CN103087219B - 一种树枝状肝素纳米材料修饰的生物型人造血管 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种树枝状肝素纳米材料及其修饰的生物型人造血管。本发明所提供的树枝状肝素纳米材料具有式I所示的末端分支单元，它是由端基为酰肼基的聚酰胺胺型树枝状高分子与肝素反应得到的；所述聚酰胺胺型树枝状高分子的内核为胱胺，其树枝骨架为酰肼修饰的半代聚酰胺胺(包括-0.5，0.5，1.5，2.5，3.5，4.5，5.5，6.5，7.5)，肝素与聚酰胺胺的连接为聚酰胺胺表面酰肼与肝素还原末端反应形成的糖苷键。将上述树枝状肝素纳米材料通过还原剂将其中的二硫键切断，得到了可与血管支架材料反应的巯基位点；通过双向官能团的偶联剂将血管内表面活化，具有分支结构的肝素即可通过化学键共价固定于血管材料内表面，从而获得具有抗凝作用的复合型人造血管。
Description
技术领域
本发明涉及一种树枝状肝素纳米材料修饰的生物型人造血管。
背景技术
人造血管主要用于人体组织血管的替代修复。目前基于人造材料(如涤纶、聚四氟乙烯)的大口径人造血管已应用于临床，而小口径人造血管(直径小于6mm)一直没有临床产品。主要原因有小口径血管的血流速度慢、血压低，容易发生急性血栓、吻合处内膜增生、动脉瘤、感染以及动脉粥样硬化。目前临床治疗中，小口径血管移植替代物多为自体血管(如取自大隐静脉的血管组织)，然而许多患者可能由于其它的血管疾病或血管组织缺失，无法提供可移植的血管。小口径人工血管因而在冠状动脉、脑血管、糖尿病足修复、血管造瘘及体外血液透析等治疗途径中有着迫切的临床需要。
脱细胞基质是通过对动物组织和器官进行固化和脱细胞等加工工序，获得的生物相容型的生物型基质，可以用于人体缺损组织的修复与重建，实现组织和器官的原位再生和功能恢复。相对于传统组织工程和再生医学中的人工型支架，脱细胞基质能保留生物组织异常复杂的成分和结构，因而具有人工材料无法比拟的化学和力学等生物性能。然而脱细胞基质虽然具有天然结构和成分，其表面性质可能仍然无法满足生物材料相容性和组织再生的需求。基于脱细胞基质的小口径血管(即生物型血管)目前存在以下问题：血栓一般会在半年内时间形成；血管内表面内皮化以及血管平滑肌细胞对植入型材料的再生重塑过程难以发生。
通过对血管内表面进行抗凝修饰是一种最常用的减少血管内血栓形成和提高材料血液相容性的方法。而肝素材料在大口径血管产品中已经得到了应用(参考文献：1.Daenens K，Schepers S，Fourneau I.Heparin-bonded ePTFE grafts compared with vein grafts infemoropopliteal and femorocrual bypasses：1-and 2-year results.J Vasc Surg 2009；49(5)：1210-62.Janczak D，Pupka A，Skora J.The use of the heparin-bonded ePTFE grafts for needs of hehemodialysis.Polim Med 2010；40(4)：35-9 3.Pupka A，Janczak D，Szyber PP.Theheparin-bonded ePTFE grafts in revascularisation of the lower limbs.Polim Med 2010；40(1)：9-144.Hugl B，Nevelsteen A，Daenens K.PEPE II--a multicenter study with an end-pointheparin-bonded expanded polytetrafluoroethylene vascular graft for above and below knee bypasssurgery：determinants ofpatency.J Cardiovasc Surg(Torino)2009；50(2)：195-203.)。
肝素是一种重要的细胞外基质糖胺聚糖物质，由D-β-葡糖醛酸(或L-α-艾杜糖醛酸)和N-乙酰氨基葡糖形成重复二糖单位组成，高度带负电荷，胺基硫酸化程度高。肝素结构如式1所表示，其结构呈不均一状态，包括氨基硫酸化的数目和位置不均一，平均分子量不均一等，其中氨基葡萄糖残基的硫酸化大部分发生在C6位，少部分发生在C3和C2位氨基上，而乙酰化选择性发生在氨基葡萄糖的C2位氨基上。氨基葡萄糖C3上的硫酸化是结合抗凝血酶III(AntiThrombin-III)的重要结构。而由于其带有很高的负电荷密度，各糖环之间有较强的排斥力因而其分子链不易交叉扭曲，呈一种线性的空间结构。
式1肝素结构式X＝sulfo or H，Y＝sulfo or H or Ac
式2与ATIII结合的五糖结构
凝血酶的激活是血栓形成的主要因素之一，而肝素的抗凝效果主要是与ATIII结合，抑制凝血酶的激活并抑制血小板聚集，减少暂时性血小板凝块转变成永久性血纤蛋白凝块的几率，降低血液粘度以维持正常的血液流动，从而防止血栓的形成。以式(II)中的五糖结构为单元，含有该五糖单位的肝素，可以有效和ATIII结合，结合后使ATIII的活性增加2*103倍，可直接抑制凝血因子FXa，从而产生高效的抗凝效果。而与FIIa结合需要更长的heparin链(至少7个二糖单位长)。而普通肝素临床应用具有半衰期短、易受血小板因子IV影响等不良效果。而低分子量肝素在保留了抗血栓形成的功能之外，具有更好的抗FXa能力和稳定疗效，而为保留其完整的五糖单元结构，降解的分子量应在2500以上。为区分抗FXa与抗FXa/FIIa两种低分子量肝素的特点，选择了3-5K和5-10K两种分子量区间的肝素(肝素与FXa和FIIa结合原理差异见图1)。
然而目前肝素修饰方法存在下述问题：
1.如果是合成型材料，一般需要在材料表面进行预处理获得化学官能团和可以复合肝素的物质；
2.利用天然材料的官能团可以对血管内表面修饰，但目前的方法一般需要直接通过肝素羧基与材料表面氨基等官能团反应，该反应方法很难有明确的肝素修饰位点，同时肝素的活性难以保证；
3.由于血管材料表面可修饰基团的数量限制，肝素的修饰量难以得到调控。
