CN103083324B

CN103083324B - 干预循环肿瘤细胞粘附和浸润到外周组织的药物和新方法

Info

Publication number: CN103083324B
Application number: CN201110338508.9A
Authority: CN
Inventors: 贾力
Original assignee: Individual
Current assignee: Nanjing Licheng Biomedical Technology Co Ltd
Priority date: 2011-11-01
Filing date: 2011-11-01
Publication date: 2016-03-02
Anticipated expiration: 2031-11-01
Also published as: CN103083324A

Abstract

本发明提供一类特异性地干预血中循环肿瘤细胞粘附和浸润到外周组织的药物，和用这类药物预防哺乳动物患者的原发性肿瘤在手术切除后再转移的新方法。与抗癌药比较，这类药物毒副作用少，病人可长期服用。血中半衰期长，病人不必频繁服用。这类药物可在肿瘤手术前或手术后早期就开始服药(至少5年)，以度过肿瘤转移的高风险期。本发明的药物可作为单一药物使用，也可与其它药物组合使用以综合性地控制肿瘤转移的各个环节，也可与抗癌药组合使用以辅助癌症的治疗。这类药物可弥补当前预防肿瘤手术后转移的药物的市场空白。

Description

干预循环肿瘤细胞粘附和浸润到外周组织的药物和新方法

技术领域

本发明涉及一类预防肿瘤手术后再复发的药物，具体地说，是用这类药物提供一种新方法，以预防哺乳动物患者在肿瘤手术后，残余的循环肿瘤细胞(circulatingtumorcells)粘附(adhesion)，浸润和外渗(extravasation)到外周组织，导致肿瘤再转移。

背景技术

现存癌症药物治疗的技术缺陷：近50年来，癌症的基础研究取得很多进展。但是癌症的药物治疗仍未见显著进展。尽管目前抗癌药物格林微克(Gleevec)已可控制血癌(淋巴瘤和白血病)，并使血癌病人的存活率达到90％。但是在外科手术切除原发性肿瘤(肺癌，肠癌，乳腺癌和前列腺癌)后的5年内，一旦肿瘤转移，90％以上的病人仍将痛苦地死于肿瘤转移，而不是原发性肿瘤。原发性肿瘤在手术切除后的5年内是癌症转移扩散的高风险期，其间，具有活性的循环肿瘤细胞可在血中通过粘附血管内膜、侵润或外渗、形成肿瘤转移的微灶、直至肿瘤全面转移扩散。人原发性肿瘤均采取外科手术切除。如果肿瘤未转移，循环肿瘤细胞可与手术切除后的患者共存10年、甚至20年之久(Meng等，ClinicalCancerRes.10：8152-62，2004)。但是，肿瘤一旦转移扩散，无药可以逆转。乳癌患者在手术后3年内的再复发几率是40％(Lancet.351：1451-67，1998)。根据2万以上结肠癌患者的术后统计，2期和3期结肠癌患者手术后3年内的再复发率分别是74％和82％(Sargent等，J.Clin.Oncol.25：4569-73，2007)。抑制循环肿瘤细胞的粘附、外渗、和根除循环肿瘤细胞才是”抗癌药”研发的重点！这就像防止白蚁群对一豪宅的侵犯一样，有效的防治法是在白蚁高发区用诱饵诱杀白蚁于豪宅之外。一旦白蚁群侵入了豪宅的各个器官，那就到了防不胜防的晚期.但是，40多年肿瘤药物的筛选重点一直放在研发能杀死离体肿瘤细胞和缩小裸鼠身上肿瘤的药物.这种研发方向与肿瘤临床治疗脱节：肿瘤病人的首选治疗方案是外科手术切除.没有任何人会选择化疗药物：1)化疗效果未知；2)化疗周期长费用大；3)化疗药物毒副作用大，而且化疗药物本身多显示致突变、致癌、和生殖毒性。把国内外肿瘤治疗的现状和现存缺陷简化一下就是：早期肿瘤可用外科手术切除(不用“抗癌药”，除非不能手术！)，到肿瘤转移了外科手术无法全身一一切除肿瘤时，“抗癌药”也无效；而肿瘤病人在手术切除后的早期又没有可预防将来循环肿瘤细胞的粘附和外渗、导致肿瘤转移的药物，这就是当今肿瘤药物治疗的一个全球性的方向性错误和技术缺陷！

