CN102038955B - 利用傅氏反应接枝制备抗凝血聚砜材料的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用傅氏反应接枝制备抗凝血聚砜材料的方法。该方法首先利用傅氏反应在聚砜表面引入羧基，然后在羧基端接枝聚合氨基硅烷使聚砜表面转化为氨基，最后通过交联剂将抗凝血药物以共价键结合于氨基末端，实现聚砜表面接枝抗凝药物，并获得具有良好抗凝血性能的聚砜材料。本方法工艺简单、快捷，可控性强，所得材料具有优良的抗凝血性能，且不干扰机体凝血系统，在体外循环(如人工肾)、抗凝涂层、生物传感器、生物分子诊断和检测等领域具有广阔的应用前景。

Description

利用傅氏反应接枝制备抗凝血聚砜材料的方法
技术领域
本实发明涉及一种利用傅氏反应接枝制备抗凝血聚砜材料的方法。
背景技术
人工生物高分子材料与血液直接接触时会激活凝血系统产生凝血和血栓，因此限制了高分子材料在生物医学中的应用。目前其它的抗凝方法或新型“抗凝剂”效果不确切、并发症多，不能从根本上解决问题。因而必须对生物材料表面进行改造，以提高其表面的抗凝血性能。
现已发现将生物活性分子固定于高分子材料表面，可显著提高和改善生物材料特异性。用于材料表面改性的方法很多，物理方法维持时间短，化学方法，如离子辐射接枝共聚合、等离子气体放电、光化学接枝以及化学衍生等，多须特殊设备，操作复杂，可控性差。国内外一些研究者虽通过物理吸附或化学结合肝素到不同基材表面均提高了基材的抗凝性能，但效果有限。
傅瑞德尔-克拉夫茨(Friedel-Crafts)反应(简称傅氏反应)在无水三氯化铝催化下，苯环上的氢原子烷基或酰基取代的反应，叫做傅氏反应。傅氏反应包括烷基化和酰基化反应。傅氏烷基化反应中，常用的烷基化试剂为卤代烷，有时也用醇、烯等。常用的催化剂是无水三氯化铝，此外有时还用三氯化铁、三氟化硼等。傅氏烷基化反应的历程，是无水三氯化铝等路易斯酸与卤代烷作用生成烷基正离子，然后烷基正离子作为亲电试剂进攻苯环发生亲电取代反应。
接枝共聚是指大分子链上通过化学键结合适当的支链或功能性侧基的反应，所形成的产物称作接枝共聚物。接枝共聚物的性能决定于主链和支链的组成，结构，长度以及支链数。长支链的接枝物类似共混物，支链短而多大接枝物则类似无规共聚物。通过共聚，可将两种性质不同的聚合物接枝在一起，形成性能特殊的接枝物。因此，聚合物的接枝改性，已成为扩大聚合物应用领域，改善高分子材料性能的一种简单又行之有效的方法。
聚砜是一种人工合成的惰性高分子材料，化学性质稳定，具有良好的物理机械性能和可加工性，在体外循环、抗凝涂层、生物传感器、生物分子诊断和检测等领域中应用十分广泛。董春华等报道了在聚砜膜表面通过傅-克反应接枝丙烯酸对其进行亲水化表面改性(接枝丙烯酸亲水化改性聚砜超滤膜及其在多肽分离中的应用，化工学报，2007，58，6：1501-1506.)，结构如下：
Figure G2009100446632D00021
在聚砜与血液接触时，由于可激活机体凝血系统，易产生凝血和血栓影响聚砜器械的应用和效果。因而，如何使用简单易行、可控性强、高效率的方法制备稳定的抗凝聚砜表面具有广阔的应用前景。
发明内容
本发明的目的是为了提高聚砜医用装置表面的抗凝血性能，提出一种利用傅氏反应接枝制备抗凝血聚砜材料的方法。
本发明提供的抗凝血聚砜材料的方法包括首先利用傅氏反应在原本呈化学惰性的聚砜表面引入活性羧基基团，使聚砜材料表面具有良好的化学活性，进一步将一些具有抗凝血性能的抗凝药物引入材料表面，实现聚砜表面接枝抗凝药物，从而赋予聚砜表面良好的抗凝血性能。
