CN103071021A

CN103071021A - 沙葱叶片黄酮类物质的提取方法

Info

Publication number: CN103071021A
Application number: CN2012104211093A
Authority: CN
Inventors: 杨忠仁; 庞杰; 张凤兰; 郝丽珍; 黄修梅
Original assignee: Inner Mongolia Agricultural University
Current assignee: Inner Mongolia Agricultural University
Priority date: 2012-10-24
Filing date: 2012-10-24
Publication date: 2013-05-01

Abstract

本发明公开了一种沙葱叶片黄酮类物质的提取方法，过程是取阴干沙葱叶片，用粉碎机粉碎，过筛子，放入热回流提取器中，加乙醇溶液浸泡，进行热回流提取，水浴锅加热，提取3-4h，结束后在三角瓶中加活性炭粉末，滤纸过滤，用旋转蒸发仪蒸干液体，即得沙葱粗黄酮干样。采用几种常规黄酮的提取方法，可以实现大规模的企业化生产；研究了不同温度下粗黄酮的抗氧化能力，为不同需求提供理论依据。

Description

沙葱叶片黄酮类物质的提取方法

技术领域

本发明涉及一种黄酮类物质的提取方法，特别指沙葱叶片黄酮类物质的提取方法。

背景技术

植物是生物活性化合物的巨大天然宝库，其产生的次生代谢产物超过400000种。其中黄酮类化合物是一种在植物界中广泛分布的酚类化合物。大量研究表明，黄酮类化合物具有清除自由基、抗氧化、抗突变、抗肿瘤、抗菌、抗病毒和调节免疫、防治血管硬化、降血糖等功能。现在对黄酮提取的研究主要集中在于芸香科、唇形科、豆科、伞形科、银杏科和菊科中。尽管很早就有葱属植物含黄酮成分的报道，但具体研究很少。目前仅从其中几种植物中分出少量的黄酮苷。张沐新等研究了分蘖葱头总黄酮的提取技术，结果显示分蘖葱头含黄酮类物质0.4261g/g。张泽英研究了大蒜黄酮提取工艺，大蒜含黄酮类物质3.76％，说明葱属植物也含有较高含量的黄酮类物质。

沙葱(Allium mongolicum Regel.)别名蒙古韭，广泛分布我国新疆东北部、青海北部、甘肃北部、宁夏北部、陕西北部、内蒙古和辽宁西部。生长在海拔800～2400m的荒漠、沙地或半干旱山坡。叶及花可食，地上部分可入蒙药，能健胃、消食、杀虫，主治消化不良、不思饮食、秃疮、青腿病等，各种牲畜均喜食，为一等饲用植物。沙葱做为一种具有药用价值的野生蔬菜，对其粗黄酮含量和抗氧化性进行研究，进一步完善黄酮类物质提取技术和不同方法提取的黄酮类物质的检测，为沙葱的进一步开发利用提供理论依据是很有意义的。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种沙葱叶片黄酮类物质的提取方法，这种提取方法进行试验条件的优化，为提取出的粗黄酮提取液进行体外模拟抗氧化能力检测。

本提取方法采用热回流提取技术提取沙葱叶片干粉黄酮，其技术简单，可以实行工厂化生产。并对最佳提取技术参数进行优化，具体技术参数有：样液比(1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40)；萃取提取时间(2h、2.5h、3h、3.5h、4h)；萃取的酒精浓度(20％、40％、60％、80％、100％)；萃取温度(50℃、60℃、70℃、80℃、90℃)。抗氧化性检测是进行黄酮粗提取液对·OH的清除作用和黄酮粗提取液清除活性氧自由基O₂·-的方法。

本发明要解决的技术问题由如下方案来实现：沙葱叶片黄酮类物质的提取方法，其特征是：阴干沙葱叶片用粉碎机粉碎，过20-30目筛子，放入热回流提取器中，每1g干粉加30～40ml的55％～65％的乙醇浸泡，水浴锅加热，进行热回流提取，温度50℃或90℃，提取3-4h，结束后在三角瓶中加1.5-3g活性炭粉末，混匀，滤纸过滤，用旋转蒸发仪蒸干液体，即得沙葱粗黄酮干样。

具体步骤如下：

1最适萃取条件的选择

采用正交设计，对最佳试验方法后进行试验条件的选择，对乙醇浓度、乙醇用量、时间、温度四个实验条件进行筛选，每种实验条件五个梯度，见表：

热回流提取结束后向提取溶液中加入1.5g活性炭粉末，混匀后滤纸过滤。旋转蒸发仪蒸干，然后用酒精定容到100ml。

2检测条件

参考大蒜黄酮检测方法，10ml提取的黄酮溶液，加入10％的NaNO2溶液1ml，摇匀后放置5min，加入10％的Al(NO₃)₃溶液1ml，摇匀后放置5min，再加入5％的NaOH溶液10ml，然后定容在25ml，在510nm下比色。以不加提取液作为空白试剂。

3标准曲线的绘制

准确称取干燥至恒重的芦丁标准品，用95％乙醇定容，配制成20mg/ml的标准应用液备用。准确吸取标准应用液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml分别置于25ml比色管中，同样按照上面的NaNO₂-Al(NO₃)₃-NaOH的步骤显色，15min后同样以不加标准应用液的试管作空白试剂，在最大特征吸收波长510nm处测定各个标样的吸光度。

