227.2g水中，充分搅拌，后与步骤2）所得溶液混合均匀，即得壳聚糖纳米粒，粒径100-600nm。

（3）制剂制备：将步骤（1）中有效成分溶液与步骤（2）所得壳聚糖纳米粒溶液均匀混合，即得。

按照上述方法制备的壳聚糖纳米粒及生物农药制剂的粒径分布、药物负载率等理化指标均比较稳定，可进行标准化水平生产。

（4）5%双链核糖核酸生物农药制剂对甜菜夜蛾的防效

将5%生物农药制剂稀释至100mg/L，均匀喷施在接有甜菜夜蛾幼虫的甘蓝盆栽上，每盆喷施5ml，每处理重复三次，48h后统计死亡率。结果如下表所示。

表 含不同防冻剂剂成分的生物农药制剂对甜菜夜蛾的防治效果

防冻剂	死亡率（%）
		丙三醇	55.94
乙二醇	56.33
		异丙醇	54.87

二甘醇	58.47
		丙三醇+乙二醇	49.96
丙三醇+异丙醇+二甘醇	57.73
		CK1	38.34
CK2	41.51
		CK3	24.50

其中CK1为5%有效成分双链核糖核酸+阳离子聚合物明胶，CK2为5%有效成分双链核糖核酸+阳离子聚合物壳聚糖，CK3为DEPC水。

2、以甜菜夜蛾乙酰胆碱酯酶基因Si-G_002基因双链核糖核酸为有效成分配置含有不同表面活性剂的双链核糖核酸生物农药制剂

（1）称取150g双链核糖核酸，溶于350g甲醇中，2000r/min搅拌使其充分溶解；

（2）壳聚糖纳米粒的制备

分别以吐温20、吐温40、吐温60、吐温80、吐温20+吐温60、吐温40+吐温60+吐温80、吐温20+吐温40+吐温60+吐温80为表面活性剂，以聚乙二醇400做助溶剂、乙二醇做防冻剂、农乳500#做乳化剂、磷酸盐缓冲液做缓冲液制备壳聚糖纳米粒。其中壳聚糖、助溶剂、防冻剂、表面活性剂、乳化剂、缓冲液重量百分比为分别2%、4%、3%、0.5%、0.5%、45%制备壳聚糖纳米粒，余量为水。

1）称取壳聚糖10g、聚乙二醇40020g、乙二醇15g，溶于225g磷酸盐缓冲液（pH4-5），1000r/min转速下搅拌24h，使壳聚糖充分溶解；

2）将步骤1）所得溶液在2500r/min下离心5min，取上清，加入2.5g表面活性剂，充分搅拌混合均匀；

3）称取2.5g农乳500#溶于225g水中，充分搅拌，后与步骤2）所得溶液混合均匀，即得。

（3）制剂制备：将步骤（1）中有效成分溶液与步骤（2）所得壳聚糖纳米粒溶液均匀混合，即得15%双链核糖核酸生物农药制剂。

按照上述方法制备的壳聚糖纳米粒及生物农药制剂的粒径分布、药物负载率等理化指标均比较稳定，可进行标准化水平生产。

（4）15%双链核糖核酸生物农药制剂对甜菜夜蛾的防效

将15%生物农药制剂稀释至100mg/L，均匀喷施在接有甜菜夜蛾幼虫的甘蓝盆栽上，每盆喷施5ml，每处理重复三次，48h后统计死亡率。结果如下表所示。

表 含不同表面活性剂成分的生物农药制剂对甜菜夜蛾的防治效果

表面活性剂	死亡率（%）
		吐温20	69.81
吐温40	72.34
		吐温60	71.62
吐温80	73.11
		吐温20+吐温60	68.94
吐温40+吐温60+吐温80	74.17
		吐温20+吐温40+吐温60+吐温80	72.56
CK1	62.65
		CK2	67.90
CK3	32.00