本发明提出的利用傅氏反应接枝制备抗凝血聚砜材料的方法包括如下步骤：
1)配制浓度为50％～75％(体积比)丙烯酸、1∶0.01～1∶0.10(摩尔比)傅氏催化剂以及50％～25％(体积比)催化助剂质子酸的混合溶液，将聚砜材料浸入该溶液中，在30～50℃下进行聚砜表面傅氏反应0.5～1小时，获得表面有活性羧基的聚砜材料；
2)将上述表面含活性羧基的聚砜材料置于0.2～10％体积比的氨基硅烷偶联剂溶液中，在避光条件下，于4℃或常温浸泡0.5小时或过夜，引发氨基硅烷在聚砜表面的接枝聚合反应，使材料表面转化为活性氨基末端；
3)采用双功能交联剂交联法将抗凝药物以共价键结合于上述所得聚砜材料材料，获得表面接枝抗凝药物的聚砜材料。
发明中所述的傅氏催化剂选自四氯化锡或三氯化铝。
发明中所述的催化助剂质子酸选自磷酸或硫酸。
发明中所述的氨基硅烷偶联剂选自γ-氨丙基三乙氧基硅烷(KH550)、γ-氨丙基三乙氧基硅烷(KH551)，N-β(氨乙基)-γ-氨丙基甲基二氧基硅烷(KH602)、或N-β-(氨乙基)-γ-氨丙基三甲氧基硅烷(KH792/KH990)。氨基硅烷偶联剂为常温下为液体状态，溶于水、醇、芳香族和脂肪碳氢化合物。本发明中其溶液用90-95％的乙醇配制。
发明中所述的抗凝药物选自阿加曲班、肝素、低分子肝素、水蛭素、比伐卢定、透明质酸或尿激酶。
发明中所述的双功能交联剂交联法包括先将抗凝药物与氨基侧链修饰剂按1∶2～1∶20的摩尔比值在PBS-EDTA缓冲液(50-100mmol/L磷酸盐，0.15mol/L NaCI，5-10mmol/L EDTA，PH 7.5-8.0)中4℃或常温下反应45分钟～2小时，将抗凝药物氨基末端修饰为巯基，同时按抗凝药物：双功能交联剂为1∶5～1∶100摩尔比的量，将双功能交联剂溶解于PH为7.0-7.2的PBS-EDTA缓冲液(50-100mmol/L磷酸盐，0.15mol/L NaCI，5-10mmol/L EDTA)中，取表面引入活性氨基的聚砜材料置于该缓冲液中室温反应1～2小时，最后将材料置于已巯基化抗凝药物的PBS-EDTA溶液中，4℃或常温反应2～24小时，获得表面接枝抗凝药物的聚砜材料。
双功能交联剂交联法的方法所述的交联剂选自磺胺琥珀酸基-4-N-异酰亚胺甲基环己烷-1-羧酸酯(Sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate(Sulfo-SMCC))、N-磺胺琥珀酸基-4-[4-碘基乙酰基]氨基苯甲酸盐(N-Sulfosuccinimidyl[4-iodoacetyl]aminobenzoate(Sulfo-SIAB))、N-[g-异酰亚胺丁氧基]-磺胺琥珀酸酯(N-[g-Maleimidobutyryloxy]sulfosuccinimide ester(Sulfo-GMBS))、m-异酰亚胺苯氧基-N-羟基磺胺琥珀酸酯(m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysulfosuccinimide ester(Sulfo-MBS))、[N-e-异酰亚胺己氧基]磺胺琥珀酸酯([N-e-Maleimidocaproyloxy]sulfosuccinimide ester(Sulfo-EMCS))、磺胺琥珀酸基4-[p-异酰亚胺苯氧基]丁酸盐(Sulfosuccinimidyl 