CN103108883A

CN103108883A - 新型变应原

Info

Publication number: CN103108883A
Application number: CN2011800204677A
Authority: CN
Inventors: L·马特松; J·利德霍尔姆; T·隆格伦
Original assignee: Phadia AB
Current assignee: Phadia AB
Priority date: 2010-04-23
Filing date: 2011-04-26
Publication date: 2013-05-15
Anticipated expiration: 2031-04-26
Also published as: WO2011133105A1; EP2560990B1; JP2016175891A; US9164101B2; JP2013528364A; US9724407B2; ES2592956T3; CA2794556A1; EP2560990A1; CA2794556C; US20130045233A1; US20160082101A1; AU2011243277A1; EP2560990A4; DK2560990T3; RU2608494C2; AU2011243277B2; RU2012150039A; CN103108883B; JP6280578B2

Abstract

本发明公开了分离的马变应原及与其共享抗体表位的其变体和片段，所述马变应原是在非还原条件下分子量为15kDa且包含连接在一起的分子量为约5kDa的第一肽链和分子量为约10kDa的第二肽链的分泌球蛋白。还公开了所述变应原在诊断和治疗中的用途，以及含有所述变应原的诊断试剂盒和药物组合物。

Description

新型变应原

技术领域

本发明涉及变态反应领域。具体而言，本发明涉及从哺乳动物中鉴定新型变应原，以及涉及哺乳动物变态反应的诊断和治疗。

背景技术

约有20%工业化社会的群体，对暴露于各种环境来源的抗原超敏感(变应性的)。这些抗原诱导即时和/或延迟型超敏反应，因此被称为变应原(Breiteneder et al.1997)。这些抗原包括草、树、杂草的产物、动物皮屑、昆虫、食品、药物和化学品。与特异性变态反应有关的抗体主要属于免疫球蛋白E同种型(IgE)。IgE通过特异性高亲和性受体FcεRI结合嗜碱性粒细胞肥大细胞和树突状细胞。在暴露于变应原后，细胞表面上的变应原特异性IgE抗体交叉连接，从而使得诸如组胺和白三烯等炎性介质释放，导致变态反应的生理表现(Akdis 2006)。

变态反应的诊断测试涉及检测患者中对变应原来源的蛋白具有特异性的患者IgE抗体。通常，这些测试中使用变应原来源的水性提取物，其含有多种蛋白的混合物。对于大部分变应原来源而言，仅部分鉴定和表征了存在于粗提取物中的变应原性蛋白。检测患者中特异性IgE抗体的诊断测试程序，可以通过使用来自患者血清的体外免疫测定，或是通过在患者的皮肤上局部应用具体提取物而进行的皮肤点刺测试(skin prick test,SPT)(Wainstein et al.2007)。

近年来，已经鉴定并表征了变应原性提取物中的许多重要的变应原性蛋白。这使得已经能定量这些个体变应原性组分中每一组分的特异性IgE抗体，这经常称为组分解析诊断学(CRD)(Valenta et al.1999)(Hiller et al.2002)，其在许多病例中能够改善超敏反应的诊断(Stumvoll et al.2003)。已经提议利用CRD辅助选择最佳免疫治疗(Valenta et al.2007)。此外，通过用组分来加强(spike)提取物，从而在一些病例中可以用个体变应原来增强提取物的诊断灵敏性。总之，鉴定和表征每个变应原来源中所有重要的变应原性蛋白非常重要。

除了例如通过抗组胺降低变态反应的症状之外，可以用具体免疫疗法进行变态反应的长期且治愈性治疗。应用引起疾病的变应原性提取物，最常见的是皮下或舌下，可以引起特异性激活针对变应原性蛋白的保护性免疫应答。尽管并不完全了解提取物机制，但是免疫系统的这种特异性激活，减轻了随后相同变应原环境暴露后的变态反应症状(Akdis et al.2007)。常规免疫疗法的进一步发展，是使用一种或数种纯化的变应原性蛋白，而不是粗天然提取物。这类免疫疗法已经成功地用于草花粉变应性患者(Jutel et al.2005)，并且已经提议将其用于治疗针对动物皮屑的变态反应(Gronlund et al.2009)。

马皮屑是日益渐增的常见呼吸变态反应原因(Liccardi et al.2011)，其症状包括鼻炎、结膜炎、支气管发炎以及哮喘。对马变应原的职业暴露是变应性敏化作用的重要风险因素(Tutluoglu et al.2002)，但是也可以在其他地方，如学校，检测到相当浓度的变应原(Kim et al.2005)。在一项研究中证明，IgE对马皮屑的敏化作用与发展哮喘的高风险相关(Ronmark et al.2003)。

马毛发和皮屑的提取物含有复杂的变应原性蛋白，且目前已经鉴定了4种马变应原：Equ c 1、Equ c 2、Equ c 3以及Equ c 4/5。前两种都是脂质运载蛋白蛋白家族的成员，并且已经从其天然来源纯化到它们(Dandeu et al.1993;Goubran Botros et al.1998)，尽管仅Equ c 1被表达为重组蛋白(Gregoire et al.1996)。Equ c 1的氨基酸序列与猫变应原Fel d 4的氨基酸序列的相似性为67%(Smith et al.2004)。Equ c 3即马血清白蛋白，是相对保守的蛋白，其表现出与其他哺乳动物白蛋白的广泛交叉反应性(GoubranBotros et al.1996)。Equ c 4/5首先作为马皮屑中的IgE结合蛋白而得到纯化和报道(Goubran Botros et al.1998;Goubran Botros et al.2001)，并且仅在后来被确定为马汗latherin (McDonald et al.2009)。

Equ c 1被认为是已知的马变应原中最重要的一个(Dandeu et al.1993)，并且重组蛋白的IgE抗体识别存在于76%的所研究的马变应性个体群体中(Saarelainen et al.2008)。在利用纯化的天然变应原的另一项研究中，仅33%的马变应性患者对Equ c 2敏感，而23%的患者对Equ c 4/5敏感(GoubranBotros et al.1998)。IgE结合马血清白蛋白的频率表述于几项研究中，其证明了在高达40%马变应性个体中的反应性(Spitzauer et al.1993;etal.2000)。然而，因为对血清白蛋白的敏化作用经常伴随着抗其他变应原组分的高浓度IgE抗体，因此其具体临床相关性是不确定的。

对尽管马皮屑变应原Equ c 1、Equ c 2、Equ c 3以及Equ c 4/5的了解已有很长时间，但是并未定量评估每种组分对针对马皮屑的总IgE应答的贡献。

发明概述

如上文所述，充分设计的用于具体IgE抗体的实验室免疫测定，能够利用天然马皮屑提取物，检测大多数对马的敏化病例。然而，在小型化或者非实验室免疫测定中，如变应原微阵列或医生办公室测试，较不利的测定条件、较低的抗体结合变应原试剂的能力以及效力有效的天然变应原提取物的组合，使得诊断的灵敏性不足。对于其他动物上皮的特异性IgE的免疫测定，存在相似的情形。因此，在一些情况下需要使用纯变应原性蛋白来在动物上皮的特异性IgE抗体的诊断测试中实现足够的灵敏性。

