CN103080340B

CN103080340B - 皮加工方法和组合物

Info

Publication number: CN103080340B
Application number: CN201080068487.7A
Authority: CN
Inventors: 肖恩·拉伊乔杜里
Original assignee: WEST BENGAL UNIVERSITY OF TECHNOLOGY
Current assignee: WEST BENGAL UNIVERSITY OF TECHNOLOGY
Priority date: 2010-08-05
Filing date: 2010-11-09
Publication date: 2014-11-19
Anticipated expiration: 2030-11-09
Also published as: EP2601316A1; US8524481B2; EP2601316A4; US20120142073A1; CN103080340A; WO2012017264A1

Abstract

本发明涉及生皮脱毛方法，所述方法包括：将生皮与含有脂肪酶和/或蛋白酶的溶液接触达预定量的时间，其中所述溶液的pH值基本上是中性的；和将毛发从所述生皮上去除。本发明还涉及含有分泌酶的铜绿假单胞菌菌株A/C2和B/GZN的培养物。

Description

皮加工方法和组合物

相关专利申请

本专利申请要求印度专利申请号863/KOL/2010的利益，所述印度专利申请于2010年8月5日提交，指定西孟加拉邦理工大学作为申请人，题为“皮加工方法和组合物”。在允许下述实践的管辖区域，该专利申请的全部内容通过引用结合于此，包括所有正文和附图。

领域

本发明技术部分涉及适用于加工皮的分离的微生物的脂肪酶和蛋白酶。本发明技术还部分涉及对环境友好的脱毛方法。

背景

动物皮和皮肤具有附着于它们的毛发，并且在皮革制备过程中毛发通常被去除。皮革制备过程通常涉及使用有毒化学品。

天然的微生物的分离株可以用于生产酶，并且这些天然源可以获得自不同环境。城市地区有时在湿地中处理废物，而来自这些废料堆的环境样品可能含有微生物的丰富生物多样化来源。来自微生物的酶可以用于皮革制备过程。

概述

作为本文特征的是用于加工皮的方法、组合物、试剂盒和过程。在一个方面，提供皮脱毛方法，所述方法包括：将皮与含有脂肪酶和蛋白酶的溶液接触达预定量的时间，其中所述溶液的pH值基本上是中性的；和将毛发从皮去除。在一些实施方案中，蛋白酶是细菌蛋白酶。在某些实施方案中，蛋白酶来自革兰氏阳性细菌。在一些实施方案中，蛋白酶来自革兰氏阴性细菌。在一些实施方案中，蛋白酶是铜绿假单胞菌(Psuedomonasaeruginosa)分泌的蛋白酶。在某些实施方案中，脂肪酶是细菌脂肪酶。在一些实施方案中，脂肪酶来自革兰氏阳性细菌。在某些实施方案中，脂肪酶来自革兰氏阴性细菌。在一些实施方案中，脂肪酶是铜绿假单胞菌分泌的脂肪酶。在某些实施方案中，脂肪酶是铜绿假单胞菌菌株B/GZN(MTCC5566)分泌的脂肪酶。在一些实施方案中，所述方法包括将毛发从皮机械地去除。在某些实施方案中，所述方法包括擦洗皮。在一些实施方案中，皮与所述溶液接触10小时以上。在某些实施方案中，pH值为约7.5至约8.0。在一些实施方案中，pH值为约pH8.0。在某些实施方案中，pH值为约pH7.5。在一些实施方案中，所述溶液含有分泌所述脂肪酶的细菌。在某些实施方案中，所述溶液含有分泌所述蛋白酶的细菌。在一些实施方案中，细菌是铜绿假单胞菌细菌。在某些实施方案中，细菌是铜绿假单胞菌菌株A/SRC002(MTCC5564)细菌。在一些实施方案中，细菌是铜绿假单胞菌菌株B/GZN(MTCC5566)细菌。在某些实施方案中，细菌被固定化。在一些实施方案中，细菌被固定化在多孔基质中。在某些实施方案中，在生长对数期的晚期收集为了酶活性而被培养的细菌细胞。在某些实施方案中，生皮是用盐处理的。在一些实施方案中，生皮是干燥的。在一些实施方案中，将溶液保持在约25至37℃的温度达预定量的时间。在某些实施方案中，通过涂覆、浸渍或喷雾中的一种或多种将溶液施加到皮。在一些实施方案中，溶液是可重复使用的。在某些实施方案中，溶液可重复使用至少7个循环。在一些实施方案中，当获得自固定化的细胞时，溶液可重复使用至少20个循环。在一些实施方案中，用氯化钙将细菌细胞固定化在藻酸钠中。在某些实施方案中，细菌细胞处于悬浮培养中。在一些实施方案中，脱毛方法的效率通过测量抗张强度、柔软度、平方面积的增加、皮重量的下降或其任意组合来评估。在某些实施方案中，所述皮是动物皮。在一些实施方案中，所述皮是生皮。在某些实施方案中，预定量的时间是足以将毛发从皮上去除的时间。

还提供皮脱毛方法，所述方法包括：将皮与含有脂肪酶的溶液接触达预定量的时间，其中所述溶液的pH值基本上是中性的；和将毛发从皮上去除。

还提供皮脱毛方法，所述方法包括：将皮与含有铜绿假单胞菌分泌的蛋白酶的溶液接触达预定量的时间，其中所述溶液的pH值基本上是中性的；和将毛发从皮上去除。在一些实施方案中，所述溶液含有蛋白酶。在某些实施方案中，所述溶液含有脂肪酶。在一些实施方案中，蛋白酶是铜绿假单胞菌菌株A/SRC002(MTCC5564)分泌的蛋白酶。

还提供组合物，所述组合物包含含有脂肪酶和蛋白酶的溶液，其中所述溶液的pH值基本上是中性的。在一些实施方案中，组合物包括分泌所述脂肪酶的细菌。在某些实施方案中，组合物包括分泌所述蛋白酶的细菌。在一些实施方案中，组合物包括分泌所述脂肪酶的细菌和分泌所述蛋白酶的细菌。

还提供组合物，所述组合物包含：与包含脂肪酶的溶液接触的皮，其中所述溶液的pH值基本上是中性的。

还提供组合物，所述组合物包含：与包含脂肪酶和铜绿假单胞菌分泌的蛋白酶的溶液接触的皮，其中所述溶液的pH值基本上是中性的。

还提供培养物，其基本由铜绿假单胞菌菌株A/SRC002(MTCC5564)细菌组成。

还提供培养物，其基本由铜绿假单胞菌菌株B/GZN(MTCC5566)细菌组成。

还提供试剂盒，所述试剂盒用于制备皮脱毛溶液，所述溶液包含：蛋白酶的培养物；和脂肪酶的培养物。在一些实施方案中，所述试剂盒包括用于制备具有基本上中性的pH值的溶液的说明书，所述溶液含有(a)由铜绿假单胞菌菌株A/SRC002(MTCC5564)分泌的蛋白酶和(b)由铜绿假单胞菌菌株B/GZN(MTCC5566)分泌的脂肪酶。

还提供皮脱毛方法，所述方法包括：将皮与含有蛋白酶的溶液接触达预定的温育时间，其中在所述温育中进行浸泡、脱脂和脱毛。在某些实施方案中，所述方法包括脂肪酶。

在一方面提供一种方法，所述方法包括将皮与含有蛋白酶的溶液接触达预定的温育时间，其中在所述温育中进行浸泡、脱脂和脱毛，并且蛋白酶描述于本文中。

前述概述例示某些实施方案而不限制公开的技术。除了上述示例的方面、实施方案和特征以外，通过参考附图和以下详述以及实施例，其他方面、实施方案和特征将变得明显。

附图简述

附图说明技术的实施方案并且不是限制性的。为了清楚和容易说明，附图不是按比例作出的并且，在一些情况中，多个方面可以被夸张或放大地显示以有助于理解特定的实施方案。

图1A提供基于分离菌SRC002(MTCC5564)的16S rRNA基因序列、使用邻接法构建的系统树的图的说明性实施方案。

图1B提供基于分离菌GZN(MTCC5566)的16S rRNA基因序列、使用邻接法构建的系统树的图的说明性实施方案。

图2A是来自菌株SRC002(MTCC5564)的蛋白酶的pH曲线(profile)的说明性实施方案的条线图。

图2B是表示来自菌株SRC002(MTCC5564)的蛋白酶的热稳定性的说明性实施方案的条线图。

图3提供与常规脱毛方法以及与未处理的山羊皮相比的使用来自菌株SRC002(MTCC5564)的蛋白酶给山羊皮脱毛的结果的说明性照片。

图4提供与常规脱毛方法以及与未处理的兔皮相比的使用来自菌株SRC002(MTCC5564)的蛋白酶给兔皮脱毛的结果的说明性照片。

图5提供说明性照片，其表示对在脱毛中酶效率的比较性分析。(i)在给收集自尾部的山羊皮脱毛中的蛋白酶作用(菌株A)。(ii)在给收集自尾部的山羊皮脱毛中的蛋白酶作用(菌株A)。(iii)脂肪酶(菌株B)在给山羊皮脱毛中的效率。(iv)蛋白酶连同脂肪酶(菌株A+菌株B：1∶1)在给山羊皮(尾部)脱毛中的效率。(v)蛋白酶连同脂肪酶(菌株A+菌株B：1∶1)在给山羊皮(腿部)脱毛中的效率。(vi)常规方法的脱毛效率。