4-[p-maleimidophenyl]butyrate(Sulfo-SMPB))、磺胺琥珀酸基6-(3`-[2-吡啶基二硫]-丙酰胺基)己酸酯(Sulfosuccinimidyl 6-(3′-[2-pyridyldithio]-propionamido)hexanoate(Sulfo-LC-SPDP))、N-[k-异酰亚胺十一烷氧基-磺胺琥珀酸酯(N-[k-Maleimidoundecanoyloxy]sulfosuccinimide ester(Sulfo-KMUS))、4-磺胺琥珀酸基-6-甲基-阿(2-吡啶基二硫)甲苯酰胺]己酸酯(4-Sulfosuccinimidyl-6-methyl-a-(2-pyridyldithio)toluamido]hexanoate)(Sulfo-LC-SMPT))、N-琥珀酰亚胺-([N-异酰亚胺3-戊酰胺]-乙二醇)酯([N-succinimidyl-([N-maleimidopropionamido]-ethyleneglycol)ester(SM(PEG)n)。
双功能交联剂交联法的方法所述的氨基侧链修饰剂选自2-亚氨基硫烷盐酸盐(又名2-IT或Traut’s Reagent)、N-磺胺琥珀酸基-S-乙酰基硫代乙酸酯(N-Succinimidyl-S-acetylthioacetate(SATA))或N-磺胺琥珀酸基-S-乙酰基硫代丙酸酯(N-Succinimidyl-S-acetylthio propionate SATP))。
Figure G2009100446632D00042
本发明显示：通过双功能交联剂具有的“分子臂”的空间基团共价结合生物活性物质，不仅结合稳固，而且可提供更大的空间自由度，保证生物活性物质在结构上处于空间伸展状态，有助于提高生物活性物质生物性能的发挥。另一方面双功能交联剂本身能钝化需修饰表面，以减少需修饰表面的非特异性吸附。
通过本发明提供的方法，可以获得一种新型的具有抗凝血性能的聚砜材料，该材料是在聚砜表面上依次形成交联层和抗凝药物层。
同时，用上述方法还可以具体地获得具有上述结构特征的血液透析滤器。
按现有技术中的方法，在制备具有上述结构特征的血液透析滤器时，可以通过循环的方式，实现上述制备方法。即将各反应液在滤器中循环并反应，从而制备具有上述膜结构特征的滤器。
试验证明，依据本发明提供的方法进行修饰后的聚砜膜的在血液透析中应该具有的性能并未受到影响或明显的影响，而只是使其具有了抗凝血的新功能。
本发明提出的利用傅氏反应接枝制备抗凝血聚砜材料的方法，简单易行，可控性强，所得聚砜表面具有良好的抗凝血性能，在体外循环、抗凝涂层、生物传感器、生物分子诊断和检测等领域中有着巨大的应用前景。
本发明的优点是：
(1)利用傅氏反应接枝制备抗凝血聚砜材料的方法，步骤简单，可控性强，同时对聚砜材料本体良好的物理性能没有影响。
(2)利用傅氏反应接枝制备抗凝血聚砜材料的方法，仅在局部作用于凝血发生的关键因子----凝血酶，明显减少血栓形成和血小板粘附，并不干扰机体凝血系统，血液相容性显著提高。
附图说明
图1是本抗凝血聚砜材料表面构造示意图；
图2是本利用傅氏反应接枝制备抗凝血聚砜表面的方法原理图；
图3是本利用傅氏反应接枝制备抗凝血聚砜表面与血流作用示意图；
图中1.抗凝药物，2.交联层，3.聚砜透析膜，4.血流，5.凝血酶。
图4是本利用傅氏反应接枝制备抗凝血聚砜材料步骤中能谱分析图。其中(a)为未改性聚砜膜(b)为接枝氨基硅烷的聚砜膜，出现硅烷中的硅元素(c)为接枝阿加曲班的聚砜膜，硅元素峰度明显下降。