这类变应原不仅可以用作在常规诊断测试中增加灵敏性的试剂，也可以用于不同类型的组分解析诊断应用中(Valenta et al.1999)(Hiller et al.2002)。具有改善的非过敏特性的纯变应原性蛋白或其变动或变体，也可以在免疫疗法中用作新试剂(Valenta et al.1999)(Cromwell et al.2006)(Saarneet al.2005);(Jutel et al.2005);(Cromwell et al.2006)。

对所有已知的马变应原组分的纯化和分析，鉴定了一些患者的血清，其具有比全部个体马变应原组分共同引起的IgE应答明显更高的针对马皮屑提取物的IgE应答。据发现，这些血清对以前未知的马变应原组分具有IgE结合反应性。

在上文所述的血清的帮助下，可以从马皮屑纯化新的主要变应原，并将其鉴定为分泌球蛋白(secretoglobin)蛋白家族的成员。新的马蛋白，本文称之为Equ c 15k，由通过二硫键而连接在一起的一个5kDa氨基酸链和一个10kDa的氨基酸链组成。考虑到两条多肽链由不同的基因编码这一事实，本研究证明了异二聚体蛋白的存在，该异二聚体蛋白以前并未被马基因组的生物信息学研究预料到。其在所有方面都不同于以前已知的马变应原。该变应原代表了对已知的马变应原组的重要增加，并且必将可用于马变态反应的诊断中。

一方面，本发明涉及分离的马变应原，Equ c 15k，其属于分泌球蛋白家族，在非还原条件下，其表现出对应于约15kDa的电泳迁移率(表观分子量)，并且包含分子量为约5kDa的第一肽链和分子量为约10kDa的第二肽链，两者通过一个或多个二硫键而连接在一起。本发明的这一方面还包括Equ c 15k的与其共享抗体表位的变体和片段，从而使得变体和片段与这类抗体的交叉反应性为至少约50%。这类变体和片段包括例如来自同一物种的相关变应原。在下文所述的本发明的其他方面，出于简化，还用术语“Equc 15k”包括其这类变体和片段。

在另一方面，本发明涉及分离的编码本发明第一方面提到的变应原的核酸，以及含有所述核酸分子的载体，并且涉及含有所述载体的宿主细胞。含有这种载体的宿主细胞所产生的重组蛋白或肽，可以是糖基化的或不是他糖基化的，这取决于所用的宿主细胞。

在另一方面，本发明涉及Equ c 15k在制备用于诊断I型变态反应的组合物中的用途。

在另一方面，本发明涉及经Equ c 15k“加强(spike)”的变应原组合物。这类变应原组合物可以是不具有或具有低Equ c 15k含量的变应原提取物或纯化的或重组变应原组分混合物，其中添加Equ c 15k的目的是，结合患者的IgE，患者的IgE与组合物中的其他变应原组分可能不结合或不充分地结合。本发明的这一方面还涉及产生这种组合物的方法，所述方法包括如下步骤：将Equ c 15k添加于变应原组合物如变应原提取物(任选地用其他组分加强)或纯化的天然或重组变应原组分的混合物中。

在另一方面，本发明涉及诊断患者的I型变态反应的体外诊断方法，其中使来自患者的体液样品，如血液或血清样品，与Equ c 15k或前述方面中的组合物接触，由此，可以确定患者样品是否含有特异性结合Equ c 15k的IgE抗体。这种诊断方法也可以以本领域已知的任何方式进行。可以将Equc 15k例如固定于固体支持体上，如在常规实验室免疫测定中，在微阵列中或在侧流测定(lateral flow assay)中，或用作流体相试剂。

在另一方面，本发明涉及用于进行前述方面的方法的诊断试剂盒。

在上述各方面，野生型Equ c 15k分子，如上文所述，可以被下文所定义的与野生型蛋白共享抗体表位的Equ c 15k的片段或变体替换。

本发明还涉及治疗I型变态反应的方法，包括向易感于这种治疗的患者施用Equ c 15k或如下文所述的经修饰的Equ c 15k。本发明的这一方面还涉及Equ c 15k在这类免疫疗法中的用途，包括例如组分解析免疫疗法(Valentaet al.2007)。在这方面的一个实施方案中，Equ c 15k可以以其天然形式或以表现出与天然分子相似的生物化学和免疫学特性的重组形式使用。在另一实施方案中，Equ c 15k可以以修饰的形式使用、以化学方式或基因方式产生，以便消除或减弱其IgE抗体结合能力，同时优选地能在治疗的个体中引发IgG应答。修饰的实例包括但不限于分子的片段化、截短、串联或聚积，内部片段的缺失，氨基酸残基的取代，结构域重排或由于二硫键或其与另一大分子结构或其他低分子化合物结合的破坏而至少部分地破坏三级结构。在这一方面的另一实施方案中，Equ c 15k的个体10kDa和/或5kDa亚基，与完整分子相比，表现出降低的IgE结合活性，用其作为修饰的Equc 15k。

在所有上述本发明的方面中，Equ c 15k蛋白可以从其天然来源纯化，如从马的尿、唾液或其他体液中，或从马的组织如毛发或皮屑中。如上文所述，其也可以通过重组DNA技术产生，或通过本领域技术人员已知的方法化学合成。

本发明还涉及Equ c 15k在I型变态反应的预防性治疗或治疗性治疗以及诊断中的用途。

定义

本文所述的变应原性马蛋白即Equ c 15k属于分泌球蛋白蛋白家族，具体而言是包含由两个异二聚体亚基形成的四聚体蛋白的一个亚家族。异二聚体由通过二硫键连接在一起的来源于不同基因的两条链构成(Klug et al.2000)。本文所述的马分泌球蛋白是15kDa的异二聚体，本文称之为Equ c15k，其分别由5±2kDa和10±2kDa的亚基组成，出于本发明的目的，这两个亚基分别称为5和10kDa亚基。分子量赋值是根据在下文实施例4所述的SDS-PAGE中所观察到的其表观分子量。应当理解到，表观分子量可以变化，这取决于分离条件，包括所用电泳分离介质和其浓度，所用的线性或梯度缓冲液等。此外，10kDa亚基含有N-糖基化位点，该位点被聚糖结构占据，可以影响表观分子量。

5kDa链的氨基酸序列具有预测的氨基酸序列ATCPAVATDIASFFLLPDSLFKLQLIKYQAPPEAKDATMQVKQCINEISAGDRYIITETLGKIVLQCGA(SEQ ID NO:4)，且其理论分子量为7.5kDa。

10kDa链的氨基酸序列具有预测的氨基酸序列GSGCQLLEDVVEKTITAELSPAEYVEAVQEFIPDEATEKAAIQLKQCYLQSNETLNDFRTMMNSMYNSAYCALF (SEQ ID NO:5)且其理论分子量为8.4kDa。