图6提供蛋白酶的脱毛效率和在脱毛的皮上鞣皮的效果的说明性照片。W-E表示阴性对照(用水温育而不进行酶处理的皮)。C表示在常规化学方法(5％石灰+5％硫化钠)中处理的皮。E表示酶处理的皮。2％L-E-T表示酶处理的皮，其中加入2％石灰；将皮在室温温育16小时。在所有情况中，轻柔的、手工擦洗导致毛发的去除。C-T、E-T和2％L-E-T分别表示在鞣皮后常规处理、酶处理和组合处理的脱毛皮。

图7提供含胞外蛋白酶的细胞培养物的可再用性的说明性照片。

图8提供通过来自固定化细胞的酶的脱毛的说明性照片。

图9提供生物反应器柱的说明性照片。

详述

在以下详述中，参考形成所述详述一部分的附图。在附图中，除非语境另有所指，相似的符号通常指示相似的组件。详述、附图和权利要求中描述的示例性实施方案不限制本技术。在不背离本文所述的主题的实质或范围的情况下，可以使用其他实施方案，并且可以进行其他改变。容易理解，如本文一般所述的以及在附图中图示的，本公开内容的各方面可以以多种不同配置来布置、取代、组合、分离和设计，其全部是本文所明确预期的。

皮革生产方法的一般方面

皮革可以用于多种不同产品如，例如，衣服、身体盔甲、靴子、马鞍、打猎附件、武器、房顶、帐篷遮盖物、容器、船覆盖物、纸、狗牙胶(dogchews)、鼓头、书捆带(book bindings)、带子、鞋、钱包、手套、皮箱、外套、衣服附件等。皮革以弹性、强度、防水、柔软度、粗糙、质地、防腐性、重量、透气、蒸发特性、绝缘和耐久性为特征并著名。

有许多不同类型的皮革。一些因其强度和韧性而众所周知，而其他因其柔软度而众所周知。全粒面产生自最上层的皮革或外部的皮肤，表面是平滑且可磨光的。绒面革产生自下层皮肤并且具有特色的细毛。所述细毛可以变得非常细，或者在外表上几乎像毛发一样长。有色皮革具有在最终阶段添加的浅的表面喷色。该处理产生均匀的外观，可以用于更正式的鞋子或皮革货物。正绒面革产生自全粒面革，摩擦粒面以产生浅的表面细毛。该细毛可以被调节至非常细，或者可以产生更长、更软的效果。

皮革可以生产自获得自多种不同动物的皮，所述动物如，例如，母牛、小牛、山羊、鹿、羚羊、猪、鳄鱼、短吻鳄和鸵鸟。取决于动物，生产的皮革的质地和用途可以不同。例如，雄鹿皮，或野生牡鹿如鹿、麋鹿或羚羊的皮，可以用于生产具有平滑抛光(finish)的柔软皮革。麂皮或羊皮被认为具有柔软度、吸收性和浅的鞣色。这种类型的皮革可以由类似山羊的动物的皮肤生产。当使小牛皮的背面粗糙以获得柔软的产品时，可以生产绒面革。鞋、靴子和夹克可以用来自成年母牛皮肤的皮革制备，所述皮革相对坚韧和耐用，并具有平滑或粗糙抛光。

印刷皮革可以具有置于表面上的任何类型的图案/设计。设计通常在压力下压印在皮革表面上并且增加材料的特征，而通常不影响皮革的结构。油和蜡通常被涂布在皮革的表面上以产生黏性抛光(tacky finish)，所述黏性抛光产生提高的抓握性(grip)。印刷皮革通常被运动员使用，例如美式橄榄球手套。将皮革与其他材料层压可以用于产生具有独特性质的产品。可以通过选择具有特征性质的不同层来改变所述性质。

皮革加工可以以任何生皮(rawhide)、毛皮(pelt)、皮(hide)、皮肤(skin)、毛皮(fur)、动物外皮(covering)等(在本文中统称为″皮″)开始。皮可以来自任何合适的动物。生皮(rawhide)或毛皮(pelt)是未暴露于鞣皮法的皮或动物皮肤。其与羊皮纸相似，与由常规植鞣生产的皮革相比颜色更浅。皮(hide)是获得自动物的皮肤，其用于人类用途。皮肤可以来自动物例如脊椎动物的柔软外皮。皮通常包含毛发，而具有足够密度的毛发被称为毛皮。覆盖动物皮肤的毛皮、毛发或毛通常在提供皮之前或之后被剥离。

皮加工可以产生若干可以利用的副产品。例如，来自动物的肉、毛发、器官和骨头等可以用于例如食物、胶、明胶、工具、器官移植、假发、衣服。某些皮革加工方法也可以产生若干影响环境的副产品。皮革制备过程可以涉及使用物理化学成分和生物学成分。这些过程可以包括用于防止细菌或霉菌腐化生皮的盐水腌渍(brine curing)，用于将成分如不需要的蛋白和盐从生皮去除的浸泡，用于生产石灰处理的生皮和去除毛发和蛋白的浸灰(liming)，用于去除石灰的脱灰，用于生物处理不需要的蛋白成分以及表面清洁的软化(bating)，用于降低pH值的酸洗，中和，复鞣，染色，加脂(fatliquoring)。每个步骤中使用的大多数化学品在用于所述过程后作为废水排出。所述过程可以采用化学品如硫化钠和石灰，例如，其可以导致水污染和土壤污染。

术语“脱毛”可以指以任何方式去除毛发。脱毛也可以指以任何方式去除软毛或绒毛。脱毛可以通过例如化学、物理或天然方法及它们的组合进行。术语“去除”可以指从原本的位置或所在地等拿走、去掉、分离、除去、去除、移去或移走。例如，将毛发从皮去除可以指毛发可以与皮完全分离或仍然附着于皮但是是松散的从而容易通过温和的擦洗去除。皮的脱毛可以在任何时间段以及通过任何方式进行。

酶

酶可以用作化学品的替代物并且可以提高皮革质量和减少环境污染。因为酶在温和条件(如温暖的温度和中性pH值)下通常是有活性的，所以它们可以通过排除对保持极端环境的需要来减小能量消耗，极端环境是许多化学催化反应所需的。酶的反应特异性可以使在皮革制备过程中产生的副产品的量最小，并且因此与化学催化反应相比可以提供更低的对环境的危险。本文提供酶在皮革生产过程，如例如预鞣过程中的环境友好的应用。

在某些实施方案中，使用酶，如蛋白酶、脂肪酶和/或淀粉酶。在一些实施方案中，使用蛋白酶和脂肪酶。在其他实施方案中，使用脂肪酶和淀粉酶。在某些实施方案中，使用蛋白酶和淀粉酶。蛋白水解酶、脂肪分解酶和淀粉分解酶可以来源于任何合适的来源，如例如微生物、动物、酵母、霉菌和植物来源。酶也可以被大量生产以及进行遗传操作以增加酶活性。酶，单独地，或组合地，可以用于皮革加工实施方案。使用两种以上的酶可以在时间和/或最终产品的质量方面加强脱毛方法。

酶可以被分离和/或纯化。分离的酶可以指与另一种分离或是单独的或单一的。分离也可以指获得一种或多种处于未结合或纯的状态的酶或分开设置或放置；分开或分离以致是单独的。纯化的酶可以指使得一种或多种酶是纯的；不含一种或多种或所有的降低成色、污染、掺杂或沾污的物质。纯化也可以指不含一种或多种或所有的外来的、外部的或不能采用的元素。可以通过任何方式分离和/或纯化一种或多种酶。

例如，如果酶由微生物在胞外生产，则这样的酶/细胞可以收集自培养物。例如，在包含酶的上清用于通过与皮温育进行脱毛前，它们可以通过离心收集。或者，可以在不进行离心/分离的情况下直接使用细胞，并且可以进行与全体培养物的直接温育以获得类似的结果。细胞和/或酶可以被纯化和/或分离。例如，纯化或分离的百分比可以是20-30％、25-35％、30-40％、35-45％、40-50％、45-55％、50-60％、55-65％、60-70％、65-75％、70-80％、75-85％、80-90％、85-95％或90-100％。

用于溶液中的酶的比率可以是将皮有效脱毛的任何比率。例如，两种酶的比率可以是1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10、2∶3、2∶5、2∶7、2∶9、3∶4、3∶5、3∶7、3∶8、3∶10、4∶5、4∶7、4∶9、4∶11、5∶6、5∶7、5∶8、5∶9、5∶11、6∶7、6∶9、6∶11、7∶8、7∶9、7∶10、7∶11、8∶9、8∶11、9∶10或9∶11。所述比率可以是脂肪酶与蛋白酶的比率，蛋白酶与脂肪酶的比率，蛋白酶与淀粉酶的比率，淀粉酶与蛋白酶的比率，脂肪酶与淀粉酶的比率，或淀粉酶与脂肪酶的比率，或其任意组合的比率。两种以上酶的比率可以是任何组合的比率，如例如，1∶1∶1、1∶2∶1、1∶2∶2、1∶3∶1、1∶3∶2、1∶4∶1、∶1∶4∶2、1∶5∶1、1∶5∶2、1∶6∶2、2∶6∶3等。该比率可以例如是脂肪酶与两种不同蛋白酶的比率，蛋白酶与两种不同脂肪酶的比率，脂肪酶、淀粉酶和蛋白酶等的比率或其任意组合的比率。

