JP2013528364A - 新規のアレルゲン - Google Patents
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Abstract
Description
さらなる形態において、本発明は、Equc15kで「スパイクされた」アレルゲン組成物に関する。このようなアレルゲン組成物は、Equc15k含量がゼロか低いアレルゲン抽出物または精製もしくは組換えアレルゲン構成要素の混合物であってもよく、ここでEquc15kは、自身のIgEが組成物中の他のアレルゲン構成要素と結合しないか、または不十分にしか結合しないと予想される患者由来のIgEと結合させるために添加される。またこの本発明の形態は、このような組成物を生産する方法にも関し、本方法は、例えばアレルゲン抽出物などのアレルゲン組成物(任意に他の構成要素でスパイクされていてもよい)、または、精製した天然または組換えアレルゲン構成要素の混合物にEquc15kを添加する工程を含む。
上述した形態において、野生型Equc15k分子は、上述したように、以下で定義されるような、野生型タンパク質と共通の抗体に対するエピトープを有するEquc15kの天然または人工のフラグメントまたは変異体で置き換えることができる。
定義
ここで述べられるアレルギーを起こすウマタンパク質であるEquc15kは、セクレトグロビンタンパク質ファミリーに属しており、具体的には2個のヘテロ二量体サブユニットによって形成された四量体タンパク質を含む1つのサブファミリーに属する。ヘテロ二量体は、ジスルフィド架橋によって一緒に連結した異なる遺伝子から誘導された2つの鎖からなる(Klug et al. 2000)。ここで述べられるウマセクレトグロビンは、本明細書においてEquc15kと称される15kDaのヘテロ二量体であって、これは、それぞれ5±2kDaのサブユニットと10±2kDaのサブユニットとからなり、これらはそれぞれ、本発明の目的において5および10kDaサブユニットと称される。分子量の割り当ては、以下の実施例4で説明されてるSDS−PAGEで観察されたそれらの見かけの分子量に従う。当然ながら見かけの分子量は、例えば電気泳動による分離の媒体およびそれらの濃度、用いられる直線的または濃度勾配のある緩衝液などの分離条件に応じて変動すると予想される。また10kDaサブユニットにはN−グリコシル化部位が含まれるが、グリカン構造にこのような部位が含まれると、見かけの分子量に影響を与える可能性がある。
以下の実施例は、ウマからのセクレトグロビンの単離および使用によって本発明を説明するものである。これらの実施例は単なる説明であり、本発明を制限するものと解釈すべきではなく、本発明は添付の請求項の範囲によって定義される。
Equc1、Equc2およびEquc4/5を精製するための出発原料としてウマ鱗屑を用い、一方でウマ血清からEquc3を精製した。
Equc1を精製するために、図1AにおけるピークAを2MのNH4SO4に調整し、20mMトリス(pH8.0)中の2MのNH4SO4で平衡化したフェニルセファロース(Phenyl SepharoseTM)HPカラム(HR10/10,Vt=9.0mL,GEヘルスケアライフサイエンス)に適用した。2M〜0MのNH4SO4の直線的なNH4SO4濃度勾配で溶出させた。勾配の中央でEquc1を含む2つのピーク(図1BにおけるピークCおよびD)が溶出した。20mMのMOPS(pH7.6)、0.5MのNaClで平衡化したセファデックス(SephadexTM)G25ファインカラム(XK16/20,Vt=34mL,GEヘルスケアライフサイエンス)で各ピークを脱塩した後、それぞれのnEquc1調製物をドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)で、サンプルと100mMのβ−メルカプトエタノールを含むNuPAGE LDSサンプル緩衝液(インビトロジェン)とを1:3で混合することによって製造された還元サンプルのNuPAGE MES緩衝液系(10%NuPAGEゲル,インビトロジェン(Invitrogen),米国カリフォルニア州カールスバッド)を用いて処理した。見かけの分子量の指標として、マーク12(Mark12TM)標準(インビトロジェン)を用いた。いずれのnEquc1調製物もSDS−PAGEでの判断から純粋であることがわかった(図1E)。
Equc2