应当指出，结构上相关的蛋白在多种哺乳动物种类中已有描述，但是只有一种蛋白被鉴定为变应原，即主要猫变应原Fel d 1(Acc no P30438和P30440)。

Equ c 15k的变体和片段应当理解为表示长度为为异二聚体中每条链的至少10氨基酸、更优选至少40个、甚至更优选至少50或60个氨基酸残基且与所述Equ c 15k的序列同一性为至少50%、优选超过60%、70%、80%、90%或95%的蛋白或肽。

在本发明的语境中，修饰的Equ c 15k应当理解为表示已经经过化学或基因修饰从而改变其免疫特性的Equ c 15k变体，如有关本发明的免疫疗法方面，上文所实例的变体。

与Equ c 15k共享抗体表位的Equ c 15k的变体和片段，应当理解为这样的片段和变体，其与来自代表性Equ c 15k敏化患者血清样品的抗体如IgE或IgG抗体的结合可以被Equ c 15k显著抑制。这一抑制测定可以根据(Mattsson et al.2009)(其公开的内容在此通过援引并入)所述的方法来进行。

低变应原性的修饰的Equ c 15k或Equ c 15k的变体或片段应当理解为这样的修饰的Equ c 15k或Equ c 15k的变体或片段，其不能结合来自代表性Equ c 15k敏化患者血清样品的Equ c 15k反应性IgE抗体，如根据下文实施例7的方案所确定的，或其没有表现出生物学变应原活性或表现出显著降低的生物学变应原活性，如通过细胞激活测定如嗜碱性粒细胞组胺释放测定所确定的(Demoly et al.2003;Ebo et al.2004)。

附图的简要说明

图1A表示通过尺寸排阻层析(SEC)分级马皮屑蛋白。用于随后纯化步骤的峰A和B用箭头表示。

图1B通过疏水相互作用层析纯化nEqu c 1。峰C和D用于随后的纯化步骤。

图1C表示通过疏水相互作用层析纯化nEqu c 2和Equ c 4/5。峰E、F和G用于随后的纯化步骤。

图1D表示通过阴离子交换层析纯化nEqu c 2。峰H和I用于随后的分析。

图1E表示纯化的蛋白Equ c 1形式A和B、Equ c 2以及Equ c 4/5形式14kDa和19kDa的SDS-PAGE分析。泳道M含有分子量标记蛋白，分子量表示在左侧。

图2A利用马皮屑反应性血清比较了nEqu c 1两种形式即A和B的IgE结合(分别来自峰C和峰D)。虚线表示0.35kU_A/L的截止水平。

图2B利用马皮屑反应性血清比较了19kDa和14kDa形式的nEqu c 4/5的IgE结合。虚线表示0.35kU_A/L的截止水平。

图3表示纯化用于寻找新IgE结合蛋白的级分。A:利用阴离子交换层析纯化级分。B:利用疏水相互作用层析纯化级分B和C。

图4表示纯化15kDa马皮屑蛋白。A：利用尺寸排阻层析对马皮屑提取物进行分级。峰A用于随后的纯化步骤。B：利用疏水相互作用层析对峰A进行分级。峰J，按图所示汇集，用于随后的纯化步骤。C：利用阴离子交换层析对峰J进行分级。峰K和L用于随后的分析和/或进一步纯化步骤。D：表示纯化的15kDa马皮屑蛋白的还原(红色(Red))和非还原(Ox)样品的SDS-PAGE分析。泳道M含有分子量标记蛋白，分子量表示于左侧。E：利用反相层析精炼纯化峰K。峰M用于随后的免疫分析。

图5表示nEqu c 15k的5kDa和10kDa氨基酸链的预测的序列。利用N末端测序所鉴定的氨基酸用下划线表示，而通过MS/MS分析所鉴定的氨基酸以粗体表示。

图6表示2个马变应性患者(编号3和12)的血清中IgE对nEqu c 15k的反应性，如通过免疫印迹所检测的。前两个条带表示总蛋白染色，而5和10kDa亚基与15kDa蛋白的位置，分别以箭头表示。右侧的4个条带表示结合Equ c 15k的还原(Red)或非还原(Ox)样品的IgE。

图7表示天然和重组Equ c 15k的IgE反应性之间的相关性。0.35kU_A/L和0.1kU_A/L水平用虚线表示。

图8表示一组25名马皮屑变应性个体中马皮屑提取物(HDE)即Equ c1、nEqu c 2、nEqu c 3.nEqu c 4/5和rEqu c 15k的IgE抗体的水平。对于每一组分，0.1kU_A/L以下的观察结果的数量表示在括号中，虚线表示0.35kU_A/L水平，且实线表示0.1kU_A/L水平。水平柱表示IgE的中值水平。

图9比较IgE抗体与nEqu c 15k和rFel d 1的结合。0.35kU_A/L和0.1kU_A/L水平以虚线表示。

图10表示可溶性Equ c 15k和Fel d 1自抑制和交叉抑制IgE结合于固定的Equ c 1和Fel d 1的能力。使用来自马皮屑敏化个体(标记A-E)或马皮屑变应性患者(根据表3标记)的血清。

本发明的详细描述

下文的实施例通过从马中分离并使用分泌球蛋白说明了本发明。实施例仅仅是说明性的，且不应当认为是限制本发明，附加的权利要求限定了本发明的范围。

实施例1：从马皮屑和血清中纯化和表征已知变应原

用马皮屑作为纯化Equ c 1、Equ c 2和Equ c 4/5的起始材料，而从马血清中纯化Equ c 3。

在20mM MOPS,pH 7.6,0.5M NaCl(MBS=MOPS缓冲盐水)中提取马皮屑(Allergon,

Sweden)，通过离心澄清并用0.45μm的混合纤维素酯滤器(Millipore,Billerica,MA,USA)过滤。作为所有3种马皮屑变应原的第一纯化步骤，将澄清的提取物施加于Superdex^TM 75柱(XK26/100,V_t=505mL,GE Healthcare Life Sciences,Uppsala,Sweden)，进行尺寸排阻层析(SEC)，并以2mL/min(mL/分钟)的流速用MBS进行洗脱。

Equ c 1

为了纯化Equ c 1，将图1A中的峰A用2M NH₄SO₄调整，并施加于用溶解于20mM tris pH 8.0中的2M NH₄SO₄平衡的苯基Sepharose^TMHP柱(HR10/10,V_t=9.0mL,GE Healthcare Life Sciences)。在2M-0M NH₄SO₄的线性NH₄SO₄梯度中进行洗脱。含有Equ c 1的两个峰洗脱于中间的梯度中，即图1B中的峰C和D。在用20mM MOPS pH 7.60.5M NaCl平衡的Sephadex^TM G25细柱(XK16/20,V_t=34mL,GE Healthcare Life Sciences)上使每个峰脱盐后，利用还原样品的NuPAGE MES缓冲液系统(10%NuPAGE凝胶,Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)，所述系统是通过使样品与含有100mM β巯基乙醇的NuPAGE LDS样品缓冲液(Invitrogen)1:3混合而制备的，使nEqu c 1的每一制剂经历十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。用Mark 12^TM标准品(Invitrogen)作为表观分子量的标志。如通过SDS-PAGE(图1E)所判断的，两种nEqu c 1制剂都是纯的。