树枝状高分子是一种人工合成的纳米材料，具有高度可控的分支结构、纳米尺寸。树枝状高分子已经广泛应用于仿生型生物材料研究中，具有毒性小、可降解和无免疫原性等特点(参考文献：1、Menjoge AR，Kannan RM，Tomalia DA.Dendrimer-based drug and imagingconjugates：design considerations for nanomedical applications.Drug Discov Today 2010Mar；15(5-6)：171-185.2、Roglin L，Lempens EH，Meijer EW.A synthetic″tour de force″：well-defined multivalent and multimodal dendritic structures for biomedical applications.AngewChem Int Ed Engl 2011 Jan 3；50(1)：102-112.3、Chabre YM，Roy R.Recent trends inglycodendrimer syntheses and applications.Curr Top Med Chem 2008；8(14)：1237-1285.4、Kiessling LL，Gestwicki JE，Strong LE.Synthetic multivalent ligands in the exploration ofcell-surface interactions.Curr Opin Chem Biol 2000 Dec；4(6)：696-703.)。将树枝状高分子与多糖和多肽功能性片段结合，可以使多重的功能片段聚集于纳米尺度，往往能通过多价性特点增强功能性片段与受体及细胞之间的相互作用。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种树枝状肝素纳米材料及其制备方法。
本发明所提供的树枝状肝素纳米材料具有式I所示的末端分支单元，它是由端基为酰肼基的聚酰胺胺型树枝状高分子与式II所示的肝素反应得到的；
所述聚酰胺胺型树枝状高分子的内核为胱胺，树枝骨架为酰肼修饰的半代聚酰胺胺(包括G-0.5，0.5，1.5，2.5，3.5，4.5，5.5，6.5，7.5)，肝素与聚酰胺胺的连接为聚酰胺胺表面酰肼与肝素还原末端反应形成的糖苷键：
其中，式I中R2＝H或SO3H，R3＝H、COCH3或SO3H，n＝1-50；
式II中R2、R3、n的定义同式I。
式II所示肝素中每个二糖单元含1.8-2.5个磺酸基团。
式II中的n值可进一步为4-8(对应分子量为3k-5k)或8-16(对应分子量为5k-10K)。相应的式I中的n值可进一步为4-8或8-16。
当聚酰胺胺型树枝状高分子为0.5代(G0.5)聚酰胺胺型树枝状高分子时，所述树枝状肝素纳米材料的结构式如式III所示，其中，所述式III中R2、R3、n的定义同式I；
当聚酰胺胺型树枝状高分子为2.5代(G2.5)聚酰胺胺型树枝状高分子时，所述树枝状肝素纳米材料的结构式如式IV所示，其中，所述式IV中R2、R3、n的定义同式I；
本发明所提供的树枝状肝素纳米材料中式II所示的肝素的端基修饰度可为1％-100％，进一步可为30％-40％。
上述树枝状肝素纳米材料的制备方法，包括下述步骤：
1)制备内核为胱胺的半代聚酰胺胺型树枝状高分子(包括G-0.5，0.5，1.5，2.5，3.5，4.5，5.5，6.5，7.5)；
2)将步骤1)制备的内核为胱胺的半代聚酰胺胺型树枝状高分子与一水合肼进行反应，得到端基为酰肼基的半代聚酰胺胺型树枝状高分子；
3)将步骤2)制备的端基为酰肼基的半代聚酰胺胺型树枝状高分子与权利要求1中式II所示的肝素进行反应，得到所述树枝状肝素纳米材料。
其中，步骤2)中所述半代聚酰胺胺型树枝状高分子的加入量以其端基的摩尔数计，其与一水合肼的摩尔比为1∶10-1∶12；步骤2)中所述反应的反应温度为55±1℃，反应时间为24±0.5小时。
步骤3)中所述端基为酰肼基的半代聚酰胺胺型树枝状高分子的加入量以其端基酰肼基的摩尔数计，其与肝素的摩尔比为1∶0.01-1∶10，具体可为1.0∶1-1.1∶1，此时所制备的树枝状肝素纳米材料中肝素修饰度为30％-40％；步骤2)中所述反应的反应温度为50±0.5℃，反应时间为24±0.5小时。
本发明的另一个目的是提供一种末端巯基化肝素纳米材料。
本发明中所述末端巯基化肝素纳米材料，是将本发明所提供的树枝状肝素纳米材料在还原剂的作用下使二硫键断裂形成巯基得到的。
当所述树枝状肝素纳米材料为式III所示的树枝状肝素纳米材料时，该末端巯基化肝素纳米材料的结构式如式V所示：
其中，所述式V中R2、R3、n的定义同式III。
当所述树枝状肝素纳米材料为式IV所示的树枝状肝素纳米材料时，该末端巯基化肝素纳米材料的结构式如式VI所示：
其中，所述式VI中R2、R3、n的定义同式IV。
上述在使二硫键断裂形成巯基的反应中，所用的还原剂具体可为TCEP。
本发明中所提供的树枝状肝素纳米材料以及末端巯基化的肝素纳米材料可用于制备抗凝剂或在植入性医用材料的抗凝修饰中得以应用。
本发明还保护一种树枝状肝素纳米材料修饰的生物型人工血管。
所述树枝状肝素纳米材料修饰的生物型人工血管是按照包括下述步骤的方法制备得到的：1)采用能分别与巯基和氨基进行反应的具有双向官能团的偶联剂对生物型人工血管内表面进行氨基活化处理；
2)将活化后的生物型人工血管与本发明提供的末端巯基化肝素纳米材料进行反应，得到树枝状肝素纳米材料修饰的生物型人工血管。
步骤1)中所述具有双向官能团的偶联剂具体可为SM(PEG)2。
采用SM(PEG)2对生物型人工血管内表面进行活化处理的具体方法如下：1)将生物型人工血管的一端标记长度并用夹子夹持，把SM(PEG)2的DMSO溶液加入到生物型人工血管内部，然后再加入DPBS缓冲液使待处理的人工血管内表面完全浸没至标记长度，然后将另一端以同样的夹子夹持；2)将生物型人工血管悬浮于容器中，在搅拌状态下于37±0.5℃反应30±1分钟，吸出生物型人工血管中的溶液并用DPBS缓冲液洗涤血管内壁。
步骤1)中对生物型人工血管内表面进行的氨基活化度可为1％-100％，具体可为50％。
当选择50％的氨基活化度时，在活化过程中，SM(PEG)2加入量与人工血管内表面氨基的摩尔比可为1.5∶1-2.0∶1。
