CN103087218A

CN103087218A - 直链形肝素修饰的生物型人造血管

Info

Publication number: CN103087218A
Application number: CN2011104539243A
Authority: CN
Inventors: 罗莹; 刘晓鹏; 张伟
Original assignee: GUANGDONG SUMMIT LIFE SCIENCES CO Ltd; Peking University
Current assignee: GUANGDONG SUMMIT LIFE SCIENCES CO Ltd; Peking University; Grandhope Biotech Co Ltd
Priority date: 2011-12-30
Filing date: 2011-12-30
Publication date: 2013-05-08
Anticipated expiration: 2031-12-30
Also published as: CN103087218B

Abstract

本发明公开了一种直链形末端胱胺化肝素及其修饰的生物型人造血管。本发明所提供的末端胱胺化肝素的结构式如式I所示。将末端胱胺化肝素通过还原剂将其中的二硫键切断，得到了可与血管支架材料反应的巯基位点；通过双向官能团的偶联剂将血管内表面活化，具有直链形状的肝素即可通过化学键共价固定于血管材料内表面，从而获得具有抗凝作用的复合型人造血管。相对于目前通过肝素羧基修饰材料表面的方法，末端位点反应最大程度保留了肝素分子的天然性质。当该直链肝素修饰于血管内表面，提高了血管内壁抵抗血小板粘附并明显提高了血管的抗凝血性能，结果未修饰的血管。

Description

直链形肝素修饰的生物型人造血管

技术领域

本发明涉及一种直链形肝素修饰的生物型人造血管。

背景技术

人造血管主要用于人体组织血管的替代修复。目前基于人造材料(如涤纶、聚四氟乙烯)的大口径人造血管已应用于临床，而小口径人造血管(直径小于6mm)一直没有临床产品。主要原因有小口径血管的血流速度慢、血压低，容易发生急性血栓、吻合处内膜增生、动脉瘤、感染以及动脉粥样硬化。目前临床治疗中，小口径血管移植替代物多为自体血管(如取自大隐静脉的血管组织)，然而许多患者可能由于其它的血管疾病或血管组织缺失，无法提供可移植的血管。小口径人工血管因而在冠状动脉、脑血管、糖尿病足修复、血管造瘘及体外血液透析等治疗途径中有着迫切的临床需要。

脱细胞基质是通过对动物组织和器官进行固化和脱细胞等加工工序，获得的生物相容型的生物型基质，可以用于人体缺损组织的修复与重建，实现组织和器官的原位再生和功能恢复。相对于传统组织工程和再生医学中的人工型支架，脱细胞基质能保留生物组织异常复杂的成分和结构，因而具有人工材料无法比拟的化学和力学等生物性能。然而脱细胞基质虽然具有天然结构和成分，其表面性质可能仍然无法满足生物材料相容性和组织再生的需求。基于脱细胞基质的小口径血管(即生物型血管)目前存在以下问题：血栓一般会在半年内时间形成；血管内表面内皮化以及血管平滑肌细胞对植入型材料的再生重塑过程难以发生。

通过对血管内表面进行抗凝修饰是一种最常用的减少血管内血栓形成和提高材料血液相容性的方法。而肝素材料在大口径血管产品中已经得到了应用(参考文献：1.Daenens K，Schepers S，Fourneau I.Heparin-bonded ePTFE grafts compared with vein grafts infemoropopliteal and femorocrual bypasses：1-and 2-year results.J Vasc Surg 2009；49(5)：1210-62.Janczak D，Pupka A，Skora J.The use of the heparin-bonded ePTFE grafts for needs of hehemodialysis.Polim Med 2010；40(4)：35-9 3.Pupka A，Janczak D，Szyber PP.Theheparin-bonded ePTFE grafts in revascularisation of the lower limbs.Polim Med 2010；40(1)：9-144.Hugl B，Nevelsteen A，Daenens K.PEPE II--a multicenter study with an end-pointheparin-bonded expanded polytetrafluoroethylene vascular graft for above and below knee bypasssurgery：determinants ofpatency.J Cardiovasc Surg(Torino)2009；50(2)：195-203.)。

肝素是一种重要的细胞外基质糖胺聚糖物质，由D-β-葡糖醛酸(或L-α-艾杜糖醛酸)和N-乙酰氨基葡糖形成重复二糖单位组成，高度带负电荷，胺基硫酸化程度高。肝素结构如式1所表示，其结构呈不均一状态，包括氨基硫酸化的数目和位置不均一，平均分子量不均一等，其中氨基葡萄糖残基的硫酸化大部分发生在C6位，少部分发生在C3和C2位氨基上，而乙酰化选择性发生在氨基葡萄糖的C2位氨基上。氨基葡萄糖C3上的硫酸化是结合抗凝血酶III(AntiThrombin-III)的重要结构。而由于其带有很高的负电荷密度，各糖环之间有较强的排斥力因而其分子链不易交叉扭曲，呈一种线性的空间结构。

