CN103074318B - 一种角蛋白酶及其编码基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体地涉及一种角蛋白酶及其编码基因和应用。所述角蛋白酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。高效表达本发明的重组角蛋白酶，可达到20000U/mL以上的发酵水平，同目前已有的生产技术相比，本发明的角蛋白酶通过表达后能够达到较高的发酵水平，在工业生产中可大大降低生产成本，使其在饲料、皮革脱毛鞣制等工业中显示出更大的应用潜力。

Description

一种角蛋白酶及其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地涉及一种角蛋白酶及其编码基因和应用。

背景技术

我国每年产生的羽毛、毛发等废弃物多达数十万吨，出现这种现象的根本原因是羽毛、毛发等主要由角蛋白组成，这种角蛋白结构非常稳定，对胃蛋白酶及胰蛋白酶具有很强的抗性，难以被降解，这些废弃物不仅造成资源浪费，而且还会造成严重的环境污染。

目前常用的羽毛处理方法是采用高温、高压工艺条件将其软化，然后加工成动物饲料添加剂，但该处理过程中耗能大，且蛋氨酸、赖氨酸及色氨酸等必需氨基酸被破坏，消化性差，营养性不稳定。而利用角蛋白酶处理，可通过特异性的酶解反应对羽毛粉进行水解，使其从结构上发生根本性变化，生成多肽或游离氨基酸，大大改善了消化及营养性能，从而成为羽毛粉等进行综合利用最为有效的手段。

角蛋白酶（Keratinase）是一种新型的蛋白水解酶，它能将角蛋白水解成游离的氨基酸或多肽。分析测试结果表明：羽毛、毛发中的粗蛋白经角蛋白酶水解后，可产生大量的氨基酸，同时还可将包含在这些蛋白质中的微量元素及未知生长因子释放出来，因此经酶解的羽毛粉可作为一种良好的蛋白原料应用于饲料中。据测试，经水解的羽毛粗粉可在7%的日粮水平上代替大豆粕。这不仅可从根本上解决羽毛及毛发等废弃物造成的环境污染、资源浪费问题，还可开发出新的蛋白来源，缓解蛋白资源供应紧张的局面。

研究表明，在以羽毛粉为唯一蛋白源饲料中添加角蛋白酶，能够极大地提高羽毛蛋白的利用效率，使之达到或超过豆粕，从而使原来作为废弃物的羽毛等物质成为高营养价值的蛋白源。

因此，角蛋白酶的应用，一方面可使羽毛等废弃物得到有效利用，大大降低了环境污染；另一方面，还有效地缓解了蛋白资源供应紧张的局面，开辟了一种新的蛋白资源。

此外，脱毛工序是皮革生产过程中的重要环节之一，传统的“毁毛脱毛”法是利用硫化物降解毛发，所排放的废水和固体废物，是导致制革废水中COD、BOD和TDS增高的主要原因，给环境带来严重污染。角蛋白酶能够有效地水解毛囊中的角质组织，使毛发得以从中拔出。在脱毛过程中，使用含角蛋白酶的生物脱毛助剂，不仅能降低脱毛废液中BOD和TDS，而且能大幅度地减少硫化物的用量甚至将其弃用，有效地减少了脱毛废液对环境的污染。虽然国内尚未见有关的研究报道，但国外的一些研究结果表明，在无硫化物的条件下，角蛋白酶的脱毛效果非常有效。

发明内容

本发明的一目的是提供一种来源于黑曲霉（Aspergillus nige，r保藏号为：CGMCC NO.4289），的角蛋白酶。

本发明的再一目的是提供上述角蛋白酶的基因。

本发明的再一目的是提供包含上述角蛋白酶的重组载体。

本发明的再一目的是提供包含上述角蛋白酶基因的重组菌株。

本发明的再一目的是提供一种高效表达角蛋白酶的方法。

本发明的再一目的是提供上述角蛋白酶的应用。

本发明中使用了黑曲霉（Aspergillus niger）的角蛋白酶基因，其编码的氨基酸序列及基因序列的分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示，然后采用了从INVITROGEN公司购买的pPICZaA表达载体和宿主毕赤酵母X33构建成角蛋白酶重组工程菌。所构建的毕赤酵母工程菌除具有原宿主菌X33的形态、遗传和生理生物特征外，还包含有角蛋白酶基因。

根据本发明的具体实施方式，从上述菌株中分离得到一种角蛋白酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：