如(Mattsson et al.2009)所述，利用在Bruker Daltonics Autoflex 2仪器(Bruker Daltonics,Bremen,Germany)中进行的肽质量指纹图谱(PMF)，毫无疑义地将肽制剂鉴定为Equ c 1。

如(Marknell DeWitt et al.2002)所述，将两种形式的蛋白固定于ImmunoCAP^TM固相。

Equ c 2

为了纯化Equ c 2，将SEC的第二峰即图1A中的峰B用1M NH₄SO₄调整，并使之在用溶解于20mM Tris pH 8.0中的1M NH₄SO₄平衡的苯基Sepharose^TM HP柱(HR10/10,Vt=9.0mL,GE Healthcare Life Sciences)上进行疏水相互作用层析(HIC)。在相同的缓冲液中用1M至0M NH₄SO₄的线性NH₄SO₄梯度进行洗脱。Equ c 2包含于流通级分(1C中的峰E)中，将所述级分汇集并在用20mM Bis-Tris丙烷pH 8.5平衡的Sephadex^TM G25细柱(XK26/20,V_t=90mL,GE Healthcare Life Sciences)上脱盐。最后将脱盐的Equ c 2集合体施加于用20mM Bis-Tris丙烷,pH 8.5平衡的阴离子交换柱Source^TM 15Q(HR16/10,V_t=9mL,GE Healthcare Life Sciences)。在相同的缓冲液中用线性0-0.40M NaCl梯度洗脱后，将蛋白解析为3个峰，通过SDS-PAGE分析，它们都表现出纯17kDa带。利用N末端测序(Procise^TMLC452,Applied Biosystems,Foster city CA,USA)分析两个最大的峰，且两者都具有序列DQDPQSEDTY，从而将它们鉴定为Equ c 2.0201(图1D峰H和I)。为了评估IgE结合反应性，如(Marknell DeWitt et al.2002)所述，汇集峰并将其固定于ImmunoCAP^TM固相。

Equ c 4/5

利用SEC的第二峰即图1A中的峰B，纯化Equ c 4/5。将该集合体用1M NH₄SO₄调整，并使之在用溶解于20mM Tris pH 8.0的1M NH₄SO₄平衡的苯基Sepharose^TM HP柱(HR10/10,V_t=9.0mL,GE Healthcare LifeSciences)上进行疏水相互作用层析(HIC)。在相同的缓冲液中，用1M至0MNH₄SO₄的线性NH₄SO₄梯度进行洗脱。Equ c 4/5蛋白在中间梯度中，洗脱成两个不同的峰(图1C中的峰F和G)。对第一峰进行SDS-PAGE分析表明，蛋白作为14kDa带迁移，而第二峰含有19kDa带。在用20mM Bis-Tris丙烷pH 8.5平衡的Sephadex^TM G25细柱(XK26/20,V_t=90mL,GEHealthcare Life Sciences)上脱盐后，如利用SDS-PAGE(图1E)所判断的，两种蛋白都是纯的。这两种制剂都表现出N末端序列VGPLLGPSDA，从而将它们鉴定为马latherin或Equ c 4/5。

如(Marknell DeWitt et al.2002)所述，将两种形式的nEqu c 4/5分别固定于ImmunoCAP^TM固相。

Equ c 3

基本上如(van Eijk et al.1999)所述，利用使用Blue Sepharose FF(GEHealthcare Life Sciences)的亲和层析、阴离子交换层析(AIEC)和SEC，从马血清中纯化天然Equ c 3。

实施例2：评估IgE结合来自马敏化个体的一组血清中个体马皮屑变应原组分的水平

利用一组马皮屑敏化血清(获得自源于内部的血清收集物)评估称为A型和B型的两种形式的Equ c 1的IgE结合活性。如图2A所示，两种形式的Equ c 1都表现出等同的IgE结合活性。因此，仅将用nEqu c 1A获得的值用于下文的分析中。利用一组相似的马皮屑反应性血清，比较结合两种形式的Equ c 4/5的IgE抗体，并发现它们非常相似，如图2B所示。

利用常规和实验性ImmunoCAP^TM测试(Phadia,Uppsala,Sweden)，检查结合马皮屑提取物和纯化的马变应原的IgE抗体。实验性ImmunoCAP^TM的制备如上文所述。使用来自马皮屑敏化个体的一组29个血清。测定IgE对马皮屑提取物nEqu c 1、nEqu c 2以及nEqu c 4/5的应答。结果显示在表1中，其中患者A1至A29的血清中针对HDE和组分的IgE抗体的浓度以及三种组分的总和，表示为kU_A/L。组分盖度为组分总和与马皮屑提取物的比值，表示为百分比。

血多血清被鉴定为比个体组分如血清A1、A21和A22所引起的显著更高的IgE结合马皮屑提取物水平。除了在本阶段未评估的可能的Equ c 3反应性外，鉴定的血清能够辅助从马皮屑中寻找新的IgE结合蛋白。

实施例3:鉴定具有新的IgE结合反应性的马皮屑的级分

在纯化以前表征的马皮屑变应原的过程中，鉴定了几种级分，其含有除了以前已知的马变应原以外的蛋白。利用在上文实施例2所鉴定的血清，选择特定目的的三种级分，用于分析IgE结合活性。级分A含有通过箭头所示的Equ c 2的阴离子交换纯化步骤(图3A)获得的10kDa带(还原SDS-PAGE)。级分B和C分别含有13kDa和10kDa带(还原SDS-PAGE)，是通过Equ c 1的HIC纯化步骤获得的，并在图3B中用箭头表示。实验性ImmunoCAP^TM(Phadia)测试的制备如(Marknell DeWitt et al.2002)所述，并用于血清分析。

结果概括于表2中，表2还包括以前对马皮屑提取物和nEqu c 1、nEquc 2和nEqu c 4/5的总和的确定，所有这些都显示为kU_A/L。在级分C中发现了最高IgE结合水平。尤其是，在血清A1中，结合级分C的IgE的水平，比结合nEqu c 1、nEqu c 2以及nEqu c 4/5的IgE总和高得多。这种血清具有仅1.5kUA/L的白蛋白IgE反应性(未显示)，这一事实表明级分C含有新的马皮屑变应原。