可以以任何必要的方式包含所用的酶。例如，可以将酶固定在填充床反应器中以保证在延长的时间内连续生产酶。在某些实施方案中，可以在多孔小珠上使用酶。

蛋白酶

蛋白酶可以用于选择性水解皮肤的非成胶成分以及去除蛋白如清蛋白、球蛋白、弹性蛋白和网硬蛋白。蛋白酶催化蛋白分解为小肽和氨基酸。术语″蛋白酶″包括具有蛋白酶活性的蛋白、多肽和肽，所述蛋白酶(protease)活性包括肽酶和/或蛋白酶(proteinase)活性。蛋白酶可以催化肽键的水解并且可以是细胞的、分泌的或分离的。蛋白酶可以在酸性、中性或碱性条件下发挥最佳作用。许多蛋白酶在碱性(alkaline)(碱性的(basic))pH值条件下具有最佳活性。蛋白酶可以在如下的多种pH值条件下发挥作用，例如，pH1-4、3-6、5-8、7-10、6-8、9-12或11-14。蛋白酶也可以在如下的多种温度发挥作用，例如，-5-10℃，0-5℃，5-15℃，10-25℃、15-30℃、25-40℃、30-45℃、40-55℃、45-60℃、55-70、60-75℃等。蛋白酶可以被划分为六个以上的组，如例如丝氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶和金属蛋白酶。

蛋白酶功能可以被蛋白酶抑制剂酶如丝氨酸蛋白酶抑制蛋白、脂笼蛋白等抑制。本身是蛋白的蛋白酶可以被其他蛋白酶分子(有时候是相同种类的)分解。在某些实施方案中，蛋白酶抑制剂，并且有时是多个蛋白酶，可以用于调节肽酶活性。

在一些实施方案中，蛋白酶可以用于脱毛、软化和浸泡，以及用于分解在本文所述的过程中生产的蛋白质物质。酶有效地提供以下优点：特异性、立体特异性、在温和条件下的活性、产生‘天然’产品的可能性、无污染和可生物降解性。

动物蛋白酶和/或微生物的蛋白酶(例如，来自细菌和/或真菌)有时被用于皮革生产过程(例如，预鞣过程)。在一些实施方案中，特定的选择标准包括，特异性、pH活性范围以及pH和热稳定性。另一个标准可以是酶扩散到皮和/或皮肤中的能力，这可以给予酶在皮革制备过程中基本均匀地发挥作用的能力。

在一些实施方案中，使用中性或碱性蛋白酶(例如，获得自细菌或真菌)，所述酶在不同的pH点具有最佳活性。有时根据pH活性范围将真菌蛋白酶分类为：真菌酸性蛋白酶，其在pH2.5至6.0之间发挥作用，并且可以来源于小米黄蓍(A.satoi)。这些可以用于酸洗前的软化并且用以打开皮的纤维结构。真菌碱性蛋白酶与碱性细菌蛋白酶一样属于相同的组：丝氨酸蛋白酶。与细菌蛋白酶相比，真菌蛋白酶通常更加热敏感并且在60℃以上更快地失活。真菌中性蛋白酶可以获得自曲霉菌(Aspergillus)或青霉属(Penicillium)物种。

除了细菌蛋白酶和真菌蛋白酶，特殊的蛋白酶如角蛋白酶是已知的。水解角蛋白的角蛋白酶获得自弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae)并且可以用于脱毛。

脂肪酶

脂肪酶可以用于皮革加工以去除脂肪、油、残余物等。脂肪酶将甘油三酯水解为甘油单酯和甘油二酯、甘油和游离脂肪酸，这些比脂肪的溶解度更好。术语“脂肪酶”包括具有脂肪酶活性的蛋白、多肽和肽。脂肪酶催化不溶于水的脂质底物中的酯键的水解，并且可以是细胞的、分泌的或分离的。脂肪酶可以增强皮革的颜色并提供更干净的外观。脂肪酶可以在如下的多种pH值条件下发挥作用，例如，pH1-4、3-6、5-8、7-10、6-8、9-12或11-14。脂肪酶也可以在如下的多种温度发挥作用，例如，-5-10℃、0-5℃、5-15℃、10-25℃、15-30℃、25-40℃、30-45℃、40-55℃、45-60℃、55-70、60-75℃等。

脂肪酶可以(i)用于油和脂肪工业以改变脂肪以用于食品中；(ii)用于去垢剂组合物；(iii)用于脂肪酸生产，通过酯交换颠倒水解和脂质修饰的脂质合成，并且(iv)用于皮和皮肤的脱脂。

淀粉酶

淀粉酶催化基于淀粉的污渍分解为可溶于水的较小片段的寡糖和糊精。术语“淀粉酶”包括具有淀粉酶活性的蛋白、多肽和肽。淀粉酶催化淀粉如碳水化合物分解为糖。可以将淀粉酶分类为三个以上的组如例如α、β和γ。淀粉酶可以是细胞的、分泌的或分离的。单独使用或与其他酶、添加剂、化学品等组合使用，淀粉酶也可以有助于皮革精制过程。淀粉酶可以在如下的多种pH值条件下发挥作用，例如，pH1-4、3-6、5-8、7-10、6-8、9-12或11-14。淀粉酶也可以在如下的多种温度发挥作用，例如，-5-10℃、0-5℃、5-15℃、10-25℃、15-30℃、25-40℃、30-45℃、40-55℃、45-60℃、55-70、60-75℃等。

淀粉酶功能可以被淀粉酶抑制剂如例如芸豆蛋白(phaseolamin)抑制。在本文所述的方法中包括这样的淀粉酶抑制剂可以有利地用于调节淀粉酶活性。

酶溶液的施用

将酶施用到皮可以以任何合适的方式进行，其非限制性实例包括转鼓加工(drumming)、涂覆、浸渍、喷雾和它们的组合。在涂覆法中，将酶溶液与惰性物质(例如，高岭土)混合，制成稀糊，调节至预定的pH值，施加到皮或皮肤的肉面，肉对肉地堆叠，用聚乙烯片覆盖，并保持直到脱毛发生。

在浸渍法中，在坑或桶中将皮或皮肤浸于预定pH值的酶溶液中。该方法可以包括稀释酶溶液。虽然观察到的酶渗透是均匀的，但是在脊椎和颈部的脱毛可能需要更多地施用所述溶液和/或在所述溶液中更长的时间。

还可以将酶溶液喷雾到皮或皮肤上。喷雾相对于涂覆和浸渍法的优点是(1)可以喷雾浓缩的溶液，(ii)将酶溶液强制喷雾在肉面促进酶与皮的接触，(iii)可以用大量的酶喷雾脊椎和颈部，由此使得脱毛方法更快速，(iv)该方法不产生废水，和(v)在脱毛后，毛发基本上不粘附皮肤组织。

微生物

酶促脱毛是皮革加工中常规石灰-硫化物步骤的可靠的备选方案。如本文提出的将酶用于脱毛可以产生优点。来自任何类型的微生物(例如，细菌)的任何酶可以单独使用或组合使用。

16SrRNA基因可以用于系统发生研究，因为它在细菌和古菌的不同物种之间是高度保守的。该基因可以有助于表征和/或鉴别相互不同类型的细菌。16S rRNA是核糖体RNA的一部分---原核核糖体小亚基(30S)的1542nt长的元件。在单个细菌中不可能存在16S rRNA的多个序列。该亚基可以具有若干功能。大(23S)核糖体RNA可以发挥结构作用，充当限定核糖体蛋白位置的支架。3′端可以包含反Shine-Dalgarno(anti-Shine-Dalgarno)序列，该序列可以在AUG起始密码子上游与mRNA结合。该亚基也可以与23S亚基相互作用，从而有助于两个核糖体亚基(50S+30S)的结合。

一种或多种细菌的16SrDNA可以彼此相似。例如，16SrDNA可以与另一种细菌具有例如95％以上、90％以上、85％以上、80％以上、75％以上、70％以上、65％以上、60％以上、55％以上或50％以上的同一性。来自一种细菌的16SrDNA也可以例如具有区别于另一种细菌的1、2或3个核苷酸置换、缺失或添加。