式1肝素结构式X＝sulfo or H，Y＝sulfo or H or Ac

式2与ATIII结合的五糖结构

凝血酶的激活是血栓形成的主要因素之一，而肝素的抗凝效果主要是与ATIII结合，抑制凝血酶的激活并抑制血小板聚集，减少暂时性血小板凝块转变成永久性血纤蛋白凝块的几率，降低血液粘度以维持正常的血液流动，从而防止血栓的形成。以式2中的五糖结构为单元，含有该五糖单位的肝素，可以有效和ATIII结合，结合后使ATIII的活性增加2*10³倍，可直接抑制凝血因子FXa，从而产生高效的抗凝效果。而与FIIa结合需要更长的heparin链(至少7个二糖单位长)。而普通肝素临床应用具有半衰期短、易受血小板因子IV影响等不良效果。而低分子量肝素在保留了抗血栓形成的功能之外，具有更好的抗FXa能力和稳定疗效，而为保留其完整的五糖单元结构，降解的分子量应在2500以上。为区分抗FXa与抗FXa/FIIa两种低分子量肝素的特点，选择了3-5K和5-10K两种分子量区间的肝素。

然而目前肝素修饰方法存在下述问题：

1、如果是合成型材料，一般需要在材料表面进行预处理获得化学官能团和可以复合肝素的物质；

2、利用天然材料的官能团可以对血管内表面修饰，但目前的方法一般需要直接通过肝素羧基与材料表面氨基等官能团反应，该反应方法很难有明确的肝素修饰位点，同时肝素的活性难以保证。

因此，设计具有可控修饰位点和可控修饰度的肝素修饰方法，将肝素复合于基于脱细胞基质的人工血管因而有着应用前景。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种直链形末端胱胺化肝素及其制备方法。

本发明所提供的直链形末端胱胺化肝素的结构式如式I所示：

其中，所述式I中R₂＝H或SO₃H，R₃＝H、COCH₃或SO₃H，n＝1-50。

式I所示的末端胱胺化肝素中每个二糖单元含1.8-2.5个磺酸基团。

制备式I所示的末端胱胺化肝素的方法，包括下述步骤：在硼氰化钠存在下，使式III所示的肝素与胱胺进行反应，得到式I所示的末端胱胺化肝素；

其中，所述式III中R₂＝H或SO₃H，R₃＝H、COCH₃或SO₃H，n＝1-50。

肝素与胱胺的反应在硼酸钠缓冲液中进行，所述反应的反应体系的pH值为8.50±0.03；所述反应的反应温度为室温，反应时间为48±0.5小时；

所述反应中，肝素与胱胺的摩尔比为1∶10-1∶15；

所述硼氰化钠与胱胺的摩尔比为1∶0.5-1∶1.0。

所述肝素中每个二糖单元含1.8-2.5个磺酸基团。

式III中的n值可进一步为4-8(对应分子量为3k-5k)或8-16(对应分子量为5k-10K)。相应的式I中的n值可进一步为4-8或8-16。

此外，将式I所示的末端胱胺化肝素在还原剂的作用下使二硫键断裂形成的式II所示的末端巯基化肝素也属于本发明的保护范围。所述还原剂具体可为TCEP。

其中，所述式II中R₂＝H或SO₃H，R₃＝H、COCH₃或SO₃H，n＝1-50。

所述式II所示的末端胱胺化肝素中每个二糖单元含1.8-2.5个磺酸基团。

本发明中所提供的末端胱胺化肝素以及末端巯基化肝素可用于制备抗凝剂或在植入性医用材料的抗凝修饰中得以应用。

本发明还保护一种直链肝素修饰的生物型人工血管。

所述直链肝素修饰的生物型人工血管是按照包括下述步骤的方法制备得到的：1)采用能分别与巯基和氨基进行反应的具有双向官能团的偶联剂对生物型人工血管内表面进行活化处理；

2)将活化后的生物型人工血管与本发明提供的末端巯基化肝素进行反应，得到直链肝素修饰的生物型人工血管。

其中，步骤1)中所述具有双向官能团的偶联剂具体可为SM(PEG)₂。

采用SM(PEG)₂对生物型人工血管内表面进行活化处理的具体方法如下：1)将生物型人工血管的一端标记长度并用夹子夹持，把SM(PEG)₂的DMSO溶液加入到生物型人工血管内部，然后再加入DPBS缓冲液使待处理的人工血管内表面完全浸没至标记长度，然后将另一端以同样的夹子夹持；2)将生物型人工血管悬浮于容器中，在搅拌状态下于37±0.5℃反应30±1分钟，吸出生物型人工血管中的溶液并用DPBS缓冲液洗涤血管内壁。

