CN103070858B - 苯骈α-吡喃酮类化合物作为抗γ型人类疱疹病毒药物的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了苯骈α-吡喃酮类化合物在制备抗γ型人类疱疹病毒药物上的应用。它们作为抗γ型人类疱疹病毒感染的化合物，与上市药物新生霉素（novobiocin）相比，表现出更高的活性；细胞毒性测试表明该类化合物具有很小的毒性。此类化合物可用于治疗或预防由KSHV感染引起的相关疾病。

Description

苯骈α-吡喃酮类化合物作为抗γ型人类疱疹病毒药物的应用

技术领域

本发明属于生物制药领域，具体涉及一类苯骈α-吡喃酮类化合物，包括此类化合物和其组合物，以及所述化合物和组合物在治疗γ型人类疱疹病毒感染相关疾病中的应用，所述γ型人类疱疹病毒主要指卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒和Epstein-Barr病毒。

技术背景

卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒（Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus,KSHV）又名人类8型疱疹病毒（Human herpesvirus type8，HHV-8），属γ型人类疱疹病毒。KSHV最早是由美国哥伦比亚大学病理学家Chang等于1994年用代表性差异分析法在卡波西氏肉瘤（Kaposi's sarcoma,KS）患者的肉瘤组织中发现。流行病学研究证实KSHV感染是多种恶性疾病的致病因素，其中卡波西氏肉瘤和原发性渗出性淋巴瘤（primary effusion lymphoma,PEL）的发病均与KSHV感染直接相关，此外多中心卡斯特莱曼病（Multicentric Castlemandisease,MCD）50%以上患者的血清中呈KSHV感染阳性。研究证实，在自身免疫系统受到抑制的AIDS患者和器官移植患者中，KSHV的感染几率及相关疾病的发病几率明显增高，且病程发展速度与致命性均明显提高，其中卡波西氏肉瘤是目前致死率最高的AIDS并发症。Epstein-Barr病毒（Epstein-Barr virus,EBV）又名人类4型疱疹病毒（Humanherpesvirus4,HHV-4），与KSHV同属γ型人类疱疹病毒。EBV是由Epstein和Barr于1964年首次从Burkitt非洲儿童淋巴瘤细胞中分离观察发现。EBV在人群中的感染率极高，我国3至5岁儿童EB病毒vca-lgG抗体阳性率达90%以上。EBV主要感染人类口咽部的B淋巴细胞和上皮细胞，被感染细胞可产生形态变化和恶性增殖等变化，并表达多种EBV病毒基因，改变细胞正常生理状态，引起患者致病。与EBV感染相关的疾病主要有移植后淋巴细胞增殖症、传染性单核细胞增多症、非洲儿童淋巴瘤和鼻咽癌等。虽然已证实KSHV感染与EBV感染可引发上述多种恶性疾病，但目前仍然缺少针对γ型人类疱疹病毒感染的特效药物问世。尽管现有的嘌呤核苷类似物类药物如阿昔洛韦（Acyclovir）及其衍生药物对α和β亚型疱疹病毒感染均有较理想的抑制效果，但SusanE.Krown等在其2011年的临床研究中证实阿昔洛韦类药物对治疗KSHV感染相关疾病并无明显效果(Krown et al.,2011.J.Infect Dis.203:1082-6)。因此目前医药界迫切的需求一种针对KSHV感染的特效药物问世，以改善γ型人类疱疹病毒相关恶性疾病的治疗效果。

γ型人类疱疹病毒感染宿主细胞后存在两种不同的生命周期，即潜伏复制期和裂解复制期。其中潜伏复制期的被感染细胞不裂解，不向胞外释放具有感染活性的病毒颗粒；但裂解复制期的被感染细胞可在胞内包装大量活性病毒颗粒，并随着细胞的裂解将病毒颗粒释放到胞外以扩大感染范围。有研究证实，缺少裂解复制，KSHV无法在宿主体内建立稳定的潜伏感染(Grundhoff and Ganem,2004.J.Clin.Invest.113:124-136)。可见裂解复制在γ型人类疱疹病毒相关疾病发病、持续与病程进展中起着决定性的作用。因此以γ型人类疱疹病毒的裂解复制为用药靶点是抗γ型人类疱疹病毒药物研发的理想方向。