Equc2を精製するために、SECからの第二のピーク(図1AにおけるピークB)を1MのNH4SO4に調整し、疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)において20mMトリス(pH8.0)中の1MのNH4SO4で平衡化したフェニルセファロースTMHPカラム(HR10/10,Vt=9.0mL,GEヘルスケアライフサイエンス)で処理した。同じ緩衝液中の1M〜0MのNH4SO4の直線的なNH4SO4濃度勾配で溶出させた。分画(図1CにおけるピークE)を通過したフロー中にEquc2が含まれており、これをプールして、20mMのビストリスプロパン(pH8.5)で平衡化したセファデックスTMG25ファインカラム(XK26/20,Vt=90mL,GEヘルスケアライフサイエンス)で脱塩した。脱塩したEquc2プールを最終的に20mMのビストリスプロパン(pH8.5)で平衡化した陰イオン交換カラムソース(SourceTM)15Q(HR16/10,Vt=9mL,GEヘルスケアライフサイエンス)に適用した。同じ緩衝液中の0〜0.40Mの直線的なNaCl濃度勾配で溶出させたところ、タンパク質は3つのピークに分解し、これらはいずれも、SDS−PAGE解析で純粋な17kDaのバンドを示した。最も大きい2つのピークをN末端の配列解析(プロサイス(ProciseTM)LC452、アプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems),米国カリフォルニア州フォスターシティー)で解析し、これらはいずれも配列DQDPQSEDTYを有しており、これらはEquc2.0201と同定された(図1DピークHおよびI)。説明されている通りに、IgE結合反応性を評価するために、これらのピークをプールし、イムノCAPTM固相に固定した(Marknell DeWitt et al. 2002)。
SECからの第二のピーク(図1AのピークB)を用いてEquc4/5の精製を行った。このプールを1MのNH4SO4に調整し、疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)において20mMトリス(pH8.0)中の1MのNH4SO4で平衡化したフェニルセファロースTMHPカラム(HR10/10,Vt=9.0mL,GEヘルスケアライフサイエンス)で処理した。同じ緩衝液中の1M〜0MのNH4SO4の直線的なNH4SO4濃度勾配で溶出させた。Equc4/5タンパク質は、勾配の中央で2つの別個のピーク(図1CにおけるピークFおよびG)に溶出した。第一のピークのSDS−PAGE解析から14kDaのバンドとして移動するタンパク質が明らかになり、第二のピークは19kDaのバンドを含むことが明らかになった。その後、20mMのビストリスプロパン(pH8.5)で平衡化したセファデックスTMG25ファインカラム(XK26/20,Vt=90mL,GEヘルスケアライフサイエンス)で脱塩した。いずれのタンパク質もSDS−PAGEにより純粋であることがわかった(図1E)。これら2種の調製物はいずれもN末端配列VGPLLGPSDAを示し、これは、ウマラセリンまたはEquc4/5と同定された。
Equc3
天然Equc3を、実質的に説明されている通りに、ブルー・セファロース(Blue Sepharose)FF、(GEヘルスケアライフサイエンス)を用いたアフィニティークロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー(AIEC)およびSECによって、ウマ血清から精製した(van Eijk et al. 1999)。
A型およびB型と名付けられたEquc1の2つの形態のIgE結合活性を、(社内の血清コレクションから得られた)ウマ鱗屑に感作された血清1セットを用いて評価した。図2Aで示されるように、Equc1の2つの形態は、同等のIgE結合活性を示した。従って以下の分析にはnEquc1Aで得られた値のみを用いた。ウマ鱗屑反応性血清の類似のセットを用いて、Equc4/5の2つの形態へのIgE抗体結合を比較したところ、図2Bで示されるように、それらは極めて類似していることがわかった。
前もって特徴付けられているウマ鱗屑アレルゲンを精製するプロセスの間に、これまでに知られていたウマアレルゲン以外のタンパク質を含む数種の分画が同定された。上記の実施例2で同定された血清を用いてIgE結合活性を解析するために特に興味深い3種の分画を選択した。分画Aには、矢印で示された(図3A)Equc2の陰イオン交換による精製工程から得られた10kDaのバンド(還元SDS−PAGE)が含まれていた。それぞれ13kDaおよび10kDaのバンド(還元SDS−PAGE)を含む分画BおよびCをEquc1のHIC精製工程から得て、これは図3Bにおいて矢印で示した。説明されている通りに、実験用イムノCAPTM(ファディア)試験を調製し(Marknell DeWitt et al. 2002)、これを血清解析に用いた。
分画Cからのウマ鱗屑タンパク質の精製
