CN103088075B

CN103088075B - 光学纯(1s,2r,5r)-二氢香芹醇的生物催化合成方法

Info

Publication number: CN103088075B
Application number: CN201110348789.6A
Authority: CN
Inventors: 陈曦; 高秀珍; 吴洽庆; 朱敦明
Original assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2011-11-08
Filing date: 2011-11-08
Publication date: 2014-09-24
Anticipated expiration: 2031-11-08
Also published as: CN103088075A

Abstract

本发明公布了一种生物催化剂催化(R)-香芹酮经过两步还原反应串联合成光学纯二氢香芹醇的方法，包括：将环状烯酮与溶剂构成反应体系，加入生物催化剂后在20℃～60℃反应4小时～72小时，制得光学纯的二氢香芹醇；每升反应体系中生物催化剂的用量0.1g～100g，溶剂为单一溶剂或多种溶剂。该方法利用生物催化剂催化合成光学纯的二氢香芹醇，与现有的化学方法相比，具有操作简单、反应条件温和、对环境友好、高产率、高对映选择性等优点。

Description

光学纯(1S,2R,5R)-二氢香芹醇的生物催化合成方法

技术领域

本发明涉及生物催化领域，尤其涉及一种利用生物催化剂两步还原反应串联合成光学纯的(1S，2R，5R)-二氢香芹醇的方法。

背景技术

生物催化剂可以有效的避免化学催化中重金属残留、合成成本增加等一系列问题，生物催化的优点在于生物催化的反应可以在室温、常压和对生态无害的情况下完成，并且具有高度的对映选择性和区域选择性和底物的专一性，减少了化学催化中可能产生的分子异构化、消旋化、差向异构化和重排等问题。因此将生物催化的还原技术应用于不饱和化合物的不对称还原，与化学催化反应相结合、相辅相成、优势互补，从而以绿色环保的方法高效的得到目标化合物。

串联反应在合成中是一类非常重要的反应，串联反应可以避免中间步骤的分离，从而节省了用于分离的时间和精力，其效率要比逐步合成反应效率高，同时串联反应能够降低废物的产生，避免不稳定中间体的积累。现在已有很多文献报道了利用串联反应来合成比较复杂化合物的方法，这些报道中使用的催化剂有化学催化剂也有生物催化剂。由于酶本身的特点，如对有机溶剂的耐受度、pH值、反应温度、溶剂等条件选择，往往会导致生物催化剂在一锅法的多步串联反应中受到影响。但也有利用生物催化剂催化串联反应的相关报道，例如利用氧化还原酶串联反应将消旋的醇转化为手性醇(《J.Am.Chem.Soc.》2008，130，13969)，作者获得了99％的产率和99％的对映体过量；利用羰基还原酶与腈基水解酶串联制备α-羟基酸，利用酶催化串联合成氨基酸衍生物(《Adv.Synth.Catal.》2008，350，1729)，通过该方法能够以产率90％、＞98％的对映体过量获得目标产物。

酶制剂作为生物催化剂的重要组成部分，其催化作用具有催化效率高，专一性强和作用条件温和等特点，所以酶在医药、食品、轻工、化工、环保、能源及生物工程等领域应用广泛。

烯酮/酯还原酶是一类能够还原被活化的碳碳双键的酶，羰基还原酶是一类能够还原碳氧双键的酶，在化学催化反应中如果需要不对称还原碳碳或者是碳氧双键时，往往需要重金属作为催化剂，并且在常压下无法实现，而利用生物催化剂如烯酮/酯还原酶、羰基还原酶时则可以在常温、常压下实现不对称催化。

二氢香芹醇为无色至浅黄色粘稠性液体，有留兰香气，有胡椒辛辣味。不溶于水，溶于丙酮、乙醚和乙醇。二氢香芹醇是一种香料，可用作食品的人造香辛料，调制薄荷香型的香精可用于食品；调制留兰香香精，用于化妆品；也用作其他香料原料。目前市场上是以消旋体或者是非对映异构体混合物的形式出售。