步骤1)中对生物型人工血管内表面进行的氨基活化度可为1％-100％，具体可为50％。

当选择50％的氨基活化度时，在活化过程中，SM(PEG)₂加入量与人工血管内表面氨基的摩尔比可为1.5∶1-2.0∶1。

活化后的生物型人工血管与末端巯基化肝素进行反应时，其所述反应的反应温度为37±0.5℃，反应时间为12±0.5小时；所述末端巯基化肝素的加入量以其末端的巯基计，其为人工血管内表面氨基摩尔量的1-100％。

本发明将肝素通过肝素酶降解，获得不同分子量范围的肝素寡糖链段(分子量分布范围：3k-5k及5k-10k)。利用多糖分子的还原末端和胱胺反应，获得可以用于生物材料表面处理的官能团化的胱胺-肝素寡糖。将胱胺-肝素寡糖与还原剂反应后，胱胺片段的二硫键得以切断，生成具有巯基的肝素寡糖。该肝素末端巯基即为肝素与血管材料复合的专一反应位点。通过具有双向官能团的偶联剂将血管内表面活化，具有直链形状的肝素即可通过化学键共价固定于血管材料内表面，从而获得具有抗凝作用的复合型人造血管。

本发明利用肝素多糖的末端结构，使肝素寡糖产生可以用于表面修饰的专一反应位点，并对脱细胞基质人工血管材料内表面进行抗凝处理。具有末端反应位点的肝素整体结构并未被破坏。相对于目前通过肝素羧基修饰材料表面的方法，末端位点反应最大程度保留了肝素分子的天然性质。当该直链肝素修饰于血管内表面，提高了血管内壁抵抗血小板粘附并明显提高了血管的抗凝血性能，结果优于未修饰前的血管。

本发明提供的末端官能团化的肝素分子是一种新的抗凝物质，在抗凝制剂和植入型医用材料中有着实际应用的前景。在此基础上所获得的人工血管可以成为新的血管组织替代修复产品。

附图说明

图1为肝素与FXa和FIIa结合原理差异示意图。

图2为5-10K胱胺化肝素的核磁共振氢谱图。

图3为3-5K胱胺化肝素的核磁共振氢谱图。

图4为胱胺化肝素通过SM(PEG)₂修饰到人工血管上的反应示意图。

图5为血管黏附的血小板的扫描电子显微镜照片，A为修饰后血管，B为空白血管。

图6为血管黏附的血小板数目柱形图。

图7为血管的血浆复钙时间柱形图。

图8为血管的凝血酶原时间柱形图。

图9为血管的活化的部分凝血活酶时间柱形图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实验用水为经过蒸馏和离子交换处理的18兆欧水(格兰特，石家庄，中国)；I型肝素酶、硼氰化钠、三硝基苯磺酸钠(TNBSA)、二甲亚砜(DMSO)、1，9-二甲基亚甲基蓝(DMMB)5，5′-二巯基双-2-硝基苯甲酸(DTNB)从Sigma-Aldrich(Milwaukee，WI)购买；猪小肠粘膜提取肝素、胱胺(cystamine)、还原剂TCEP、三羟甲基胺基甲烷盐酸盐(Tris)、甘氨酸和硼酸钠等从Alfa Aesar(Ward Hill，MA)购买；偶联剂SM(PEG)2从Pierce Biotech.(Rockford，IL)购买；杜氏磷酸缓冲液(DPBS)从Invitrogen(Carlsbad，CA)购买；凝血酶原(PT)试剂购自协和生物(成都，中国)；APTT试剂购自协和生物(成都，中国)；截留分子量10K及3K的超滤管购自Amicon(Mumbai，India)，截留分子量5K超滤管的购自赛多利斯(Germany)。

所述生物型人工血管是取自健康成年猪的胸主动脉，采用文献中所提到的处理方法而制得的脱细胞人工血管。(O.E.Teebken，A.Bader，G.Steinhoff.Tissue engineeringof vascular grafts：human cell seeding of decellularised porcine matrix.Eur J Vasc EndovascSurg 2000；19(4)：381-6)