实施例4：级分C的主要蛋白成分的纯化和鉴定

从级分C中纯化马皮屑蛋白

为了以多个靶向方式纯化存在于级分C中的10kDa蛋白，如实施例1所述，使马皮屑提取物进行SEC。如图(4A中峰A的)所示，根据SDS-PAGE分析，汇集含有Equ c 1的峰。仅右手部分的峰A含有10kDa带，并且包括于集合体中。用2M NH₄SO₄调整集合体，并且如实施例1针对Equ c 1所述，使之进行HIC(图4B)。在20mM Tris,pH 8.0中以1:3稀释图4B中的峰J，并施加于在相同的缓冲液中平衡的Source^TM 15Q柱(PE 4.6/100,V_t=1.7mL;GE Healthcare Life Sciences)。用0-0.4M NaCl的线性梯度进行洗脱，从而在中间梯度中产生主峰，接着是较小的峰(峰K和L，图4C)。利用实施例1所述NuPAGE MES缓冲液系统，进行SDS-PAGE分析，其中在具有或不具有分别用于还原或非还原条件的4%β-巯基乙醇的情况下，通过在NuPAGE LDS缓冲液中以1:3稀释样品，制备样品。两个峰(图4D)的SDS-PAGE分析在非还原条件下显示了约15kDa的带。在还原样品后，15kDa带消失，而出现了约5和10kDa的两个带，这表明未还原的15kDa带由形成5kDa和10kDa带的多肽构成，其通过一个或多个二硫键彼此连接。尽管两个峰看起来都含有相同的担保，但是仅对大峰(K)进行进一步的生物化学分析。出于研究IgE结合的目的，通过将样品施加于用溶解于水中的0.065%TFA平衡的Source^TM 5RPC柱(ST 2.1/150,V_t=0.52mL;GEHealthcare Life Sciences)，而将精炼RPC纯化步骤包括在内。用缓冲液B的线性0-70%梯度进行洗脱，缓冲液B由溶解于90%乙腈中的0.05%TFA构成。在梯度的末端附加，蛋白被洗脱成单个峰(峰M，图4E)中。

15kDa的马皮屑蛋白被鉴定为分泌球蛋白

利用N末端测序，分析从SDS-PAGE凝胶中切割和提取的还原的5kDa和10kD蛋白带。对5kDa带进行的分析显示了氨基酸序列ATxPAVATDIASFFLLPDSL (x：未解析的残基)，其匹配预测的马(Equuscaballus)序列的残基22-41，表示“与LppAB相似”(Genbank Acc noXP_001502544)(SEQ ID NO:1)。对10kDa带进行的分析显示了序列GSGxQLLEDVVEKTITAELS (x：未解析的残基)，匹配预测的序列的残基19-38，表示“与来自马的亲脂蛋白CL2相似”(GenBank Acc noXP_001494564)(SEQ ID NO:2)。

对利用胰蛋白酶溶液消化(in-solution trypsin digest)的MALDI-TOF MS纯化的15kDa蛋白进行肽质量指纹图谱(PMF)分析，并未导致与已知的数据库条目的任何明显匹配(p<0.05)。然而，然而肽的MS-MS分析m/z=2281和m/z=1262.5从预测的序列“与LppAB(Equus caballus)(GenBank Acc noXP_001502544相似”鉴定了序列qcineisagdryiitetlgk(SEQ ID NO:3)。

利用凝胶中胰蛋白酶消化的5kDa片段的MALDI-TOF MS，进行肽质量指纹图谱(PMF)分析，并未导致与已知的数据库条目的任何明显匹配(p<0.05)。然而，所检测的5个主要的肽都对应于SEQ ID NO:4的预期的胰蛋白酶片段，其中m/z=903.47(对应于残基28-35)，m/z=1037.6(残基43-53)，m/z=1262.6(残基43-53)，m/z=2281.1(残基43-62)，以及m/z=2384.2(残基1-22)，在SEQ ID NO:4的预测的氨基酸残基中其总共覆盖50(72%)个。

通过凝胶中胰蛋白酶消化的10kDa带的MALDI-TOF MS，进行肽质量指纹图谱(PMF)分析，并未导致对已知的数据库条目的任何明显匹配(p<0.05)。然而，所检测到的两个主要的肽是m/z=1433.6和m/z=2880.4，这分别与对应于SEQ ID NO:5的残基1-13和14-39的肽GSGCQLLEDVVEK和TITAELSPAEYVEAVQEFIPDEATEK的质量一致。

两个鉴定的数据库条目即XP_001502544(SEQ ID NO:6)和XP_001494564(SEQ ID NO:7)的氨基酸序列，包括被认为是分泌球蛋白蛋白家族特有的特征。因此，综合起来看，所述结果将15kDa马皮屑蛋白鉴定为了分泌球蛋白。该蛋白在后文中称为Equ c 15k。Equ c 15k的两条链的预测的全长序列前体序列显示在图5(5kDa片段-SEQ ID NO:6；10kDa片段-SEQ ID NO 7)中，其中N末端测序所鉴定的氨基酸标有下划线，而MS-MS分析所鉴定的那些氨基酸以粗体显示。5kDa片段的前体序列包括21个氨基酸的N末端信号肽，而10kDa片段的前体序列包括18个氨基酸的N末端信号肽。必须指出，利用SignalP(www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)预测前体序列的信号肽，导致与针对5kDa和10kDa链以实验方式获得的那些相同的成熟序列。

图4D中的SDS-PAGE分析提供了在非还原条件下5和10kDa氨基酸链通过一个或多个二硫键保持在一起从而形成异二聚体蛋白的证据。因此，所述分析将编码序列SEQ ID No 4的基因与编码SEQ ID No 5的不同基因联系在一起，两者一起组成以前未知的异二聚体分泌球蛋白蛋白。

实施例5：利用免疫印迹分析评估IgE与Equ c 15k的结合

为了确定IgE针对Equ c 15k的反应性定向所述蛋白的哪个亚基，利用还原和非还原条件，进行免疫印迹分析。

对通过SDS-PAGE利用4-20%NuPAGE凝胶分离的(Invitrogen)纯化的Equ c 15k的还原和非还原样品进行免疫印迹分析，并将其在Hybond ECL硝化纤维素膜(GE Healthcare Life Sciences)上进行电印迹。利用封闭缓冲液(50mM磷酸盐pH 7.4,0.1%(v/v)Tween^TM 20,0.9%(w/v)NaCl,0.3%(w/v)葡聚糖T10)，在室温下将蛋白印迹封闭1小时，接着将其与来自患者3和12的血清孵育过夜，在封闭缓冲液中分别以1:4.8和1:13.5稀释。在用含有0.5%(v/v)Tween-20的0.15M NaCl洗涤后，将膜在封闭缓冲液中与HRP-标记的抗人IgE抗体一起孵育3小时，利用ECL Advance WesternBlotting Detection Kit(GE Healthcare Life Sciences)和LAS 4000迷你CCD相机(Fujifilm,Tokyo,Japan)，使用荧光测定法检测结合的IgE。