(R)-香芹酮 (1S，2R，5R)-二氢香芹醇

二氢香芹醇的制法：(1)从天然精油中提取；(2)以香芹酮为原料，在极性溶剂中用保险粉(连二亚硫酸钠)还原而得。从天然精油中提取受制于有限的原料，以香芹酮为原料化学合成，产物多为消旋体，且各种手性异构体成分不一。如：以(R)-香芹酮是一种环状烯酮化合物，该化合物有三个不饱和键，其中两个碳碳双键和一个碳氧双键，使用化学还原试剂对其还原时，如果没有高的选择性，可能有17种产物生成(《Angew.Chem.Int.Ed.》2011，40，40)。2011年，Ewa(《Green Chem.》2011，13，DOI：10.1039/C1GC15495H)报道了使用非均相催化剂催化还原香芹酮，使用的介质为超临界二氧化碳，作者使用的催化剂为钌催化剂和钯催化剂，得到产物高达7种及以上。现有研究结果表明，手性异构体的物理和化学性质相同，但是，在生理、药理活性可能有很大的差别。一个典型的例子是，20世纪60年代在欧洲发生因服用酞胺哌啶酮(俗称反应停，一种缓解孕妇妊娠反应的药)导致海豹畸形儿出生的惨剧。这是因为，服用的反应停是两个手性异构体的混合物，其中一个异构体有缓解孕妇妊娠反应的药理作用，而另一个异构体却会导致海豹畸形儿的出生。从药物安全和人类健康的根本要求出发，以单一结构的手性异构体的药物上市或食品添加剂已是迫在眉睫的事情。美国FDA已明令限制两种手性异构体混合物的药物(消旋药物)的生产，我国的SFDA也已出台相关的法规促使消旋药物将会被手性药物所代替。除此之外，应用于农业的手性除草剂、杀虫剂和植物生长调节剂也都表现出强烈的生物识别作用，正在引起广泛的注意。

因此实现(R)-香芹酮高化学选择性、高区域选择性、高对映选择性转化为光学纯的二氢香芹醇是很有挑战和有意义的。

发明内容

本发明提供了一种操作简单、反应条件温和、产率高的生物催化剂催化两步还原反应串联合成手性二氢香芹醇的方法。

一种生物催化剂催化(R)-香芹酮经过两步还原反应串联合成手性二氢香芹醇的方法，包括：

将底物(R)-香芹酮与溶剂构成反应体系，加入生物催化剂后在20℃～60℃条件下反应4小时～72小时，制得光学纯的二氢香芹醇。

每升反应体系中生物催化剂的用量为0.1g～100g，溶剂为单一溶剂或多种溶剂。

本发明发现，(R)-香芹酮在溶剂存在下可以通过烯酮/酯还原酶的还原作用，首先以高达99％的转化率和99％的非对映选择性得到(2R，5R)-二氢香芹酮，随后(2R，5R)-二氢香芹酮在羰基还原酶作用下进一步反应，以高达99％的转化率和99％的非对映选择性得到(1S，2R，5R)-二氢香芹醇。

(R)-香芹酮 (1S，2R，5R)-二氢香芹醇

所述的溶剂为缓冲溶液，助溶剂为二甲基亚砜，N，N-二甲基甲酰胺，二氧六环，甲醇，乙醇，丙醇，异丙醇，乙腈，四氢呋喃，正己烷，乙酸乙酯，甲基叔丁基醚，吡啶，甲苯中的一种或多种。

本发明具有如下优点：

本发明方法采用在一种溶剂或者是多种溶剂的混合溶剂中，利用烯酮/酯还原酶与羰基还原酶的高度底物专一性和选择性的特点两步反应串联由(R)-香芹酮催化合成(1S，2R，5R)-二氢香芹醇，与现有的化学合成和生物合成相比，本发明操作简单，条件温和，光学纯度＞98％，产率高，后处理步骤简单，有效地实现了手性二氢香芹醇的合成。

具体实施方式

以下通过具体的实施例来进一步说明，但是这些实施例不构成对本发明的限制。

实施例：1

分步添加固体酶粉分作为生物催化剂实现手性二氢香芹醇的合成

在0.9mL磷酸缓冲溶液(100mM，pH 8.0)中，加入100μL溶有3.0mg(0.02mmol)(R)-香芹酮的DMSO溶液，1mg烯酮还原酶，1mg葡萄糖脱氢酶(GDH)，0.5mgNADH(NAD⁺)葡萄糖15mg(0.08mmol)37℃反应4小时，GC检测底物反应完全后，补加入1mg羰基还原酶，1mg葡萄糖脱氢酶(GDH)，0.5mg NADPH(NADP⁺)，葡萄糖7.9mg(0.04mmol)37℃继续反应20小时。等体积甲基叔丁基醚萃取，无水硫酸钠干燥，GC检测，转化率＞99％，对映选择性为99％。反应的结果如说明书附图1为底物(R)-香芹酮的气相谱图，附图2为产物(1S，2R，5R)-二氢香芹醇气相谱图，附图3为(R)-二氢香芹酮的可能产物气相谱图。

实施例：2

在0.9mL磷酸缓冲溶液(100mM，pH 8.0)中，加入3.0mg(0.02mmol)(R)-香芹酮，1mg烯酮还原酶，1mg葡萄糖脱氢酶(GDH)，0.5mg NADH(NAD⁺)葡萄糖15mg(0.08mmol)37℃反应4小时，GC检测底物反应完全后，补加入1mg羰基还原酶，1mg葡萄糖脱氢酶(GDH)，0.5mg NADPH(NADP⁺)，葡萄糖7.9mg(0.04mmol)37℃继续反应20小时。等体积甲基叔丁基醚萃取，无水硫酸钠干燥，GC检测，转化率＞99％，对映选择性为99％。