分离/选择性

“分离的”是指酶、蛋白、多肽或肽与其他细胞物质基本分离。例如，蛋白可以通过被分泌到上清中与细菌分离，并且然后上清与生产蛋白的细菌分离。或者，例如，可以使用将蛋白与组合物中的其他物质分离的分离技术对蛋白进行进一步纯化。分离的和/或纯化的细菌可以来自任何属和/或物种。例如，细菌可以来自假单胞菌属(Pseudomonas)、气杆菌属(Aerobacter)、根瘤菌属(Rhizobium)、根瘤菌科(Rhizobiaceae)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、念珠蓝细菌属(Nostoc)、束毛蓝细菌属(Trichodesmium)、黄单胞菌(Xanthomonas)、硝化杆菌科(Nitrobacteriaceae)、硝化杆菌属(Nitrobacter)、硝化单胞菌属(Nitrosomonas)、硫杆菌属(Thiobacillus)、螺菌属(Spirillum)、弧菌属(Vibrio)、拟杆菌属(Bacteroides)、埃希氏菌属(Escherichia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、欧文氏菌属(Erwinia)、立克次氏体属(Rickettsia)、衣原体属(Chlamydia)、支原体属(Mycoplasma)、放线菌属(Actinomyces)、链霉菌属(Streptomyces)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、多囊菌属(Polyangium)、微球菌属(Micrococcus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、双球菌(Diplococcus)、链球菌属(Streptococcus)、螺旋体属(Spirochaeta)、密螺旋体属(Treponema)、疏螺旋体属(Borrelia)或钩端螺旋体属(Leptospira)。细菌可以来自可以被分类为球形(球菌)或杆状(杆菌)或螺旋形细菌(螺菌)的任何物种。分离的和/或纯化的细菌可以来自任何物种，如，例如奈瑟氏球菌(Neisseria)、链球菌、葡萄球菌、放线细菌(Actinobacteria)或铜绿假单胞菌(Aeruginosa)。

可以通过任何可用方法将微生物菌株用于分泌酶，所述方法包括，例如，通过分批发酵以及通过微生物的固定化。可以通过多种技术进行并控制发酵。可以制备合适的营养培养液，所述培养液包含，例如，碳源和氮源以及对特定微生物(例如，细菌)的生长有利或必需的其他营养物质。糖类和含糖的物质可以作为合适的碳源被包含，其包括，例如，但不限于，淀粉、糊精、蔗糖、乳糖、麦芽糖、果糖和葡萄糖。氮源包括例如，含蛋白质的物质，如来自大豆、肉类、酪蛋白、明胶、酵母蛋白质或酵母抽提物的蛋白胨，来自肉或动物体加工的废物，以及铵盐。营养物的其他实例包括，例如，无机盐，例如碱金属盐和碱土金属盐和磷酸盐，以及痕量元素，如，例如，Fe、Mg、Mn、Co和Ni。

发酵可以在合适的pH值水平和温度进行以最大化微生物生长和酶的分泌，包括，例如，在约5至9的pH水平，或者，例如，在约6至8的pH水平。温度可以是，例如，在约33至约45摄氏度，或者，例如，在约35至约39摄氏度，或者，例如，在约37摄氏度。

细菌生长和/或存活可以取决于渗透平衡、碳、氮和或其他生长条件和/或因素。细菌有约80-90％是水，并且它们需要水分以生长，因为它们从其水环境中获得它们的大部分营养物。一些类型的细菌，例如极端或专性嗜盐菌，适应-并且需要-高盐浓度。除了水和正确的盐平衡，细菌还可能需要多种元素如，例如碳、氢和氮、硫、氨、光、氧、磷、钾、铁、镁和钙。生长因子，如维生素和嘧啶和嘌呤也可能是必要的。细菌也可以在一种或多种抗生素的存在下生长或死亡。

固定化

以下列出的任何方法，单独地或组合地，可以用于固定一种或多种酶。对于工业应用，酶在固体载体上的固定可以产生另外的优点如，但不限于，酶的重复使用，产物分离的简易，和稳定性的提高(Ahmed，S.A.，等，2007.Stabilization of Bacillus licheniformis ATCC21415alkaline protease byimmobilization and modification(通过固定和修饰稳定地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ATCC21415碱性蛋白酶)，Aust.J.Basic Applied Sci.，1(3)：313-322)。例如，固定化可以包括但不限于吸附在玻璃、藻酸盐小珠或基质上(例如，见美国专利号4,978,619)。一种或多种酶可以结合到惰性材料的外部，所述酶如例如巯基酶，在活性位点附近含有S-H基团的酶(即尿素酶、脱氢酶)或对戊二醛敏感的酶等。固定可以以多种方式进行，例如，通过物理保持，如酶-辅酶复合物可以被固定在一起，在酶和载体之间具有多点接触，以致在吸附方式中接触点是非特异性的。另一种固定方法可以通过化学键，例如，通过与脱辅基酶接触以形成全酶。其他固定方法可以采用其他技术，如使用血清清蛋白共固定惰性蛋白，(例如，Phadke.Immobilization of enzymes/coenzymes for molecular electronicsapplications(用于分子电子应用的酶/辅酶的固定)，BioSystems35(1995)179-182；Betancor，L等，Different mechanisms of protein immobilization onglutaraldehyde activated supports：Effect of support activation andimmobilization conditions(在戊二醛活化载体上的蛋白固定的不同机制：载体活化的效果和固定条件)，Enzyme and Microbial Technology卷39，第4期，2006年8月2日，第877-882页；或Mateo，C.等Glyoxyl agarose：A fullyinert and hydrophilic support for immobilization and high stabilization ofproteins(乙醛酰琼脂糖：用于蛋白的固定和高度稳定的完全惰性和疏水载体)，Enzyme and Microbial Technology，卷39，第2期，2006年6月26日，第274-280页；Karyakin，A.A.等；或Self-doped polyanilines electrochemicallyactive in neutral and basic aqueous solutions：Electropolymerization ofsubstituted anilines(在中性和碱性水溶液中具有电化学活性的自掺杂聚苯胺：取代苯胺的电引发聚合)，Journal of Electroanalytical Chemistry，卷371，第1-2期，1994年6月27日，第259-265页；Crosslinking of enzymes forimproved stability and performance(酶的交联用于提高稳定性和性能).CurrOpin Biotechnol.1999年8月；10(4)：331-5)。可以使用的另一种固定方法是包埋，其中酶被包埋在不溶性小珠或微球中，所述不溶性小珠或微球诸如但不限于藻酸钙小珠。例如，在藻酸盐小珠中包埋的细胞允许酶分泌到培养基中，其中溶液中的酶发挥脱毛作用，(见例如Najafi，M.F.，等，Potentialapplication of protease isolated from Pseudomonas aeruginosa PD100(分离自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)PD100的蛋白酶的潜在用途)，Electronic Journal of Biotechnology，Vol.8No.2，2005年8月15日；或SubbaRao，C.Studies on Improving the Immobilized Bead Reusability and AlkalineProtease Production by Isolated Immobilized Bacillus circulans(MTCC6811)Using Overall Evaluation Criteria(通过分离的、固定的环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)(MTCC6811)使用综合评价标准的对提高固定的小珠的可重复利用性和碱性蛋白酶制备的研究).2008，Electronic Journal ofBiotechnology，卷150，65-83)。该方法也可以采用间隔分子如但不限于例如聚(乙二醇)。

酶还可以使用固定的微生物细胞来生产，例如，如在以下文献中提出的：Kumar，S.R.和M.Chandrasekharan，2003.Continuous production ofL-glutaminase by an immobilized marine Pseudomonas sp BTMS-51in apacked bed reactor(通过固定的海洋假单胞菌属(Pseudomonas sp)BTMS-51在填充床反应器中连续制备L-谷氨酰胺酶).Process Biochem.，38：1431-1436和Samia A.Ahmed，Shireen A.Saleh和Ahmed F.Abdel-Fattah2007Stabilization of Bacillus Licheniformis ATCC21415Alkaline Protease byImmobilization and Modification(通过固定和修饰稳定地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis)ATCC21415碱性蛋白酶)Australian Journal of Basicand Applied Sciences，1(3)：313-322，2007。

为减少生产步骤，细胞的固定可以通过由Kumar等报道的实验方案进行。改进可以包括使用8％藻酸钠溶液和1M CaCl₂。小珠被转移到25ml的新鲜培养基并在37℃在持续振荡下温育过夜。在每24小时后，将该相同的小珠转移到新鲜培养基中作为接种物。在小珠转移后，将过夜培养物用于脱毛。酶的效率可以每次通过观察毛发去除性能以及通过皮粉末测定监测分泌的酶的单位来检验。只要小珠存在就可以重复该过程。

脱毛效率

为评价一种或多种酶在溶液中的表现，可以以多种不同方式测量酶效率。例如，溶液可以被重复使用的循环数，用于浸泡皮的时间量，使用后溶液的毒性，浸泡后皮的颜色，浸泡后皮的弹性，浸泡后皮的质地，浸泡后皮的抗张强度，浸泡后皮的柔软度，使用期间溶液的温度或pH值，每单位体积(例如，立方英寸)的溶液可以使用的皮数，溶液中的有效酶浓度，对于不同浓度的溶液可以使用的不同身体部位的皮，每种溶液不同浓度的酶，浸泡后附着于皮的毛发的量，浸泡后皮的重量，浸泡后毛发去除的简易性等。以下是可以用于评价酶和脱毛效率的一些测定。