活化后的生物型人工血管与末端巯基化肝素纳米材料进行反应时，其所述反应的反应温度为37±0.5℃，反应时间为12±0.5小时；所述末端巯基化肝素纳米材料的加入量以其末端的巯基计，其为人工血管内表面氨基摩尔量的1-100％。
当采用本发明制备的G0.5或G2.5规格的树枝状肝素按照1-100％的血管修饰度修饰人工血管时，所述树枝状肝素的量为0-0.160mg heparin/mg血管支架，或者0-11.60mg heparin/cm2血管内表面积。
本发明基于树枝状分子的合成方法，用酰肼基团替代表面的氨基，表面为阳离子氨基的树枝状高分子材料聚酰胺胺(polyamidoamine，PAMAM)被改造成中性的纳米基底材料。将动物源大分子量肝素通过肝素酶降解，获得不同分子量范围的肝素寡糖链段。利用多糖分子半缩醛还原性末端和酰肼基团的反应，将肝素寡糖与具有胱胺核的PAMAM树枝状高分子直接进行化学键偶联，形成N-糖苷键，从而获得了可以进一步用于表面修饰的肝素纳米材料，即肝素-PAMAM。该纳米材料具有分支状结构，可以连接不同分子量的肝素，其分支数和纳米形貌尺寸可以通过树枝状高分子基底材料得到调控。
然后通过还原剂将肝素-PAMAM中的二硫键切断，从而得到了可与血管支架材料反应的巯基位点。通过双向官能团的偶联剂将血管内表面活化，具有分支结构的肝素即可通过化学键共价固定于血管材料内表面，从而获得具有抗凝作用的复合型人造血管。
本发明通过设计肝素与树枝状高分子的复合材料，得到可控纳米结构后，对脱细胞基质人工血管材料内表面进行抗凝处理。肝素寡糖通过专一末端反应位点连接于树枝状高分子，因而最大程度保留了肝素分子的天然性质。利用树枝状的高分子骨架获得的肝素空间构型，可以提高局部控制肝素的聚集密度。在溶液中，用显色底物法进行测量，同等肝素质量下比较线性和两代纳米肝素材料的效果显示，这种特殊的多价性结构相对于单分支肝素分子显示了更好的与抗凝血酶III(Antithrombin III，简写作ATIII)结合后，增强ATIII活性并抑制凝血因子FXa的性质。当该肝素-PAMAM纳米材料修饰于血管内表面，提高了血管内壁抵抗血小板粘附并降低了凝血作用。本发明提供的肝素与树枝状高分子的复合物是一种新的抗凝物质，在抗凝制剂和植入型医用材料中有着实际应用的前景。在此基础上所获得的人工血管可以成新的血管组织替代修复产品。
附图说明
图1为肝素与FXa和FIIa结合原理差异示意图。
图2为制备肝素修饰的酰肼化CysPAMAM的反应流程图。
图3为制备肝素寡糖修饰的酰肼化CysPAMAM的反应流程图。
图4为Heparin5-10K+G0.5 CysPAMAM的核磁共振氢谱图。
图5为Heparin5-10K+G2.5 CysPAMAM的核磁共振氢谱图。
图6为Heparin3-5K+G0.5 CysPAMAM的核磁共振氢谱图。
图7为Heparin3-5K+G2.5 CysPAMAM的核磁共振氢谱图。
图8为巯基纳米肝素通过SM(PEG)2修饰到人工血管上的反应示意图。
图9为血管黏附的血小板的扫描电子显微镜照片，A为修饰后血管，B为空白血管。
图10为血管黏附的血小板数目柱形图。
图11为血管的血浆复钙时间柱形图。
图12为血管的凝血酶原时间柱形图。
图13为血管的活化的部分凝血活酶时间柱形图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实验用水为经过蒸馏和离子交换处理的18兆欧水(格兰特，石家庄，中国)；胱胺核聚酰胺胺(CysPAMAM)G2.0、抗凝血酶III(ATIII)、I型肝素酶、硼氰化钠、三硝基苯磺酸钠(TNBSA)、二甲亚砜(DMSO)、1.9二甲基亚甲基蓝(DMMB)、5，5’二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)从Sigma-Aldrich(Milwaukee，WI)购买；乙二胺、丙烯酸甲酯、猪小肠粘膜提取肝素、还原剂TCEP、三羟甲基胺基甲烷盐酸盐(Tris)、甘氨酸和硼酸钠等从Alfa Aesar(Ward Hill，MA)购买；凝血因子X(FXa)购自New England biolabs(NE，US)；显色底物S2222购自Chromogenix(Milano，Italy)偶联剂SM(PEG)2从Pierce Biotech.(Rockford，IL)购买；杜氏磷酸缓冲液(DPBS)从Invitrogen(Carlsbad，CA)购买；血酶原(PT)试剂购自协和生物(成都，中国)；APTT试剂购自和生物(成都，中国)。截留分子量10K及3K的超滤管购自Amicon(Mumbai，India)，截留分子量5K超滤管的购自赛多利斯(Germany)。
所述生物型人工血管是取自健康成年猪的胸主动脉，采用文献中所提到的处理方法而制得的脱细胞人工血管。(O.E.Teebken，A.Bade，G.Steinhoff.Tissue engineering of vasculargrafts：human cell seeding of decellularised porcine matrix.Eur J Vasc Endovasc Surg2000；19(4)：381-6)
实施例1、肝素寡糖的制备
1、酶降解法制备3-5K及5-10K肝素
由猪小肠粘膜提取的肝素，经过一定时间的I型肝素酶降解，然后用含分子量选择性强的超滤膜超滤并透析获得：
(1)配制0.1M的Tris-盐酸缓冲液，pH调节为7.00±0.02之间。
(2)称取806.9mg的heparin粉末(白色)，在生物安全柜中紫外杀菌30±1分钟。将其加入用220微米孔径滤器滤菌后的Tris缓冲液16.0ml。(取样并用pH计测量体系pH值，为7.08)。
(3)再次用滤膜滤菌。加入100μl 100单位(sigma单位，约为600分之一国际单位)的heparinase-Tris缓冲液，37℃无菌酶解96h，然后95℃煮5分钟使酶失活。
(4)先分别用10,000的超滤管超滤，小于10,000的滤液用截留分子量1000的透析袋透析96h(20倍体积去离子水，6-8h换一次水)以除去溶液中的盐类等小分子。然后用截留分子量5,000的超滤管超滤6次，每次20mins，离心速度为4900转/分钟，得到分子量5-10K的肝素水溶液，然后-80℃冷冻之后冻干，最后得到5-10K肝素的质量为245.5mg，产率为：30.3％。