分析中所用的2个血清(3号和12号患者)，根据ImmunoCAP^TM分析(参见下文的实施例7)，都具有与Equ c 15k的主要反应性。这两种血清仅与Equ c 15k的在还原条件下解离的亚基微弱反应，所述亚基作为对应于还原的5kDa和10kDa亚基的弱带是可见的(图6)。在非还原条件下，用与Equc 15k的非还原的15kDa带一致的带，观察到强得多的反应性。在本分析中，未观察到与其他带的明显反应性。该免疫印迹分析表明，IgE结合反应性确实定向Equ c 15k制剂中的主要蛋白带。

实施例6：重组Equ c 15k的产生和免疫学表征

重组Equ c 15k的克隆和纯化

通过将编码的5kDa和10kDa亚基的氨基酸序列的核苷酸序列与编码包含3x(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)的连接肽的序列组合，设计合成的Equ c 15k单链基因。将全长合成基因克隆到载体pET23a(+)(Novagen,Madison,WI,USA)的NdeI和XhoI位点，从而添加C末端六聚组氨酸标签，使得能利用固定金属离子亲和层析(IMAC)纯化蛋白。

整个重组蛋白的氨基酸序列显示在SEQ ID NO:8中。针对在E.coli(DNA2.0,Menlo Park,CA,USA)中的最佳密码子使用，设计核苷酸序列。编码整个重组蛋白的核酸序列显示于SEQ ID NO:9中。

将质粒DNA构建体转化到E.coli菌株BL21-AI(Invitrogen)中，并利用3升的生物反应器(Belach Bioteknik,Solna,Sweden)产生重组Equ c 15k单链蛋白。

为了纯化重组Equ c 15k，将收获的细胞重悬浮于20mM Tris-HCl pH8.0中，并通过以10000-15000kPa将悬浮液通过Emulsiflex C5匀浆器(Avestin,Ottawa,Ontario,Canada)，使之裂解。在离心悬浮液后，将粒状内含体溶解于6M胍-HCl、20mM Tris pH 8.0、0.5M NaCl、5mM咪唑(imidazol)中，并用0.45μm混合纤维素滤器(Millipore)过滤。将过滤的上清液施加于螯合琼脂糖(Chelating Sepharose)FF柱(GE Healthcare LifeSciences)，用NiSO₄使所述EF柱带电。用溶解于20mM Tris-HCl pH 8.0,0.15M NaCl,20mM咪唑中的6M脲进行柱洗涤，随后在相同的缓冲液中利用脲的线性6M-2M梯度进行原位复性。复性后，在相同的缓冲液中用咪唑的线性20-500mM梯度洗脱重组蛋白。利用Q Sepharose^TM FF柱(GEHealthcare Life Sciences)，通过20mM Tris-HCl pH 8.0中的AIEC进一步纯化重组蛋白。利用线性0-0.5M NaCl梯度，洗脱蛋白，并根据SDS-PAGE结果汇集级分。利用0.44per mg/mL的计算的消光系数，根据280nm下的吸光度，确定最终制剂的蛋白浓度。

评估IgE与Equ c 15k的结合

将重组Equ c 15k固定于实验性ImmunoCAP^TM，并且如(MarknellDeWitt et al.2002)所述，测定IgE与来自36个马皮屑敏化个体的血清的反应性。

在结合于纯化的天然Equ c 15k和重组Equ c 15k的IgE之间，存在良好的一致性(r=0.98)(图7)，这表明重组蛋白是免疫活性的，且在结构式与天然蛋白形似。这些数据提供了强有力的证据，即Equ c 15k的5kDa (SEQID NO:4)和10kDa(SEQ ID NO:5)片段的氨基酸序列，如根据确定的基因组序列信息所预测的，是正确的，且表示纯化的马皮屑变应原Equ c 15k的氨基酸序列。

实施例7：评估一组马变应性患者中nEqu c 1、nEqu c 2、nEqu c 3、 nEqu c 4/5以及Equ c 15k的IgE结合活性

本研究使用来自西班牙(n=20)和瑞典(n=5)的25名马变应性个体的血清。所有的患者被医生诊断为马变态反应，具有诸如哮喘、鼻结膜炎和荨麻疹症状，以及对马皮屑提取物的阳性皮肤点刺测试。在对储存样品和数据的生物数据库(biobank)作出贡献的每一中心，在获得当地伦理委员会许可的情况下，收集所有样品和临床数据。

利用ImmunoCAP^TM(Fig.8,Table 3)，测定25名马变应性个体中马皮屑提取物nEqu c 1、nEqu c 2、nEqu c 3和nEqu c 4/5以及rEqu c 15k的特异性IgE抗体的水平。在表3中，将所有ImmunoCAP^TM水平显示为kU_A/L，且用ES(西班牙)或SE(瑞典)表示每一患者的来源。暴露于马后记录的变应性症状为鼻炎(rhin)、哮喘(astm)、荨麻疹(urt)或过敏反应(anaph)。

在所测试的25种血清中，12(48%)种表现出针对rEqu c 15k的IgE应答≥0.35kU_A/L，16种(64%)表现出针对nEqu c 2的IgE应答，以及19种(76%)表现出针对nEqu c 1的IgE应答。在所研究的个体中，nEqu c 3和nEqu c 4/5两者都表现为次要的变应原，分别结合仅来自5(20%)种和7种(28%)测试的血清的IgE ab。25种血清中有4种(16%)唯一地与Equ c 15k反应，平均而言，在所有Equ c 15k反应性血清中，Equ c 15k的IgE抗体的浓度相当于马皮屑IgE抗体浓度的37%。nEqu c 1的IgE抗体的相应相对浓度为52%，而对于nEqu c 2、nEqu c 3以及nEqu c 4/5而言，在对这些变应原具有特异性反应性的血清中，相对浓度分别为35%、69%以及9%。25种血清中有24种表现出IgE抗体结合马皮屑提取物。所有这些血清都表现出与所测试的5种个体马变应原中的至少一种结合。IgE与个体组分的结合水平的总和，匹配或超过与马皮屑提取物的结合水平的总和。

实施例8：对Equ c 15k和猫的分泌球蛋白即主要的猫变应原Fel d 1 的独立敏化作用

因为Equ c 15k属于分泌球蛋白蛋白家族，因此研究与主要的猫变应原Fel d 1的免疫学关系，Fel d 1属于同一蛋白家族。在36名马皮屑敏化个体的血清中，评估IgE与Fel d 1的结合水平，所述敏化个体包括实施例7所述的25名马变应性患者。并未检测到IgE水平与重组Equ c 15和rFel d 1之间的明显关联(r=0.36)(图9)，这表明，针对Equ c 15k的IgE抗体应答主要不是Equ c 15k与Fel d 1之间的交叉反应性的结果，反之亦然。