分画Cに存在する10kDaのタンパク質をより高度に標的化した方法で精製するために、ウマ鱗屑抽出物を実施例1で説明されているようにしてSECで処理した。図で指定された通りに(図4AにおけるピークA)、SDS−PAGE解析に従ってEquc1を含むピークをプールした。ピークAの右側部分だけに10kDaバンドが含まれており、これをプールした。実施例1においてEquc1に関して説明されている通りに、このプールを2MのNH4SO4に調整し、HICで処理した(図4B)。図4BにおけるピークJを20mMのトリス(pH8.0)で1:3に希釈し、同じ緩衝液で平衡化したソースTM15Qカラム(PE4.6/100,Vt=1.7mL;GEヘルスケアライフサイエンス)に適用した。0〜0.4MのNaClの直線的な濃度勾配で溶出させたところ、濃度勾配の中央において優勢なピーク、それに続いてより小さいピークが得られた(図4CにおけるピークKおよびL)。実施例1で説明されているようにNuPAGE MES緩衝液系を用いてSDS−PAGE解析を行ったが、ここでサンプルは、それぞれ還元および非還元条件に応じた4%β−メルカプトエタノール含有または非含有のNuPAGE LDS緩衝液で1:3に希釈することによってサンプルを調製した。両方のピークのSDS−PAGE解析(図4D)から、非還元条件下でおよそ15kDaのバンドが出現した。サンプルを還元した際に、15kDaのバンドが消失したが、同時におよそ5および10kDaの2つのバンドが現れたことから、非還元の15kDaのバンドは、1個またはそれより多くのジスルフィド架橋で互いに連結した5kDaおよび10kDaのバンドを形成するポリペプチドで構成されていることが示唆される。両方のピークは同じタンパク質を含むようにみえるが、大きいピーク(K)のみをさらなる生化学的解析で処理した。IgE結合を研究ために、RPC精製工程でサンプルを0.065%TFAの水溶液で平衡化したソースTM5RPCカラム(ST2.1/150,Vt=0.52mL;GEヘルスケアライフサイエンス)に適用することにより精製を行った。0.05%TFAを含む90%アセトニトリルからなる緩衝液Bの0〜70%の直線的な濃度勾配で溶出させた。濃度勾配の終わり付近でタンパク質が単一のピークで溶出した(図4EにおけるピークM)。
SDS−PAGEゲルから切り出し抽出した還元型5kDaおよび10kDaのタンパク質バンドをN末端の配列解析によって解析した。5kDaのバンドの解析から、アミノ酸配列ATxPAVATDIASFFLLPDSL(x:未解析の残基)が明らかになり、これは、「LppABに類似」と表示されたエクウス・カバルス(Equus caballus)の予測配列(Genbank登録番号XP_001502544)(配列番号1)の残基22〜41とマッチした。10kDaのバンドの解析から、配列GSGxQLLEDVVEKTITAELS(x:未解析の残基)が明らかになり、これは、「リポフィリンCL2に類似」と表示されたエクウス・カバルス由来の予測配列(GenBank登録番号XP_001494564)(配列番号2)の残基19〜38とマッチした。
IgEのタンパク質への反応性がEquc15kのどのサブユニットに対するものなのかを決定するために、還元および非還元条件の両方を用いた免疫ブロット解析を行った。
組換えEquc15kのクローニングおよび精製
5kDaおよび10kDaサブユニットのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と、(Gly−Gly−Gly−Gly−Ser)を3回含むリンカーペプチドをコードする配列とを組み合わせることによってEquc15k一本鎖の合成遺伝子を設計した。この合成遺伝子全長を、固定した金属イオンアフィニティークロマトグラフィー(IMAC)によるタンパク質精製ができるようにC末端にヘキサヒスチジンタグを添加したベクターpET23a(+)(ノバジェン(Novagen),米国ウィスコンシン州マディソン)のNdeIおよびXhoI部位にクローニングした。
組換えEquc15kを実験用イムノCAPTMに固定し、説明されている通りに、36人のウマ鱗屑に感作された被験者の血清に対するIgEの反応性を決定した(Marknell DeWitt et al. 2002)。
この研究には、スペイン(n=20)およびスウェーデン(n=5)からの25人のウマアレルギーの被験者の血清が用いられた。全ての患者は、喘息、鼻結膜炎およびじんましんなどの症状、ならびにウマ鱗屑抽出物に対する皮膚プリックテスト陽性を有するウマアレルギーという医者の診断を受けていた。サンプルおよびデータが寄託されているバイオバンクに寄与する各センターにおける地域倫理委員会の承認の元に、全てのサンプルおよび臨床データを回収した。
Equc15kはセクレトグロビンタンパク質ファミリーに属することから、同じタンパク質ファミリーに属する主要なネコアレルゲンであるFeld1との免疫学的な関係を調査した。36人のウマ鱗屑に感作された被験者(実施例7で説明した25人のウマアレルギー患者を含む)の血清におけるFeld1に対するIgE結合のレベルを評価した。組換えEquc15に対するIgEレベルとrFeld1に対するIgEレベルとの間に有意な相関(r=0.36)は観察されず(図9)、これは、Equc15kに対するIgE抗体反応は、主としてEquc15kおよびFeld1間の交差反応性の結果によるものではない(逆もまた同様)ことを示唆している。