(5)分子量小于5000的用分子截留量3,000的超滤管超滤6次，得到3-5K的产品，96h产品质量为63.6mg，产率为7.86％。
实施例2、合成酰肼化CysPAMAM(CysPAMAM-HYD)和肝素修饰的酰肼化CysPAMAM
原理如下：先制备全部为酰肼端基的胱胺核聚酰胺胺(CysPAMAM)，然后通过保留半缩醛结构的肝素其还原端和酰肼基团的共价反应，无需催化剂作用，在温和条件下将肝素寡糖定位地通过端基修饰到CysPAMAM-HYD上，反应流程见图2。
1、合成CysPAMAM-HYD：
(1)制备G0.5 CysPAMAM和G2.5 CysPAMAM：
在冰浴搅拌下，缓慢将丙烯酸甲酯加入到浓度为50mg/ml的胱胺-甲醇溶液中，在37℃水浴中反应48h(胱胺与丙烯酸甲酯的摩尔比为1∶20，丙烯酸甲酯过量)，之后在65℃下通过悬蒸去除溶剂和未反应的丙烯酸甲酯，得到-0.5代的CysPAMAM，真空干燥后4℃存储。
(2)在冰浴搅拌下，缓慢将乙二胺加入到浓度为50mg/ml的G-0.5 CysPAMAM溶液中，0度冰浴中反应120h(-0.5代CysPAMAM与乙二胺的摩尔比为1∶40，乙二胺过量)，之后在75℃下通过旋蒸去除溶剂和未反应的乙二胺，得到第0代(G0)CysPAMAM，真空干燥后4℃存储。
(3)在冰浴搅拌下，缓慢将丙烯酸甲酯加入到浓度为50mg/ml的G0.0 CysPAMAM溶液中，37℃水浴中反应48h(G0.0 CysPAMAM与丙烯酸甲酯的摩尔比为1∶40，丙烯酸甲酯过量)，之后在65℃下通过旋蒸去除小分子溶剂和未反应的丙烯酸甲酯，得到G0.5 CysPAMAM，真空干燥后4℃存储。
(4)在冰浴搅拌下，缓慢将丙烯酸甲酯加入到浓度为50mg/ml的G2.0 CysPAMAM溶液中，37℃水浴中反应48h(G2.0 CysPAMAM与丙烯酸甲酯的摩尔比为1∶160，丙烯酸甲酯过量)，之后在65℃下通过旋蒸去除小分子溶剂和未反应的丙烯酸甲酯，得到G2.5 CysPAMAM，真空干燥后4℃存储。
(5)制备G0.5 CysPAMAM-HYD：
将G0.5 CysPAMAM用乙醇溶解成50mg/ml的溶液，与一水合肼在55℃下回流反应24小时(G0.5 CysPAMAM与一水合肼的摩尔比为1∶80)，得到G0.5 CysPAMAM-HYD，通过65℃旋蒸除掉溶剂，用水重新溶解后经截留分子量为500的透析袋透析后冻干，密封保存于-20℃。
(6)制备G2.5 CysPAMAM-HYD：
将G2.5 CysPAMAM用乙醇溶解成50mg/ml的溶液，与一水合肼在55℃下回流反应24小时(G2.5 CysPAMAM与一水合肼的摩尔比为1∶320)，得到G2.5 CysPAMAM-HYD，通过65℃悬蒸除掉溶剂，用水重新溶解后经截留分子量为2000的透析袋透析后冻干，密封保存于-20℃。
2、合成肝素寡糖修饰的酰肼化CysPAMAM(Heparin-CysPAMAM-HYD，缩写为HCPH)
原理如下：将肝素通过肝素酶降解，使其保留半缩醛结构的还原端，并且获得不同分子量范围的肝素寡糖链段。利用多糖分子的还原末端和酰肼基团的共价反应，将肝素寡糖定位地通过端基修饰到CysPAMAM-HYD上，然后用TCEP还原CysPAMAM的二硫键，形成相应的扇形结构，反应流程见图3。
制备HCPH的具体步骤如下：
(1)将CysPAMAM-HYD G0.5或G2.5用0.2M、pH5.0的自制磷酸缓冲液溶解成1mg/ml溶液。
(2)将酶解得到的heparin定量加入步骤(1)的溶液中，在50℃水浴中反应24小时，CysPAMAM-HYD端基与heparin(按分子量中位值计算)的摩尔比为1∶1，反应质量比见下表：
表1
3、末端巯基化纳米肝素的制备(TCEP还原法)
(1)将2-(2)中得到的HCPH溶于自制PBS中，制成10mg/ml溶液，然后加入10mg/mL的TCEP溶液(2倍摩尔量)，调节pH为5.18，反应12±0.5小时，用截留分子量3000的超滤管超滤7次，每次加入3ml去离子水超滤20分钟，冻干后得到产品，产率85％以上。-20度密封保存。
4、末端巯基化纳米肝素的DTNB巯基检测
反应原理：5，5′-二巯基双-2-硝基苯甲酸(DTNB)或称Ellman试剂与巯基化合物发生硫醇-二硫化物交换反应，生成5-巯基-2-硝基苯甲酸，在碱性条件下反应显黄色，在412nm处有强烈的光吸收。该反应可特异性地检测-SH。采用半胱氨酸为标准物质制作标准曲线。
(1)半胱氨酸工作曲线的绘制
A.1mM半胱氨酸母液的配制
称取0.0053g半胱氨酸晶体，溶解于40ml DPBS中，搅拌均匀，使其完全溶解。
B.2mg/ml DTNB溶液的配制
先用0.1M Na3PO4将DPBS的pH值调到8.0，然后称取0.02g DTNB粉末，溶解于pH8.0的DPBS中，适当加热搅拌，使其完全溶解。
C.配置一系列浓度的半胱氨酸溶液
表2反应体系
D.反应时，每个管中加入250ul样品，再加入50ulEllman试剂，混合均匀，室温反应15分钟；
E.测量吸光值，在96孔板的每个孔中加入150ul反应后溶液，以A-1孔为空白，在412nm处进行吸光值的测定。
表3.DTNB标准曲线吸光值测定
以半胱氨酸浓度为横坐标(X)，吸光度值为纵坐标(Y)，进行线性回归分析。所得半胱氨酸工作曲线方程为y＝0.005x-0.008，R2＝0.999。
(2)末端巯基化纳米肝素的DTNB巯基检测
(a)配制DPBS pH8.0的缓冲液，配制2.0mg/ml的DTNB溶液；
(b)称取适量末端巯基化纳米肝素样品；
(c)将适量样品溶于DPBS缓冲液中，取250微升样品溶液，加入50微升的DTNB，常温反应15mins，然后在412nm处检测吸光度，然后代入曲线y＝0.005x-0.008；
(d)由标准曲线比较，根据测量值测得
表4
实施例3、树枝形肝素-PAMAM复合物化学组分分析
肝素寡糖修饰的酰肼化CysPAMAM(Heparin/CysPAMAM-HYD G0.5)的结构式如式III所示：