实施例：3

同步添加固体酶粉分作为生物催化剂实现手性二氢香芹醇的合成

在1mL磷酸缓冲溶液(100mM，pH 8.0)中，加入100μL溶有3.0mg(0.02mmol)(R)-香芹酮的DMSO溶液，1mg烯酮还原酶，1mg羰基还原酶，1mg葡萄糖脱氢酶(GDH)，0.5mg NADH(NAD⁺)，0.5mg NADPH(NADP⁺)，葡萄糖24mg(0.12mmol)37℃反应24小时，等体积甲基叔丁基醚萃取，无水硫酸钠干燥，GC检测，转化率＞99％，对映选择性为99％。

实施例：4

在1mL磷酸缓冲溶液(100mM，pH 8.0)中，加入3.0mg(0.02mmol)(R)-香芹酮，1mg烯酮还原酶，1mg羰基还原酶，1mg葡萄糖脱氢酶(GDH)，0.5mg NADH(NAD⁺)，0.5mgNADPH(NADP⁺)，葡萄糖24mg(0.12mmol)37℃反应24小时，等体积甲基叔丁基醚萃取，无水硫酸钠干燥，GC检测，转化率＞99％，对映选择性为99％。

实施例：5

增大反应体积，同步添加固体酶粉分作为生物催化剂实现手性二氢香芹醇的合成

在18mL磷酸缓冲溶液(100mM，pH 8.0)中，加入2mL溶有60mg(0.4mmol)(R)-香芹酮的DMSO溶液，5mg烯酮还原酶，5mg羰基还原酶，5mg葡萄糖脱氢酶(GDH)，3mg NADH(NAD⁺)，3mg NADPH(NADP⁺)，葡萄糖475mg(2.4mmol)37℃反应24小时，等体积甲基叔丁基醚萃取三次，无水硫酸钠干燥，GC检测，转化率＞99％，对映选择性为99％。得到黄色液体57.2mg，分离产率为92.9％。

说明书附图4为产物(1S，2R，5R)-二氢香芹醇¹H NMR，附图5为产物(1S，2R，5R)-二氢香芹醇的¹³C NMR。

Claims

1.一种用生物催化剂合成手性光学纯度＞98％二氢香芹醇的方法，在0.9mL，100mM，pH8.0磷酸缓冲溶液中，加入100μL溶有3.0mg(R)-香芹酮的DMSO溶液，1mg烯酮还原酶，1mg葡萄糖脱氢酶，0.5mgNADH或NAD⁺，葡萄糖15mg，37℃反应4小时，GC检测底物反应完全后，补加入1mg羰基还原酶，1mg葡萄糖脱氢酶，0.5mg NADPH或NADP⁺，葡萄糖7.9mg，37℃继续反应20小时，制得光学纯的二氢香芹醇；所合成的中间产物为光学纯的(2R，5R)-二氢香芹酮，产物为具有如下结构式的光学纯的(1S，2R，5R)-二氢香芹醇：

2.一种用生物催化剂合成手性光学纯度＞98％二氢香芹醇的方法，在0.9mL，100mM，pH8.0磷酸缓冲溶液中，加入3.0mg(R)-香芹酮，1mg烯酮还原酶，1mg葡萄糖脱氢酶，0.5mg NADH或NAD⁺，葡萄糖15mg，37℃反应4小时，GC检测底物反应完全后，补加入1mg羰基还原酶，1mg葡萄糖脱氢酶，0.5mgNADPH或NADP⁺，葡萄糖7.9mg，37℃继续反应20小时，制得光学纯的二氢香芹醇；所合成的中间产物为光学纯的(2R，5R)-二氢香芹酮，产物为具有如下结构式的光学纯的(1S，2R，5R)-二氢香芹醇：

3.一种用生物催化剂合成手性光学纯度＞98％二氢香芹醇的方法，在1mL，100mM，pH8.0磷酸缓冲溶液中，加入100μL溶有3.0mg(R)-香芹酮的DMSO溶液，1mg烯酮还原酶，1mg羰基还原酶，1mg葡萄糖脱氢酶，0.5mgNADH或NAD⁺，0.5mg NADPH或NADP⁺，葡萄糖24mg，37℃反应24小时，制得光学纯的二氢香芹醇；所合成的中间产物为光学纯的(2R，5R)-二氢香芹酮，产物为具有如下结构式的光学纯的(1S，2R，5R)-二氢香芹醇：

4.一种用生物催化剂合成手性光学纯度＞98％二氢香芹醇的方法，在1mL，100mM，pH8.0磷酸缓冲溶液中，加入3.0mg(R)-香芹酮，1mg烯酮还原酶，1mg羰基还原酶，1mg葡萄糖脱氢酶，0.5mg NADH或NAD⁺，0.5mgNADPH或NADP⁺，葡萄糖24mg，37℃反应24小时，制得光学纯的二氢香芹醇；所合成的中间产物为光学纯的(2R，5R)-二氢香芹酮，产物为具有如下结构式的光学纯的(1S，2R，5R)-二氢香芹醇：