实施例1、末端胱胺化肝素和末端巯基化肝素制备

1、酶降解法制备3-5K及5-10K肝素

由猪小肠粘膜提取的肝素，经过一定时间的I型肝素酶降解，然后用含分子量选择性强的超滤膜超滤并透析获得：

(1)配制0.1M的Tris-盐酸缓冲液，pH调节为7.00±0.02之间。

(2)称取806.9mg的heparin粉末(白色)，在生物安全柜中紫外杀菌30min。将其加入用220微米孔径滤器滤菌后的Tris缓冲液16.0ml。(取样并用pH计测量体系pH值，为7.08)。

(3)再次用滤膜滤菌。加入100μl 100单位(sigma单位，约为600分之一国际单位)的heparinase-Tris缓冲液，37℃无菌酶解96h，然后95℃煮5分钟使酶失活。

(4)先分别用10,000的超滤管超滤，小于10,000的滤液用截留分子量1000的透析袋透析96h(20倍体积去离子水，6-8h换一次水)以除去溶液中的盐类等小分子。然后用截留分子量5,000的超滤管超滤6次，每次20mins，离心速度为4900转/分钟，得到分子量5-10K的肝素水溶液，然后-80℃冷冻之后冻干，最后得到5-10K肝素的质量为245.5mg，产率为：30.3％。

(5)分子量小于5000的用分子截留量3,000的超滤管超滤6次，得到3-5K的产品，96h产品质量为63.6mg，产率为7.86％。

2、末端胱胺化肝素(Cystamine-heparin，简写作CH)的合成

以过量10倍的胱胺加入，以使胱胺与肝素以接近1∶1比例进行反应。

(1)配制0.1M的硼酸钠缓冲液，调节pH值为8.50±0.03；

(2)称取5-10K分子量肝素，34.3mg溶于4ml pH 8.50±0.03的硼酸钠缓冲液中，称取cystamine(胱胺)38.4mg溶于上述体系中，称取9.0mg的硼氰化钠溶于体系中，然后调节体系pH8.50±0.03，室温反应48±0.5小时。反应完毕后，用截留分子量500的透析袋在去离子水中透析72h(每6-8小时换一次去离子水)。最后得到产品28.0mg，产率78.12％。-20℃密封保存。

(3)称取3-5K分子量肝素，13.7mg溶于2ml pH 8.50±0.03的硼酸钠缓冲液中，称取cystamine(胱胺)11.8mg溶于体系中，称取9.0mg的硼氰化钠溶于体系中，然后调节体系pH8.50±0.03，室温反应48±0.5小时。反应完毕后，用截留分子量500的透析袋透析72h在去离子水中透析72h(每6-8小时换一次去离子水)。最后得到产品10.1mg，产率73.73％。-20℃密封保存。

3、核磁共振法定量表征胱胺化后肝素修饰比例及分子量：

末端胱胺化肝素的结构式如式I所示：

其中，所述式I中R₂＝H或SO₃H，R₃＝H、COCH₃或SO₃H，n＝4-8或8-16。

由胱胺化后肝素的结构可知，二糖重复单元上有12个H，而胱胺化后连接部分胱胺亚甲基的4个化学环境相同的H(峰)，并且积分区域不重叠。因此通过将δ2.950-3.100(胱胺部分中的-CH₂-S-，4H)和δ3.350-3.500(胱胺部分中的-CH₂-NH₂-，4H)三重峰定标为1.00，其余从δ3.0-6.5之间的峰(除掉4.70-4.90的水分子上的氢峰)其余的峰面积加和与定标量比较，得出每个胱胺分子对应二糖单元的数量，然后根据肝素二糖平均分子量(根据磺酸化程度的差异有所不同，此处取500均值，即每二糖单元磺酸化程度为2.5左右)

(1)5-10K的胱胺化肝素的核磁共振氢谱中(见图2)，δ2.977(胱胺部分中的-CH₂-S-，4H)和δ3.350(胱胺部分中的-CH₂-NH₂-，4H)的三重峰定标为1.00，其余从δ3.0-6.5之间的峰(除掉4.70-4.90的水分子上的氢峰)其余的峰面积加和与定标量比较。糖环上氢(对应12H)积分面积之和为0.40+5.82+1.36+21.89+2.54＝32.01，计算得每1mol的胱胺基团连接二糖单元个数为：32.01/12*(4/1)＝10.67个，则定标积分定量的肝素换算的胱胺化肝素平均分子量为：5.3K。