SEQ ID NO.1：氨基酸序列

MKLTLLPILATAAAGLVSSATKLLILPLAAATLAGVSLLDDKVQIGYRTNEVIDGLP

GTPFGLMYDTGDSTLSWVLDSNC

TDDCPNVSGYSRHGYNLTSTGVNLGVNSDAISGYTVGGFSATTILDVPTTNDVSQS

YRAVITFWDSTLAAAAIGLACTVP

FKNTTIASVEPTTEEMMLDEHGLSLGSSSVYAGPCQRESDPNPVFTLNNGHEDGG

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GHKIQGQALSSATPMVNVHDWCLYNIDTSTGALTSIHVEDQNAPMSLTHAVSYRY

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该角蛋白酶共由395个氨基酸组成，其理论pI/Mw：4.53/42585.82。

本发明还提供了编码上述角蛋白酶的基因，该基因的序列如SEQ ID NO.2所示：

SEQ ID NO.2：基因序列

ATGAAGCTCACCCTCCTACCGATTCTGGCAACAGCCGCTGCCGGACTGGTAAGTTCCGCTA

CCAAGCTACTCATTCTCCCGCTGGCCGCAGCCACACTGGCTGGAGTAAGTTTGCTAGATGA

CAAGGTTCAAATCGGCTATAGGACTAATGAGGTAATCGACGGACTTCCAGGTACCCCGTTTG

GCTTGATGTACGATACCGGAGACTCAACACTCTCATGGGTGCTTGATAGCAATTGTACAGAT

GATTGTCCAAATGTTAGCGGGTACTCCCGACACGGCTACAACCTCACCTCTACTGGTGTCAA

CTTAGGTGTCAACAGCGACGCTATTAGCGGATACACTGTCGGCGGCTTCAGCGCCACGACT

ATTCTCGATGTTCCCACGACCAACGACGTCTCACAGAGCTATCGCGCCGTCATTACCTTTTG

GGACAGTACCTTAGCAGCCGCGGCCATCGGCCTGGCATGTACGGTTCCGTTCAAGAATACT

ACCATCGCATCCGTCGAACCTACGACAGAGGAGATGATGCTGGATGAACATGGACTTTCTC

TCGGATCCAGTTCAGTATATGCAGGACCGTGCCAAAGGGAATCGGACCCTAATCCCGTGTTC

ACCTTGAATAATGGCCATGAGGATGGTGGCAGGGACGGAACCTATGCGGAGATGAAACTGC

AATGGATCCCGCTCTCTGAAATATACTTAACCAAAAACCTTCTTGGACACAAAATTCAGGGC

CAGGCCCTGTCAAGCGCAACTCCGATGGTGAACGTCCACGACTGGTGCCTTTACAATATCG

ATACATCGACCGGTGCTTTAACCAGCATTCACGTTGAGGACCAGAATGCCCCGATGTCTTTA

ACGCACGCTGTCTCATACAGATACCGACCTCTGTGTCTCATCTGCAATGATACCTCCGATTTG

ATCTCTTTATGGTCGGGTACAATTGGCTTCTACGAGGGCTTCAATGTCACCGGTTTGACGCT

GGCTGATCATGGCTATCACGTGCCCGACCACTGCTTCCCGGACGACAATCCCTTGGACAGCT

ATCCATGGATTATCAACACGCATTGTGGTCACAATTTGTTGAGTGTATTCTATGCCGGATCCG

ACTTCGAATTCCCATACGATATGGAGACTGGGCTACGTGTTCCGGCTTTGAAGGAGAACCTA

TACAGGCCCGCTTGA

本发明还提供了包含上述角蛋白酶基因VKER的重组载体，优选为VKER-pPICzαA。将本发明的角蛋白酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将本发明的角蛋白酶基因插入到质粒pPICzaA上的EcoR I和NotI限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控，得到重组表达质粒VKER-pPICzαA。

本发明还提供了包含上述角蛋白酶基因VKER的重组菌株，优选重组菌株是毕赤酵母菌株X33。

本发明还提供了一种高密度液体发酵法生产上述角蛋白酶的方法，包括以下步骤：

1）用上述的重组载体转化毕赤酵母感受态细胞，得到重组菌株VKER-PIC-X33-18；

2）采用筛选获得的重组菌株在发酵罐中进行发酵，诱导重组角蛋白酶的表达；以及

3）发酵结束后，回收并纯化所表达的角蛋白酶。

其中，重组菌株在发酵罐中的发酵过程可分为3个阶段：第一阶段为菌体培养阶段，按10%比例接入种子，培养24-30小时，以补完葡萄糖为标志；第二阶段为饥饿阶段，当葡萄糖补完之后，不流加任何碳源，当溶氧上升至80%以上即表明该阶段结束，为期约30-60min；第三阶段为诱导表达阶段，流加诱导培养基，并且保持溶氧在20%以上，培养时间在180-200小时之间。