为了进一步研究Equ c 15k与Fel d 1之间的潜在的交叉反应性，利用固相上的rEqu c 15k和rFel d 1以及nEqu c 15k和rFel d 1作为抑制剂，以100μg/ml的终浓度(图10)，测试8种血清的交叉抑制，所述血清表现出针对Fel d 1和Equ c 15k的明显的IgE抗体结合反应性。利用IgE稀释液(Phadia)作为抑制对照。计算每次抑制的双份测定的平均值，以及利用可以用每种抑制剂压制(quench)的稀释液抑制剂，来将抑制的分数计算为结合的分数。在这些所选的血清中，当结合于固相上的Fel d 1时，仅可以通过Feld 1实现抑制。同样，在固相上的Equ c 15k上，利用Equ c 15k的抑制仅是可能的，这表明，在这些个体中，对这些分子的敏化作用独立于彼此发生，并且不是交叉反应性的结果。然而，并不能完全排除两种蛋白之间弱交叉反应性的存在。

表1

表2

表3

序列表

SEQ ID NO：1

ATCPAVATDIASFFLLPDSL

SEQ ID NO：2

GSGCQLLEDVVEKTITAELS

SEQ ID NO：3

QCINEISAGDRYIITETLGK

SEQ ID NO：4

ATCPAVATDIASFFLLPDSLFKLQLIKYQAPPEAKDATMQVKQCINEIS

AGDRYIITETLGKIVLQCGA

SEQ ID NO：5

GSGCQLLEDVVEKTITAELSPAEYVEAVQEFIPDEATEKAAIQLKQCYLKQSNETLNDFRTMMNSMYNSAYCALF

SEQ ID NO：6

MRLFLPVLLVTLALCCCETNAATCPAVATDIASFFLLPDSLFKLQLIKYQAPPEAKDATMQVKQCINEISAGDRYIITETLGKIVLQCGA

SEQ ID NO：7

MKLVTVLMLVAFPLYCYAGSGCQLLEDVVEKTITAELSPAEYVEAVQEFIPDEATEKAAIQLKQCYLKQSNETLNDFRTMMNSMYNSAYCALF

SEQ ID NO：8

MATCPAVATD IASFFLLPDS LFKLQLIKYQ APPEAKDATM QVKQCINEIS 50

AGDRYIITET LGKIVLQCGA GGGGSGGGGS GGGGSGSGCQ LLEDVVEKTI 100

TAELSPAEYV EAVQEFIPDE ATEKAAIQLK QCYLKQSNET LNDFRTMMNS 150

MYNSAYCALF LEHHHHHH 168

SEQ ID NO：9

GCCACGTGCCCTGCAGTCGCTACGGACATCGCATCGTTCTTCTTGCTGCCGGACAGCCTGTTTAAGCTGCAACTGATCAAATATCAGGCTCCGCCGGAGGCCAAAGACGCGACCATGCAGGTTAAGCAGTGCATCAACGAGATTAGCGCGGGTGATCGCTATATCATTACCGAAACCCTGGGCAAGATTGTGTTGCAGTGCGGTGCCGGTGGCGGTGGTTCCGGCGGTGGCGGCAGCGGTGGTGGTGGCAGCGGTAGCGGCTGTCAACTGCTGGAAGATGTTGTGGAGAAAACGATTACCGCGGAGCTGAGCCCGGCTGAATATGTCGAGGCGGTTCAGGAGTTTATTCCGGACGAGGCAACTGAAAAAGCAGCGATCCAACTGAAGCAGTGTTACCTGAAACAAAGCAACGAAACCTTGAACGATTTTCGTACCATGATGAATAGCATGTACAATTCTGCGTACTGTGCGCTGTTCCTCGAGCACCACCACCACCACCAC

参考文献

Akdis,C.A.(2006)."Allergy and hypersensitivity:mechanisms of allergicdisease."Curr Opin Immunol 18(6):718-726.

Akdis,M.and C.A.Akdis(2007)."Mechanisms of allergen-specificimmunotherapy."J Allergy Clin Immunol 119(4):780-791.

Breiteneder,H.,K.Hoffmann-Sommergruber,et al.(1997)."Recombinantallergens;basic and practical considerations."Arbeiten aus dem Paul Ehrlich Institut-Bundesamt fur Sera und Impfstoffe-Zu Frankfurt Am(91):80-86.

R.,M.C.López-Serrano,et al.(2000)."Importance of albuminin cross-reactivity among cat,dog and horse allergens."Journal of Investigational Allergology and Clinical Immunology 10(2):71-77.

Cromwell,O.,H.Fiebig,et al.(2006)."Strategies for recombinant allergenvaccines and fruitful results from first clinical studies."Immunol Allergy Clin North Am 26(2):261-281,vii.

Dandeu,J.P.,J.Rabillon,et al.(1993)."Hydrophobic InteractionChromatography for Isolation and Purification of Equ.Cl,the Horse MajorAllergen."Journal of Chromatography-Biomedical Applications 621(1):23-31.

Demoly，P.,B.Lebel,et al.(2003)."Allergen-induced mediator releasetests."Allergy 58(7):553-558.

Ebo,D.G.,M.M.Hagendorens,et al.(2004)."In vitro allergy diagnosis:should we follow the flow?[Review]."Clinical&Experimental Allergy 34(3):332-339.

Goubran Botros,H.,C.Gregoire,et al.(1996)."Cross-antigenicity of horseserum albumin with dog and cat albumins:study of three short peptides withsignificant inhibitory activity towards specific human IgE and IgG antibodies."Immunology 88(3):340-347.

Goubran Botros,H.,P.Poncet,et al.(2001)."Biochemical characterizationand surfactant properties of horse allergens."Eur J Biochem 268(10):3126-3136.

Goubran Botros,H.,J.Rabillon,et al.(1998)."Thiophilic adsorptionchromatography:purification of Equ c2and Equ c3,two horse allergens fromhorse sweat."Journal of Chromatography.B,Biomedical Sciences& Applications 710(1-2):57-65.

Gregoire,C.,I.Rosinski-Chupin,et al.(1996)."cDNA cloning andsequencing reveal the major horse allergen Equ c1 to be a glycoprotein memberof the lipocalin superfamily."Journal of Biological Chemistry 271(51):32951-32959.

Gronlund,H.,T.Saarne,et al.(2009)."The Major Cat Allergen,Fel d 1,inDiagnosis and Therapy."Int Arch Allergy Immunol 151(4):265-274.

Hiller,R.,S.Laffer，et al.(2002)."Microarrayed allergen molecules:diagnostic gatekeepers for allergy treatment."FASEB Journal 16(3):414-416.

Jutel,M.,L.Jaeger，et al.(2005)."Allergen-specific immunotherapy withrecombinant grass pollen allergens."J Allergy Clin Immunol 116(3):608-613.

Kim,J.L.,L.Elfman,et al.(2005)."Current asthma and respiratorysymptoms among pupils in relation to dietary factors and allergens in the schoolenvironment."Indoor Air 15(3):170-182.

Klug,J.,H.M.Beier,et al.(2000)."Uteroglobin/Clara cell 10-kDa familyof proteins:nomenclature committee report."Ann N Y Acad Sci 923:348-354.