图5是未改性聚砜膜及利用傅氏反应接枝制备抗凝血聚砜膜表面扫描电镜结果，其中(a)为未改性聚砜膜，(b)为利用傅氏反应接枝制备抗凝血聚砜膜。
图6是未改性聚砜膜及利用傅氏反应接枝制备抗凝血聚砜膜的复钙试验结果。
图7是未改性聚砜膜及利用傅氏反应接枝制备抗凝血聚砜膜材料的血小板粘附试验结果，其中(a)为未改性聚砜膜，血小板粘附数量多，且聚集严重，伸出大量伪足。(b)为利用傅氏反应接枝制备抗凝血聚砜膜，血小板粘附数量少，无聚集现象，伪足少。扫描电镜图。
图8是未改性聚砜膜及利用傅氏反应接枝制备抗凝血聚砜的白蛋白粘附试验结果，其中(a)为未改性聚砜膜(b)为利用傅氏反应接枝制备抗凝血聚砜。扫描电镜图。
图9是未改性聚砜血液净化滤器及利用傅氏反应接枝制备抗凝血聚砜血液净化滤器中空纤维膜内表面扫描电镜结果，其中(a)为未改性聚砜表面，(b)为利用傅氏反应接枝制备抗凝血聚砜表面。
具体实施方式
本发明首先利用傅氏反应在聚砜表面引入羧基，然后在羧基端接枝硅烷使聚砜表面转化为氨基，最后通过交联剂将抗凝剂固定于在氨基末端，实现聚砜表面接枝固定抗凝剂，并获得抗凝血性表面。
下面的实施例是对本发明的进一步说明，而不是限制本发明的范围。
实施例1：
(1)制备羧基化的聚砜表面：在丙烯酸：磷酸(V∶V为3∶1)混合溶液中溶解与丙烯酸摩尔比为0.05∶1的四氯化锡，将聚砜膜浸入50mL该溶液中，30℃作用60分钟，三蒸水彻底冲洗。能谱分析显示所得的聚砜表面因羧基化，故氧原素含量增加。
(2)制备氨基化的聚砜表面：配制90％乙醇水溶液，再取1份KH550溶解于49份乙醇水溶液中，将上述聚砜膜浸入50mL该溶液中，室温下接枝30分钟后，90％乙醇、三蒸水充分冲洗。能谱分析显示所得的聚砜表面出现硅烷中的硅元素(见图4b)。
(3)制备接枝固定抗凝剂的聚砜表面：将10mg阿加曲班与50mg2-IT在30mL100mmol/L PBS-EDTA缓冲液(100mmol/L磷酸盐，0.15mol/LNaCI，5m mol/LEDTAPH＝8.0)常温作用45分钟。溶解20mgSulfo-SMCC于20mL的100mmol/L PBS-EDTA缓冲液(100mmol/L磷酸盐，0.15mol/L NaCI，5mmol/L EDTA，PH 7.2)中，将上述聚砜膜浸入该溶液中，常温作用1小时后，用100mmol/L PBS-EDTA缓冲液(PH＝7.2)充分冲洗，立即将该聚砜膜浸入阿加曲班-2-IT溶液中，4℃避光浸泡过夜，100mmol/LPBS-EDTA缓冲液(100mmol/L磷酸盐，0.15mol/L NaCI，5mmol/L EDTA，PH＝7.2)彻底冲洗，最终在聚砜膜表面接枝固定阿加曲班。能谱分析显示所得的聚砜表面硅元素峰度明显下降(见图4c)。扫描电镜显示膜表面较未改性聚砜膜表面无明显改变(见图5a和图5b)。
(4)抗凝性能评价
复钙时间测定：在硅化试管中，采集新鲜人血4mL，按9∶1加入3.8％枸橼酸抗凝，3000r/m离心10min分离血浆；将表面接枝固定抗凝剂的聚砜膜洗净，放入硅化试管内，加入0.2mL血浆，37℃水浴1min后加入37℃预热的0.2mL 0.025mol/L CaCl2，37℃水浴，记录试管中出现第一条纤絮状物的时间。每个样品重复测5次，取平均值。复钙时间结果显示利用傅氏反应接枝改性后的聚砜复钙时间明显延长(见图6)。
