CN103083309B - 金松双黄酮在制备防治糖尿病药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了金松双黄酮在制备防治糖尿病药物中的应用。经实验研究表明，金松双黄酮具有很好的治疗糖尿病的作用，对糖尿病及其糖尿病合并心脏病和糖尿病合并高脂血症等相关性疾病均具有非常好的治疗效果，且实验过程中，未表现出副作用等不良反应，有望开发成为新一代安全有效，用于防治糖尿病及其并发症的药物。

Description

金松双黄酮在制备防治糖尿病药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种金松双黄酮，具体涉及金松双黄酮在制备防治糖尿病药物中的应用。

背景技术

当今，在全球范围内糖尿病已经成为继心脑血管疾病和肿瘤之后威胁人类的“第三号杀手”，无论在发达国家还是发展中国家，糖尿病的发病率都在急剧上升。据世界卫生组织公布的资料，1985年全世界有3000万糖尿病患者，到1997年已增加至1.35亿。据国际权威糖尿病流行病学专家预测，到2050年，全球糖尿病人将达3亿人，亚洲地区患者增长幅度非常快，我国的糖尿病患者总数已有6000万以上，预计每年发病增长率超过6%。此病不仅给患者带来极大的痛苦，生活质量受到很大影响，甚至威胁患者的生命，还给社会带来沉重的经济负担。因此，糖尿病作为一种严重的非传染性、慢性疾病，已成为世界各国关注的重大公共卫生问题。

糖尿病作为一种伴随终身的慢性疾病，患者需要长期服药，如何合理用药显的尤其重要，而降糖药物就像一把双刃剑，既能治病，也存在一定副作用。口服降糖药，如磺酰脲类、双胍类等药物是治疗糖尿病、调节血糖的首选药物，严格掌握其适应证、作用机制、合理的联合应用等非常重要。然而这些药物具有一定的副作用，要严格在医生的指导下合理使用。

红豆杉科（Taxaceae）红豆杉属（Taxus.L）植物包括南方红豆杉[T.mairei var.mairei（Lemccet Level）cheng et L.K.Fu]及西藏红豆杉（T.wallichiana Zucc)、云南红豆杉（T.yunnanensis Chenget.L.K.Fu）、中国红豆杉[T.chinensis（Pilger）Rehd.]、东北红豆杉（T.cuspidata.Sieb.et.Zucc.）和曼地亚红豆杉（T.media），红豆杉在开发抗肿瘤药物中应用较多，金松双黄酮为红豆杉植物中双黄酮类化合物，未见有防治治疗糖尿病药物的报道。

发明内容

发明目的：本发明的目的是为了克服现有技术的不足，在金松双黄酮原有功效的基础上，开发其新的临床用途，提供金松双黄酮在制备防治糖尿病药物中的应用。实验结果表明，其具有很好的防治糖尿病及其并发症的作用，且无不良反应。

技术方案：为了实现以上目的，本发明采取的技术方案为：

金松双黄酮其分子式为C₃₃H₂₄O₇，结构式为如下：

本发明通过大量实验研究表明，金松双黄酮具有很好的治疗糖尿病的作用，可用于制备治疗糖尿病药物中的应用。

作为优选方案，金松双黄酮在制备防治糖尿病合并心脏病药物中的应用。

作为另一优选方案，金松双黄酮在制备防治糖尿病合并高脂血症药物中的应用。

本发明所述的金松双黄酮在制备防治糖尿病药物中的应用，将金松双黄酮和药学上可接受的载体制成胶囊剂、颗粒剂、喷雾剂、注射剂、微囊、片剂、软膏剂或透皮控释贴剂剂型的药物。

本发明提供的金松双黄酮制成胶囊剂时把金松双黄酮和载体乳糖或玉米淀粉混合均匀，整粒，然后装胶囊制成胶囊剂。

将本发明提供的金松双黄酮制成片剂时，把金松双黄酮和乳糖或玉米淀粉，需要时加入润滑剂硬脂酸镁，混合均匀，然后压片制成片剂。

本发明提供的金松双黄酮制成颗粒剂时，把金松双黄酮和稀释剂乳糖或玉米淀粉混合均匀，整粒，干燥，制成颗粒剂。

本发明提供的金松双黄酮制成注射液时，取金松双黄酮加入生理盐水溶解然后加入活性碳，搅拌均匀，80℃加热30分钟，过滤，调节pH值，用垂熔玻璃漏斗或其它滤器过滤至澄明，灌装，在100至115℃灭菌30分钟制成注射液。

本发明提供的金松双黄酮除热原之后，经无菌过滤，冷冻干燥，得到注射用粉针剂。

有益效果：本发明在金松双黄酮原有功效的基础上进行新的用途开发，实验研究表明金松双黄酮具有很好的治疗糖尿病的作用，对糖尿病及其糖尿病合并心脏病和糖尿病合并高脂血症等相关性疾病均具有非常好的治疗效果，且实验过程中，未表现出副作用等不良反应，