Liccardi,G.,G.D'Amato,et al.(2011)."Sensitization to Horse Allergens inItaly:A Multicentre Study in Urban Atopic Subjects without OccupationalExposure."Int Arch Allergy Immunol 155(4):412-417.

Marknell DeWitt,V.Niederberger,et al.(2002)."Molecular andimmunological characterization of a novel timothy grass(Phleum pratense)pollen allergen,Phl p 11."Clinical&Experimental Allergy 32(9):1329-1340.

Mattsson,L.,T.Lundgren,et al.(2009)."Prostatic kallikrein:A new majordog allergen."J Allergy Clin Immunol 123(2):362-368.

McDonald,R.E.,R.I.Fleming,et al.(2009)."Latherin:a surfactantprotein ofhorse sweat and saliva."PLoS One 4(5):e5726.

Ronmark,E.,M.Perzanowski,et al.(2003)."Different sensitization profilefor asthma,rhinitis,and eczema among 7-8-year-old children:report from theObstructive Lung Disease in Northern Sweden studies."Pediatr Allergy Immunol 14(2):91-99.

Saarelainen,S.,M.Rytkonen-Nissinen,et al.(2008)."Animal-derivedlipocalin allergens exhibit immunoglobulin E cross-reactivity."Clin Exp Allergy38(2):374-381.

Saarne,T.,L.Kaiser,et al.(2005)."Rational design of hypoallergensapplied to the major cat allergen Fel d 1."Clin Exp Allergy 35(5):657-663.

Smith,W.,A.J.Butler,et al.(2004)."Fel d 4,a cat lipocalin allergen."Clinical&Experimental Allergy 34(11):1732-1738.

Spitzauer,S.,C.Schweiger,et al.(1993)."Characterisation of dogallergens by means of immunoblotting."International Archives of Allergy and Immunology 100:60-67.

Stumvoll,S.,K.Westritschnig,et al.(2003)."Identification ofcross-reactive and genuine Parietaria judaica pollen allergens."Journal of Allergy and Clinical Immunology 111(5):974-979.

Tutluoglu,B.,S.Atis,et al.(2002)."Sensitization to horse hair，symptomsand lung function in grooms."Clin Exp Allergy 32(8):1170-1173.

Wainstein,B.K.,A.Yee,et al.(2007)."Combining skin prick,immediateskin application and specific-IgE testing in the diagnosis of peanut allergy inchildren."Pediatr Allergy Immunol 18(3):231-239.

Valenta,R.,J.Lidholm,et al.(1999)."The recombinant allergen-basedconcept of component-resolved diagnostics and immunotherapy(CRD andCRIT)."Clinical and Experimental Allergy 29(7):896-904.

Valenta,R.and V.Niederberger(2007)."Recombinant allergens forimmunotherapy."J Allergy Clin Immunol 119(4):826-830.

Valenta,R.,T.Twaroch,et al.(2007)."Component-resolved diagnosis tooptimize allergen-specific immunotherapy in the Mediterranean area."J Investig Allergol Clin Immunol 17Suppl 1:36-40.

van Eijk,H.M.,D.R.Rooyakkers,et al.(1999)."Automated isolation ofhigh-purity plasma albumin for isotope ratio measurements."Journal of Chromatography.B,Biomedical Sciences and Applications 731(2):199-205.

Claims

1.分离的马变应原以及与其共享抗体表位的其变体和片段，所述马变应原是分泌球蛋白，其在非还原条件下具有15kDa的分子量且包含连接在一起的分子量为5kD的第一肽链和分子量为10kDa的第二肽链。

2.如权利要求1所述的马变应原，其是从马中纯化的或是重组产生的。

3.如权利要求1或2所述的马变应原以及与其共享抗体表位的其变体和片段，其中所述第一肽链包含N末端氨基酸序列ATCPAVATDIASFFLLPDSL(SEQ ID NO:1)。

4.如权利要求1、2或3所述的马变应原以及与其共享抗体表位的其变体和片段，其中所述第二肽链包含N末端氨基酸序列GSGCQLLEDVVEKTITAELS(SEQ ID NO:2)。

5.如权利要求1-4中任一项所述的马变应原以及与其共享抗体表位的其变体和片段，其中所述第一肽链包含具有氨基酸序列QCINEISAGDRYIITETLGK(SEQ ID NO:3)的片段。

6.如权利要求1-5中任一项所述的马变应原以及与其共享抗体表位的其变体和片段，其中所述第一肽片段包含氨基酸序列ATCPAVATDIASFFLLPDSLFKLQLIKYQAPPEAKDATMQVKQCINEISAGDRYIITETLGKIVLQCGA(SEQ ID NO:4)。

7.如权利要求1-5中任一项所述的马变应原以及与其共享抗体表位的其变体和片段，其中所述第二肽片段包含氨基酸序列GSGCQLLEDVVEKTITAELSPAEYVEAVQEFIPDEATEKAAIQLKQCYLKQSNETLNDFRTMMNSMYNSAYCALF(SEQ ID NO:5)。

8.分离的核酸序列，其编码权利要求1-7中任一项所述的马变应原。

9.载体，其包含权利要求8所述的核酸分子。

10.宿主细胞，其包含权利要求9所述的载体。

11.权利要求1-7中任一项所述的马变应原，用于I型变态反应的体外诊断。

12.权利要求1-7中任一项所述的马变应原在制备用于体外诊断I型变态反应的诊断组合物中的用途。

13.产生变应原组合物的方法，包括如下步骤：将权利要求1-7中任一项所述的马变应原添加于包含变应原提取物和/或至少一种纯化的变应原组分的组合物中。

14.能通过权利要求13所述的方法获得的变应原组合物。

15.体外诊断I型变态反应的方法，包括如下步骤：

将来自疑似患有I型变态反应的患者的含有免疫球蛋白的体液样品与权利要求1-7中任一项所述的马变应原或与权利要求14所述的变应原组合物接触，以及

检测所述样品中特异性结合所述马变应原的IgE抗体的存在，

其中特异性结合所述马变应原的此种IgE抗体的存在表示I型变态反应。

16.用于进行权利要求15所述方法的诊断试剂盒，包含权利要求1-7中任一项所述的马变应原或权利要求14所述的组合物。

17.权利要求1-7中任一项所述的马变应原，用于I型变态反应的预防性治疗或治疗性治疗。

18.权利要求1-7中任一项所述的马变应原在制备用于预防性治疗或治疗性治疗I型变态反应的治疗组合物中的用途。

19.用于治疗I型变态反应的方法，包括向易感于这类治疗的个体施用权利要求1-7中任一项所述的马变应原或所述马变应原经修饰以消除或减弱其IgE结合应答的形式。

20.药物组合物，包含权利要求1-7中任一项所述的马变应原或所述马变应原经修饰以消除或减弱其IgE结合应答的形式，和任选存在的至少一种药物可接受的载体、赋形剂、缓冲剂以及稀释剂。