其中CK1为15%有效成分双链核糖核酸+阳离子聚合物明胶，CK2为15%有效成分双链核糖核酸+阳离子聚合物壳聚糖，CK3为DEPC水。

3、以甜菜夜蛾乙酰胆碱酯酶Si-G_003基因核糖核酸为有效成分配置含有不同乳化剂的双链核糖核酸生物农药制剂

（1）称取150g双链核糖核酸，溶于350g甲醇中，2000r/min搅拌使其充分溶解；

（2）壳聚糖纳米粒的制备

分别以三聚磷酸钠、农乳400#（苄基二甲基酚聚氧乙烯醚）、农乳500#（烷基苯磺酸钙）、农乳600#（苯乙基酚聚氧乙烯醚）、农乳700#（烷基酚聚氧乙烯醚甲醛缩聚物）、农乳1600#（苯乙基酚聚氧乙烯聚氧丙烯醚）、NP系列磷酸酯（壬基酚聚氧乙烯醚磷酸酯）、苯乙基聚氧乙烯醚硫酸铵盐、烷基联苯醚二磺酸镁盐、三聚磷酸钠+农乳400#、农乳500#+农乳600#、农乳400#+NP系列磷酸酯、NP系列磷酸酯+烷基联苯醚二磺酸镁盐、三聚磷酸钠+农乳1600#+NP系列磷酸酯、三聚磷酸钠+农乳1600#+NP系列磷酸酯+苯乙基、聚氧乙烯醚硫酸铵盐+烷基联苯醚二磺酸镁盐为乳化剂，以丙二醇做助溶剂、异丙醇做防冻剂、磷酸盐缓冲液做缓冲液制备壳聚糖纳米粒。其中壳聚糖、助溶剂、防冻剂、表面活性剂、乳化剂、缓冲液重量百分比分别为2%、4%、3%、0.5%、0.5%、45%制备壳聚糖纳米粒，余量为水。

1）称取壳聚糖10g、丙二醇40020g、异丙醇15g，溶于225g磷酸盐缓冲液（pH4-5），1000r/min转速下搅拌24h，使壳聚糖充分溶解；

2）将步骤1）所得溶液在2500r/min下离心5min，取上清，加入2.5g吐温40，充分搅拌混合均匀；

3）称取2.5g乳化剂溶于225g水中，充分搅拌，后与步骤2）所得溶液混合均匀，即得。

（3）制剂制备：将步骤（1）中有效成分溶液与步骤（2）所得壳聚糖纳米粒溶液均匀混合，即得15%双链核糖核酸生物农药制剂。

按照上述方法制备的壳聚糖纳米粒及生物农药制剂的粒径分布、药物负载率等理化指标均比较稳定，可进行标准化水平生产。

（4）15%双链核糖核酸生物农药制剂对甜菜夜蛾的防效

将15%生物农药制剂稀释至100mg/L，均匀喷施在接有甜菜夜蛾幼虫的甘蓝盆栽上，每盆喷施5ml，每处理重复三次，48h后统计死亡率。结果如下表所示。

表 含不同乳化剂成分的生物农药制剂对甜菜夜蛾的防治效果

其中CK1为15%有效成分双链核糖核酸+阳离子聚合物明胶，CK2为15%有效成分双链核糖核酸+阳离子聚合物壳聚糖，CK3为DEPC水。

4、以甜菜夜蛾乙酰胆碱酯酶基因Si-G_004基因siRNA为有效成分配置含有不同缓冲液的双链核糖核酸生物农药制剂

（1）称取500mg双链核糖核酸，溶于199.5g水中，800r/min搅拌使其充分溶解；

（2）壳聚糖纳米粒的制备

分别以醋酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液+柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液+柠檬酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液+磷酸盐缓冲液+柠檬酸盐缓冲液做壳聚糖纳米粒制备的缓冲液，以二甘醇做防冻剂、吐温60做表面活性剂、农乳1600#做乳化剂、制备壳聚糖纳米粒。其中壳聚糖、助溶剂、防冻剂、表面活性剂、乳化剂、缓冲液重量百分比分别为5%、10%、5%、1%、0.5%、60%制备壳聚糖纳米粒，余量为水。