4抗氧化性研究

提取的沙葱叶粗黄酮用旋转蒸发仪蒸干，用蒸馏水溶解至3μg/ml备用。

4.1黄酮对·OH的清除作用

参照Fenton反应的方法建立·OH自由基产生体系模型。取7支具塞试管，分别加入7.5mmol·L^-1邻二氮菲溶液1mL，pH7.4的PBS缓冲液3.8mL，充分混匀后再加7.5mmol·L^-1FeSO₄溶液1.5mL立即混匀。然后向其中5支试管分别加入一定量的黄酮溶液(每管加的体积不同)，混匀，另2支分别为损伤和未损伤管，均不加黄酮溶液，在损伤管中加0.01％H₂O₂1mL，未损伤管不加H₂O₂，最后用蒸馏水补至相同体积10mL，6支试管于37℃保温1h，测A536，计算·OH清除率。·OH清除率＝(A₂-A₁)/(A₀-A₁)

其中A₀为未损伤管的吸光度，A₁为损伤管的吸光度，A2为加黄酮溶液的吸光度。

4.2清除活性氧自由基O₂·-的方法

参照Beauchamp等的方法加以改进。5mL反应液中，核黄素的浓度为3×10^-6mol/L，甲硫氨酸浓度1×10^-2mol/L。在25℃，自然光照20min，核黄素即因光化反应产生O₂·-。然后在此体系中加入NBT，使浓度达到1×10^-4mol/L。光照核黄素产生的O₂·-能将NBT还原为蓝色的产物，以不光照的试液作校正，在560nm测得其吸光度为A，可表示O₂·-的含量。加入提取物后能清除O2·-来抑制NBT的还原，测得此时的吸光度为A₁，A-A₁表示O₂·-的减少量，则清除率可计算为：

本发明具有以下优点：采用几种常规黄酮的提取方法，可以实现大规模的企业化生产；研究了不同温度下粗黄酮的抗氧化能力，为不同需求提供理论依据。

现在对植物生物活性物质研究虽然较多，但是主要集中在芸香科、唇形科、豆科、伞形科、银杏科、菊科等，对于百合科和葱属植物研究虽然较早，但对于百合科和葱属植物黄酮的主要成分研究报道较少，本方法是以蒙古高原广泛分布的具有药用价值的优良牧草和优质野生蔬菜--沙葱为材料，进行沙葱叶片干粉的粗黄酮物质提取，为沙葱的进一步开发提供技术参考。

现在关于黄酮提取方法有水蒸气蒸馏法、超临界CO₂流体提取和有机溶剂提取。其他方法都是从这几种方法加以改进，其中有机溶剂提取法具有工艺简单、效率高和较经济等优点。实验采用的机溶剂一般有甲醇、乙醇等，参考文献对于甲醇和乙醇提取黄酮的对比，以及甲醇毒性较高，易残留，实验操作过程危险等原因，本实验采用乙醇为萃取的有机溶剂。本实验所采用的就是对有机溶剂萃取法加以改进的试验方法。采用一些辅助方法易促进有机溶剂萃取黄酮。

试验结果如下：

1标准曲线

如图2所示，用芦丁浓度和吸光度值做坐标，绘制标准曲线。浓度与吸光值关系：M＝2.5A-0.0643，结果表明，芦丁对照品浓度在20～100mg范围内与吸光度线性良好。

2最适实验条件的选择

表1正交试验结果

如表种R值显示，各因素对沙葱叶片黄酮提取的影响程度依次为酒精浓度＞时间＞样叶比＞温度，即酒精浓度对沙葱叶片干样黄酮的提取影响最大，提取时间次之，提取温度影响最小。由表中K值显不得知，提取的最佳组合为样叶比为1∶35，提取时间3.5h，酒精浓度为60％，提取温度50℃和90℃经发1∶35差异不显著，考虑到提取温度对提取的影响最小，从节能的角度考虑最佳提取温度为50℃。

3沙葱叶片提取的粗黄酮抗氧化性研究

3.1黄酮对羟自由基(·OH)的清除作用

如图3所示，在所选用量范围内，50℃和90℃提取的沙葱黄酮对H₂O₂/Fe²⁺体系通过Fenton反应产生的OH具有清除作用，且随着黄酮溶液用量的增加清除率上升，说明清除率与黄酮的用量存在着一定的量效关系。

4.2黄酮对活性氧自由基(O₂·-)的清除作用

如图4所示，不同提取温度下沙葱叶片黄酮提取液对活性氧自由基的清除作用差异明显，90℃下提取的黄酮对活性氧自由基清除率随着用量增加变化不大，而50℃下提取的黄酮在低用量(1ml到3ml)下基本没变化，用量在3ml和5ml时有一个跃迁的过程，5ml到7ml差异不大，7ml到9ml增幅明显。

附图说明

图1是提取沙葱粗黄酮的工艺流程图。

图2标准曲线。

图3沙葱叶黄酮对·OH的清除曲线。

图4沙葱叶黄酮对O₂·-的清除曲线。

具体实施方法

取沙葱叶片，阴干，二十目筛子粉碎。用60％的乙醇以样叶比为1∶35浸泡，在50℃或90℃(根据不同需求选择)提取3.5h，加活性炭粉末，过滤，用旋转蒸发仪蒸干液体，即得沙葱粗黄酮干样，可进一步进行开发。

Claims

1.沙葱叶片黄酮类物质的提取方法，其特征是：阴干沙葱叶片用粉碎机粉碎，过20-30目筛子，放入热回流提取器中，每1g干粉加30～40ml的55％～65％的乙醇浸泡，水浴锅加热，进行热回流提取，温度50℃或90℃，提取3-4h，结束后在三角瓶中加1.5-3g活性炭粉末，混匀，滤纸过滤，用旋转蒸发仪蒸干液体，即得沙葱粗黄酮干样。