未改性聚砜膜及利用傅氏反应接枝制备抗凝血聚砜膜的溶血率的分光光度计测定。溶血率测定方法：在硅化试管中，采集新鲜人血2mL，加入3.8％枸橼酸抗凝0.2mL、NS2.5mL备用；将表面接枝固定抗凝剂的聚砜膜洗净，放入硅化试管内，加入生理盐水10mL，37℃水浴30min；加入0.2mL备好的人血，混匀，37℃水浴60min，850r/m离心5min；吸取上清液移入比色杯中，用分光光度仪于545nm测定吸光度值，每次测量6次，取平均值。溶血率结果显示利用傅氏反应接枝改性后的聚砜为0.552，符合国家标准(见下表)。
Figure G2009100446632D00071
血小板吸附实验：在硅化试管中，采集新鲜人血2mL，加入3.8％枸橼酸抗凝，850r/m离心10min，取上清富含血小板的血浆1mL移入硅化试管中；将表面接枝固定抗凝剂的聚砜膜洗净，放入已加入血浆的硅化试管内浸泡30min；取出膜片，放入PBS液(PH＝7.2)中冲洗3次；放入2.5％戊二醛液中固定30min；在70％、80％、90％、95％、100％乙醇-水溶液中脱水，每次15-30min；自然干燥；在真空条件下镀金，扫描电镜观察。血小板吸附实验结果显示利用傅氏反应接枝改性后的聚砜表面血小板粘附数量少，无聚集现象，伪足少(见图7)。
白蛋白粘附试验：将表面接枝固定抗凝剂的聚砜膜洗净，放入PH＝7.4的40ug/mL人血清白蛋白溶液中浸泡60min，取出，再放入PH＝7.4的磷酸缓冲液中浸泡8小时后取出，自然干燥；在真空条件下镀金，扫描电镜观察。白蛋白粘附试验结果显示改性及未改性的聚砜表面粘附的白蛋白均未变形，但改性后的聚砜膜表面白蛋白粘附数量少(见图8)。
复钙时间试验、溶血率测定、血小板粘附实验及白蛋白粘附试验结果表明，利用傅氏反应接枝制备抗凝血聚砜表面具有良好的抗凝血性。
实施例2：
(1)制备羧基化的聚砜表面：在丙烯酸：磷酸(V∶V为1∶1)混合溶液中溶解与丙烯酸摩尔比为0.05∶1的四氯化锡，将聚砜膜浸入50mL该溶液中，40℃作用30分钟，三蒸水彻底冲洗。能谱分析显示所得的聚砜表面因羧基化，故氧原素含量增加。
(2)制备氨基化的聚砜表面：同实施例1。能谱分析显示所得的聚砜表面出现硅烷中的硅元素。
(3)制备接枝固定抗凝剂的聚砜表面：同实施例1。能谱分析显示所得的聚砜表面硅元素峰度明显下降。
(4)抗凝性能评价：同实施例1。
复钙时间试验、溶血率测定、血小板粘附实验及白蛋白粘附试验结果表明，利用傅氏反应接枝制备抗凝血聚砜材料具有良好的抗凝血性。
实施例3：
(1)制备羧基化的聚砜表面：同实施例1。能谱分析显示所得的聚砜表面因羧基化，故氧原素含量增加。
(2)制备氨基化的聚砜表面：90％乙醇配制0.2％KH550硅烷溶液，将上述聚砜膜浸入50mL该溶液中，室温下接枝过夜，90％乙醇、三蒸水充分冲洗。能谱分析显示所得的聚砜表面出现硅烷中的硅元素。
(3)制备接枝固定抗凝剂的聚砜材料：同实施例1。能谱分析显示所得的聚砜表面硅元素峰度明显下降。
(4)抗凝性能评价：同实施例1。
复钙时间试验、溶血率测定、血小板粘附实验及白蛋白粘附试验结果表明，利用傅氏反应接枝制备抗凝血聚砜材料具有良好的抗凝血性。
实施例4：
(1)制备羧基化的聚砜表面：同实施例1。能谱分析显示所得的聚砜表面因羧基化，故氧原素含量增加。
(2)制备氨基化的聚砜表面：同实施例1。能谱分析显示所得的聚砜表面出现硅烷中的硅元素。