1）称取壳聚糖40g、聚乙二醇20080g、二甘醇40g，溶于480g缓冲液（pH4-5），800r/min转速下搅拌12h，使壳聚糖充分溶解；

2）将步骤1）所得溶液在3000r/min下离心10min，取上清，加入8g吐温60，充分搅拌混合均匀；

3）称取4g农乳1600#溶于156g水中，充分搅拌，后与步骤2）所得溶液混合均匀，即得。

（3）制剂制备：将步骤（1）中有效成分溶液与步骤（2）所得壳聚糖纳米粒溶液均匀混合，即得0.05%双链核糖核酸生物农药制剂。

按照上述方法制备的壳聚糖纳米粒及生物农药制剂的粒径分布、药物负载率等理化指标均比较稳定，可进行标准化水平生产。

（4）0.05%双链核糖核酸生物农药制剂对甜菜夜蛾的防效

将0.05%生物农药制剂稀释至100mg/L，均匀喷施在接有甜菜夜蛾幼虫的甘蓝盆栽上，每盆喷施5ml，每处理重复三次，48h后统计死亡率。结果如下表所示。

表 含不同缓冲液成分的生物农药制剂对甜菜夜蛾的防治效果

缓冲液	死亡率（%）
		醋酸缓冲液	78.59
磷酸盐缓冲液	80.12
		柠檬酸盐缓冲液	79.46
醋酸盐缓冲液+柠檬酸盐缓冲液	78.06
		磷酸盐缓冲液+柠檬酸盐缓冲液	73.56
醋酸盐缓冲液+磷酸盐缓冲液+柠檬酸盐缓冲液	74.65

CK1	65.84
		CK2	71.33
CK3	26.38

其中CK1为有效成分双链核糖核酸+阳离子聚合物明胶，CK2为有效成分双链核糖核酸+阳离子聚合物壳聚糖，CK3为DEPC水。

5、复配核糖核酸生物农药制剂的制备和应用

本例特别提供了甜菜夜蛾G-蛋白偶联受体基因Si-G_005和Si-G_006双链核糖核酸的复配生物制剂及应用。

（1）有效成分溶解：分别称取Si-G_005+Si-G_006、Si-G_005、Si-G_006双链核糖核酸原药粉末500mg，溶于199.5g水中，800r/min搅拌使其充分溶解；

（2）壳聚糖纳米粒制备

以聚乙二醇200做助溶剂、丙三醇做防冻剂、吐温20做表面活性剂、三聚磷酸钠做乳化剂、磷酸盐缓冲液做缓冲液制备壳聚糖纳米粒。其中壳聚糖、助溶剂、防冻剂、表面活性剂、乳化剂、缓冲液重量百分比为分别5%、10%、5%、1%、0.5%、60%制备壳聚糖纳米粒，余量为水。

1）称取壳聚糖40g、聚乙二醇20080g、丙三醇40g，溶于480g磷酸盐缓冲液（（pH4-5）），800r/min转速下搅拌12h，使壳聚糖充分溶解；

2）将步骤1）所得溶液在3000r/min下离心10min，取上清，加入8g吐温20，充分搅拌混合均匀；

3）称取4g三聚磷酸钠溶于156g水中，充分搅拌，然后与步骤2）所得溶液混合均匀，即得壳聚糖纳米粒，粒径100-600nm。

（3）制剂制备：将步骤（1）中有效成分溶液与步骤（2）所得壳聚糖纳米粒溶液均匀混合，即得。

按照上述方法制备的壳聚糖纳米粒及生物农药制剂的粒径分布、药物负载率等理化指标均比较稳定，可进行标准化水平生产。

（二）0.05%双链核糖核酸生物农药制剂的防治效果

将0.05%生物农药制剂稀释至100mg/L，均匀喷施在接有甜菜夜蛾幼虫的甘蓝盆栽上，每盆喷施5ml，每处理重复三次，72h后观察防效。结果如下表所示。

表 复配双链核糖核酸为有效成分的生物制剂对甜菜夜蛾的防治效果

双链核糖核酸

死亡率（%）

Si-G_005+Si-G_006	85.67
		Si-G_005	73.69
Si-G_006	80.45
		DEPC水	36.00

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种壳聚糖纳米粒，其特征是，其由以下重量百分比的原料组成：