有望开发成为新一代安全有效，用于防治糖尿病的药物。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1

金松双黄酮的制备：

取南方红豆杉枝叶3.8kg，切成饮片规格，用10倍体积量95%乙醇，8倍50%醇各回流提取一次，合并药液将药液浓缩至无醇味后加入适量的水依次用石油醚、乙酸乙酯及正丁醇萃取。乙酸乙酯萃取物77g经反复硅胶柱层析(200~300目)石油醚-乙酸乙酯-甲醇梯度洗脱，共收集400个馏分。根据薄层层析情况分成8个部分（F6~F13），取F10合并液析出物硅胶柱层析(200-300目)二氯甲烷-甲醇100:1等度洗脱，得到金松双黄酮、银杏黄素、异银杏黄素、白果双黄酮、穗花双黄酮。

金松双黄酮：黄色粉末（MeOH），mp>300°C，H₂SO₄/EtOH加热显黄色。¹H-NMR(DMSO,500MHz)δ：13.08（1H,s，5″-OH）,12.90（1H,s，5-OH），10.77（1H,s，7″-OH）,10.24（1H,s，4″'-OH）,8.20(1H,dd,9.0Hz,2.5Hz，H-6′),8.10(1H,d,2.5Hz,H-2'),7.50(2H,d,9.0Hz,H-2″′,6″′),7.37(1H,d,9.0Hz,H-5′),7.00(1H,s,H-3″),6.83(1H,s,H-3),6.80(1H,d,2.0Hz,H-8),6.73(2H,d,9.0Hz,H-3″′,5″′),6.42(1H,s,H-6'),6.36(1H,d,2.0Hz,H-6),3.83（3H,s,7-OMe）,3.80（3H,s,4'-OMe）以上数据与文献报道的金松双黄酮波谱数据一致，而且与金松双黄酮对照品薄层比较，Rf值及显色行为一致。故鉴定该化合物为金松双黄酮

实施例2金松双黄酮对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用

在96微孔板上加磷酸钾缓冲液(pH6.8)110μL，再加入0.2U/mLα-glucosidase 20μL，10μL样品溶液，混匀，37℃恒温15min后，加入2.5mmol/L4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷酶(PNPG)20μL，混匀后37℃恒温反应15min。最后加入80μL0.2mol/L的Na₂CO₃溶液，于405nm波长下测OD值。

以阿卡波糖为阳性对照，同时设定对照组（缓冲液+酶液+底物），空白组对照组（缓冲液）。

酶活性抑制率=（1-（A样品-A样品对照）/(A对照-A空白)）×100%

标准曲线的测定用磷酸缓冲液（pH6.8）配制1000μmol·L-1对硝基苯酚，稀释成400，300，200，150，100，50，25，5，0μmol·L-1，分别取每不同浓度的PNP溶液各160μL，加入0.2moL·L^-1Na₂CO₃溶液80μL，混匀，在405nm下测定A值，测3组取平均值。以A值为纵坐标，对硝基苯酚浓度为横坐标，做出标准曲线Y=0.336X-0.027(R²=1)。

α-葡萄糖苷酶活力的测定：根据反应体系加入110μL磷酸钾缓冲液（pH6.8），加入20μL0.2U·mL^-1α-葡萄糖苷酶，8μLDMSO，37℃恒温15min后加入2.5mmoL·L^-1PNPG20μL，37℃恒温反应15min。再加入80μL0.2moL·L^-1的Na₂CO₃溶液，于405nm波长下测A值。

酶活力单位定义：37℃，pH6.8条件下，每分钟水解底物所产生1μmoL对硝基苯酚的酶量，规定为1个酶活力单位（U）。

金松双黄酮对α-葡萄糖苷酶抑制作用结果见表1。

表1金松双黄酮对α-葡萄糖苷活性的抑制作用

名称	IC50/mg·L-1
		金松双黄酮	5.18153

实施例3金松双黄酮降血糖作用

1、实验方法

糖尿病模型小鼠模型的建立：取雄性昆明小鼠100只，随机取10只为空白组。空白组给予标准颗粒饲料直至试验结束，其余小鼠喂食高脂饲料（配方：颗粒标准饲料74.5%，蔗糖10%，猪油10%，蛋黄粉5%，胆固醇0.5%）。喂养4周后，除空白组外，小鼠禁食不禁水18h,腹腔注射170mg/kg链脲霉素。72h后，尾静脉取血测定小鼠空腹血糖值，血糖值在10-25mmol/L之间并出现多饮多尿症状的小鼠被选为糖尿病模型小鼠。