(3)制备接枝固定抗凝剂的聚砜表面：将10mg阿加曲班与50mg2-IT在30mL100mMPBS-EDTA缓冲液(100mmol/L磷酸盐，0.15mol/L NaCI，5mmol/L EDTA PH＝8.0)常温作用45分钟。溶解20mgSulfo-SMCC于20mL的100mmol/L PBS-EDTA缓冲液(100mmol/L磷酸盐，0.15mol/L NaCI，5mmol/L EDTA，PH 7.2)中，将上述聚砜膜浸入该溶液中，常温作用1小时后，用100mmol/L PBS-EDTA缓冲液(PH＝7.2)充分冲洗，立即将该聚砜膜浸入阿加曲班-2-IT溶液中，室温避光浸泡2小时，100mmol/LPBS-EDTA缓冲液(100mmol/L磷酸盐，0.15mol/L NaCI，5mmol/L EDTA，PH＝7.2)彻底冲洗，最终在聚砜膜表面接枝固定阿加曲班。能谱分析显示所得的聚砜表面硅元素峰度明显下降。
(4)抗凝性能评价：同实施例1。
复钙时间试验、溶血率测定、血小板粘附实验及白蛋白粘附试验结果表明，利用傅氏反应接枝制备抗凝血聚砜材料具有良好的抗凝血性。
实施例5：
(1)制备羧基化的聚砜表面：同实施例1。能谱分析显示所得的聚砜表面因羧基化，故氧原素含量增加。
(2)制备氨基化的聚砜表面：同实施例1。能谱分析显示所得的聚砜表面出现硅烷中的硅元素。
(3)制备接枝固定抗凝剂的聚砜表面：将100mg肝素与50mg2-IT在30mL100mmol/LPBS-EDTA缓冲液(100mmol/L磷酸盐，0.15mol/LNaCI，5mmol/L EDTA PH＝8.0)常温作用45分钟。溶解20mgSulfo-SMCC于20mL的100mM PBS-EDTA缓冲液(100mmol/L磷酸盐，0.15mol/L NaCI，5mmol/LEDTA，PH 7.2)中，将上述聚砜膜浸入该溶液中，常温作用1小时后，用100mmol/L PBS-EDTA缓冲液(PH＝7.2)充分冲洗，立即将该聚砜膜浸入肝素-2-IT溶液中，4℃避光浸泡过夜，100mmol/LPBS-EDTA缓冲液(100mmol/L磷酸盐，0.15mol/LNaCI，5m mol/LEDTA，PH＝7.2)彻底冲洗，最终在聚砜膜表面接枝固定肝素。能谱分析显示所得的聚砜表面硅元素峰度明显下降。
(4)抗凝性能评价：同实施例1。
复钙时间试验、溶血率测定、血小板粘附实验及白蛋白粘附试验结果表明，利用傅氏反应接枝制备抗凝血聚砜材料具有良好的抗凝血性。
实施例6：
(1)制备羧基化的聚砜表面：同实施例1。能谱分析显示所得的聚砜表面因羧基化，故氧原素含量增加。
(2)制备氨基化的聚砜表面：同实施例1。能谱分析显示所得的聚砜表面出现硅烷中的硅元素。
(3)制备接枝固定抗凝剂的聚砜表面：制备接枝固定抗凝剂的聚砜表面：将4100U低分子肝素针剂与50mg2-IT在30mL100mmol/LPBS-EDTA缓冲液(100mmol/L磷酸盐，0.15mol/LNaCI，5mmol/LEDTA PH＝8.0)常温作用45分钟。溶解20mgSulfo-SMCC于20mL的100mmol/LPBS-EDTA缓冲液(100mmol/L磷酸盐，0.15mol/LNaCI，5mmol/LEDTA，PH 7.2)中，将上述聚砜膜浸入该溶液中，常温作用1小时后，用100mmol/LPBS-EDTA缓冲液(PH＝7.2)充分冲洗，立即将该聚砜膜浸入低分子肝素-2-IT溶液中，4℃避光浸泡过夜，100mmol/LPBS-EDTA缓冲液(100mmol/L磷酸盐，0.15mol/LNaCI，5mmol/LEDTA，PH＝7.2)彻底冲洗，最终在聚砜膜表面接枝固定肝素。能谱分析显示所得的聚砜表面硅元素峰度明显下降。
(4)抗凝性能评价：同实施例1。