浸泡参数和重复使用

可以将皮浸泡达任何时间长度，所述时间长度对于有效给皮脱毛是合适的。例如，可以将皮浸泡达约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30小时，例如。含一种或多种酶的溶液的可重复利用性可以保证连续生产中涉及的成本下降。例如，酶溶液可被重复使用约0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30次/循环。酶溶液可以被重复使用达例如约0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30天。溶液还可以用细菌“再生(refreshed)”，并且可以使用新的酶与旧的酶和/或细菌的预定比率。例如，旧的与新的或新的与旧的细菌和/或酶的比率可以是例如：1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10、2∶3、2∶5、2∶7、2∶9、3∶4、3∶5、3∶7、3∶8、3∶10、4∶5、4∶7、4∶9、4∶11、5∶6、5∶7、5∶8、5∶9、5∶11、6∶7、6∶9、6∶11、7∶8、7∶9、7∶10、7∶11、8∶9、8∶11、9∶10或9∶11。“再生”步骤可以发生在例如溶液的每次重复使用之间或在每隔一次或每隔两次或每隔三次或每隔四次的重复使用时。

中性pH值的酶活性还改善与释放的化学品相关的与工人健康和环境有关的危害。酶活性的pH值范围可以是有效地给皮脱毛的任何pH值。例如，pH值范围可以是pH1-4、3-6、5-8、7-10、6-8、9-12或11-14。酶活性也可以在如例如以下的不同温度起作用：-5-10℃、0-5℃、5-15℃、10-25℃、15-30℃、25-40℃、30-45℃、40-55℃、45-60℃、55-70、60-75℃等。

皮革质地

可以以多种方式评价质地。质地可以包括柔软度、脆性、柔韧性、粗糙度、拉伸性、层、平滑度、颗粒量、弹性、重量、宽度、长度、耐久性、寿命及其组合。质地可以通过任何已知方法测量如，例如，通过使用仪器如SMS MT-LQ Plus Texture Analyzer(质地分析仪)测量。

抗张强度

可以以合适的方式评价抗张强度。在一些实施方案中，抗张强度可以通过应力-应变曲线的最大限度测定并且，通常，指示颈缩或变形在何时发生。因为抗张强度是强度性质，所以其值可以取决于测试样品的大小。然而，其取决于样品制备和测试环境和材料的温度。皮长度和宽度的增加可以指示皮抗张强度的增加。抗张强度通过任何已知方法测量，如，例如，使用张力试验仪，裂纹(crackness)试验仪，和/或二维拉伸试验仪。

柔软度

皮的柔软度可以通过任何已知方法测定，所述方法如触知、压痕、压缩、重整、抗性、柔韧性、比较、一致性、一致重复、一致耐久性、平滑度、弹性、可以感知的颗粒量、重量、长度、层、粗糙度等。也可以使用仪器如ST300柔软度试验仪。

实施例

下述实施例说明特定实施方案而不限制公开的技术。

实施例1：蛋白酶分离

一种具体的蛋白酶分离自细菌培养物(菌株A/SRC002(于2010年5月24日保藏于微生物模式培养物保藏中心与基因库(Microbial Type CultureCollection&Gene Bank)，Sector39-A，Chandigarh-160 036，印度，指定的参考号为MTCC5564))并且用作皮革加工方法的一部分。菌株A获得自水样品，所述水样品收集自Charakdanga Bheri，废水养殖渔场，其是东加尔各答湿地的组成部分。位置地图指示22°32′04.95″N和88°24′21.70″E(使用Google Earth http://earth.google.com/)。它是革兰氏阴性芽孢杆菌，其生产蛋白酶、过氧化氢酶、DNA酶、脂肪酶、氧化酶，但是不分泌卵磷脂酶。分离株的分子识别是基于对16SrDNA的部分序列分析。该部分序列显示与铜绿假单胞菌具有100％的同一性。

GATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGATGAAGGGAGCTT

GCTCCTGGATTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCTGGTAGTG

GGGGATAACGTCCGGAAACGGGCGCTAATACCGCATACGTCCTGAGGGAGAAAGT

GGGGGATCTTCGGACCTCACGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGG

TGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGT

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GATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCAGTAAGTTAATACCTTGCTGTTTT

GACGTTACCAACAGAATAAGCACCGGCTAACTTCGT

(SEQ ID NO：1)

细菌对头孢噻肟(Cephotaxime)、氨苄青霉素(Ampicillin)、四环素(Tetracycline)、多黏菌素B(PolymyxinB)、氯霉素(Cloramphenicol)、头孢他啶(Ceftazidime)、氯唑西林(Cloxacillin)、庆大霉素(Gentamicin)、利福平(Rifampicin)、盐酸多西环素(Doxycycline hydrochloride)、头孢羟氨苄(Cephadroxil)、万古霉素(Vancomycin)、甲硝唑(Metronidazole)、甲氧苄啶(Trimethoprim)有抗性。测试抗性为完全抗性(100％)。

菌株对不同抗生素的敏感性通过圆盘扩散法(disk diffusion method)使用市售的(Himedia)抗生素圆盘确定。已经测试了每组抗生素的代表。所用抗生素是氨苄青霉素(Ampicillin)(A10)，头孢羟氨苄(Cephadroxil)(Cq30)，氯霉素(Chloramphenicol)(C30)，氯唑西林(Cloxacillin)(Cx30)，头孢噻肟(Cephotaxime)(Ce30)，头孢他啶(Ceftazidime)(Ca30)，环丙沙星(Ciprofloxacin)(Cf5)，盐酸多西环素(Doxycycline Hydrochloride)(Do30)，庆大霉素(Gentamicin)(G10)，甲硝唑(Metronidazole)(Mt4)，新霉素(Neomycin)(N30)，诺氟沙星(Norfloxacin)(Nx10)，多黏菌素B(Pb100)，利福平(R15)，罗红霉素(Roxithromycin)(Ro30)，四环素(Tetracycline)(T30)，甲氧苄啶(Tr30)，万古霉素(Va30)。以微克计的每盘的抗生素浓度在以上所示的括号中提及，例外是多黏菌素B，其中它是100单位。将Mueller Hinton琼脂培养基(Himedia-M173)用于培养用于抗生素敏感性测试的每种微生物。将每种分离株的对数期培养物稀释100倍并倒在Mueller Hinton Agar(MHA)平板上。将其均匀旋转以将培养物分布在整个平板中。在等待30分钟后，用移液器将培养物小心地从平板移出并且使平板干燥。然后使用与抗生素圆盘一起提供的分配器将抗生素圆盘放置在MHA表面上。将平板在37℃孵育过夜。测量抑制区域。使用由Himedia与抗生素圆盘一起提供的国家临床实验室标准(NCCLS)图表评估结果。对每种生物重复测定三次。

所述细菌对环丙沙星、新霉素和诺氟沙星敏感。对菌株A的选择性筛选在牛奶培养基(0.3％酵母抽提物，10％牛奶；1.5％琼脂)和Luria Bertani肉汤(1％胰蛋白胨，0.5％酵母抽提物，0.5％氯化钠)中进行。对于培养，还使用粗糖，所述粗糖是作为没有分离糖蜜(mollasses)和晶体的蔗汁的浓缩产物获得的未精炼的非分蜜糖(non centrifugal sugar)。

发现分离株在重金属盐如Pb、Cr、Cd、Hg、Cu、Ni和Cd的存在下生长。菌株SRC002(MTCC5564)显示约500ppb的铅累积。菌株SRC002(MTCC5564)显示Pb，Cr，Cd，Hg和Cu处理后的明显的纳米颗粒。作为金属诱导的应激的效应，在细胞形态学方面观察到明显变化。菌株SRC002(MTCC5564)在Ni处理后显示产生毛状外层(wooly coat)，而在Cd处理的情况中观察到细胞伸长。

在深层发酵条件下，基于酶活性确定蛋白酶和脂肪酶生产(例如，见实施例2，脂肪酶生产)的最佳时间。在生长的对数期晚期(具有最佳蛋白酶活性)收集培养物，并将不同部分的皮(2x2cm)浸入分开的装置中达10小时。将常规方法也应用于来自不同部分的皮上达相同时间。为了使该方法节约成本，通过用粗糖代替Luria Bertani富集培养基来改变培养基配方。

根据序列比较，apr基因测序反映所述酶是碱性蛋白酶家族的成员。

过程：通过改良的碱溶菌法从菌株分离基因组DNA。使用针对铜绿假单胞菌的aprA特异性引物(5′-TACTCGCTGGGCA AGTTCAGCG-3′(SEQ ID NO：2)和5′-GTAGCT CATCAC CGAATAGGCG-3′(SEQ ID NO：3))在以下条件下进行对aprA基因片段的PCR扩增：开始在94℃变性5min；35个扩增循环(在94℃变性30秒；在59℃退火30秒；在72℃延伸30秒)；并且最后在延伸后在72℃达5分钟(Kim等，2006)。PCR之后，将扩增子在具有100bp DNA梯状带(DNA ladder)(货号SM0623，Fermentas)的2％琼脂糖凝胶上跑胶，并且然后利用溴化乙锭染色。将曾经在凝胶上确认的400个碱基对的PCR产物送去用于部分测序。对序列进行blast分析，并且也向GenBank提交，登记号为GQ202011(Adarsh V K，MadhusmitaMishra，Sanhita Chowdhury，M Sudarshan，A.R.Thakur和S Ray Chaudhuri.2007Studies on metal microbe interaction of three bacterial isolates from EastCalcutta Wetland.Online Journal of Biological Sciences(对来自东加尔各答湿地的三种细菌分离株的金属微生物相互作用的研究)，7(2)：80-88)。

