CN103087314B - 生物可降解聚氨酯基因转染试剂的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于纳米生物材料技术领域，涉及一类可降解阳离子聚氨酯的制备方法及其作为转染试剂转染哺乳动物细胞株的应用。其结构式如式(1)所示：其中，R基团选自聚合度n为200～400。本发明方法中使用的反应试剂无毒无污染、成本低廉，具有可推广性；合成反应中无需添加特殊的缩合剂及催化剂、反应条件温和、副反应少；本方法便于引入双硫键和胺基官能团，可以得到结构多样性的聚氨酯。另外，本发明提供给的聚氨酯生物相容性好，细胞毒性低。
Description
技术领域
本发明属于纳米生物材料技术领域，涉及一类可降解阳离子聚氨酯的制备方法及其作为转染试剂转染哺乳动物细胞株的应用。
背景技术
基因治疗是将具有治疗功能的基因输送到人体细胞，表达需要的功能蛋白治疗疾病的新方法。如何利用载体将外源基因安全准确有效地导入靶细胞是基因治疗成功的关键技术。目前重组病毒载体已被广泛的应用于体外基因转染和临床基因治疗，但其潜在的安全问题比如免疫原性、诱变及致肿瘤性仍然是一大亟需解决的问题。相比之下，非病毒基因载体如脂质体、聚合物和纳米粒子有更好的安全性，同时具有设计合成方便、花费低、载药量大及大批量合成等优点。但基于非降解聚合物的基因释放载体往往在具有较低的传染效率。近十年来，国内外聚合物基因释放载体的研究是研究热点。特别是生物可降解的聚合物基因载体，如可降解的聚赖氨酸、聚乙烯亚胺、聚酰胺。双硫键在设计可降解聚合物基因载体中充当着重要的角色。在细胞外部，双硫键具有很高的化学稳定性,但在进入细胞后便会被降解,因此将双硫键引入阳离子聚合物是设计高效低毒基因载体的一大进步。
聚氨酯是一类在主链上含有氨基甲酸酯键(urethane linkage)的聚合物。在过去十年里，聚氨酯在生物医学领域，特别是药物缓释和组织工程方面得到广泛的应用。目前，含有双硫键的阳离子聚氨酯的合成还没有报到。并且含有双硫键的阳离子聚氨酯作为基因释放载体的研究也未见报道。
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发明内容
本发明的目的在于为克服现有技术的缺陷而提供一种含有双硫键的阳离子聚氨酯及其制备方法和用途。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
首先合成单体二硫代二乙基对硝基苯碳酸酯。它和含有叔胺基团的二伯胺化合物通过逐步聚合得到含有双硫键和可质子化胺基的聚氨酯。该方法具有制备简单、反应条件温和的优点。
一种含有双硫键的阳离子聚氨酯，其结构式如式(1)所示：
其中，R基团选自 或
聚合度n为200～400。
一种上述含有双硫键的阳离子聚氨酯的制备方法，包括以下步骤：
(1)通过取代反应合成出二硫代二乙基对硝基苯基碳酸酯(DTDE-PNC)
将二硫代二乙二醇(DTDE)和吡啶加入到有机溶剂中搅拌溶解10-30分钟，然后将对硝基苯基氯甲酸酯加入到反应器内，进行反应；
(2)反应结束后将混合物洗涤，然后蒸掉有机溶剂后，用硅胶柱提纯得到二硫代二乙基对硝基苯基碳酸酯；
(3)制备含有双硫键的聚氨酯
将二硫代二乙基对硝基苯基碳酸酯和二伯胺化合物加入到有机溶剂中进行反应；
(4)反应完毕后，加入去离子水稀释，每1mmol反应物加入20mL ddH2O(重蒸水),用1M盐酸调节pH值到6，然后用透析袋透析、冷冻干燥，得到含有双硫键的聚氨酯。
所述的步骤(1)中二硫代二乙二醇(DTDE)和吡啶的按摩尔比为1:(1～3)；搅拌溶解10-30分钟。
所述的步骤(1)或(3)中的有机溶剂为三氯甲烷或二甲基甲酰胺。
所述的步骤(1)中对硝基苯基氯甲酸酯(PNC)与二硫代二乙二醇(DTDE)的摩尔比为1:(1～5)。
