CN103086980A

CN103086980A - 一种用于高效促进干细胞增殖的嘧啶化合物及其用途

Info

Publication number: CN103086980A
Application number: CN2011103459576A
Authority: CN
Inventors: 田杰
Original assignee: BEIJING QMLC STEM CELL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: BEIJING QMLC STEM CELL TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2011-11-07
Filing date: 2011-11-07
Publication date: 2013-05-08

Abstract

本发明属于医药领域，涉及一种可用于促进干细胞增殖的小分子化合物，本发明以色酮类化合物卤化后得到的卤代物作为一个组分，使受试细胞增值速度加快，并能保持细胞活性良好。其特征在于：在制备修复损伤神经组织及功能重建的细胞营养素和细胞增殖剂中的应用；构建高效率的药物筛选模型，并利用该模型在药物药效的初步筛选与评价中的应用。本发明确定了新嘧啶化合物的细胞药理活性，奠定了其在干细胞移植中的应用基础，同时也可为开发拥有自主知识产权的新药提供借鉴。

Description

一种用于高效促进干细胞增殖的嘧啶化合物及其用途

技术领域

本发明属于医药领域，涉及一种可用于促进干细胞增殖的小分子化合物，此类化合物使受试细胞增值速度加快，并能保持细胞活性良好。

背景技术

基于干细胞的再生医学为生命科学和医学的发展开辟了一个崭新的、广阔的领域。研究者认为干细胞(再生医学)研究有潜力通过修复特定的组织或尘长器官，改变人类对疾病的应对方法。干细胞再生医学在治疗神经退行性疾病、恶性肿瘤、糖尿病、肝硬化、脑萎缩、脊髓损伤等目前尚无良好治疗方案的疾病方面具有广泛的应用前景。

但是目前的干细胞研究中仍然存在重要的技术障碍，其中最重要的是干细胞的来源和制备。因为涉及到社会伦理问题，干细胞来源受到关注。干细胞分为胚胎干细胞、成体干细胞和诱导性多能干细胞。其中，胚胎干细胞和成体干细胞是天然存在的，而诱导性多能干细胞是由体细胞经过人为的基因表达调控和细胞重编程等过程转化而来的。胚胎干细胞的功能强大，但来源有限且受到伦理学限制；成体干细胞来源和功能有限。诱导性多能干细胞是由人体细胞转化而来，来源广泛，不受限制，无伦理学问题，其功能与胚胎干细胞接近，因此是最具发展前景的干细胞制备技术。诱导性多能干细胞的出现和制备技术获得2008年十大科技创新之首。但该技术目前仍然存在致命缺陷。目前制各诱导性多能干细胞是通过病毒裁体或质粒向体细胞转移外源性干细胞特异性基因如SOX2、OCT4、KLF4、NANOG、C-MYC等。上述基因在体细胞内的表达能够使体细胞经历细胞重编程的过程而回到干细胞的状态。但是上述基因一旦通过病毒载体或质粒导入到体细胞中，其在体内的表达是不受控制的，产生的远后生物学效应同样是无法预知且不受控制的，因此其安全性受到质疑。小分子化合物的作用是暂时性的、可控制的、可预期的，因此，发展小分子化合物制备诱导性多能干细胞是今后发展需要重点解决的关键问题。

许多疾病的根源都可追溯为功能性细胞的丢失或损伤所致，而细胞替代疗法是治疗这些疾病的有效方法，有时甚至是唯一的方法。细胞替代疗法分为：细胞移植和通过药物调节自体干细胞增殖与定向分化。干细胞药物就是指可以通过调节生物体内干细胞的增殖与分化，来防治由于细胞缺失或损伤而引起的疾病的一类治疗和预防药物。近年来发现：生长因子和小分子化合物均可调节生物体内干细胞的增殖与分化；运用干细胞药物来调节自身干细胞的增殖与定向分化潜能，以重建受损的功能细胞，恢复其生物学功能，既解决了成体干细胞的来源困难和胚胎干细胞的伦理困惑问题；也避免了细胞移植的免疫排斥和手术后遗症问题。为细胞丢失或损伤性疾病的防治提供崭新的视点和思路。

虽然生长因子或生物活性蛋白可以最为干细胞药物应用，但由于生长因子或生物活性蛋白作为体内的大分子活性物质，不仅介入纵横交错的生理过程，在体内呈现极其复杂的多重调控功能，而且是异源性多肤或蛋白，可以引发免疫反应，价格也很昂贵，很难具有临床治疗和药用价值。小分子化合物则一直是临床疾病治疗药物的主体，而小分子化合物作为干细胞调节药物的潜力也越来越受到人们的重视。小分子化合物包括合成小分子化合物和天然小分子化合物(主要是指植物提取化合物以及中药的有效成分单体)，相比之下用小分子化合物药物具有以下特点及优势：