基因序列：-

tttcccgcgc aggccagacc aagttgtcgc tgcaatcctg gtcggacgtc gccaagatca

acttcgtcga cgccggccag ggcgagcagg gcgacctcgt cttcggtaac ttcagcagca

gcgtcggcgg cgcggcgttc gctttcctgc cggatgttca ggatgcgctc aagggccagt

cctggtacct gatcaacagc agctacagcg ccaacgtcaa cccggccaat ggcaactacg

ggcgccagac gctgacccac gagatcggcc ataccctggg tctcagccac cccggcgact

acaacgccgg cgagggcgac ccgacctacg ccgacgccac ctacgccgag gacacccgcg

cctattcggt gatgagctac ca

(SEQ ID NO：4)

来自菌株SRC002(MTCC5564)的胞外上清的SDS PAGE分析显示两条带，一个在66和43kD之间而另一个在43和29kD之间。在疏水相互作用色谱后获得的纯化的蛋白在SDS-PAGE上是均质的。估计其分子量为约35kD，这与其他报道的蛋白酶(18至49kD)不同。利用粗的胞外蛋白酶进行脱毛。为更好的了解酶，按照下述方案进行纯化：

纯化：将通过使用speedvac浓缩胞外上清达30小时获得的、与结合缓冲液(20mM磷酸盐缓冲液pH-7.0，其中有50％的硫酸铵)混合的200mg蛋白以1.5ml/min的流速加载到在20％乙醇中预溶胀的、用20mM磷酸盐缓冲液(pH-7.0)预平衡的Phenyl Sepharose CL-4B柱(3.8cm长，1.8cm直径，柱床体积9.66ml)上。将该柱用同样的缓冲液洗涤。然后用在20mM磷酸盐缓冲液中的硫酸铵的阶式梯度(50-0％浓度)(每个梯度20ml)洗脱结合的酶。洗脱液的总体积为100ml。收集5ml的级分，测量每个级分的蛋白含量和蛋白酶活性。将显示活性的级分对20mM磷酸盐缓冲液(pH-7.0)进行大量透析以去除硫酸铵。进行活性级分的表征。还进行ESI质谱用于纯化的蛋白的分子量的精确计数。

活性凝胶方案：在SRC-002和SRC-004的情况中，在复性的SDSPAGE凝胶上，来自所有菌株的胞外上清的酶谱(zymograph)显示明显活性，其中以明胶作为底物。在含明胶的SDS酶谱中SRC-005也产生非常微弱的条带。虽然其他分离株在牛奶培养基平板上显示活性(平板清除活性)并且在利用蓝色皮粉(hide powder azure)和偶氮酪蛋白(azocasein)的生化测定期间显示活性，但是它们在酶谱上不显示活性，这表明缺乏明胶酶活性。酶可以由具有可变分子量的多个亚基组成，所述亚基可能已经在SDSPAGE上分离，因此不显示活性。还有可能的是，这些蛋白需要一些辅因子，所述辅因子在SDS PAGE上被移置并且因此导致活性丧失。

分析还显示在含明胶作为底物的活性凝胶中的清除区域：存在于粗的胞外上清中的上方条带不显示活性凝胶中的清除区域。通过ESI质谱，纯化的蛋白的分子量进一步被确认为36.18kDa。

不含细胞的上清的蛋白酶含量通过蛋白酶测定(使用蓝色皮粉(hidepowder azure)作为底物)来确定，如在Chowdhury，S.等，2008，Novel MetalAccumulator and Protease Secretor Microbes from East Calcutta Wetland(来自东加尔各答湿地的新的金属累积和蛋白酶分泌微生物)，American Journalof Biochemistry and Biotechnology4：255-264中所讨论的那样，所述文献通过引用结合于此。

酶动力学研究揭示存在蛋白酶的两种同工酶或两种不同蛋白酶。一种酶在低的底物浓度起作用，而发现另一种在更高的底物浓度有活性。从Lineweaver-Burk图确定的这两种蛋白酶的Km值为18.18和46.5mg/ml。

酶活性在4℃至50℃以及4℃至40℃的整个温度范围内是显著的，其中在40℃具有最大活性(图2B)。该最佳温度低于关于来自铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)菌株的其他蛋白酶报道的值(Ogino，H.，F.Watanabe，M.Yamada，S.Nakagawa，T.Hirose，A.Noguchi，M.Yasuda和H.Ishikawa.1999.Purification and characterization of organic solvent-stable protease fromorganic solvent-tolerant Pseudomonas aeruginosa PST-01(来自耐受有机溶剂的铜绿假单胞菌PST-01的有机溶剂稳定蛋白酶的纯化和表征).J.Biosci.Bioeng.87：61-68以及Gupta A.，Roy I.，Khare S.K.，Gupta M.N.，2005.Purification and characterization of a solvent stable protease fromPseudomonas aeruginosa PseA(来自铜绿假单胞菌PseA的溶剂稳定蛋白酶的纯化和表征).J.Chromatogr.1069，155-161.[doi10.1007/s00253-002-0975-y])。

EGTA(10mM)；1，10菲咯啉(Phenanthrolin)(2mM)和磷阿米酮(Phosphoramidone)(500μg/ml)完全抑制蛋白酶活性。抗蛋白酶(Antipain)(20μM)；倍司他汀(Bestatin)(50μg/ml)；胰凝乳蛋白酶抑制剂(Chymostatin)(20μM)；E-64(2μM)；胃酶抑素(Pepstatin)(1μM)和Ebelacetone-B(1μM)几乎对蛋白酶的活性没有影响。

所述酶在pH3-10.5的大范围内显示超过80％的活性，在7.5-8的中性范围显示最大活性(图2a)。报道来自铜绿假单胞菌的其他蛋白酶显示7至9的最佳pH值。粗酶的pH曲线(profile)在pH5-8的整个范围内显示几乎相似的活性，并且在pH7显示最大活性。所述酶在中性pH值的活性可以减少由于施加石灰导致的碱性而产生的问题。

酶在Cr的存在下保持最多可达90％的活性，在Co的存在下保持最多可达82％的活性，在Ag的存在下保持最多可达76％的活性，在Ni和Al的存在下保持最多可达70％的活性，在Pb和Cu的存在下保持最多可达50％的活性，并且在Zn和Cd的存在下保持最多可达34％的活性，其中在Hg的存在下活性被完全抑制。EDTA也使酶活性丧失，而β巯基乙醇、过氧化氢、Triton X100、漂白剂和去垢剂部分抑制粗酶的活性。同样地，EGTA、1，10菲咯啉和磷阿米酮完全抑制蛋白酶活性，而抗蛋白酶、倍司他汀、胰凝乳蛋白酶抑制剂、E-64、胃酶抑素和Ebelacetone-B不具有抑制作用。

实施例2：脂肪酶

一种具体的脂肪酶分离自细菌培养物(菌株B/GZN(于2010年5月24日保藏于微生物模式培养物保藏中心与基因库(Microbial Type CultureCollection&Gene Bank)，Sector39-A，Chandigarh-160 036，印度，指定的参考号为MTCC5566))并被用作皮革加工方法的一部分。菌株B的来源是来自所谓“绿色区域(green zone)”的土壤样品，所述“绿色区域”是最老的垃圾倾倒场，其目前被用作具有森林样生态系统的娱乐中心。位置地图显示22°32′17.5″N和88°23′53.7″E(使用Google Earth http://earth.google.com/)。

这是最老的垃圾倾倒场，其接收整个城市的废物；目前名为绿场(Greenone)。气候终年湿热。

它是革兰氏阴性的。分离株的分子鉴别是基于对16SrDNA的部分序列分析，并且序列可以在GenBank作为GZN获得，登记号为FJ788518。

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(SEQ ID NO：5)

该部分序列显示与铜绿假单胞菌具有100％的同一性。

该菌株生产蛋白酶和脂肪酶，并且耐受万古霉素、氨苄青霉素、多黏菌素B、Ciprofloxacillin、Norfloxacillin、多西环素、四环素和利福平。

该菌株也对庆大霉素敏感，并且显示对新霉素、头孢噻肟(cefotaxime)、头孢他啶、甲氧苄啶和氯霉素的中等反应。该菌株不分泌蛋白酶、过氧化氢酶、氧化酶、DNA酶、卵磷脂酶或淀粉酶。酶的生产通过分光光度法使用pNPP作为底物量化。发现，在16小时的生长后菌株B产生约3个单位的脂肪酶。

发现该分离株在重金属盐如Pb的存在下生长。菌株GZN(MTCC5566)显示约2688ppb的胞内累积的铅。在处理后，该菌株累积金属如Cu和Ag。作为金属诱导的应激的效应，在细胞形态学上观察到明显的改变。分离的GZN(MTCC5566)菌株在用重金属如Al、Cr、Fe、Pb和Ag处理后显示细胞大小的明显缩短。