(2)3-5K的胱胺化肝素的核磁共振氢谱中(见图3)，δ3.059(胱胺部分中的-CH₂-S-，4H)和δ3.417(胱胺部分中的-CH₂-NH₂-，4H)的三重峰定标为1.00，其余从δ3.0-6.5之间的峰(除掉4.70-4.90的水分子上的氢峰)其余的峰面积加和与定标量比较。糖环上氢(对应12H)积分面积之和为2.37+15.30+1.87＝20.54，计算得每1mol的胱胺基团连接二糖单元个数为：20.54/12*(4/1)＝6.85个，则定标积分定量的肝素换算的胱胺化肝素平均分子量为：3.6K。

(3)在核磁共振定量过程中，由于a.两个肝素在胱胺两端反应使反应比例大于1∶1；b.氧连或氮连磺酸基团在反应过程中会有少量的损失，使得所测值与实际分布会偏低一些。但基本满足由于ATIII结合机理对所制胱胺化肝素的要求。

4、末端巯基化肝素制备(TCEP还原法)

(1)将2-(2)中得到的分子量5-10K末端胱胺化肝素21.3mg溶于2.0ml的DPBS中，加入1.0ml的10mg/L的TCEP(磷酸三(β-氯乙基)酯)，调节pH为5.18，反应12小时，用截留分子量3000的超滤管超滤7次，每次加入3ml去离子水超滤20分钟，冻干后得到13.0mg产品，产率为61.03％。-20度密封保存。

(2)将2-(3)中得到的分子量3-5K末端胱胺化肝素10.1mg溶于2.0ml的DPBS中，加入1.0ml的10mg/L的TCEP(磷酸三(β-氯乙基)酯)，调节pH值为5.18，反应12小时，用截留分子量3000的超滤管超滤7次，每次加入3ml去离子水超滤20分钟，冻干后得到6.6mg产品，产率为65.35％。-20度密封保存。

5、末端巯基化肝素的DTNB巯基检测

反应原理：5，5′-二巯基双-2-硝基苯甲酸(DTNB)或称Ellman试剂与巯基化合物发生硫醇-二硫化物交换反应，生成5-巯基-2-硝基苯甲酸，在碱性条件下反应显黄色，在412nm处有强烈的光吸收。该反应可特异性地检测-SH。采用半胱氨酸为标准物质制作标准曲线。

(1)半胱氨酸工作曲线的绘制

A.1mM半胱氨酸母液的配制

称取0.0053g半胱氨酸晶体，溶解于40ml DPBS中，搅拌均匀，使其完全溶解。

B.2mg/ml DTNB溶液的配制

先用0.1M Na₃PO₄将DPBS的pH值调到8.0，然后称取0.02g DTNB粉末，溶解于pH8.0的DPBS中，适当加热搅拌，使其完全溶解。

C.配置一系列浓度的半胱氨酸溶液

表1.反应体系

D.反应时，每个管中加入250ul样品，再加入50ulEllman试剂，混合均匀，室温反应15分钟；

E.测量吸光值，在96孔板的每个孔中加入150ul反应后溶液，以A-1孔为空白，在412nm处进行吸光值的测定。

表2.DTNB标准曲线吸光值测定

以半胱氨酸浓度为横坐标(X)，吸光度值为纵坐标(Y)，进行线性回归分析。所得半胱氨酸工作曲线方程为y＝0.0059x-0.0085，R²＝0.9996。

(2)末端巯基化肝素的DTNB巯基检测

(a)配制DPBS pH8.0的缓冲液，配制2.0mg/ml的DTNB溶液；

(b)称取适量末端巯基化肝素样品；

(c)将适量样品溶于DPBS缓冲液中，取250微升样品溶液，加入50微升的DTNB，常温反应15mins，然后在412nm处检测吸光度，然后代入曲线y＝0.005x-0.008；

(d)由标准曲线比较，根据测量值测得5-10K巯基化肝素分子量均值为：7.9±1.7K，即巯基单位摩尔量为：(1.27±0.35)*10^-7mol/mg，每摩尔巯基连接10-16个二糖单元。

(e).由标准曲线比较，根据测量值测得3-10K巯基化肝素分子量均值为：4.5±0.6K即巯基单位摩尔量为：(2.22±0.34)*10^-7mol/mg，每摩尔巯基连接6-8个二糖单元。

实施例2、肝素复合于脱细胞基质人工血管

将胱胺化肝素末端还原后，得到巯基化肝素，之后定量检测血管内表面的氨基量，然后通过具有巯基-氨基双向官能团连接剂，将血管内表面活化，即可通过化学键共价固定具有直链形状的肝素于血管材料内表面(见图4)。

1、血管上氨基的检测

反应原理：含有初级胺或酰肼基团的分子可以与

2，4，6-trinitrobenzenesulfonate(TNBS)发生反应，从而生成有色衍生物；复合物中的氨基含量与桔黄色生成物在335nm处的吸收值成线性关系。因此可以通过测定335nm处的吸光值来测定氨基含量。