通过核磁共振分析，由合成后肝素的结构(式III所示)可知，二糖重复单元上有12个H，而CysPAMAM-HYD骨架分子上上有临近羰基的的H(峰)，与之积分区域不重叠，可以用来定量。因此通过将δ2.750-2.800(CysPAMAM-HYD部分中的-CH2-C＝O-，G0.5为24H，G2.5为120H)多重峰定标为1.00，其余从δ3.0-6.5之间的峰(除掉4.70-4.90的水分子上的氢峰以及PAMAM上与之重合的同样定标G0.5为0.33单位的8个H，G2.5为0.47的56个H)其余的峰面积加和与定标量比较，得出每个胱胺分子对应二糖单元的数量，然后根据肝素二糖平均分子量进行肝素修饰比例的计算。二糖均化分子量根据磺酸化程度(与制备情况差异有关，酶解法可以较为完整地保留磺酸基团)所不同根据2002版英国药典肝素标准品的磺酸化程度为1.8-2.5。而肝素钠降解所得二糖结构，其二磺酸化二糖质量563.35/三磺酸化二糖质量665.4，因此分子量取600进行计算。
(1)Heparin5-10K+G0.5 CysPAMAM
其核磁共振氢谱图见图4。以2.7-2.9范围内的PAMAM上乙酰基团旁亚甲基(G0.5为24个)定标并进行计算，糖环上氢(对应12±0.5小时)积分面积之和为17.69+2.32＝20.01，计算得每1mol的HYD基团连接二糖单元个数为：(20.01-0.33)/(12*8)＝4.92
则计算得每个HCPH G0.5分子的端基(共8个端基)均化连接的二糖单元数为：4.92，均化为每个端基连接heparin分子量为2952；如果按照5-10K heparin中位分子量7500计算，则端基修饰度为39.4％，每个heparin-conjugate分子量为24.8K左右，同理求得肝素/CysPAMAM-HYD计算比为18.7。
(2)Heparin5-10K+G2.5 CysPAMAM
其核磁共振氢谱图见图5。以2.7-2.9范围内的PAMAM上乙酰基团旁亚甲基(G2.5为120个)定标并进行计算，糖环上氢(对应12±0.5小时)积分面积之和为11.45+3.95＝15.40，计算得每1mol的HYD基团连接二糖单元个数为：(15.40-0.47)/(12*32)＝4.50
则计算得每个HCPH G2.5分子的端基(共32个端基)均化连接的二糖单元数为：4.50，均化为每个端基连接heparin分子量为2700；如果按照5-10K heparin中位分子量7500计算，则端基修饰度为36.0％，每个heparin-conjugate分子量为91.8K左右，同理求得肝素/CysPAMAM-HYD计算比为14.4。
(3)Heparin3-5K+G0.5 CysPAMAM
其核磁共振氢谱图见图6。以2.7-2.9范围内的PAMAM上乙酰基团旁亚甲基(G0.5为24个)定标并进行计算，糖环上氢(对应12±0.5小时)积分面积之和为7.87+1.47＝9.34，计算得每1mol的HYD基团连接二糖单元个数为：(9.34-0.33)/(12*8)＝2.25
则计算得每个HCPH G0.5分子的端基(共8个端基)均化连接的的二糖单元数为：2.25，均化为每个端基连接heparin分子量为1350；如果按照3-5K heparin中位分子量4000计算，则端基修饰度为33.8％，每个heparin-conjugate分子量为11.7K左右，同理求得肝素/CysPAMAM-HYD计算比为8.9.
(4)Heparin3-5K+G2.5 CysPAMAM
其核磁共振氢谱图见图7。以2.7-2.9范围内的PAMAM上乙酰基团旁亚甲基(G2.5为120个)定标并进行计算，糖环上氢(对应12±0.5小时)积分面积之和为7.51+0.90＝8.41，计算得每1mol的HYD基团连接二糖单元个数为：(8.41-0.47)/(12*32)＝2.63
则计算得每个HCPH G2.5分子的端基(共32个端基)均化连接的的二糖单元数为：2.63，均化为每个端基连接heparin分子量为1578；如果按照3-5K heparin中位分子量4000计算，则端基修饰度为39.4％，每个heparin-conjugate分子量为55.4K左右，同理求得肝素/CysPAMAM-HYD计算比为8.4.
表5
实施例4、树枝状肝素纳米材料的抑制凝血因子性质表征
在溶液条件下，检测同质量的肝素纳米材料与线性肝素结合ATIII后对FXa功能的抑制作用，由于FXa可以选择性地切断肽链，因此选用特异性发色底物S2222(Chromogenix)，可以根据切断效率判断FXa的活性，从而通过分光光度法得出肝素纳米材料的抗凝血性能
1.FXa标准曲线测定：
主要是根据FXa对显色底物(对硝基苯胺，pNA)肽键的水解效率，获得溶液中FXa最终浓度的显色曲线。在37.0度水浴的条件下，将梯度的FXa和S2222充分混合并反应一定时间，然后用50％乙酸终止反应并在405nm下测量水解后(产生pNA)的吸收值；
(1)配制显色底物S2222溶液：0.1MTris-buffer+27.5mM EDTA(8mg/ml)，调节pH至8.2，粉末经紫外照射30分钟，溶液并滤膜除菌。
(2)FXa、ATIII及heparin-conjugate所用Buffer：10ml去离子水+Tris 121mg(50mM)+88mg NaCl(0.15mM)，HCl调节至pH7.4，紫外照射+0.22μm滤膜过滤除菌；
(3)FXa储存液浓度：1.0μM，(FXa分子量48K，50μg包装溶于1050μL Buffer)；
(4)ATIII储存液浓度：1.1μM，(ATIII分子量58K，25μg溶于400μL Buffer)；
(5)S2222浓度，2mM，(分子量(734+748)/2＝741)实配溶液为9.0mg/ml(试剂中有过量保护剂)。
2.FXa标准曲线制作：
(1)测试所用条件：测试反应总体积：120μL；
FXa最终浓度区间：0.001-1.0μM，从原液中取FXa，作为对照组加入ATIII浓度：0.01μM，所加体积11μL，然后加Buffer至最终所加体积25μL；
S2222最终浓度：0.5mmol，所加体积30μL测量液；
50％乙酸；65μL；
酶标仪测量所用体积：100μL
(2)操作步骤
1.按上述溶液条件，加入FXa及Buffer至25μL，对照组加入FXa+ATIII及Buffer至25μL，37±0.5℃水浴5min；
2.加入S2222溶液30μL并抽提2s，水浴反应2min；
3.立即加入65μL 50％乙酸并抽提2s，结束水浴并迅速取100μL加入96孔板中；