在摇瓶培养中优化酶生产。对于菌株B，将以椰子油作为底物的基本(碳基本盐(Carbon minimal salt))培养基用作选择培养基；将Luria Bertani肉汤用于培养。对于培养，还使用粗糖，所述粗糖是作为没有分离糖蜜(mollasses)和晶体的蔗汁的浓缩产物获得的未精炼的非分蜜糖(noncentrifugal sugar)。

实施例3：脱毛溶液

将上述微生物的培养物直接用于约10小时的一步温育，所述一步温育结合了浸泡、脱脂和脱毛的常规步骤，导致更快的处理时间。在该实施例中，在皮革处理中，由于省略了细胞收集以及将所述三个预鞣工艺结合为一个，所以在时间和金钱支出上也有减少。

使用来自东加尔各答湿地(不同位置)的铜绿假单胞菌的两个分离株菌株A(描述于实施例1中)和菌株B(描述于实施例2中)。发现这两个分离株在广泛的温度和pH范围内生长，如本文所述。该耐受性提供在不同环境条件下使用的优点。在室温(30℃至35℃)和中性pH范围，将山羊生皮浸泡在含有脂肪酶和蛋白酶(约1∶1的比例)的溶液中达约10小时。在温育后，在水中轻柔地擦洗和洗涤皮，这导致毛发的去除。毛发副产品可以在商业上用于刷子生产等。

溶液中使用的酶的比率可以是有效地给皮脱毛的任何比率。例如，比率可以是1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10、2∶3、2∶5、2∶7、2∶9、3∶4、3∶5、3∶7、3∶8、3∶10、4∶5、4∶7、4∶9、4∶11、5∶6、5∶7、5∶8、5∶9、5∶11、6∶7、6∶9、6∶11、7∶8、7∶9、7∶10、7∶11、8∶9、8∶11、9∶10或9∶11。所述比率可以是脂肪酶与蛋白酶的比率、蛋白酶与脂肪酶的比率、蛋白酶与淀粉酶的比率、淀粉酶与蛋白酶的比率、脂肪酶与淀粉酶的比率或淀粉酶与脂肪酶的比率。

实施例4：用于酶生产的固定化细胞的循环

含有酶的培养物的可重复利用性有利地降低了连续生产的成本。培养过夜细菌培养物并将其用于孵育生皮。在孵育10小时后，取出处理过的皮并将新鲜皮置于培养物中。所用培养物体积的损失可以通过添加足够的生长培养基来补偿。它可以以相同的效率连续使用达约7个连续的循环。

在悬浮和固定化条件下评价蛋白酶在脱毛中的效率。重复使用相同的起始培养物使得整个过程更加节约成本。在悬浮培养中，进行再循环达7个循环，并且每个循环显示大致相同的脱毛效率(图7)。在固定化条件(1％接种物，在8％藻酸钠和1M CaCl₂中(Kumar等的改进的实验方案，见实施例5))下，确定脱毛在20个循环内有效(图8)。发现直至第20个循环，酶活性都大致相同(图8)。对于生产脂肪酶的菌株，同样发现可重复利用性是有效的。填充床反应器中的固定化保证在延长时间内的酶的连续生产。

实施例5：细胞的固定化和用于酶生产的填充床法.

对于藻酸盐小珠中的固定，使用改编自Kumar和Chandrasekharan(2003，Continuous production of L-glutaminase by an immobilised marinePseudomonas sp BTMS-51in a packed bed reactor(通过固定化的海洋假单胞菌种BTMS-51在填充床反应器中连续生产L-谷氨酰胺酶)，ProcessBiochem.，38：1431-1436))的实验方案来固定细胞，其中具有一些改变(例如，使用8％藻酸钠溶液和1M CaCl₂)。将浓缩的细胞悬浮液与8％藻酸钠溶液混合，并逐滴加入到冷却的氯化钙溶液中以形成小珠。保持该小珠溶液冷却直至其被转移到培养基中，之后用PBS洗涤以去除附加的氯化钙溶液。

然后将小珠转移到25ml的新鲜培养基中，并在连续振荡下在37℃温育过夜。在每24小时后，将相同的小珠转移到新鲜培养基中作为接种物。在转移小珠后，将过夜培养物用于脱毛。每次通过观察毛发去除性能以及通过使用皮粉末测定监测分泌的酶的单位来检验酶溶液的效率。

只要小珠存在就重复该过程。随着温育进行，小珠缓慢开始破裂/溶解在温育培养基中。甚至只要存在小量的小珠就可以将该过程继续。

对于基于填充床的生产，采用以下方法：

·将任何类型的稻草(或任何相似基质)切成小段(大约2至3cm长)并煮约5分钟。然后将水轻轻倒出并加入新鲜的水。将整个过程重复约3至4次直至在沸水中不再看到颜色，从而保证完全去除任何营养物。

·然后将其在37℃干燥。

·用稻草填充生物反应器的柱以充当细胞生长的基质。也可以使用任何其他相似类型的基质。生物反应器柱可以是在壁上具有穿孔的塑料套，所述穿孔使得培养基可以进入和离开所述柱。见图9。

·在锥形烧瓶中制备200ml L.B肉汤，灭菌，并用所需菌株的2ml培养物接种。

·将烧瓶在37℃温育过夜。

·将过夜培养的培养物倒入包含所述柱的腔室中以使细胞和培养基灌注到生物反应器基质中。培养物中的细菌粘附到煮过的稻草上，将其用作用于固定和生物膜形成的基质。用培养基填充腔室以保证柱中的稻草保持与培养基中的细菌接触24小时。

·将包括生物反应器柱的腔室在室温保持24小时。

·24小时后，将培养基从腔室和生物反应器柱中轻轻倒出。然后将反应器保持干燥达24小时以允许细胞粘附到稻草。在不存在培养基下温育允许细胞粘附到基质上以使其在该处的位置稳定，以致其在新添加的培养基存在下不被洗去。

·24小时后，将新鲜培养基倒入或重新装入包含生物反应器柱的腔室中。通过固定化的细胞生产的胞外的酶将被分泌到将用于多种用途的培养基中。

·12小时后，轻轻倒出培养基，并将新鲜培养基充入腔室中。

·每12小时后，将1.5ml轻轻倒出的培养基等分到eppendorf管中，并将25ml等分到falcon管中。

·每12小时后，使用轻轻倒出的培养基检验蛋白酶的生产和脱毛活性。将1.5ml用于蛋白酶定量，将25ml用于脱毛。

实施例6：酶效率

可以通过多种不同参数评价脱毛效率。评价的主要特征是皮革质地，皮抗张强度和柔软度的增加。本文所述的酶相对于常规化学处理的适用性尤其可以关于以下各项评价：可重复利用性、完成脱毛方法需要的时间和对不同部位的皮(例如，来自颈部、尾部、腿区域的皮革，对于上述皮革脱毛是有挑战性的)的效果。对本文所述的酶进行给山羊皮和兔皮脱毛的测试。

酶促脱毛方法的效率通过皮面积的相对增加和皮重量的相对下降来分析(表1-3；图3和4)。例如，这可以涉及皮片在脱毛前和脱毛后长度和宽度的变化。

脂肪酶可以降低脂肪含量，这可以被测量为处理后皮重量的下降。因为脂肪酶特异性地分解脂肪，其通常不影响或破坏皮革自身。脂肪酶不仅水解皮和皮肤外部的脂肪，而且还水解皮肤结构内部的脂肪。使用脂肪酶的优点是制备具有均匀颜色和更清洁外表的皮革。脂肪酶还改善疏水(防水)皮革的生产。脂肪酶与蛋白酶的组合作用可以通过促进蛋白分解和脂肪分解来提供协同效应。

在对数期晚期，收集两种培养物(用于蛋白酶和脂肪酶生产的细菌培养物)，并以1∶1的比例混合，将皮浸入其中。菌株A的蛋白酶活性为37.5个单位，菌株B的脂肪酶和蛋白酶活性分别为7.9个单位和和38.1个单位。

表1：蛋白酶在脱毛中的效率，所述脱毛在来自身体特定区域的皮上进行

表2：常规方法在脱毛中的效率，所述脱毛在来自身体特定区域的皮上进行。

表3.组合的蛋白酶和脂肪酶作用相对于蛋白酶或脂肪酶的脱毛效率。

本文参考的每篇专利、专利申请、出版物和文献的全部通过引用结合于此。对以上专利、专利申请、出版物和文献的引用并非承认任何上述各项是相关现有技术，并且也并非承认这些公布或文献的内容或日期。

本公开内容不限于本公开内容中所述具体实施方案，所述具体实施方案是不同方面的举例说明。对于本领域技术人员来说是明显的，可以进行许多改变和变化而不背离本公开内容的实质和范围。除了本文中列举的那些，从前述说明，在本公开内容范围内的功能上等同的方法和仪器对于本领域技术人员将是明显的。这些改变和变化落在所附权利要求的范围内。本公开内容仅被权利要求(例如，所附权利要求)以及这些权利要求所有权要求的等同物的全部范围所限定。要理解，本公开内容不限于具体方法、试剂、化合物组合物或生物系统，这些当然可以变化。还要理解，本文所用术语仅用于描述具体实施方案，未必是限制性的。

关于本文中的基本上任何复数和/或单数术语的使用，本领域技术人员可以根据语境和/或用途将复数转变为单数和/或从单数转变成复数。为了清楚，本文中可以明显地陈述不同的单数/复数变换。