“抗癌药”本身并不是预防肿瘤手术后转移的药物。当今的“抗癌药”主要是使癌細胞的复制和生长受阻断而死亡。抗癌药在离体试验中确实可以造成细胞(癌细胞和正常细胞)死亡，所以称为细胞毒类药(包括靶向类药)。在整体环境下，抗癌药并不能靶向地聚集到癌变部位，而是广泛地分布到全身各组织，造成毒副作用，病人生活品质下降，自身免疫和康复的能力受到抗癌药的打击。Rustin等人报道过(Lancet376：1155-63，2010)，将卵巢癌病人在紫杉醇治疗后血清癌抗原CA125水平恢复到正常时，随机分成二组，早期化疗组和延迟化疗组。早期化疗组在CA125水平增加二倍后即进行早期化疗(顺铂，或顺铂+紫杉醇)；延迟化疗组在临床症状出现时才进行同样化疗。早期化疗组(265人)和延迟化疗组(264人)的存活期中值分别是25.7月和27.1月，二组存活期中值无显著差异。早期化疗组病人的存活期中值反而缩短二个月，提示药物的毒副作用。更重要的是，“抗癌药”(包括细胞毒类和靶向类药)根本无法逆转肿瘤转移病人的死亡，反而造成病人生活品质降低，家属负担剧增！40多年研发出的“抗癌药”大体上仅可延缓癌症转移(metastasis)病人4个月的生命。

发明内容

为了克服现有的预防肿瘤手术后转移的药物的市场空白，本发明的目的旨在提供一种可特异性地抑制循环肿瘤细胞的粘附和着床到内皮细胞基质，并外渗到外周组织的源头新药，以达到预防肿瘤手术后再转移的目的。这种药物应是无毒副作用，病人可长期服用。血中半衰期长，病人不必频繁服用。药物可在血中抑制循环肿瘤细胞的粘附和着床，预防肿瘤手术后的再转移。本发明的具体内容如下：

米非司酮是美她司酮的母体药物。作为一种甾体激素受体的拮抗剂，米非司酮已在法國、中國、英國、瑞典、美國、台湾相继批准上市。米非司酮为受体水平抗孕激素药，具有终止早孕、抗着床、诱导月经及促进宫颈成熟等作用，与孕酮竞争受体而达到拮抗孕酮的作用。米非司酮与糖皮质激素受体亦有一定结合力。米非司酮能明显增高妊娠子宫对前列腺素的敏感性。在研发早期，米非司酮并不是综合成药性(drugability)指标最好的候选药。在早期选择米非司酮作为第一候选开发药时仅仅是基于它在离体的酶学试验中表现出对子宫孕酮受体具有高的结合力(K_d＝1.3x10nM)，可竞争对抗甾体激素的作用(Heikinheimo等.J.SteroidBiochem.26：279-284，1987)，而美她司酮和安闽司酮与人子宫肌膜孕酮受体的亲和力仅仅是米非司酮的21％和15％。美她司酮和安闽司酮与糖皮质激素受体的结合力是米非司酮的61％和48％。

米非司酮口服吸收迅速，其血药浓度达峰时间为1.5小时左右.给药剂量在25-600mg/人时，血药峰值范围是0.8-2.34μg/mL。米非司酮在体内消除缓慢，消除半衰期约20-34小时。服药后72小时血药水平仍可维持在0.2μg/mL(0.5μM)左右(Heikinheimo等.J.SteroidBiochem.26：279-284，1987；Shi等.Contraception48：133-149，1993)。米非司酮有明显的首过效应，在体内肝药酶P450作用下，米非司酮代谢为单去甲基产物美她司酮(Metapristone)和双去甲基产物安闽司酮(Aminopristone)。口服1-2小时后，血中美她司酮的水平已超过母体化合物米非司酮(Heikinheimo等.J.SteroidBiochem.26：279-284，1987；Shi等.Contraception48：133-149，1993)。表1对比了二药在健康人的药代动力学。从表中可见：1)米非司酮的血药峰值(Tmax)是1.4-1.7h，而美她司酮的血药峰值3.6-6.2h，提示母体药物米非司酮在体内很快代谢为美她司酮，后者产生了第二个血药峰值。美她司酮的血浆半衰期和AUC值显著大于母体药物米非司酮。比如，给予受试者200和400mg的米非司酮后，美她司酮的AUC是米非司酮的二倍。Heikinheimo等人报道(J.SteroidBiochem.26：279-284，1987)，给予受试者(n＝5)200mg的米非司酮后12-15h，米非司酮和其去甲基代谢产物在子宫基膜的浓度分别是148±58和443±139ng/g；在血清中的浓度分别是396±259和1671±498ng/mL；在脂肪中的浓度分别是447±191和649±358ng/g。服药后12-15h，去甲基代谢产物在人血清中的浓度是母体药物的4.2倍！Cekan等人报道(Hum.Reproduc.4：131-35，1989)给予受试者(n＝21)100mg的米非司酮后1h，美她司酮和米非司酮的血浆浓度分别是3.09和1.93μM。以上结果表明，美她司酮是母体药物米非司酮的最主要药理活性物质，母体药物是通过其代谢产物发挥药理作用的。