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Claims (20)
- 非還元条件下で15kDaの分子量を有するセクレトグロビンであり、一緒に連結した5kDaの分子量を有する第一のペプチド鎖と10kDaの分子量を有する第二のペプチド鎖とを含む単離されたウマアレルゲン、ならびに抗体に対する該ウマアレルゲンと共通のエピトープを有するそれらの変異体およびフラグメント。
- ウマから精製された、または、組換え生産された、請求項1に記載のウマアレルゲン。
- 第一のペプチド鎖が、N末端アミノ酸配列ATCPAVATDIASFFLLPDSL(配列番号1)を含む、請求項1または2に記載のウマアレルゲン、ならびに、抗体に対するエピトープが該ウマアレルゲンと共通であるそれらの変異体およびフラグメント。
- 第二のペプチド鎖が、N末端アミノ酸配列GSGCQLLEDVVEKTITAELS(配列番号2)を含む、請求項1〜3請求項のいずれか一項に記載のウマアレルゲン、ならびに、抗体に対するエピトープが該ウマアレルゲンと共通であるそれらの変異体およびフラグメント。
- 第一のペプチド鎖が、アミノ酸配列QCINEISAGDRYIITETLGK(配列番号3)を有するセグメントを含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載のウマアレルゲン、ならびに、抗体に対するエピトープが該ウマアレルゲンと共通であるそれらの変異体およびフラグメント。
- 第一のペプチドセグメントが、アミノ酸配列ATCPAVATDIASFFLLPDSLFKLQLIKYQAPPEAKDATMQVKQCINEISAGDRYIITETLGKIVLQCGA(配列番号4)を含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載のウマアレルゲン、ならびに、抗体に対するエピトープが該ウマアレルゲンと共通であるそれらの変異体およびフラグメント。
- 第二のペプチドセグメントが、アミノ酸配列GSGCQLLEDVVEKTITAELSPAEYVEAVQEFIPDEATEKAAIQLKQCYLKQSNETLNDFRTMMNSMYNSAYCALF(配列番号5)を含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載のウマアレルゲン、ならびに、抗体に対するエピトープが該ウマアレルゲンと共通であるそれらの変異体およびフラグメント。
- 請求項1〜7のいずれか一項に記載のウマアレルゲンをコードする単離された核酸配列。
- 請求項8に記載の核酸分子を含むベクター。
- 請求項9に記載のベクターを含む宿主細胞。
- インビトロでの1型アレルギーの診断に使用するための請求項1〜7のいずれか一項に記載のウマアレルゲン。
- インビトロでの1型アレルギーの診断のための診断剤組成物を製造するための、請求項1〜7のいずれか一項に記載のウマアレルゲンの使用。
- アレルゲン抽出物および/または少なくとも1種の精製したアレルゲン構成要素を含む組成物に、請求項1〜7のいずれか一項に記載のウマアレルゲンを添加する工程を含む、アレルゲン組成物の製造方法。
- 請求項13に記載の方法によって得られるアレルゲン組成物。
- インビトロでの1型アレルギーの診断方法であって、該方法は:
1型アレルギーを有する疑いのある患者からの免疫グロブリンを含む体液サンプルを、請求項1〜7のいずれか一項に記載のウマアレルゲン、または、請求項14に記載のアレルゲン組成物と接触させる工程、および、
サンプル中の、前記ウマアレルゲンに特異的に結合するIgE抗体の存在を検出する工程、
を含み、ここで、このような前記ウマアレルゲンに特異的に結合するIgE抗体が存在することは、1型アレルギーであることを示す、上記方法。 - 請求項1〜7のいずれか一項に記載のウマアレルゲン、または、請求項14に記載の組成物を含む、請求項15に記載の方法を行うための診断キット。
- 1型アレルギーの予防的または治療的処置に使用するための、請求項1〜7のいずれか一項に記載のウマアレルゲン。
- 1型アレルギーの予防的または治療的処置のための治療用組成物を製造するための、請求項1〜7のいずれか一項に記載のウマアレルゲンの使用。
- 1型アレルギーの治療に感受性を有する個体に、請求項1〜7のいずれか一項に記載のウマアレルゲン、または、IgE結合反応を排除するかまたは弱められるように改変された形態のウマアレルゲンを投与することを含む、1型アレルギーの治療方法。
- 請求項1〜7のいずれか一項に記載のウマアレルゲン、または、IgE結合反応を排除するかまたは弱められるように改変された形態のウマアレルゲン、および、任意に医薬的に許容されるキャリアー、賦形剤、緩衝液および希釈剤の少なくとも1種を含む医薬組成物。
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