发酵结束后，发酵液通过陶瓷膜或超滤膜处理后获得粗酶液。利用本发明的方法高效表达上述的重组角蛋白酶，可达到20000U/mL以上的发酵水平，同目前已有的生产技术相比，本发明的角蛋白酶通过表达后能够达到较高的发酵水平，在工业生产中可大大降低生产成本，使其在饲料、皮革脱毛鞣制等工业中显示出更大的应用潜力。

附图说明

图1重组角蛋白酶在50L罐中的发酵过程曲线

图2重组角蛋白酶SDS-PAGE图谱

图3重组角蛋白酶的最适反应温度

图4重组角蛋白酶的最适反应pH值

图5重组角蛋白酶的耐热性能

图6重组角蛋白酶的pH稳定性能

具体实施方式

以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》（第三版）J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均从商业途径获得。

实验材料和试剂：

1、菌株与载体

大肠杆菌菌株Topl0、毕赤酵母X33、载体pPICzalphaA购自Invitrogen公司。黑曲霉（Aspergillus niger），该菌株于2010年11月5日保存于中国普通微生物菌种保藏中心（保藏中心地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所，邮编：100101），其保藏编号是：CGMCC No.4289，已在中国专利申请CN201010544083。

2、酶与试剂盒

逆转录酶SuperScript^TM III、RNA提取试剂盒购自Invitrogen公司。质粒DNA提取试剂盒，胶回收试剂盒，PCR纯化试剂盒购自上海生工公司。限制性内切酶购自Fermentas公司。

3、培养基

基本盐培养基：磷酸氢二铵5%、磷酸二氢钾0.5%、七水硫酸镁1.5%、硫酸钾1.95%、硫酸钙0.1%、氢氧化钾0.1%、消泡剂0.03%。高压后每升加4.35毫升PTM1

PTM1（微量盐溶液）：硫酸铜0.6%、碘化钾0.018%、一水硫酸锰0.3%、二水钼酸钠0.02%、硼酸0.002%、六水氯化钴0.05%、氯化锌2%、七水硫酸铁6.5%、浓硫酸0.5%、生物素0.02%

实施例1、黑曲霉（Aspergillus niger）角蛋白酶VKER基因的克隆

培养黑曲霉（Aspergillus niger），其保藏号为：CGMCCNo.4289。运用RNA提取试剂盒，提取黑曲霉（Aspergillus niger）总RNA，按照逆转录酶SuperScript^TMIII Reverse Transcriptase操作说明合成第一链cDNA。以cDNA为模板，设计角蛋白酶引物（KER5EcoRI，KER3NotI）进行PCR扩增，将PCR产物由EcoRI和NotI进行双酶切，然后与经过同样酶切的毕赤酵母表达载体pPICzaA相连接，连接产物转化大肠杆菌Topl0感受态细胞，经抗生素Zeocin筛选后,获得阳性克隆。提取阳性克隆的质粒。送样到上海英骏生物公司测序，测序结果表明，所获得克隆DNA插入片段含有角蛋白酶基因完整的开放阅读框。该角蛋白酶基因VKER，全长1188bp（SEQID No.2），编码395个氨基酸（SEQ ID No.1）。得到的重组表达载体命名为VKER--pPICzαA。

扩增所用引物如下：

VKER 5EcoRI：

5’CGACGAATTCATGAAGCTCACCCTCCTACCGATTC3’

VKER 3NotI：

5’CCAGCGGCCGCTCAAGCGGGCCTGTATAGGTTCTCC 3’

实施例2、包含角蛋白酶基因VKER的毕赤酵母工程菌的构建

将PCR扩增获得的角蛋白酶基因VKER，采用EcoRI和NotI进行双酶切，重新连接到经相同双酶切的载体pPICzαA上，获得重组表达载体VKER--pPICzαA。然后采用SacI进行线性化，线性化后的重组载体电击转化毕赤酵母X33，电转化后涂布于YPD（Zeo+）平板上进行筛选，得到毕赤酵母重组菌株。

实施例3、角蛋白酶重组菌株的高效表达

将筛选获得的角蛋白酶重组菌株VKER-pPICZaA-X33-18进行高密度发酵培养。

配制20L基本盐培养基，在50L自动控制发酵罐中灭菌后，冷却至常温备用。用氨水和磷酸调节发酵液的pH值至4.6，通过调节转速和空气流量控制溶氧大于20%以上，发酵温度为30℃。整个发酵过程分3个阶段：第一阶段为菌体培养阶段，将重组菌VKER-pPICZaA-X33-18按照10%的接种量接种至发酵罐中，流加已灭菌的4L50%的葡萄糖，培养24-30小时，以补完葡萄糖为标志；第二阶段为饥饿阶段，当葡萄糖补完之后，不流加任何碳源，当溶氧上升至80%以上即表明该阶段结束，为期约30-60min；第三阶段为诱导表达阶段，流加诱导培养基，并且保持溶氧在20%以上，培养时间在180-200小时之间。发酵液可通过陶瓷膜或超滤膜处理后获得酶液。