壳聚糖0.5-5%、助溶剂1-10%、防冻剂0-5%、表面活性剂0.1-1%、乳化剂0.1-0.5%、缓冲液40-60%、余量为水。

2.根据权利要求1所述的壳聚糖纳米粒，其特征是，所述助溶剂为聚乙二醇200、聚乙二醇400、乙醇、丙二醇中的一种或者几种混合物。

3.根据权利要求1所述的壳聚糖纳米粒，其特征是，所述防冻剂为丙三醇、乙二醇、异丙醇、二甘醇中的一种或者几种混合物。

4.根据权利要求1所述的壳聚糖纳米粒，其特征是，所述表面活性剂为吐温20、吐温40、吐温60、吐温80中的一种或者几种混合物。

5.根据权利要求1-4任一项所述的壳聚糖纳米粒，其特征是，所述乳化剂为三聚磷酸钠、苄基二甲基酚聚氧乙烯醚、烷基苯磺酸钙、苯乙基酚聚氧乙烯醚、烷基酚聚氧乙烯醚甲醛缩聚物、苯乙基酚聚氧乙烯聚氧丙烯醚、壬基酚聚氧乙烯醚磷酸酯、苯乙基聚氧乙烯醚硫酸铵盐、烷基联苯醚二磺酸镁盐中的一种或者几种混合物；所述缓冲液为醋酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液或柠檬酸盐缓冲液的一种或者几种混合物。

6.一种防治甜菜夜蛾的生物农药制剂，其特征是，其主要由以下重量百分比的成分组成：

（A）0.05-15%的有效成分:针对甜菜夜蛾高效致死靶基因设计合成siRNA，所述siRNA为15-50nt的双链核糖核酸、

（B）19.95-55%溶剂、

（C）30-80%权利要求1-5任一项所述的壳聚糖纳米粒。

7.根据权利要求6所述的防治甜菜夜蛾的生物农药制剂，其特征是，所述甜菜夜蛾高效致死靶基因为钙粘蛋白基因、肌动蛋白基因、细胞色素P450基因、G-蛋白偶联受体基因。

8.根据权利要求7所述的防治甜菜夜蛾的生物农药制剂，其特征是，所述siRNA为选自针对钙粘蛋白基因的双链核糖核酸为SEQ ID NO.1及SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3及SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6；针对肌动蛋白基因的双链核糖核酸为SEQ ID NO.7及SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9及SEQ ID NO.10中；针对细胞色素P450基因的双链核糖核酸为SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16；和针对G-蛋白偶联受体基因的双链核糖核酸为SEQ ID NO.17及SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19及SEQID NO.20、SEQ ID NO.21及SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28中的一对或多对。

9.根据权利要求6-8任一项所述的防治甜菜夜蛾的生物农药制剂，其特征是，所述溶剂为甲醇、二甲亚砜、水、Tris缓冲液中一种或者几种混合物。

10.一种权利要求6-9任一项所述的防治甜菜夜蛾的生物农药制剂的制备方法，其特征是，包括以下步骤：

（A）溶解：称取所述siRNA，溶于溶剂，搅拌，使所述siRNA充分溶解，得溶液；

（B）壳聚糖纳米粒制备：

1）称取所述壳聚糖、助溶剂和防冻剂，加入到缓冲液中，搅拌使其充分溶解，得溶液1；

2）将溶液1离心，取上清，加入表面活性剂，充分搅拌，混匀，得溶液2；

3）将乳化剂用水溶解后加入溶液2中，混匀即得壳聚糖纳米粒；

（C）制剂制备：将步骤（A）中所得溶液与步骤（B）所得的壳聚糖纳米粒混合均匀，即得所述防治甜菜夜蛾的生物农药制剂。