4.酶标仪405nm处测量吸收，每组3个平行样品。
所测数值如下表：
表6
3.样品测量：
根据相同质量下对FXa抑制效果进行抗凝血效果的鉴定，即所测得pNA浓度越低(表现为405nm处吸光度越低)，肝素纳米材料结合并激活ATIII后抑制FXa效果越好
A.用pH7.5的Tris缓冲液将肝素纳米材料配成1.0mg/ml的溶液，ATIII(11μL)+FXa(12μL)+heparin(11μL)，37±0.5℃下混匀并培育5min；
B.37±0.5℃水浴下，加入30μL S2222溶液并抽提，培育2min；
C.快速加入66μL 50％乙酸抽提后从水浴中取出；
D.取100μL加入96孔板，酶标仪测量405nm处吸收值；
E.每组三个平行样品，进行统计。
F.(最终)所用浓度条件：
ATIII：10nM；
FXa：10nM；
S2222：500μM，
Heparin-conjugate(HC)：1mg/ml，0.5mg/ml；(每组纳米肝素材料溶解后需要单独微调pH然后滤菌)
所测数值如下表：
表7
| 405nm吸光度 | 3-5K | 3-5K+G0.5 | 3-5K+G2.5 | 5-10K | 5-10K+G0.5 | 5-10K+G2.5 |
| 平行组A | 0.06 | 0.052 | 0.025 | 0.085 | 0.064 | 0.039 |
| 平行组B | 0.052 | 0.051 | 0.038 | 0.069 | 0.075 | 0.035 |
| 平行组C | 0.049 | 0.05 | 0.035 | 0.071 | 0.068 | 0.038 |
| 均值 | 0.053667 | 0.051 | 0.032667 | 0.075 | 0.069 | 0.037333 |
| 标准差 | 0.004643 | 0.000816 | 0.005558 | 0.007118 | 0.004546 | 0.0017 |
4.凝血效果讨论：
A.等质量浓度条件下，0.5-3K heparin对ATIII的结合并激活作用最弱，从理论上讲，0.5-3K的heparin各分子上五糖序列的含量比例最低，这是最可能的原因，即使考虑摩尔量比；
B.而5-10K等质量浓度下分子摩尔量少于3-5K，对于ATIII结合后抑制FXa的量会有所减少，因此3-5K结合ATIII后对FXa的抑制力最强；抑制作用增强的机理可能在于对FXa/FXa-ATIII的结合平衡构成了影响，增加了FXa的解离阻力。
C.连接到CysPAMAM-HYD上后，各heparin-ATIII complex抑制FXa的能力均有所增强，考虑到等质量浓度情况下，heparin-PAMAM本身的质量还要有10％左右PAMAM本身的质量，抑制能力有所增强。
实施例4、树枝状肝素纳米材料复合于人工血管
将纳米肝素末端还原后，得到巯基化纳米肝素，之后定量检测血管内表面的氨基量，然后通过具有巯基-氨基双向官能团连接剂，将血管内表面活化，即可通过化学键共价固定具有树枝状的肝素于血管材料内表面(见图8)。
1、血管上氨基的检测
反应原理：含有初级胺或酰肼基团的分子可以与2，4，6-trinitrobenzenesulfonate(TNBS)发生反应，从而生成有色衍生物；复合物中的氨基含量与桔黄色生成物在335nm处的吸收值成线性关系。因此可以通过测定335nm处的吸光值来测定氨基含量。
(1)TNBS标准曲线的测量
A.配制系列浓度的含氨基溶液，以甘氨酸溶液为标准试样，先配制2mM的母液，然后分别稀释到不同浓度，每个浓度的溶液配制三个平行样。
表8测定标准曲线所需溶液
| 编号 | 浓度/uM | 稀释倍数 | Gly/uL | NaHCO3/uL |
| 0 | 0 | - | 0 | 800 |
| 1 | 20 | 100 | 8 | 792 |
| 2 | 50 | 40 | 20 | 780 |
| 3 | 80 | 25 | 32 | 768 |
| 4 | 100 | 20 | 40 | 760 |
| 5 | 130 | 15.38 | 52 | 748 |
| 6 | 160 | 12.5 | 64 | 736 |
| 7 | 200 | 10 | 80 | 720 |
| 8 | 250 | 8 | 100 | 700 |
| 9 | 300 | 6.67 | 120 | 680 |
| 10 | 400 | 5 | 160 | 640 |
| 11 | 500 | 4 | 200 | 600 |
| 12 | 600 | 3.33 | 240 | 560 |
B.在250μL含氨基溶液中加入125μL 0.05％TNBS，混匀后，在摇床中恒温反应2小时(37℃，120rpm)。
C.每个平行中取150μL样品，在酶标仪中测量335nm处的吸收值。
D.以氨基浓度为横坐标，A335nm为纵坐标，绘制标准曲线。所得TNBSA标准曲线方程为：y＝0.0044x+0.0012，R2＝0.9993。
(2)TNBS法定量检测人工血管上氨基密度
A.用新TNBSA配制10ml 0.01％TNBSA溶液，缓冲液用硼酸钠缓冲液，pH8.5；
B.将约2cm长的生物型人工血管(取自健康成年猪的胸主动脉)，加入100μl TNBSA溶液及300μl pH8.5硼酸钠缓冲液，用透析夹夹住两端使液体充满被夹住的人工血管内部，然后37±0.5℃水浴锅中反应3h，设三个平行样品；
C.取出上清液200μl在其中加入25μl的5mM甘氨酸，37±0.5℃摇床搅拌反应2h，加入25μl1M HCl终止反应；
D.微量比色皿测量335nm处吸收值并计算氨基浓度。除掉血管被夹持的部分后，将剩余部分用乙醇脱水并自然风干，然后称量其质量。
E.根据与标准曲线比较得，新测血管内部氨基含量为：1.73(±0.35)nmol/mg。
2、血管的修饰
操作步骤：
(1)将血管退包装后，分别用去离子水、体积百分比75％乙醇溶液浸泡2h并风干称重，取直径接近部分并用均值计算被修饰部分的重量，测量值为85.0±3.8mg/cm；
(2)将新鲜血管一端标记长度并用适当松紧度的夹子夹持，加去离子水检测夹持端，要求夹持端不漏液、不破损；
(3)用调节后的DPBS(pH8.0)作为缓冲液，将DMSO溶解的SM(PEG)2以2倍于血管内氨基的摩尔量加入到人工血管内部(使氨基活化程度为50％)，然后加入pH8.0的DPBS缓冲液将其内表面尽量完全浸没至标记长度，然后将另一端以同样的夹子夹持；