a.小分子化合物调节不仅易于给药又易于在生理功能恢复后撤出，对病理和生理过程的调节主动方便。

b.外源性的小分子化合物通常调节作用单一，不像内源性的大分子活性物质一样，介入体内复杂的多重调控系统，而且易引发免疫反应。因而有助于维持正常的机体生理功能。

c.小分子化合物易于人工合成及工业化生产，比内源性的生物活性大分子有更好的药用价值及临床药物治疗价值。

d.特别是天然小分子化合物由于经过了生物(植物体)代谢过程，其生物适应性特别是毒性更优于合成的小分子化合物。

e.小分子化合物由于分子量小，易于通过血脑屏障。

因此寻找特异性调节成体干细胞增殖与分化的小分子化合物不仅是成体干细胞体外增殖与分化的生物学研究热点，还是创新药物一一干细胞药物的研究热点。

本发明的目的是提供具有促进干细胞增殖作用的小分子化合物。该小分子化合物可以作为干细胞增殖促进剂以及用于制备促进干细胞增殖的药物，为科研、临床及药用提供更多的选择。运用干细胞药物来调节自身干细胞的增殖与定向分化潜能，以重建受损的功能细胞，恢复其生物学功能，既解决了成体干细胞的来源困难和胚胎干细胞的伦理困惑问题，也避免了细胞移植的免疫排斥和手术后遗症问题，为细胞丢失或损伤性疾病的防治提供崭新的视点和思路。

发明内容

本发明的目的在于提供一类具有特殊结构和功能的小分子化合物以及一种应用该类小分子化合物高效促进干细胞增殖的方法。具体的说，本发明提供一类具有特殊结构和功能的小分子化合物，可以作为干细胞增殖促进剂以及用于制备促进干细胞增殖的药物，可以应用于临床，为移植提供大量干细胞。本发明提供的小分子化合物能够促进干细胞增殖以及功能细胞的修复，而且能够用于干细胞增殖机理的研究。

本发明提供所示化合物或其药学上可接受的盐、异构体、水合物：

其中：R，为氮，烷基，烷氧基，卤素，峭基等；

R：为各种取代芳环、杂环等；

R₂也可以是SR₂’或SO₂R₂’，其中：R₂’为2-(1-烷基咪唑基)或3-(4H-1，2，4一三氮唑基)的各种五元氮杂杂环；

R₃为氢，烷基，取代或未取代苯基，杂环取代基，甲硫基，取代或未取代的氨基，甲氧基等。

本发明还涉及一种干细胞的促进增殖方法，其特征在于，用本发明提供的通式1所示小分子化合物促进干细胞的增殖。

本发明还涉及一种干细胞的促进增殖方法，其特征在于，将本发明提供的通式所示小分子化合物与干细胞接触。

本发明的上述方法可以在体内或者体外进行。

本发明还提供一种培养干细胞的方法，包括在本发明化合物存在的情况下，培养干细胞。

在一个实施方案中，在本发明所述的干细胞促嘧啶类化合物增殖剂存在的情况下，培养获得的干细胞。可以在存在本发明所述的干细胞促增殖剂的情况下，通过培养动物的干细胞有效的促进干细胞的增殖。动物的干细胞可以是任一种动物的干细胞，优选是哺乳动物，更优选是由大鼠、小鼠、猴子、人得来的干细胞。作为干细胞，可列举出由大脑得来的神经干细胞、造血干细胞、间充质干细胞等，优选是神经干细胞。神经干细胞可以是由任何周龄或任何年龄的动物得来的细胞，但优选是成体干细胞。

本发明的干细胞可以包括人胚胎干细胞，或者在另一个实施方式中，本发明的干细胞包括人胚胎干细胞。

作为由动物取得成年神经干细胞的方法，可列举出下述方法，分离培养大鼠神经干细胞。

本发明的干细胞促增殖剂存在下培养神经干细胞时，相对于2×10⁶个/ml左右的神经干细胞，优选该神经干细胞促增殖剂浓度作用范围在1umol/ml-100umol/ml。通过使神经干细胞与本发明的神经干细胞促增殖剂接触，在37℃下和5％CO₂气体中，于2-7天内每3天一次更换全部或部分培养基进行培养，这样可以促进神经干细胞的增殖。作为用于培养成年神经干细胞的培养基，只要是不姑碍促进神经干细胞增殖的培养基，任一种培养基都可以使用，但优先选用DMEM/F12培养基等。

按上述培养方法获得的神经干细胞可以从培养基中回收，通过外科手术将其移植到神经疾病患者的障碍部位，即可用于治疗该神经疾病。作为该神经疾病，可列举出：帕金森氏病、阿尔采末病、唐氏症、脑血管障碍、脑中风、脊髓损伤、亨廷顿氏病、多发性硬化症、肌萎缩性侧索硬化症、癫痈、焦虑性障碍、综合失调症、抑郁症和躁郁症等。

附图说明

图1.细胞分离增殖效率比较

圆形标记为对照组，三角形标记为实验组。

具体实施方式

以实验例来进一步阐述嘧啶类化合物作为促进哺乳动物神经干细胞增殖的新应用的有益效果。

1.细胞培养基配制

DMEM/F12基础培养液：取制备DMEM/F12基础培养液1L用量的DMEM/F12(GIBCO，31600034)、谷氨酰胺(Sigma，G-3126)2.5g，用浓度为0.1mol/L、pH值为7.35的磷酸盐缓冲液即PBS溶解并稀释至1L，调节PH值为7.5，用0.2um微孔滤膜过滤除菌，即得；