在发酵过程中的不同时间点取样测定酶活，发酵过程中角蛋白酶的表达情况如图1所示，发酵196h的发酵液酶活为21050U/mL。

实施例4、重组角蛋白酶的活性分析

角蛋白酶活定义：每毫升酶液在规定条件下反应15分钟后OD值增加0.01为1个酶活单位。

具体测定方法如下：

①准确称取0.020g偶氮角蛋白（Azokeratin），溶解于3.2mL乳酸缓冲液（pH3.5），震荡混匀，在50℃水浴中预先预热2min；

②加入经适当稀释的酶液0.8mL，在40℃水浴中精确保温反应15min；

③加入10%三氯乙酸0.8mL，使酶反应终止；

④反应液于10000r/min下离心6min，并在450nm下测吸光值；

⑤反应时应加空白对照，空白对照操作方法同上，只是反应液中先加10%三氯乙酸0.8mL，再加酶液0.8mL。

实施例5、重组角蛋白酶的性质测定

1、角蛋白酶比活测定

将上述发酵液中的角蛋白酶通过离子交换柱（Q Sepharose^TM Fast Flow IonExchanger）纯化，采用改良型Bradford试剂盒（上海Sangon公司）测定蛋白浓度，得出该角蛋白酶的比活为2005U/mg。

2、角蛋白酶分子量测定

将经上述纯化后的蛋白液进行SDS－PAGE检测，以确定其分子量大小，电泳结果参见图2。

3、角蛋白酶的最适反应温度及pH测定

最适反应温度：将酶液稀释适当倍数，在不同温度(20~85℃)下反应，测定角蛋白酶的酶活。以最高酶活力为100%，其它温度下测得的酶活与之相比，即得到该温度下的相对酶活。最适反应温度曲线见图3。

最适反应pH：将稀释后的酶液，于不同pH(2.0~7.0)检测条件下，检测该角蛋白酶的酶活力，并采用最高酶活为100%，其他检测结果与之相比，即得到不同pH检测条件下的相对酶活。最适反应pH曲线见图4。

结果如图3和图4所示：该重组角蛋白酶的最适反应温度为50℃，最适反应pH为4.0。

4、角蛋白酶的耐热性能测定

将酶液稀释适当倍数，在不同温度(60~90℃)下处理酶液5、10、15、20、25、30min后，以未处理的酶活力为对照测定角蛋白酶的相对酶活。耐热性能曲线见图5。

结果显示该角蛋白酶的耐热性能良好，完全可达到饲料等行业用酶的要求。

5、角蛋白酶pH稳定性测定

将稀释后的酶液与不同pH的缓冲液混合，室温放置1h，以未处理的酶液为对照，测定角蛋白酶的相对酶活，结果如图6所示。

该角蛋白酶的最适pH为4.0，并且在pH2.0~8.0范围内相对酶活均可达到80%以上，说明该角蛋白酶的pH稳定性良好。

6、金属离子和EDTA对酶活力的影响

将含有1mM K⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Zn²⁺、Fe²⁺、Fe³⁺、Mn²⁺、Co²⁺、Cu²⁺和EDTA的溶液与稀释适当倍数的酶液混合，室温放置30min，以未处理的酶液为对照，结果如表1所示。

结果表明，Mg²⁺、Ca²⁺对该角蛋白酶有一定的激活作用，酶活性分别促进24％、28％；K⁺、EDTA对酶活性没有什么影响；其余金属离子Cr³⁺、Cu²⁺、Fe²⁺、Zn²⁺和Fe³⁺对酶活性均有不同程度的抑制作用；而SDS完全抑制了酶的活性。

表1金属离子和EDTA对重组角蛋白酶酶活力的影响

Claims (8)

1.一种角蛋白酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种角蛋白酶基因，其特征在于，编码权利要求1所述的角蛋白酶。

3.根据权利要求2所述角蛋白酶基因，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID NO.2所示。

4.包含权利要求2或3所述角蛋白酶基因的重组载体。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为VKER—pPICzαA，将权利要求2所述的角蛋白酶基因插入到质粒pPICzaA上的EcoRI和NotI限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控，得到重组表达质粒VKER-pPICzαA。

6.包含权利要求2或3所述角蛋白酶基因的重组菌株。

7.一种制备角蛋白酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）用权利要求4的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2）培养所述重组菌株；

3）分离纯化角蛋白酶。

8.权利要求1所述角蛋白酶用于水解角蛋白的应用。

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