发明内容

本发明是以人类II型拓扑异构酶的ATP结合位点为药物设计靶点，通过计算机辅助药物筛选获得一系列化合物可能具有人类II型拓扑异构酶抑制活性的化合物。在细胞水平对筛选获得的化合物进行抗KSHV裂解复制抑制实验，发现其中一类新型苯骈α-吡喃酮类化合物可以有效抑制KSHV的裂解复制，且只有很低的细胞毒性。此后在同属γ型人类疱疹病毒的EBV病毒上对此类化合物进行细胞实验，证实此类化合物对EBV裂解复制同样具有抑制作用，并保持较低毒性。通过拓扑酶功能抑制实验证实其中部分化合物明确具有人类拓扑异构酶II抑制剂活性。此类苯骈α-吡喃酮类化合物可用于治疗或预防KSHV感染引起的相关疾病，如经典型卡波西氏肉瘤（Classic-KS）、艾滋病相关型卡波西氏肉瘤（AIDS-KS）、器官移植相关型卡波西氏肉瘤（post-transplant KS）、原发性渗出性淋巴瘤，卡斯特莱曼病等，同时亦有望用于治疗或预防EBV感染引起的传染性单核细胞增多症、非洲儿童淋巴瘤和鼻咽癌的疾病。

本发明提供一种苯骈α-吡喃酮类化合物（结构式如式I）或与他的药学组合物制剂用于治疗γ型人类疱疹病毒感染相关疾病的药物。

式I：苯骈α-吡喃酮类化合物

式1中R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆所代表的基团如以下各项所述：

(1)其中，R₁为氢、烷基，R₂为氢、甲基、羟基，R₃为氢、烷氧基，R₄为氢、羟基、烷基、烷氧基、糖苷，R₅为氢、羟基、烷基、烷氧基、氨基、取代的氨基、糖苷；R₆为氢、羟基、烷基、烷氧基。R₁与R₂可选的形成环，优选为环戊醚基、取代的环戊醚基；R₄与R₅可形成环，优选为环戊烯醚基、取代的环戊烯醚基；R₅与R₆可形成环，优选为环戊醚基、取代的环戊烯醚基。

(2)根据（1）所述的用途，其中，R1为氢、C1-C6的烷基，R2为氢、甲基、羟基，R3为氢、C1-C6烷氧基，R4为氢、羟基、C1-C6的烷基、C1-C6烷氧基，R5为氢、羟基、烷基、C1-C6的烷基、C1-C6烷氧基、氨基、糖苷，R6为氢、羟基、C1-C6的烷基、C1-C6烷氧基。

(3)根据（1）所述的用途，其中，R1与R2形成环；或R4与R5形成环；或R5与R6形成环；或R1与R2、R4与R5、R5与R6均形成环。

(4)根据（3）所述的用途，其中，R1与R2形成的环为环戊醚基或取代的环戊醚基；R4与R5形成的环为环戊烯醚基或取代的环戊烯醚基；R5与R6形成的环为环戊醚基或取代的环戊烯醚基。

术语“烷基”是用于表示饱和烃基，C1-C6的烷基是指含有1-6个碳原子的饱和烃基。

上述化合物药学上可接受的盐类或酯类，在抗γ型人类疱疹病毒药物上的应用，也同样属于本发明的保护范畴。所述的盐为与酸或碱形成的药学上可接受的盐。

同时，发明提供了化合物与药学上可接受的载体和/或赋形剂所构成的组合物在制备治疗和/或预防由γ型人类疱疹病毒感染引起的相关疾病的药物中的用途。

同时，发明提供了抗γ型人类疱疹病毒感染的药物组合物，其中含有有效剂量的权利要求1所述的化合物。

本发明以人类II型拓扑异构酶为靶点，结合口袋位于ATP结合位，通过药物筛选实验，获得人类II型拓扑异构酶抑制剂活性的化合物。对筛选获得的化合物进行细胞水平的抗KSHV裂解复制活性检测，发现其中7个化合物(C18、C19、C28、C30、C33、C34、C35)具有抗KSHV裂解复制活性。对上述7个化合物在细胞水平检测抗EBV裂解复制活性，发现其同样具有EBV裂解复制抑制活性。对这7个化合物进行结构分析，发现其均属苯骈α-吡喃酮类化合物，结构通式见式I。

本发明通过在细胞水平对上述化合物进行γ型人类疱疹病毒裂解复制抑制实验、细胞毒性实验和细胞增殖力影响实验，确定7个化合物(C18、C19、C28、C30、C33、C34、C35)均有明显抑制γ型人类疱疹病毒裂解型DNA复制的活性，实验方法如下：使用TPA和丁酸钠诱导BCBL-1细胞或HR-1细胞，使细胞内原处于潜伏复制期的KHSV或EBV进入裂解复制期。细胞经过TPA和丁酸钠诱导处理3小时后对细胞给予20μM不同药物处理并设置无药物处理空白对照组。细胞诱导处理48小时后，提取细胞总DNA，使用实时定量PCR分别检测KSHV标志基因LANA或EBV标志基因EBNA1和内参GAPDH的拷贝数。使用如下公式计算各药物20μM浓度下对KSHV或EBV裂解复制的抑制率：KSHV裂解复制抑制率=（LANA/GAPDH_{TPA+&compound+}－LANA/GAPDH_{TPA-&compound+}）/（LANA/GAPDH_{TPA+&compound-}－LANA/GAPDH_{TPA-&compound-}）；EBV裂解复制抑制率=（EBNA1/GAPDH_{TPA+&compound+}－EBNA1GAPDH_{TPA-&compound+}）/（EBNA1/GAPDH_{TPA+&compound-}－EBNA1/GAPDH_{TPA-&compound-}）。化合物具体结构式及其抑制活性结果见表1。