(1)TNBS标准曲线的测量

A.配制系列浓度的含氨基溶液，以甘氨酸溶液为标准试样，先配制2mM的母液，然后分别稀释到不同浓度，每个浓度的溶液配制三个平行样。

表3.测定标准曲线所需溶液

编号	浓度/uM	稀释倍数	Gly/uL	NaHCO3/uL
					0	0	-	0	800
1	20	100	8	792

2	50	40	20	780
					3	80	25	32	768
4	100	20	40	760
					5	130	15.38	52	748
6	160	12.5	64	736
					7	200	10	80	720
8	250	8	100	700
					9	300	6.67	120	680
10	400	5	160	640
					11	500	4	200	600
12	600	3.33	240	560

B.在250μL含氨基溶液中加入125μL 0.05％TNBS，混匀后，在摇床中恒温反应2小时(37℃，120rpm)。

C.每个平行中取150μL样品，在酶标仪中测量335nm处的吸收值。

D.以氨基浓度为横坐标，A335nm为纵坐标，绘制标准曲线。所得TNBSA标准曲线方程为：y＝0.0044x+0.0012，R²＝0.9993。

(2)TNBS法定量检测人工血管上氨基密度

A.用新TNBSA配制10ml 0.01％TNBSA溶液，缓冲液用硼酸钠缓冲液，pH8.5；

B.将约2cm长的人工血管，加入100μl TNBSA溶液及300μl缓冲液在去离子水中透析72h(每6-8小时换一次去离子水)，用透析夹夹住两端使液体充满被夹住的人工血管内部，然后37度水浴锅中反应3h，设三个平行样品；

C.取出上清液200μl在其中加入25μl的5mM甘氨酸，37度摇床搅拌反应2h，加入25μl1M HCl终止反应；

D.微量比色皿测量335nm处吸收值并计算氨基浓度。除掉血管被夹持的部分后，将剩余部分用乙醇脱水并自然风干，然后称量其质量。

E.根据与标准曲线比较得，新测血管内部氨基含量为：1.73(±0.35)nmol/mg。

2、血管的修饰

操作步骤：

(1)将血管退包装后，分别用去离子水、体积百分比75％乙醇溶液浸泡2h并风干称重，取直径接近部分并用均值计算被修饰部分的重量，测量值为85.0±3.8mg/cm；

(2)将新鲜血管一端标记长度并用适当松紧度的夹子夹持，加去离子水检测夹持端，要求夹持端不漏液、不破损；

(3)用调节后的DPBS(pH8.0)作为缓冲液，将DMSO溶解的SM(PEG)₂以2倍于血管内氨基的摩尔量加入到人工血管内部(使氨基活化程度为50％)，然后加入DPBS缓冲液将其内表面尽量完全浸没至标记长度，然后将另一端以同样的夹子夹持；

(4)悬浮于容器中，加入磁性转子带轻微搅动(约60转/分钟)37度反应30min，吸出溶液并用DPBS缓冲液洗涤血管内壁三次，加入摩尔量为血管内壁氨基摩尔量50％的末端巯基化肝素；

(5)37度反应12h，然后除掉两端的夹子，轻压出反应液，然后分别用DPBS、去离子水冲洗至少五次，之后去离子水浸泡3次，每次15min。

(6)制备完成后，先用灭菌去离子水冲洗多次，然后用95％乙醇浸泡2h以灭菌。

(7)用高温灭菌的去离子水浸泡3次，每次12h，浸泡液体积为50ml(每根血管单独标记后浸泡)。

(8)再用50ml灭菌去离子水浸泡3h，重复三次；

(9)用5ml去离子水浸泡3h，然后用DMMB(1，9-二甲基亚甲基蓝)检测，确定其没有未修饰的肝素吸附在表面(肝素值小于1μg/ml)。

3、血管内修饰巯基化肝素的DMMB定量检测：

原理：Heparin与DMMB(1.9二甲基亚甲基蓝)在30℃下反应，形成沉淀，加入DMMB解析液，使沉淀溶解，在656nm处测量样品中重新游离出来的DMMB的吸光度值，DMMB的量与heparin的量成正比，进而计算出heparin的含量。

操作步骤：

(1).配置标准曲线：

A.将酶降解所得的heparin，配制成10μg/ml的标准液；

B.依次配制浓度分别为0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、1.0、1.4、1.8、2.0μg/ml的标准液，分别取出100μl，加入1ml的DMMB，30℃下反应30mins，离心(13x10000，10mins)。