(4)悬浮于容器中，加入磁性转子带轻微搅动(约60转/分钟)37±0.5℃反应30±1分钟，吸出溶液并用DPBS缓冲液洗涤血管内壁三次，加入巯基化HCPH，其加入量以末端巯基的摩尔数计，巯基摩尔数为血管内表面氨基摩尔量的50％；
(5)37±0.5℃反应12±0.5小时，然后除掉两端的夹子，轻压出反应液，然后分别用DPBS、去离子水冲洗至少五次，之后去离子水浸泡3次，每次15min。
(6)制备完成后，先用灭菌去离子水冲洗多次，然后用95％乙醇浸泡2h以灭菌。
(7)用高温灭菌的去离子水浸泡3次，每次12±0.5小时，浸泡液体积为50ml(每根血管单独标记后浸泡)。
(8)再用50ml灭菌去离子水浸泡3h，重复三次；
(9)用5ml去离子水浸泡3h，然后用DMMB(1，9-二甲基亚甲基蓝)检测，确定其没有未修饰的肝素吸附在表面(肝素值小于1μg/ml)。
3、血管内修饰纳米肝素的DMMB定量检测：
原理：Heparin与DMMB(1.9二甲基亚甲基蓝)在30℃下反应，形成沉淀，加入DMMB解析液，使沉淀溶解，在656nm处测量样品中重新游离出来的DMMB的吸光度值，DMMB的量与heparin的量成正比，进而计算出heparin的含量。
操作步骤：
(1)配置标准曲线：
A.将实施例1中酶降解法获得的heparin，配制成10μg/ml的标准液【注：按质量划分，不区别分子量】；
B.依次配制浓度分别为0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、1.0、1.4、1.8、2.0μg/ml的标准液，分别取出100μl，加入1ml的DMMB溶液，30℃下反应30±1分钟s，离心(13x10000，10mins)。
C.沉淀用0.5ml的DMMB解析液溶解，30℃下反应30±1分钟s，取出150μl，96孔板656nm处测量。
表9 DMMB标准曲线吸光度测量值
F.在0～1.8μg/ml的范围内，其Y＝0.110X，R2＝0.9934。
(2)血管修饰肝素的定量检测：
A.将修饰后的血管取适量(15-30mg之间)，用体积分数75％乙醇溶液浸泡12±0.5小时，生物安全柜中风干后，紫外灭菌30分钟；
B.溶于1ml pH 7.00±0.02的Tris缓冲液中，加入0.01UN的I型肝素酶，30℃下无菌酶解48h，
C.取出100μl上清降解液，加入1ml的DMMB，30℃下反应30±1分钟，离心(1.3*105转/分钟，10分钟)。
D.沉淀用0.5ml的DMMB解析液溶解，30℃下反应30±1分钟，取出150μl，96孔板656nm处测量。
表10 DMMB定量检测巯基化肝素修饰血管
实施例5、复合肝素纳米材料的人工血管抗凝性质表征
1、动物血液样品采集
从健康的新西兰兔静脉采血若干毫升，加入占总体积10％的枸橼酸钠，可短时间内起抗凝血作用。采集的新鲜兔全血在普通离心机1500rpm离心15min，然后吸取上层和中层液体到另一离心管，3000rpm再次离心10min，离心完毕后吸取75％的上清液保存，即为贫血小板血浆(PPP)，剩余的液体则为富集血小板血浆(PRP)。其中，PPP用于血浆复钙时间、凝血酶原时间、活化的部分凝血活酶时间的检测，PRP用于血小板黏附试验。
2、血小板黏附检测(platelet adhesion assay，PAA)
1)将各血管样品(1cm2，指双面表面积)放入1ml PRP中，在37℃、60rpm摇床中振荡60min：
2)用新鲜的去离子水清洗血管样品两次，每次5min，尽量洗掉血管表面未黏附的血小板；
3)将血管样品放入质量浓度2.5％的戊二醛溶液中4℃过夜，然后用去离子水冲洗2-3次，每次5min；
4)用体积百分比30％、50％、70％、80％、90％的梯度的乙醇溶液脱水，100％乙醇重复脱水两次，每次15min；
5)用大头针固定血管样品，并放置在空气中自然干燥；
6)电镜室中真空喷金，扫描电子显微镜观察血小板形态，并对每血管样品随机取3个视野，对每个视野中的血小板进行计数，求平均值；
7)实验中同一血管样品各3个平行样，以评价实验的差异性。
8)材料界面血小板的黏附和活化是导致凝血的重要因素。材料的血液相容性越好，其材料界面黏附的血小板就越少，甚至极少。本试验中，修饰后血管黏附的血小板为3166.000±830.834/mm2，空白血管为8865.750±1378.003/mm2；
3、血浆复钙时间检测(plasma recalcification time，PRT)
1)先将PPP和CaCl2溶液分别在37℃水浴锅中下孵育数分钟；
2)将各血管样品(0.5cm2，指指双面表面积)放入一定容量的玻璃试管中，然后再加入1ml的PPP，并在摇床中37℃振荡1min，再加入1ml的0.025mol/L CaCl2溶液；
3)将试管放置于37℃、60rpm的摇床，然后开始用秒表计时；
4)当反应溶液出现凝胶状态时(即出现少量丝状纤维)，记录此时间即为血浆复钙时间；
5)实验中同一血管样品设3个平行样，取平均值。
6)血浆复钙时间常用作评价血液和材料相互作用的一个指标，表示钙离子加到抗凝血浆中纤维蛋白凝结的时间。在钙离子参与下，材料的血液相容性能越好，血浆复钙时间就越长。本试验中，修饰后血管的血浆复钙时间为448.333±153.324s，而空白血管为98.333±7.638s。
4、凝血酶原时间检测(prothrombin time，PT)
1)先将PPP和凝血酶原(PT)试剂在37℃水浴锅中下孵育5min；
2)将各血管样品(0.5cm2，指双面表面积)放入到玻璃试管中，然后加入1ml的PPP，接着加入1ml的PT试剂，混匀后开始秒表计时；
3)在室温条件下，用手轻微抖动试管，肉眼观察溶液出现凝胶状态时(即出现少量丝状纤维)，即停止计时，该时间即为凝血酶原时间；
4)实验中同一血管样品设3个平行样，取平均值。
5)凝血试验可以检测所测样品的抗凝血活性，凝血酶原时间就是其中的一种方法。凝血酶原时间值越大，说明材料的血液相容性越好。本试验中，修饰后血管的凝血酶原时间为16.750±0.957s，而空白血管为11.750±0.500s。
5、活化的部分凝血活酶时间检测(actived partial thromboplastin time，APTT)