表1药物筛选获得7个化合物结构及其抗KSHV和EBV裂解复制活性数据

其中，C28和C33抑制KSHV裂解复制活性最高并且细胞毒性低。C28和C33的KSHV裂解复制半数抑制剂量（IC₅₀）分别为14.71μM和1.12μM，KSHV产毒半数抑制剂量（EC₅₀）分别为16.91μM和1.62μM，BCBL-1细胞半致死剂量（CC₅₀）分别为98.76μM和79.73μM，选择抑制常数（SI）分别为6.71和71.18（图1，表2）。

细胞毒性实验证实C28和C33对BCBL-1细胞在各自的IC₅₀浓度以下均无细胞毒性（图2）。

本发明通过KSHV裂解复制起始位点依赖型复制水平实验，证实C28和C33可有效抑制KSHV裂解复制起始位点依赖型DNA复制（图3）。

本发明通过人类拓扑异构酶II酶学实验证实C33为人类拓扑异构酶抑制剂（图4）。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1.所述化合物对KSHV的裂解复制具有高抑制活性；

2.所述化合物毒性较小；

3.所述化合物结构简单、易合成；

4.所述化合物作用靶标部分明确。

基于本发明的研究结果，本发明所述的化合物将在以下方面具有良好的应用前景：

1.鉴于本发明所述化合物的高效抑制KSHV裂解复制活性，因此所述化合物可用于治疗典型性卡波西氏肉瘤（Classic-KS）。Grundhoff等的研究工作中报道，KSHV的裂解复制是Classic-KS维持的重要条件，抑制KSHV的裂解复制可引起KS肉瘤的萎缩和消失(Grundhoff and Ganem,2004.J. Clin.Invest.113:124-136)。

2.鉴于本发明所述化合物可有效抑制KSHV裂解复制，因此本发明所述化合物可用于治疗艾滋病相关型卡波西氏肉瘤（AIDS-KS）。研究证实，共感染HIV和KSHV比单纯感染KSHV具有更高的KS发病几率，且病程进展迅速，致死率也明显增高。目前AIDS-KS已成为AIDS患者最主要的致死性并发症。临床上对于AIDS及AIDS-KS的治疗常采用HAART疗法，虽然HARRT疗法能有效降低病人体内HIV拷贝数，并可提高病人的免疫力，一定程度上降低了AIDS-KS的发病率，但HAART疗法治疗AIDS-KS仍然存在一些问题。首先，HAART是通过抑制HIV从而治疗AIDS-KS，但KS的直接致病因素是KSHV，目前仍无报道证实HAART疗法对KSHV有直接作用。其次，部分AIDS患者在接受HAART治疗的最初阶段由于体内CD4⁺T细胞数增高常会引起免疫重建炎症综合征（Immune reconstitution inflammatory syndrome,IRIS），许多患者会在此阶段表现出卡波西氏肉瘤的快速发病(Connick et al.,2004.Clin Infect Dis.39:1852-5)。可见HAART对于治疗AIDS-KS还显不足。本专利中所述化合物与HAART疗法共同用药治疗AIDS-KS可作为更有效的疗法。

3.鉴于本发明所述化合物可有效抑制KSHV裂解复制，因此本发明所述化合物可用于治疗器官移植患者接受免疫抑制治疗后发生的KS。器官移植患者为了减少自身免疫系统对外源器官的排斥作用，常需进行免疫抑制治疗。但在使用免疫抑制剂后，部分患者出现器官移植后肿瘤，包括的器官移植后KS。对于这种情况，患者不得不停止免疫抑制治疗，承受失去移植的器官的可能性。本发明所述化合物可有效抑制KSHV的裂解复制，当与免疫抑制剂联合使用时，可减少器官移植后KS的发病或使已发病的KS消退。