所述的步骤(1)中PNC加入到反应器内，室温反应24-36小时。
所述的步骤(2)中，反应结束后，混合物用磷酸氢二钠溶液洗涤1-3次，再用去离子水洗涤。
所述的步骤(3)中二伯胺类化合物选自氨基酸、1,4-双(3-氨基丙基)-哌嗪、N-甲基-2,2’-二氨基二乙胺、双(2-氨基乙基)2-(叔丁氧羰基氨基)乙基胺或1,4-哌嗪二乙胺等。
所述的步骤(3)中，二硫代二乙基对硝基苯基碳酸酯与二伯胺化合物的摩尔比为1:1，室温反应5-9天。
所述的步骤(4)中，透析袋的截留分子量为1000-3000。
一种上述含有双硫键的聚氨酯作为基因转染试剂的用途。可以转染多种哺乳动物细胞株，产生较高的基因表达效率。
所述的用途包括如下步骤：
(1)将培养至85-90％融合的所需细胞用胰蛋白酶消化、计数，并以4-15×104/孔接种24孔板，置于培养箱中培养约24h，至细胞达50-70％融合；
(2)按N/P比为2.5、5、10、15、20、40、80将不同浓度比例的聚氨酯与pCMV-GFP质粒进行复合，室温复合半个小时；
转染时，将孔板中的细胞培养基吸除，以PBS缓冲液冲洗细胞，更换新鲜无血清培养基于培养箱中培养1h，，随后向孔板中滴加质粒复合物，充分混匀后置培养箱培养1-4h；
(3)吸去培养基，加入含10％胎牛血清和100U/ml双抗(青霉素和链霉素)的培养基，置培养箱培养，44-48h后用倒置荧光显微镜观察细胞绿色荧光表达情况并拍照。
通过上述方法制备的聚氨酯具有很低的细胞毒性和生物相容性。本发明提供的含有双硫键的聚氨酯基因转染试剂可适用于萤火虫荧光素酶、绿色荧光蛋白等报告基因，以及其它实验所需功的基因质粒。
与现有技术相比，本发明有如下优点：
(1)本发明通过对二硝基苯基碳酸酯与二伯胺化合物逐步聚合方法制备聚氨酯。不同于传统的聚氨酯制备方法，即二异氰酸酯或多异氰酸酯与二羟基或多羟基化合物聚合。
该方法使用的反应试剂无毒无污染、成本低廉，具有可推广性；合成反应中无需添加特殊的缩合剂及催化剂、反应条件温和、副反应少；本方法便于引入双硫键和胺基官能团，可以得到结构多样性的聚氨酯。
(2)本发明中制备的含有双硫键和胺基的聚氨酯相比普通聚氨酯能够有效的提高包裹基因的能力以及在胞浆内释放基因的能力。因此，该类新型的聚氨酯生物相容性好，细胞毒性低。经实验证明，该系列材料制备的基因复合物在多种哺乳细胞株(如293T、HepG2、MC3T3、SKOV3、MCF-7等)的转染试验中，均表现出比商业化转染试剂(ExGen500、Lipofectamine2000)更高的转染效率和更低的细胞毒性。因此，本发明制备的含有双硫键聚氨酯在基因转染试剂领域具有良好的产业化前景。
附图说明
图1为本发明实施例二硫代二乙醇对硝基苯基碳酸酯的1H NMR谱图。
图2为本发明实施例含有1,4-双(3-氨基丙基)-哌嗪的聚氨酯的1H NMR谱图。
图3为本发明实施例含有三(2-氨乙基)胺的聚氨酯的1H NMR谱图。
图4为本发明实施例含有1,4-哌嗪二乙胺的聚氨酯的1H NMR谱图。
图5为本发明实施例含有N-甲基-2,2’-二氨基二乙胺的聚氨酯的1H NMR谱图。
图6为本发明实施例含有双硫键聚氨酯高效转染a)293T、b)HepG2、c)MCF-7细胞表达绿色荧光蛋白(GFP)基因。
图7本发明实施例含有双硫键的聚氨酯的细胞毒性的评价。(注：样品1：含有1,4-双(3-氨基丙基)-哌嗪的聚氨酯；样品2：含有三(2-氨乙基)胺的聚氨酯；样品3：含有1,4-哌嗪二乙胺的聚氨酯；样品4：含有N-甲基-2,2’-二氨基二乙胺的聚氨酯)
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明
实施例1：合成二硫代二乙醇对硝基苯基碳酸酯(DTDE-PNC)