米非司酮是通过CYP3A4(Jang等.BiochemPharmacol.52：753-761，1996)和CYP3A5(Khan等.DrugMetab.Dispos.30：985-990，2002)代谢的。CYP3A4起主要代谢作用，产生米非司酮的单、或双-去甲基代谢产物米她司酮和安闽司酮以及C羟基代谢产物。CYP3A5仅产生去甲基代谢产物。

表1.美她司酮与其母体药物米非司酮在人体内的药代动力学参数的比较。健康人(n＝9，年龄28.9±5.1岁)口服单一剂量的母体药物米非司酮(25，100，200，400and600mg/人)后，在20和40分钟，1，2，4，8，12，48，72，96和120小时采血，用HPLC法测定血浆中的美她司酮与米非司酮母体的浓度，并计算其药代动力学参数。括弧内数值代表标准差。

除了抗甾体激素的主要作用外，米非司酮还曾试用于Cushing综合症、脑脊膜瘤、神经胶质瘤、乳癌、结肠癌以及其它癌症(Grunberg等，CancerInvest。24：727-733，2006)。与所有的“抗癌药”一样，米非司酮对晚期病人无根治作用。其原因可能是肿瘤一旦转移，也就无药可治了。但米非司酮曾在临床上使用长达157个月(13年)，剂量高达200-400mg/人，用于脑脊膜瘤，表明其毒副作用低。本发明利用米非司酮的最主要代谢活性物质美她司酮，可作为一种辅助癌症疗法，减少病人疼痛，增加能量，提高生活品质，和延长生存时间。

根据已发表的文献，米非司酮具有以下药理作用：1.与甾体激素(孕酮和糖皮质激素)竞争受体，从而拮抗甾体激素的作用；2.抑制一种34kDa蛋白的合成，从而协同自然杀伤细胞的免疫监控作用(Check等AnticancerRes.29：1611-1613，2009)；3.通过拮抗孕激素(孕酮)的作用，干预由Brca1/p53基因缺陷小鼠的乳癌的发展(Poole等.Science314：1467-1470，2006)，以及拮抗孕激素刺激乳癌的生长和侵润的作用(Holley等.JSteroid.Biochem.Mol.Biol.117：23-30，2009)；4.通过作用于p53和Bcl-2，间接地产生细胞调亡作用(Navo等.CancerChemther.Pharmacol.62：483-89，2008)；5.抑制胃癌细胞粘附到基质，抑制细胞的迁移和血管新生(Li等WorldJ.Gastroenterol.10：1726-1729，2004)；6.抑制NF-kappaB的表达(Wissink等.Mol.Endocrinol.12：355-63，1998)；7.干预Beta-2integrin的作用(Yazawa等.Fertil.Steril.75：980-85，2001)。由于米非司酮很快代谢为美她司酮(为主)和安闽司酮，所以米她司酮应具有米非司酮的药理作用。