嘧啶类化合物诱导培养基：分别在70ml DMEM/F12基础培养液中加入嘧啶类化合物，溶解后用0.2um微孔滤膜过滤除菌后，加入胎牛血清(Gibco，16000-044)10ml、青霉素与链霉素的混合液(由浓度为4万U/ml的青霉素溶液、浓度为4万U/ml的链霉素溶液按1∶1混合而成)1ml，最后用DMEM/F12基础培养液定容至100ml，嘧啶类化合物的最终浓度为400nM，胎牛血清最终浓度为10％。

2.细胞的分离、培养

将新生48小时内的SD乳大鼠用体积百分浓度为75％的乙醇溶液消毒，脱颈椎处死后，无菌条件下打开颅腔，于解剖显微镜下剥离脑膜分离出海马，置D-Hank’s溶液中剪切成大小约为0.5mm³的细小组织块，滴管反复吹打，再经200目铜网过滤后离心，细胞沉淀重悬于DMEM/F12无血清培养基，台盼蓝染色后进行活细胞计数；按细胞密度为1×10⁶细胞/ml将细胞接种于75ml培养瓶中，置温度37℃，体积浓度为5％的CO₂培养箱中悬浮培养，当原代克隆球形成后用机械分离法制作单细胞悬液，再按细胞密度为5×10⁵细胞/ml进行传代培养，每隔3天半量更换培养液1次，每隔7～8天机械分离克隆球并传代培养1次；

将经过传代所形成的NSCs克隆球接种于预先涂布有多聚赖氨酸的载玻片上，继续培养4小时使其贴壁后进行Nestin免疫荧光染色，观察NSCs特异性抗原Nestin的表达情况。

鉴定后的细胞分为对照组与实验组(嘧啶类化合物浓度为400nM)。

3.细胞增殖率检测

应用CCK-8试剂盒(日本同仁化学研究所，T-100)，紫外光分光光度计450nm波长下对细胞增殖进行检测。检测结果如图(图1)。

Claims

1.一类结构通式如下的嘧啶类小分子化合物

其中，R1为氢、卤素、烷基、烷氧基、硝基

R2为各种取代芳环、杂环。R2也可以是SR2活SO2R2，其中R2为为2-(1-烷基咪唑基)或3-(1，2，4-三氮哑基)的五元氮杂环；R3为氢，烷基、取代或未取代苯基、杂环取代基、取代或未取代的氨基、甲氧基、甲硫基。

2.如权利要求1所述的嘧啶类小分子化合物，其R1为氢、4-氯、4-氟、4-甲基、4-异丁基、4-甲氧基、4-硝基；R2为对甲氧基苯基、间甲氧基苯基、2-甲氧基苯基、对三氟甲基苯基、间三氟甲基苯基、对氟苯基、2-氟苯基、对氯苯基、对异丁基苯基、对甲硫基苯基。

3.如权利要求1所述的嘧啶类小分子化合物的制备方法，包括：卤代色原酮、碳酸钾、巯基氮杂环反应后，再与脒反应，得到R2为SR2的化合物，该类产物用氧化剂氧化得到R2为SO2R2的化合物。

4.一类可用于制备诱导性多能干细胞的小分子化合物，其特征在于，此类化合物使受试细胞增值速度加快，并能保持细胞活性良好。

5.根据权利要求1所述的小分子化合物，其特征在于该类化合物以色酮类化合物为原料，卤化后得到的卤代物作为多组分反应的一个组分，与各种芳基或杂环基硼酸化合物、或硫代氮杂环类化合物偶联，再和眯类化合物缩合得到。

6.促进干细胞增殖的方法，包括将权利要求1或2的化合物与干细胞接触，例如，该方法包括在培养基中添加权利要求1或2的化合物促进培养的干细胞增殖。

7.一种药物组合物，含有权利要求1或2的化合物或其药学上可接受的盐、异构体或水合物。

8.权利要求1或2的化合物或者权利要求7所述的组合物在制备治疗细胞丢失或损伤性疾病的药物中的用途.

9.权利要求8所述的用途，其特征在于：细胞丢失或损伤性疾病选自与神经系统细胞退行性或损伤性有关的疾病、血液系统疾病、心血管系统细胞丢失性或损伤性疾病、皮肤疾病。

10.权利要求9所述的用途，其特征在于：所述与神经系统细胞退行性或损伤性有关的疾病选自帕金森氏病、阿尔采末病、亨廷顿病、唐氏症、脑血管障碍、脑中风、脊髓损伤、多发性硬化症、肌萎缩性侧索硬化症、癫痈、焦虑性障碍、抑郁症、躁郁症；所述血液系统疾病选自再生障碍性贫血、地中海贫血症、白血病、恶性肿瘤放化疗后引起的造血系统及免疫系统功能障碍；所述心血管系统细胞丢失性或损伤性疾病选自心肌病、冠心病、心力衰竭、亚急性心内膜炎、急性心肌梗死、心绞痛、缺血性心脏病；所述皮肤疾病是皮肤烧伤。