复钙时间试验、溶血率测定、血小板粘附实验及白蛋白粘附试验结果表明，利用傅氏反应接枝制备抗凝血聚砜材料具有良好的抗凝血性。
实施例7：
(1)利用傅氏反应接枝制备抗凝血聚砜血液净化滤器：
(A)制备羧基化的聚砜表面：在反应池中加入丙烯酸和磷酸(V∶V为3∶1)，并溶解与丙烯酸摩尔比为0.05∶1的四氯化锡以配制混合溶液，将费森尤斯(Fresenius)公司AV400聚砜滤器、血路管(已截短改良，容积＜50ml)与反应池连接成闭合回路，排尽空气后，30℃条件下，在闭合回路中循环混合液45分钟，断开回路，三蒸水彻底冲洗滤器及血路管。
(B)制备氨基化的聚砜表面：在反应池中配制90％乙醇水溶液，再取1份KH550溶解于49份乙醇水溶液中，将上述AV400聚砜滤器、血路管与反应池连接成闭合回路，排尽空气后，室温下，在闭合回路中循环KH550混合液30分钟，断开回路，90％乙醇、三蒸水彻底冲洗滤器及血路管。
(C)制备接枝固定抗凝剂的聚砜表面：将20mg阿加曲班与100mg2-IT在60mL100mmol/L PBS-EDTA缓冲液(100mmol/L磷酸盐，0.15mol/LNaCI，5m mol/LEDTAPH＝8.0)常温作用45分钟。在反应池中溶解50mgSulfo-SMCC于100mL的100mmol/LPBS-EDTA缓冲液(100mmol/L磷酸盐，0.15mol/L NaCI，5mmol/L EDTA，PH 7.2)中，将上述AV400聚砜滤器、血路管与反应池连接成闭合回路，排尽空气后，常温下，在闭合回路中循环Sulfo-SMCC混合液1小时，断开回路，用100mmol/L PBS-EDTA缓冲液(PH＝7.2)彻底冲洗滤器及血路管。立即将该聚砜滤器血室腔加入阿加曲班-2-IT溶液中，排尽空气，4℃避光反应过夜，100mmol/LPBS-EDTA缓冲液(100mmol/L磷酸盐，0.15mol/LNaCI，5mmol/L EDTA，PH＝7.2)彻底冲洗，最终在滤器的聚砜膜表面接枝固定阿加曲班。剖开滤器，取出聚砜中空纤维管，扫描电镜显示纤维管内膜表面较未改性滤器纤维管内膜表面无明显改变(见图9a和图9b)。
(2)抗凝性能评价
复钙时间测定：在硅化试管中，采集新鲜人血10mL，按9∶1加入3.8％枸橼酸抗凝，3000r/m离心10min分离血浆；将未改性的聚砜AV400滤器和表面接枝固定抗凝剂的聚砜AV400滤器剖开，各取不同部位10根0.5cm长中空纤维，剪碎放入硅化试管内，加入0.2mL血浆，37℃水浴1min后加入37℃预热的0.2mL 0.025mol/L CaCl2，37℃水浴，记录试管中出现第一条纤絮状物的时间。每个样品重复测5次，取平均值。复钙时间结果显示利用傅氏反应接枝改性后的聚砜复钙时间明显延长。
溶血率测定：在硅化试管中，采集新鲜人血10mL，加入3.8％枸橼酸抗凝0.2mL、NS2.5mL备用；将未改性的聚砜AV400滤器和表面接枝固定抗凝剂的聚砜AV400滤器剖开，各取不同部位10根0.5cm长中空纤维，剪碎放入硅化试管内，加入生理盐水10mL，37℃水浴30min；加入0.2mL备好的人血，混匀，37℃水浴60min，850r/m离心5min；吸取上清液移入比色杯中，用分光光度仪于545nm测定吸光度值，每次测量6次，取平均值。溶血率结果显示利用傅氏反应接枝改性后的聚砜为0.536，符合国家标准。
复钙时间试验、溶血率测定结果表明，利用傅氏反应接枝制备抗凝血聚砜滤器较未改性滤器具有更好的抗凝血性。

Claims (7)