C.沉淀用0.5ml的DMMB解析液溶解，30℃下反应30mins，取出150μl，96孔板656nm处测量。

表4.DMMB标准曲线吸光度测量值

F.在0～1.8μg/ml的范围内，其Y＝0.110X，R²＝0.9934。

(2)血管修饰肝素的定量检测：

A.将修饰后的血管取适量(15-30mg之间)，用体积分数75％乙醇溶液浸泡12小时，生物安全柜中风干后，紫外灭菌30分钟；

B.溶于1ml pH 7.00±0.02的Tris缓冲液中，加入0.01UN的I型肝素酶，30℃下无菌酶解48h，

C.取出100μl上清降解液，加入1ml的DMMB，30℃下反应30mins，离心(1.3*10⁵转/分钟，10分钟)。

D.沉淀用0.5ml的DMMB解析液溶解，30℃下反应30mins，取出150μl，96孔板656nm处测量。

表5.DMMB定量检测巯基化肝素修饰血管

实施例3、复合型人工血管抗凝性质表征

从健康的新西兰兔静脉采血若干毫升，加入占总体积10％的枸橼酸钠，可短时间内起抗凝血作用。采集的新鲜兔全血在普通离心机1500rpm离心15min，然后吸取上层和中层液体到另一离心管，3000rpm再次离心10min，离心完毕后吸取75％的上清液保存，即为贫血小板血浆(PPP)，剩余的液体则为富集血小板血浆(PRP)。其中，PPP用于血浆复钙时间、凝血酶原时间、活化的部分凝血活酶时间的检测，PRP用于血小板黏附试验。

1.血小板黏附检测(platelet adhesion assay，PAA)

1)将各血管样品(1cm²，指双面表面积)放入1ml PRP中，在37℃、60rpm摇床中振荡60min；

2)用新鲜的去离子水清洗血管样品两次，每次5min，尽量洗掉血管表面未黏附的血小板；

3)将血管样品放入质量浓度2.5％的戊二醛溶液中4℃过夜，然后用去离子水冲洗2-3次，每次5min；

4)用体积百分比为30％、50％、70％、80％、90％的乙醇溶液梯度脱水，100％乙醇重复脱水两次，每次15min；

5)用大头针固定血管样品，并放置在空气中自然干燥；

6)电镜室中真空喷金，扫描电子显微镜观察血小板形态，并对每血管样品随机取3个视野，对每个视野中的血小板进行计数，求平均值；

7)实验中同一血管样品各3个平行样，以评价实验的差异性。

8)材料界面血小板的黏附和活化是导致凝血的重要因素。材料的血液相容性越好，其材料界面黏附的血小板就越少，甚至极少。

本试验中，修饰后血管黏附的血小板为2937.000±718.084/mm²，空白血管为8865.750±1378.003/mm²。(见图6)

2.血浆复钙时间检测(plasma recalcification time，PRT)

1)先将PPP和CaCl₂溶液分别在37℃水浴锅中下孵育数分钟；

2)将各血管样品(0.5cm²，指指双面表面积)放入一定容量的玻璃试管中，然后再加入1ml的PPP，并在摇床中37℃振荡1min，再加入1ml的0.025mol/L CaCl₂溶液；

3)将试管放置于37℃、60rpm的摇床，然后开始用秒表计时；

4)当反应溶液出现凝胶状态时(即出现少量丝状纤维)，记录此时间即为血浆复钙时间；

5)实验中同一血管样品设3个平行样，取平均值。

6)血浆复钙时间常用作评价血液和材料相互作用的一个指标，表示钙离子加到抗凝血浆中纤维蛋白凝结的时间。在钙离子参与下，材料的血液相容性能越好，血浆复钙时间就越长。

本试验中，修饰后血管的血浆复钙时间为318.667±95.002s，而空白血管为98.333±7.638s。(见图7)

3.凝血酶原时间检测(prothrombin time，PT)

1)先将PPP和凝血酶原(PT)试剂在37℃水浴锅中下孵育5min；

2)将各血管样品(0.5cm²，指双面表面积)放入到玻璃试管中，然后加入1ml的PPP，接着加入1ml的PT试剂，混匀后开始秒表计时；

3)在室温条件下，用手轻微抖动试管，肉眼观察溶液出现凝胶状态时(即出现少量丝状纤维)，即停止计时，该时间即为凝血酶原时间；

4)实验中同一血管样品设3个平行样，取平均值。

5)凝血试验可以检测所测样品的抗凝血活性，凝血酶原时间就是其中的一种方法。凝血酶原时间值越大，说明材料的血液相容性越好。

本试验中，修饰后血管的凝血酶原时间为13.750±0.500s，而空白血管为11.750±0.500s。(见图8)