(1)将二硫代二乙二醇(DTDE，4g)和吡啶(7.4g)两者摩尔比1:1，加入40ml的无水二甲基甲酰胺中搅拌溶解10-30分钟，缓慢加入对硝基苯基氯甲酸酯(PNC，10.3g)对硝基苯基氯甲酸酯(PNC)与二硫代二乙二醇(DTDE)的摩尔比为1:1.5，室温反应24小时；
(2)将反应结束的混合物用磷酸氢二钠溶液洗涤一次，再用去离子水洗涤，旋转蒸发除去溶剂；反应粗产品用硅胶株分离提纯得到纯浅黄色产品二硫代二乙基对硝基苯基碳酸酯(7.4g，产率58％)。1HNMR(300MHz,CDCl3,ppm)：δ8.26(aromatic protons,4H)；7.37(aromatic protons,4H)；4.57(2×SSCH2CH2,4H)；3.08(2×SSCH2CH2,4H)(见图1)。
实施例2：合成含有1,4-双(3-氨基丙基)-哌嗪的聚氨酯
(1)将实施例1制备的DTDE-PNC(1.21g)和1,4-双(3-氨基丙基)-哌嗪(0.5g)两者摩尔比例1:1，放入圆底烧瓶中；用5ml三氯甲烷溶解，在室温下反应5天；
(2)反应产物用10ml去离子水溶解；用盐酸将pH值调到6用分子截留量为1000g/mol的透析袋透析；冷冻干燥，得到固体产物含有双硫键的聚氨酯(0.7g，产率65％)。聚合度n为300-350。
固体产物的核磁数据为：1HNMR(D2O)δ(ppm)＝4.30(2×SSCH2CH2,4H)；3.4-4.0(2×NCH2CH2N,8H)；3.31(2×OCONHCH2,4H)；3.21(2×OCONHCH2CH2,4H)；2.95(2×SSCH2CH2,4H)；1.95(2×CH2CH2CH2,4H)(见图2)。
实施例3：合成含有三(2-氨乙基)胺的聚氨酯
(1)将等摩尔比的DTDE-PNC(1.83g)和双(2-氨基乙基)2-(叔丁氧羰基氨基)乙基胺(0.93g)放入烧瓶中；
(2)用5ml二甲基甲酰胺溶解，在室温下反应5天；
(3)反应结束后，加入20ml三氟乙酸反应6h，减压旋转蒸发掉三氟乙酸；
(4)反应产物用10ml去离子水溶解，将pH值调到6；
(5)用分子截留量为1000g/mol的透析袋透析；
(6)冷冻干燥，得到固体产物(0.25g，产率18％)。聚合度n为200-250；1HNMR(D2O)δ(ppm)＝4.33(2×SSCH2CH2,4H)；3.65(CH2CH2NH2,2H)；3.56(2×OCONHCH2,4H)；3.47(CH2N(CH2)CH2,6H)；2.98(2×SSCH2CH2,4H)(见图3)。
实施例4：合成含有1,4-哌嗪二乙胺的聚氨酯
(1)将等摩尔比例的DTDE-PNC(0.96g)和1,4-哌嗪二乙胺(0.34g)放入放入烧瓶中；用5ml二甲基甲酰胺溶解，在室温下反应5天；
(2)反应结束后，用10ml去离子水溶解产物，用盐酸将pH值调到6，用分子截留量为1000g/mol的透析袋透析；冷冻干燥，得到固体产物(0.3g，产率42％)。聚合度n为200-300；1H NMR(D2O)δ(ppm)＝4.33(2×SSCH2CH2,4H)；3.65(CH2CH2NH2,2H)；3.56(2×OCONHCH2,4H)；3.47(CH2N(CH2)CH2,6H)；2.98(2×SSCH 2CH2,4H)(见图4)。
实施例5：合成含有N-甲基-2,2’-二氨基二乙胺的聚氨酯
(1)将等摩尔比例的DTDE-PNC(1.03g)和N-甲基-2,2’-二氨基二乙胺(0.26g)放入圆底烧瓶中；用10ml二甲基甲酰胺溶解，在室温下反应5天；