本发明的有益效果是用米非司酮的稳定代谢产物美她司酮在血中全面地干预循环肿瘤细胞的粘附和着床到内皮细胞基质。本发明的创新点在于：1)它摒弃了传统的“抗肿瘤药物”(即细胞毒药和靶向药)的开发模型(即企图用细胞毒药和靶向药逆转症的转移)，而着眼于在肿瘤一经确诊(手术前或手术后)早期就开始服药(至少5年)，以抑制血中肿瘤细胞的粘附、着床、外渗而引起的肿瘤转移；2)本类药作为癌症晚期的一种辅助治疗，可望减少病人疼痛，增加能量，提高生存品质和时间。3)米她司酮是米非司酮的稳定代谢产物，其溶解度和稳定性比母体药物好；4)根据其母体药物的临床资料推知，与现有“抗癌药”相比，美她司酮安全、毒副作用少，病人可长期服用至少5年，以度过肿瘤转移的高风险期。

具体实施方式

发明的化合物可具有一个或多个手性中心，本化合物可作为外消旋体、外消旋混合物以及作为各非对映体或对映体出现，所有此类异构形式及其混合物都包括在本发明范围之内。本发明化合物的晶型可作为多晶型存在，还可以与水或常用的有机溶剂形成溶剂合物。此类溶剂合物和水合物，以及无水组合物都包括在本发明范围之内。

本发明的化合物可作为单一药物使用，也可与其它药物组合使用，以全面和综合性地控制肿瘤转移的各个环节。本类甾体药物作为单一药物使用时的剂量水平为每天约0.001mg/kg至10mg/kg体重.为达到长期服药预防哺乳动物患者的原发性肿瘤在手术切除后再转移的目的，通常每日剂量约0.005mg/kg至0.01mg/kg.为达到辅助治疗哺乳动物患者癌症的目的，每日特别剂量可用至10mg/kg。

在与抗癌药组合用药或分开用药以达到辅助治疗癌症时，本发明的药物的剂量应根据多种因素选择，包括患者类型、种族、年龄、体重、性别和疾病；待治疗疾病的严重度；给药途径；患者的肾功能和肝功能；以及使用的具体化合物或其盐或酯。在此，抗癌药的定义包括破坏DNA的药、微管抑制剂、局部异构酶、抗代谢药、和激素药。

将两种以上不同的活性剂一起用于联合疗法，必须考虑药物各自的效力以及将它们组合一起达到的相互作用。为了确定预防、对抗或阻止疾病进展需要的治疗有效或预防有效剂量，这些因素都在普通临床医生的考虑范围之内。组合的有效量是缓解受治疗患者的特定疾病症状或者预防此类症状的量，具体剂量水平和给药频率，取决于多种因素，包括用于组合的具体化合物的活性、化合物的代谢稳定性和作用时长、年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、给药方式和时间、排泄率、特定疾病的严重度以及正接受治疗的患者。

为了预防和治疗疾病，本发明药物可以与药学上可接受的其它载体制作成经口服、局部、胃肠外、吸入、喷雾、经直肠或经阴道给予活性成分(单独或组合)的剂型.胃肠外用药包括皮下注射、静脉内注射、肌肉注射、脑池内注射或输注方法。

本发明的单一药物或组合药物可采用适合口服使用的形式，如片剂、含片、锭剂、水或油混悬液、可分散粉剂或粒剂、乳剂、硬胶囊或软胶囊、溶液、糖浆剂和酏剂。可根据药用组合物制备领域已知的任何方法制备成口服使用的组合物，为了得到精致可口的药用制剂，此类组合物通常包含一种或多种选自甜味剂、矫味剂、着色剂和防腐剂的制剂。这些赋形剂可以是稀释剂，如乳糖、碳酸钙、碳酸钠、磷酸钙或磷酸钠；制粒剂和崩解剂，如玉米淀粉或海藻酸；粘合剂，如淀粉、明胶或阿拉伯胶；和润滑剂，如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石粉。片剂可以不包衣或者可以包衣。包衣可以延迟药物在胃肠道中的分解，从而延长药物的作用时间。例如，可使用时间延迟材料如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。

本领域技术人员应该理解，在不背离本发明的基本原理和范围的情况下，可对本方法进行各种变更、改变、修饰、取代、删除或添加。例如，由于任何适应症而用本发明化合物或组合物治疗的哺乳动物患者的反应不同，以上列出的特定剂量之外的有效剂量也可适用。同样，观察到的具体药理学反应可根据所选择的特定活性化合物是否存在药用载体，以及使用的制剂类型和给药方式而不同.这些变更或差异符合本发明的目的和实践。