本领域技术人员将理解，通常，本文中以及尤其在所附权利要求(例如，权利要求书)中使用的术语通常被视为是“开放式”术语(例如，术语“包括(including)”应当被解释为“包括但不限于”，术语“具有”应当被解释为“至少具有”，术语“包括(includes)”应当被解释为“包括但不限于”等)。本领域技术人员还要理解，如果引入的权利要求列举的具体数字是故意的，则该意图将明显地列举在所述权利要求中，并且在该列举不存在的情况下，则不存在这种意图。例如，为方便理解，以下所附权利要求可以包含使用引导短语″至少一个″以及″一个或多个″以引入权利要求列举。然而，使用这样的短语不应当被认为是暗示通过不定冠词″一个(a)″或″一种(an)″的权利要求列举的引入将包含所述引入的权利要求列举的任何具体权利要求限制为仅含一种所述列举的实施方案，即使当相同的权利要求包含引导短语″一个或多个″或者″至少一个″和不定冠词如″一个(a)″或″一种(an)″(例如，″一个(a)″或″一种(an)″应当被解释为是指“至少一个”或“一个或多个”)；这同样适用于用于引入权利要求列举的定冠词的使用。此外，即使引入的权利要求列举的具体数字被明确列举，本领域技术人员也将理解，所述列举应当被解释为是指至少所列举的数字(例如，在没有任何修饰语的情况下，仅列举″两个列举″是指至少两个列举，或两个以上的列举)。

此外，在使用类似于“A、B和C等中的至少一个”的表达的那些情况中，通常这样的结构意在表达本领域技术人员所理解的含义(例如，“具有A、B和C中至少一个的系统”将包括但不限于仅具有A的系统，仅具有B的系统，仅具有C的系统，具有A和B的系统，具有A和C的系统，具有B和C的系统，和/或具有A、B和C的系统等)。在使用类似于“A、B或C等中的至少一个”的表达的那些情况中，通常这样的结构意在表达本领域技术人员所理解的含义(例如，“具有A、B或C中至少一个的系统”将包括但不限于仅具有A的系统，仅具有B的系统，仅具有C的系统，具有A和B的系统，具有A和C的系统，具有B和C的系统，和/或具有A、B和C的系统等)。

当在本文中使用时，术语“约”是指在基础参数的10％内的值(即，加或减10％)，在一串值前使用术语“约”修饰每个值(即，“约1、2和3”是指约1、约2和约3)。例如，“约100克”的重量可以包括90克至110克之间的重量。此外，当本文中描述值的列表时(例如，约50％，60％，70％，80％，85％或86％)，该列表包括其所有的中间值和小数值(例如，54％、85.4％)。本领域技术人员还要理解，实际上提供两个以上备选术语的任何选择性词语和/或短语，不论是在说明书中、权利要求中还是在附图中，应当被理解为具有以下可能性：包括术语中的一个，包括术语中的任一个，或者包括两个术语。例如，短语“A或B”将被理解为包括以下可能性：“A”或“B”或“A和B”。

此外，当本公开内容的特征或方面按照马库什组来描述时，本领域技术人员将理解，本公开内容也因此按照马库什组的任何个体成员或成员的亚组来描述。

因此，应当理解，尽管本技术已经被代表性实施方案和任选特征具体公开，但是本领域技术人员可以采用本文公开的概念的改变和变化，并且所述改变和变化被认为是在本技术的范围内。如本领域技术人员将理解的，为了任何和所有目的，如在提供书面说明方面，本文公开的所有范围也涵盖任何和所有可能的亚范围以及其亚范围的组合。任何列出的范围可以容易地被接受为足以描述被分为至少相等的二分之一、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一等的相同的范围并使其充分公开。作为非限制性实例，本文讨论的每个范围可以被容易地分为下三分之一、中三分之一和上三分之一等。如本领域技术人员将理解的，所有语言如“最多可达”、“至少”、“大于”、“少于”等包括列举的数字并且是指随后可以被分解为如上所述的亚范围的范围。最后，如本领域技术人员将理解的，范围包括每个个体成员。因此，例如，具有1-3个细胞的组是指具有1、2或3个细胞的组。类似地，具有1-5个细胞的组是指具有1、2、3、4或5个细胞的组，诸如此类。

虽然本文已经公开了多个方面和实施方案，对于本领域技术人员，其他方面和实施方案将是明显的。本文公开的多个方面和实施方案是用于举例说明而非限制性的，某些实施方案的真实范围和实质由以下权利要求所指示。

Claims

1.一种生皮脱毛方法，所述方法包括：

将生皮与含有脂肪酶和蛋白酶的溶液接触达预定量的时间，其中所述脂肪酶是铜绿假单胞菌菌株B/GZN分泌的脂肪酶，并且此外其中所述溶液的pH值是5-10；和

将毛发从所述生皮去除。

2.一种生皮脱毛方法，所述方法包括：

将生皮与含有假单胞菌属脂肪酶和蛋白酶的溶液接触达预定量的时间，其中所述蛋白酶是铜绿假单胞菌菌株A/SRC002分泌的蛋白酶，所述溶液的pH值是5-10；和

将毛发从所述生皮去除。

3.权利要求1的方法，其中所述蛋白酶是细菌蛋白酶。

4.权利要求1的方法，其中所述蛋白酶来自革兰氏阳性细菌。

5.权利要求1的方法，其中所述蛋白酶来自革兰氏阴性细菌。

6.权利要求3的方法，其中所述蛋白酶是铜绿假单胞菌分泌的蛋白酶。

7.权利要求6的方法，其中所述蛋白酶是铜绿假单胞菌菌株A/SRC002分泌的蛋白酶。

8.权利要求1的方法，所述方法还包括将毛发从所述生皮机械地去除。

9.权利要求8的方法，所述方法还包括擦洗所述生皮。

10.权利要求1的方法，其中将所述生皮与所述溶液接触10小时以上。

11.权利要求1的方法，其中所述pH值为7.5至8.0。

12.权利要求1的方法，其中所述pH值为pH 8.0。

13.权利要求1的方法，其中所述溶液包含分泌所述脂肪酶和所述蛋白酶中之一或两者的细菌物种。

14.权利要求13的方法，其中所述细菌物种是铜绿假单胞菌。

15.权利要求13的方法，其中所述细菌物种是铜绿假单胞菌菌株A/SRC002，其中所述蛋白酶是分泌的。

16.权利要求13的方法，其中所述细菌物种是铜绿假单胞菌菌株B/GZN。

17.权利要求13的方法，其中所述细菌物种被固定化。

18.权利要求17的方法，其中所述细菌物种被固定化在多孔基质中。

19.权利要求1的方法，所述方法还包括将细菌培养至生长对数期的晚期，其中所述细菌拥有具有蛋白酶活性或脂肪酶活性或两者的一种或多种酶。

20.权利要求1的方法，其中所述生皮用盐处理。

21.权利要求1的方法，其中所述生皮是干燥的。

22.权利要求1的方法，其中将所述溶液保持在40℃的温度达所述预定量的时间。

23.权利要求1的方法，其中通过涂覆、浸渍或喷雾中的一种或多种将所述溶液施用到所述生皮。

24.权利要求1的方法，其中所述溶液是可重复使用的。

25.权利要求24的方法，其中所述溶液可重复使用达至少7个循环。

26.权利要求24的方法，其中所述溶液可重复使用达至少20个循环。

27.权利要求17的方法，其中用氯化钙将所述细菌物种固定化在藻酸钠中。

28.权利要求1的方法，其中所述溶液还包含处于悬浮培养物中的细菌细胞。

29.一种组合物，所述组合物包含与含有脂肪酶和蛋白酶的溶液接触的生皮，其中所述脂肪酶是铜绿假单胞菌菌株B/GZN分泌的脂肪酶，并且此外其中所述溶液的pH值是5-10。

30.一种组合物，所述组合物包含与含有假单胞菌属脂肪酶的溶液接触的生皮，其中所述脂肪酶是铜绿假单胞菌菌株B/GZN分泌的脂肪酶，所述溶液的pH值是5-10。

31.一种组合物，所述组合物包含与含有脂肪酶和铜绿假单胞菌分泌的蛋白酶的溶液接触的生皮，其中所述蛋白酶是铜绿假单胞菌菌株A/SRC002分泌的蛋白酶，所述溶液的pH值是5-10。

32.权利要求29的组合物，所述组合物包含分泌所述脂肪酶的细菌物种。

33.权利要求29的组合物，所述组合物包含分泌所述蛋白酶的细菌物种。

34.权利要求29的组合物，所述组合物包含分泌所述脂肪酶的细菌物种和分泌所述蛋白酶的细菌物种。

35.一种用于制备生皮脱毛溶液的试剂盒，所述试剂盒包括：

基本由铜绿假单胞菌菌株A/SRC002组成的第一培养物；

基本由铜绿假单胞菌菌株B/GZN组成的第二培养物；和

制备具有5-10的pH值的溶液的说明书，所述溶液含有(a)由铜绿假单胞菌菌株A/SRC002分泌的蛋白酶和(b)由铜绿假单胞菌菌株B/GZN分泌的脂肪酶。