1.一种利用傅氏反应接枝制备抗凝血聚砜材料的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)配制浓度为50％～75％体积比丙烯酸、1∶0.01～1∶0.10摩尔比傅氏催化剂以及50％～25％体积比催化助剂质子酸的混合溶液，将聚砜材料浸入该溶液中，在30～40℃下进行聚砜表面傅氏反应0.5～1小时，获得表面有活性羧基的聚砜材料；
2)将上述表面含活性羧基的聚砜材料置于0.2～10％体积比的氨基硅烷偶联剂溶液中，在避光条件下，于4 ℃或常温浸泡0.5小时或过夜，引发氨基硅烷在聚砜表面的接枝聚合反应，使材料表面转化为活性氨基末端；
3)采用双功能交联剂交联法将抗凝药物以共价键结合于上述所得聚砜材料表面，获得表面接枝抗凝药物的聚砜材料；
所述双功能交联剂交联法包括先将抗凝药物与氨基侧链修饰剂按1∶2～1∶20的摩尔比值在PBS-EDTA缓冲液中4℃或常温下反应45分钟～2小时，该PBS-EDTA缓冲液组成为50-100mmol/L磷酸盐，0.15mol/LNaCI，5-10mmol/L EDTA，PH7.5-8.0，将抗凝药物氨基末端修饰为巯基，同时按抗凝药物：双功能交联剂为1∶5～1∶100摩尔比的量，将双功能交联剂溶解于PH为7.0-7.2的PBS-EDTA缓冲液中，该PBS-EDTA缓冲液组成为50-100mmol/L磷酸盐，0.15mol/LNaCI，5-10mmol/LEDTA，取表面引入活性氨基的聚砜材料置于该缓冲液中室温反应1～2小时，最后将材料置于已巯基化抗凝药物的PBS-EDTA溶液中，4℃或常温反应2～24小时，获得表面接枝抗凝药物的聚砜材料；
所述的交联剂选自磺胺琥珀酸基-4-N-异酰亚胺甲基环己烷-1-羧酸酯、N-磺胺琥珀酸基-4-[4-碘基乙酰基]氨基苯甲酸盐、N-[g-异酰亚胺丁氧基]-磺胺琥珀酸酯、m-异酰亚胺苯氧基N-羟基磺胺琥珀酸酯、[N-e-异酰亚胺己氧基]磺胺琥珀酸酯、磺胺琥珀酸基4-[p-异酰亚胺苯氧基]丁酸盐、磺胺琥珀酸基6-(3`-[2-吡啶基二硫]-丙酰胺基)己酸酯、N-[k-异酰亚胺十一烷氧基-磺胺琥珀酸酯、4-磺胺琥珀酸基-6-甲基-阿(2-吡啶基二硫)甲苯酰胺]己酸酯、N-琥珀酰亚胺-([N-异酰亚胺3-戊酰胺]-乙二醇)酯。
2.根据权利要求1所述的一种利用傅氏反应接枝制备抗凝血聚砜材料的方法，其特征在于所述的傅氏催化剂选自四氯化锡或三氯化铝。
3.根据权利要求1所述的一种利用傅氏反应接枝制备抗凝血聚砜材料的方法，其特征在于所述的氨基硅烷偶联剂选自γ-氨丙基三乙氧基硅烷、γ-氨丙基三乙氧基硅烷，N-β (氨乙基)-γ-氨丙基甲基二氧基硅烷、或N-β-(氨乙基)-γ-氨丙基三甲氧基硅烷。
4.根据权利要求1所述的一种利用傅氏反应接枝制备抗凝血聚砜材料的方法，其特征在于所述的抗凝药物选自阿加曲班、肝素、低分子肝素、水蛭素、比伐卢定、透明质酸或尿激酶。
5.根据权利要求1所述的双功能交联剂交联法的方法，其特征在于所述的氨基侧链修饰剂选自2-亚氨基硫烷盐酸盐、N-磺胺琥珀酸基-S-乙酰基硫代乙酸酯或N-磺胺琥珀酸基-S-乙酰基硫代丙酸酯。
6.一种抗凝血聚砜材料，其特征在于在聚砜表面上有通过权利要求1-5之一所述方法获得的交联层，在交联层上有抗凝药物层。
7.一种血液透析滤器，其特征在于滤器材料是权利要求6所述的抗凝血聚砜材料。 
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