以下几个实施例进一步阐明本发明，但是本发明不仅限于此。

实施例1(米她司酮的制备方式)：

取米非司酮500mg，溶解在7mL甲醇和7mLTHF溶剂的混合液(1∶1)中，再加入新鲜氧化钙(CaO)555mg到此混合液中。将739mg的碘溶解在1.5mL的甲醇和THF溶剂的混合液(1∶1)中，在冰浴条件下，将此碘甲醇THF的混合液逐滴加入到以上米非司酮-甲醇THF的混合液。搅拌冰浴反应1小时后去除CaO，用10％的Na₂S₂O₃稀释混合液，用CH₂Cl₂萃取。分离有机溶剂层，用饱和盐水洗去有机溶剂层中的杂质。用Na₂SO₄干燥、过滤。蒸发滤液。再用柱层析纯化干粉，用HPLC(条件ProntoSIL120-5-C18H，5μm，200x20mm，MeCN∶H₂O＝84∶16，23mL/min，波长254nm)进一步分离米非司酮和米她司酮，冻干洗脱液后即得米她司酮白色固体。

实施例2：

用15μg的基质胶(Matrigel)包被12孔板的各槽。室温隔夜凉干12-孔板。用磷酸缓冲液生理盐水(PBS)清洗3次。用牛血清蛋白(20mg/L)100μL/孔涂盖非包被处。制备含定量的T47D、BT474或MKN-45乳癌细胞(8x10⁵/mL)与不同浓度的美她司酮(0，0.5，5，20μM)的RPMI1640培养液，并把100μL的这种培养液加入到12-孔板的各槽。在37℃和24h的粘附期后，用37℃的PBS分三次清洗掉未粘附的细胞。吸干PBS，定量(2mL)加入含0.25％胰蛋白酶/EDTA的RPMI1640，将细胞继续孵育3-5min，确保细胞已完全悬浮。轻微混匀细胞液，抽取混匀的细胞液加入到细胞计数仪检测细胞数，取5次试验的细胞计数平均值，对比给药组和对照组的细胞平均数，换算成％值。结果表明，米她司酮可以产生与药物浓度成正比的抑制细胞粘附的作用。

实施例3：

仿Jia等的方法(J.Pharm.Sci.92：161-172，2003；BiochemPharmacol.66：2193-2199，2003)并加以改进，采用含8μm穿透孔的聚碳酸酯(polycarbonate)膜的CytoSelect^TM24孔板(或Transwell孔板)，孔板直径6.5mm。在膜的上层加入定量的培养细胞HT-1080(或MKN-45)，用NIH3T3细胞作为阴性对照，细胞密度约为30,000个/孔。所有的细胞与不同浓度的美她司酮(0，0.5，5，20μM)混合，下层加入含10％胎牛血清(含细胞粘附促进因子vitronectin和fibronectin)，或成纤维细胞预处理过的培养液(作为化学吸引趋化因子)。细胞在37℃孵育24h，用棉签移去膜上层未浸润的细胞，下层细胞用冰浴的甲醇固定，HE染色，显微镜观察侵润和外渗到下层的细胞数。结果表明，美她司酮可以产生与药物浓度成正比的抑制细胞浸润和外渗的作用。

实施例4：

B16-F10鼠黑色素瘤细胞株倾向于在肺形成细胞菌落。把B16-F10培养后，加入0.02％EDTA使其悬浮，再加入美她司酮(50和500nM)。将加有美她司酮的B16-F10细胞液(7X10⁴/mL)由C57BL/6小鼠尾静脉缓慢注射。在此后第3，6，9，12天，给小鼠灌胃美她司酮12和120mg/kg，14天后乙醚处死小鼠。取肺，10％福尔马林处理，切片检查，给药组的肺B16-F10细胞菌落数量41±18，23±16明显少于对照组(136.8±16.2)。而且细胞菌落的减少与美她司酮剂量的增加成正比。本实验提示美她司酮具有抑制B16-F10肿瘤细胞粘附和着床到肺的作用。

Claims

1.美她司酮(Metapristone)在制备抑制哺乳动物患者血中的循环肿瘤细胞粘附和浸润到外周组织从而预防乳腺癌或黑色素瘤患者的原发性肿瘤在手术切除后再转移的药物中的应用，所述的美她司酮具有以下化学结构：

，R=NHCH₃。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的美她司酮作为单一剂型、或与其它药合用构成组合物。