(2)反应结束后，用10ml去离子水溶解产物，用盐酸将pH值调到6，用分子截留量为1000g/mol的透析袋透析；冷冻干燥，得到固体产物(0.2g，产率29％)。聚合度n为300-400；1H NMR(D2O)δ(ppm)＝4.33(2×SSCH2CH2,4H)；3.55(2×OCONHCH2,4H)；3.38(CH2N(CH3)CH2,4H)；3.00(CH2N(CH3)CH2,3H)；2.95(2×SSCH2CH2,4H)(见图5)。
以上实施例2-5合成的聚氨酯均采用红外分析和1H NMR表征，由核磁共振图谱分析可知在δ8.26,7.37的苯环上氢的特征峰消失，说明这些聚合物终端没有对硝基苯酚官能团，已经被伯胺分子反应掉，合成成功。红外光谱显示在1700cm-1和1530cm cm-1处的吸收峰是C-O-C的对称和非对称震动峰，证明了氨酯键存在。采用凝胶渗透色谱(GPC)测试这些聚合物的分子量在11.3-19.6kDa之间，并且有较低的分散度(PDI 1.2-1.5)。表征结果证明了含有双硫键的聚氨酯被成功的合成。
实施例6：含有双硫键的聚氨酯转染MCF-7细胞株
(1)培养至85-90％融合的所需细胞用胰蛋白酶消化、计数，并以4×104/孔接种24孔板，置于培养箱中培养约24h，至细胞达50-70％融合；
(2)对细胞进行分组，每亚组设平行的3个复孔，并设空白对照组，及以ExGen500和lipofectamine 2000作为转染试剂的阳性对照组；
(3)配置N/P比为2.5、5、10、15、20、40、80不同浓度比例的实施例2-5制备的阳离子聚氨酯聚合物与pCMV-GFP质粒的混合物。并按ExGen500和lipofectamine 2000的说明书要求，配置质粒复合物；
(4)将孔板中的细胞培养基吸除，以PBS冲洗细胞，更换新鲜无血清培养基于培养箱中培养1h；
(5)按照不同组别向孔板中滴加质粒复合物，充分混匀后置培养箱培养1h；
(6)吸除孔板中的液体，以PBS冲洗细胞，更换新鲜的含10％胎牛血清和100U/ml双抗的培养基，置培养箱培养，48h后用倒置荧光显微镜观察细胞绿色荧光表达情况并拍照。其中采用实施例2制得的阳离子聚氨酯聚合物转染MCF-7细胞株的实验结果如图6所示。
实施例7：含有双硫键的聚氨酯对MCF-7细胞毒性的评价
(1)步骤如实施例6步骤1-2；
(2)将实施例2-5中制备聚合物与无血清培养基配制成含有不同样品浓度(2、4、8、15、30、60、100μg/mL)培养基500μl，
(3)将孔板中的细胞培养基吸除，以PBS冲洗细胞，更换含有不同样品浓度的培养基500μl于培养箱中培养4h，将孔板中的细胞培养基吸除，以PBS冲洗细胞，更换新鲜的含10％胎牛血清和100U/ml双抗的培养基，置培养箱培养44小时。
(4)配置10:1的RPMI 1640(无酚红)与Alamar Blue混合液，充分混匀，预热至37℃；
(5)吸除孔板中的培养基，PBS冲洗细胞后，每孔加入500μl上述混液，于培养箱中培养3h；
(6)每孔吸取200μl上清液，按分组顺序依次加入一个新的96孔板；
(7)将96孔板置于酶标仪上，以630nm为参考波长，570nm为试验波长，测定各孔吸光度；
(8)按照公式计算细胞对Alamar Blue的还原率：细胞Alamar Blue还原率＝OD570-OD630；
(9)细胞存活率(％)＝各组细胞Alamar Blue还原率/阴性对照组细胞Alamar Blue还原率×100。实验结果如图7。
实施例6中细胞转染结果和实施例7含有双硫键聚氨酯的细胞毒性评价结果表明，相对于目前的商业化试剂ExGen500和lipofectamine 2000，本发明合成含有双硫键的聚氨酯与基因的复合物对转染细胞有更高的基因转染效率，并且对于转染细胞的生物安全性良好。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和应用本发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于这里的实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种含有双硫键的聚氨酯，其特征在于：其结构式如式(1)所示：