4.活化的部分凝血活酶时间检测(actived partial thromboplastin time，APTT)

1)将各血管样品(0.5cm²，指双面表面积)放入到玻璃试管中，加入1ml的PPP，接着加入1ml的APTT试剂，混匀后放入37℃水浴锅中孵育5min；

2)然后向各试管中加入1ml的0.025mol/LCaCl₂溶液；

3)在室温条件下用手轻微抖动试管，肉眼观察到溶液中出现丝状纤维时停止计时，该时间即为活化的部分凝血活酶时间；

4)实验中同一血管样品设3个平行样，取平均值。

5)凝血试验可以检测所测样品的抗凝血活性，活化的部分凝血活酶时间就是其中的另一种方法。活化的部分凝血活酶时间值越大，说明材料的血液相容性越好。

本试验中，修饰后血管的活化的部分凝血活酶时间为30.000±1.155s，而空白血管为24.500±0.577s。(见图9)

以上各试验结果均表明，纳米修饰后血管的血液相容性优于空白血管，即该修饰方法可提高生物型人造血管的抗凝血性能。

Claims

1.式I所示的末端胱胺化肝素：

2.根据权利要求1所述的末端胱胺化肝素，其特征在于：所述式I所示的末端胱胺化肝素中每个二糖单元含1.8-2.5个磺酸基团；所述式I中的n＝4-8或8-16。

3.式II所示的末端巯基化肝素：

4.根据权利要求3所述的末端胱胺化肝素，其特征在于：所述式II所示的末端胱胺化肝素中每个二糖单元含1.8-2.5个磺酸基团；所述式II中的n＝4-8或8-16。

5.制备式I所示的末端胱胺化肝素的方法，包括下述步骤：在硼氰化钠存在下，使式III所示的肝素与胱胺进行反应，得到式I所示的末端胱胺化肝素；

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述反应在硼酸钠缓冲液中进行，所述反应的反应体系的pH值为8.50±0.03；所述反应的反应温度为室温，反应时间为48±0.5小时；

所述反应中，肝素与胱胺的摩尔比1∶10-1∶15；

所述硼氰化钠的加入量与胱胺量摩尔比为1∶0.5-1∶1.0。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述式III所示的肝素中每个二糖单元含1.8-2.5个磺酸基团；所述式III中的n＝4-8或8-16。

8.制备式II所示的末端巯基化肝素的方法，是将权利要求1中式I所示的末端胱胺化肝素在还原剂的作用下使二硫键断裂形成巯基得到的；其中所述还原剂具体为TCEP。

9.权利要求1或2所述末端胱胺化肝素或权利要求3或4所述的末端巯基化肝素在制备抗凝剂中的应用或在植入性医用材料抗凝修饰中的应用。

10.一种制备直链肝素修饰的生物型人工血管的方法，包括下述步骤：

1)采用能分别与巯基和氨基进行反应的具有双向官能团的偶联剂对生物型人工血管内表面进行氨基活化处理；

2)将活化后的生物型人工血管与权利要求1或2中所述末端巯基化肝素进行反应，得到直链肝素修饰的生物型人工血管。

11.根据权利要求10所述的方法其特征在于：步骤1)中所述氨基活化处理的活化度为1％-100％；

步骤1)中所述具有双向官能团的偶联剂为SM(PEG)₂；

采用SM(PEG)₂对生物型人工血管内表面进行活化处理的方法如下：1)将生物型人工血管的一端标记长度并用夹子夹持，把SM(PEG)₂的DMSO溶液加入到生物型人工血管内部，然后再加入DPBS缓冲液使待处理的人工血管内表面完全浸没至标记长度，然后将另一端以同样的夹子夹持；2)将生物型人工血管悬浮于容器中，在搅拌状态下于37±0.5℃反应30±1分钟，吸出生物型人工血管中的溶液并用DPBS缓冲液洗涤血管内壁。

12.根据权利要求10或11所述的方法，其特征在于：步骤2)中所述末端巯基化肝素的加入量以其末端的巯基计，其为所述人工血管的内表面上氨基摩尔量的1-100％；

所述反应的反应温度为37±0.5℃，反应时间为12±0.5小时。

13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于：步骤1)中所述氨基活化处理的活化度为50％，在氨基活化处理的过程中，SM(PEG)₂加入量与人工血管内表面氨基的摩尔比为1.5∶1-2.0∶1；步骤2)中所述末端巯基化肝素纳米材料的加入量以其末端的巯基计，其为人工血管内表面氨基摩尔量的50％。

14.权利要求10-13任一项所述方法制备得到的直链肝素修饰的生物型人工血管。