1)将各血管样品(0.5cm2，指双面表面积)放入到玻璃试管中，加入1ml的PPP，接着加入1ml的APTT试剂，混匀后放入37℃水浴锅中孵育5min；
2)然后向各试管中加入1ml的0.025mol/LCaCl2溶液；
3)在室温条件下用手轻微抖动试管，肉眼观察到溶液中出现丝状纤维时停止计时，该时间即为活化的部分凝血活酶时间；
4)实验中同一血管样品设3个平行样，取平均值。
5)凝血试验可以检测所测样品的抗凝血活性，活化的部分凝血活酶时间就是其中的另一种方法。活化的部分凝血活酶时间值越大，说明材料的血液相容性越好。本试验中，修饰后血管的活化的部分凝血活酶时间为40.500±5.447s，而空白血管为24.500±0.577s。以上各试验结果均表明，肝素纳米材料修饰后的血管的血液相容性优于空白血管，即该修饰方法可提高生物型人造血管的抗凝血性能。
Claims (15)
1.一种树枝状肝素纳米材料，具有式Ⅰ所示的末端分支单元，它是由端基为酰肼基的聚酰胺胺型树枝状高分子与式Ⅱ所示的肝素通过聚酰胺胺表面酰肼与肝素还原末端反应形成糖苷键得到的；
所述聚酰胺胺型树枝状高分子的内核为胱胺，其树枝骨架为酰肼修饰的半代聚酰胺胺，所述半代包括-0.5代，0.5代，1.5代，2.5代，3.5代，4.5代，5.5代，6.5代，7.5代；
(式Ⅰ)
(式Ⅱ)
其中，所述式Ⅰ中R2＝H或SO3H，R3＝H、COCH3或SO3H，n＝1-50；
式Ⅱ中R2、R3、n的定义同式Ⅰ。
2.根据权利要求1所述的树枝状肝素纳米材料，其特征在于：所述聚酰胺胺型树枝状高分子为0.5代聚酰胺胺型树枝状高分子，所述树枝状肝素纳米材料的结构式如式Ⅲ所示，其中，所述式Ⅲ中R2、R3、n的定义同式Ⅰ；
所述聚酰胺胺型树枝状高分子为2.5代聚酰胺胺型树枝状高分子，所述树枝状肝素纳米材料的结构式如式Ⅳ所示，其中，所述式Ⅳ中R2、R3、n的定义同式Ⅰ；
(式Ⅲ)
(式Ⅳ)。
3.根据权利要求1或2所述的树枝状肝素纳米材料，其特征在于：所述树枝状肝素纳米材料中所述式Ⅱ所示的肝素的端基修饰度为1％-100％；所述式Ⅱ所示肝素中每个二糖单元含1.8-2.5个磺酸基团。
4.根据权利要求1或2所述的树枝状肝素纳米材料，其特征在于：所述式Ⅰ中的n＝4-8或8-16。
5.一种末端巯基化肝素纳米材料，是权利要求1-4中任一项所述树枝状肝素纳米材料在还原剂的作用下使二硫键断裂形成巯基得到的。
6.根据权利要求5所述的末端巯基化的肝素纳米材料，其特征在于：所述树枝状肝素纳米材料为权利要求2中结构式如式Ⅲ所示的树枝状肝素纳米材料，所述末端巯基化肝素纳米材料的结构式如式Ⅴ所示：
(式Ⅴ)
其中，所述式Ⅴ中R2、R3、n的定义同式Ⅲ；
所述树枝状肝素纳米材料为权利要求2中结构式如式Ⅳ所示的树枝状肝素纳米材料，所述末端巯基化肝素纳米材料的结构式如式Ⅵ所示：
(式Ⅵ)
其中，所述式Ⅵ中R2、R3、n的定义同式Ⅳ。
7.根据权利要求5所述的末端巯基化的肝素纳米材料，其特征在于：所述还原剂为TCEP。
8.权利要求1-4中任一项所述的树枝状肝素纳米材料或权利要求5-7中任一项所述的末端巯基化的肝素纳米材料在制备抗凝剂中的应用或在植入性医用材料抗凝修饰中的应用。
9.一种制备权利要求1中所述树枝状肝素纳米材料的方法，包括下述步骤：
1)制备内核为胱胺的半代聚酰胺胺型树枝状高分子，所述半代包括-0.5代，0.5代，1.5代，2.5代，3.5代，4.5代，5.5代，6.5代，7.5代；
2)将步骤1)制备的内核为胱胺的半代聚酰胺胺型树枝状高分子与一水合肼进行反应，得到端基为酰肼基的聚酰胺胺型树枝状高分子；
3)将步骤2)制备的端基为酰肼基的聚酰胺胺型树枝状高分子与权利要求1中式Ⅱ所示的肝素进行反应，得到的所述树枝状肝素纳米材料。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：步骤2)中所述聚酰胺胺型树枝状高分子的加入量以其端基的摩尔数计，其与一水合肼的摩尔比为1：10-1:12；步骤2)中所述反应的反应温度为55±1℃，反应时间为24±0.5小时；
步骤3)中所述端基为酰肼基的聚酰胺胺型树枝状高分子的加入量以其端基的摩尔数计，其与肝素的摩尔比为1:0.01-1:10；步骤2)中所述反应的反应温度为50±0.5℃，反应时间为24±0.5小时。
11.一种制备树枝状肝素纳米材料修饰的生物型人工血管的方法，包括下述步骤：1)采用能分别与巯基和氨基进行反应的具有双向官能团的偶联剂对生物型人工血管内表面进行氨基活化处理；
2)将活化后的生物型人工血管与权利要求5-7中任一项所述末端巯基化肝素纳米材料进行反应，得到树枝状肝素纳米材料修饰的生物型人工血管。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于：步骤1)中所述氨基活化处理的活化度为1％-100％；
所述具有双向官能团的偶联剂为SM(PEG)2；
采用SM(PEG)2对生物型人工血管内表面进行活化处理的方法如下：1)将生物型人工血管的一端标记长度并用夹子夹持，把SM(PEG)2的DMSO溶液加入到生物型人工血管内部，然后再加入DPBS缓冲液使待处理的人工血管内表面完全浸没至标记长度，然后将另一端以同样的夹子夹持；2)将生物型人工血管悬浮于容器 中，在搅拌状态下于37±0.5℃反应30±1分钟，吸出生物型人工血管中的溶液并用DPBS缓冲液洗涤血管内壁。
13.根据权利要求11或12所述的方法，其特征在于：步骤2)中所述末端巯基化肝素纳米材料的加入量以其末端的巯基计，其为所述人工血管的内表面上氨基摩尔量的1-100％；
所述反应的反应温度为37±0.5℃，反应时间为12±0.5小时。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于：步骤1)中所述氨基活化处理的活化度为50％，在氨基活化处理的过程中，SM(PEG)2加入量与人工血管内表面氨基的摩尔比为1.5:1-2.0：1；步骤2)中所述末端巯基化肝素纳米材料的加入量以其末端的巯基计，其为人工血管内表面氨基摩尔量的50％。
15.权利要求11-14任一项所述方法制备得到的树枝状肝素纳米材料修饰的生物型人工血管。
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