给药与测定：将糖尿病小鼠按体重、血糖随即分成5组，每组10只，即为模型组、阳性药组（二甲双胍）、金松双黄酮高剂量组（5mg·kg^-1·d^-1）、中低剂量组（2mg·kg^-1·d^-1）、低剂量组（0.5mg·kg^-1·d^-1）。模型、空白组给予等体积的0.5%羧甲基纤维素钠。每天灌胃1次，连续给药3周。

用罗氏Advantange血糖仪；罗康泉Advantange血糖试纸定期测量小鼠血糖。

2、实验结果

具体实验结果如表2所示。

表2南方红豆杉不同提取部位对糖尿病模型小鼠FBG的影响n=10）

与模型组比较^ap<0.05,^aap<0.01;与给药前比较^bp<0.05,^bbp<0.01

由表2实验结果表明，金松双黄酮能明显降低糖尿病小鼠的空腹血糖，具有明显的降血糖作用为。

实施例4金松双黄酮对模型糖尿病大鼠血脂作用

1.实验方法

1.12型糖尿病大鼠模型制作

实验前适应性普通饲料饲养一周后随机分组。除正常对照组大鼠外其他各组大鼠均喂以高糖高脂饲料，正常对照组大鼠喂以普通饲料。高糖高脂饲料2周喂养后，禁食、水12h，造模组给予一次性腹腔注射2％链脲佐菌素(STZ)溶液30mg/Kg，继续高糖高脂饲料喂养1周后测随机血糖≥16.7mmol/L判断为糖尿病成模；正常对照组腹腔注射同剂量柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，继续喂以普通饲料。

动物分组与给药正常组：给予等量蒸馏水；模型组：给予等量蒸馏水；性对照组：给予二甲双胍0.14g/kg体重。金松双黄酮高剂量组（5mg·kg^-1·d^-1）、中低剂量组（2mg·kg^-1·d^-1）、低剂量组（0.5mg·kg^-1·d^-1）。

各组均灌胃给药，给药体积为10ml/kg体重，每日1次，固定时间给药，连续给4周。

1.2生化及免疫等指标检测

血糖、血脂用全自动生化分析仪检测。所有测定严格按照试剂盒说明书操作。

1.3心肌组织结构普通光学显微镜下观察

组织取材后甲醛固定，经过固定、脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋等程序，制成4μm厚切片，每只大鼠心脏制作10张切片，取1张制作常规HE染色切片，其余备用。观察心肌细胞形态并拍片。

2.实验结果

具体实验结果见表3所示

表3金松双黄酮对糖尿病大鼠血脂影响。

由表3的实验结果表明，本发明提供的金松双黄酮具有明显的降低糖尿病模型大鼠总胆固醇和甘油三酯的含量，具有很好的降低糖尿病模型大鼠血脂的作用。

金松双黄酮对糖尿病心肌病大鼠心肌病理组织学的影响

光镜下HE染色可见正常对照组大鼠心肌细胞排列整齐致密，结构清晰，细胞间质较少，可见少量成纤维细胞。糖尿病模型组大鼠心肌细胞排列紊乱、心肌细胞肥大、扭曲，间质及血管周围细胞外基质积聚和胶原成分增多、间质纤维化明显；金松双黄酮各治疗组光镜下HE染色结果表明心肌纤维排列稍紊乱，心肌细胞正常，间质无明显淋巴细胞浸润。

金松双黄酮对糖尿病大鼠心肌超微结构的影响

电镜可见正常对照组大鼠心肌细胞排列整齐，密集，细胞连接清晰，细胞核呈卵圆形，胞浆内可见大量的结构正常的线粒体和糖原，糖尿病模型大鼠心肌细胞线粒体肿胀、断裂，闰盘间歇显著扩大，核肿胀、染色质边集，中药复方各治疗组的大鼠心肌细胞排列整齐，密集，细胞连接清晰，明显较糖尿病模型组及二甲双胍组好转。说明本发明提供的金松双黄酮能够明显减轻心肌病变，对糖尿病大鼠心肌具有保护作用。

由以上实验结果表明，本发明提供的南方红豆杉提取得到的金松双黄酮，不仅可显著抑制α-葡萄糖苷酶活性，而且具有明显降血糖和降血脂的作用，能够有效纠正糖尿病的糖代谢紊乱，提高糖耐量的作用，并且能够显著减轻糖尿病心肌病大鼠心脏重量与体重比值、明显减轻心肌病理组织学异常和心肌超微结构异常，且未见有不良反应，能够减轻或抑制糖尿病并发症的发生和发展，有望开发成新的降血糖及其并发症的药物。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (2)

1.金松双黄酮在制备防治糖尿病合并心脏病药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的金松双黄酮在制备防治糖尿病合并心脏病药物中的应用，其特征在于，将金松双黄酮和药学上可接受的载体制成胶囊剂、颗粒剂、喷雾剂、注射剂、微囊、片剂、软膏剂或透皮控释贴剂剂型的药物。