其中，R基团选自 聚合度n为200～400。
2.一种上述权利要求1所述的含有双硫键的聚氨酯的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)通过取代反应合成出二硫代二乙基对硝基苯基碳酸酯
将二硫代二乙二醇和吡啶加入到有机溶剂中搅拌溶解，然后将对硝基苯基氯甲酸酯加入到反应器内，进行反应；
(2)反应结束后将混合物洗涤，然后蒸掉有机溶剂后，用硅胶柱提纯得到二硫代二乙基对硝基苯基碳酸酯；
(3)制备含有双硫键的聚氨酯
将二硫代二乙基对硝基苯基碳酸酯和二伯胺化合物加入到有机溶剂中进行反应；
(4)反应完毕后，加入去离子水稀释，每1mmol反应物加入20mL重蒸水,用1M盐酸调节pH值到6，然后用透析袋透析、冷冻干燥，得到含有双硫键的聚氨酯。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述的步骤(1)中二硫代二乙二醇与吡啶的按摩尔比为1:(1～3)；搅拌溶解10-30分钟；
或所述的步骤(1)中对硝基苯基氯甲酸酯与二硫代二乙二醇的摩尔比为1:(1～5)。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述的步骤(1)或(3)中的有机溶剂为三氯甲烷或二甲基甲酰胺。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述的步骤(1)中对硝基苯基氯甲酸酯加入到反应器内，室温反应24-36小时。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述的步骤(2)中，反应结束后，混合物用磷酸氢二钠溶液洗涤1-3次，再用去离子水洗涤。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述的步骤(3)中二伯胺类化合物选自1,4-双(3-氨基丙基)-哌嗪、N-甲基-2,2’-二氨基二乙胺、双(2-氨基乙基)2-(叔丁氧羰基氨基)乙基胺或1,4-哌嗪二乙胺；
或所述的步骤(3)中，二硫代二乙基对硝基苯基碳酸酯与二伯胺化合物的摩尔比为1:1，室温反应5-9天。
8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述的步骤(4)中，透析袋的截留分子量为1000-3000。
9.一种上述权利要求1所述的含有双硫键的聚氨酯作为基因转染试剂的用途。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于：所述的用途包括如下步骤：
(1)将培养至85-90％融合的所需细胞用胰蛋白酶消化、计数，并以4-15×104/孔接种24孔板，置于培养箱中培养约24h，至细胞达50-70％融合；
(2)按N/P比为2.5、5、10、15、20、40、80将不同浓度比例的聚氨酯与pCMV-GFP质粒进行复合，室温复合半个小时；
转染时，将孔板中的细胞培养基吸除，以PBS缓冲液冲洗细胞，更换新鲜无血清培养基于培养箱中培养1h，随后向孔板中滴加质粒复合物，充分混匀后置培养箱培养1-4h；
(3)吸去培养基，加入含10％胎牛血清和100U/ml双抗的培养基，置培养箱培养，44-48h后用倒置荧光显微镜观察细胞绿色荧光表达情况并拍照。
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