4.鉴于本发明所述化合物可有效抑制EBV裂解复制，因此本发明所述化合物可用于治疗或预防EBV诱发的移植后淋巴细胞增殖症。EBV诱发的移植后淋巴细胞增殖症描述的是一种实体器官移植后EBV感染相关的淋巴细胞增生性疾病。有研究报道移植后淋巴细胞增殖症发病率为0.8%-20%，发病率与器官移植种类，接受器官移植病人的年龄移植免疫抑制的种类有关，移植后淋巴细胞增殖症致死率可达50%-80%。绝大多数移植后淋巴细胞增殖症病例是从患者的B淋巴细胞发展，其中部分是由于使用免疫抑制，EBV过度裂解复制所造成的(Transplantation.1999.Nov27;68(10):1517-25)。由于目前对移植后淋巴细胞增殖症缺少统一的定义，因此治疗移植后淋巴细胞增殖症尚缺乏清晰的共识。移植后淋巴细胞增殖症的治疗目前主要包括：减少免疫抑制、化疗、生物学和抗B细胞单克隆抗体以及以细胞为基础的治疗等方式。然而这些方法的效果都不尽如人意。鉴于EBV感染在移植后淋巴细胞增殖症中的致病作用，因此抗EBV的药物尤其是抗EBV裂解复制药物对移植后淋巴细胞增殖症的预防和治疗应具有理想的效果。

5.鉴于本发明所述化合物可有效抑制EBV裂解复制，因此本发明所述化合物可用于治疗传染性单核细胞增多症。EB病毒在世界范围内有90%以上的感染率，但首次感染普遍发生在较小的年龄段，若首次感染发生在6岁以前，则感染可能仅带来轻微反应，但如果感染发生在15岁左右时，则有较高几率引发传染性单核细胞增多症，致病原因目前尚未完全清楚。传染性单核细胞增多症病程一般可长达6个月，极端者可持续1至2年，患者表现为乏力、头痛、纳差、恶心、稀便、畏寒等症状，对青少年正常学习生活带来巨大影响。由于卫生条件的不断改善，目前EBV首次感染时间有推后的迹象，传染性单核细胞增多症的发病率也随之升高。但是目前对于该病仍缺少有效地治疗手段，常用的治疗方式为对症治疗，如高热病人酌情补液，休克者给予补充血容量及血管活性药物治疗，出血者给予止血药物；脑水肿者给予甘露醇脱水，急性期特别是并发肝炎时应卧床休息等，但均非针对直接致病因素EBV感染治疗，对缩短病程没有明显帮助。本发明所述化合物对于EBV裂解复制可高效抑制，或有望在治疗传染性单核细胞增多症中发挥疗效，降低其发病率。更重要的是，降低青春期传染性单核细胞增多症的发生，能减少成年后EBV相关肿瘤如鼻咽癌的发病几率（SciTransl Med.2011Nov2;3(107):107fs7）。

附图说明

图1为C28和C33抑制KSHV裂解复制活性及细胞毒性曲线图。

图2为C28和C33对BCBL-1细胞增殖抑制的作用。

图3为C33抑制KSHV依赖型病毒DNA复制的活性。

图4为C33抑制人类II型拓扑异构酶α的活性。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。

实施例1：虚拟筛选化合物

1.化合物库预处理：虚拟筛选化合物库为自备化合物数据库。化合物库作如下处理：去除离子及络合水分子、加电荷、质子化、产生三维构象。这些流程均在药物设计软件包Discovery Studio2.5中完成。其中质子化在pH6.5-8.5条件下进行。准备好的小分子库用于虚拟筛选。

2.以基于苯骈α-吡喃酮结构进行子结构匹配的数据库搜寻，找出含有该母核的化合物。最终7个化合物（C18,C19,C28,C30,C33,C34,C35）被选取做细胞学实验，化合物化学结构见表1。

实施例2：KSHV裂解复制抑制活性测定

1.细胞培养。体外培养BCBL-1细胞（原发性渗出性淋巴瘤细胞系，含有潜伏感染期KSHV）。使用含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基，在37℃，5%二氧化碳浓度条件下进行常规维持培养和传代。

2.药物干预。调整对数生长期BCBL-1细胞密度为3×10⁵cells/ml，使用20ng/mlTetradecanoyl phorbol acetate(TPA)诱导BCBL-1细胞进入裂解复制期。使用DMSO将待测化合物配置为不同浓度的药物溶液。BCBL-1细胞经TPA处理3小时后，对细胞进行不同浓度的化合物（上述7个化合物）处理，每个浓度设3个平行复孔，并设不进行TPA诱导和不经化合物处理的对照组进行比较。

3.测试方法。BCBL-1细胞经TPA诱导2天后收集细胞，提取细胞总DNA。应用实时定量PCR技术，使用LightCycler FastStart DNA MasterPlus SYBR green试剂盒、LANA引物和GAPDH引物（引物序列需要放在说明书最后，单独成页，并提交光盘形式的序列格式，下同）分别检测上述细胞总DNA中LANA和GAPDH的拷贝数，并计算LANA/GAPDH的相对比值。

4.结果处理。按照公式：KSHV裂解复制相对抑制数=（LANA/GAPDH_{TPA+&compound+}－LANA/GAPDH_{TPA-&compound+}）/（LANA/GAPDH_{TPA+&compound-}－LANA/GAPDH_{TPA-&compound-}）计算各化合物在不同浓度下的KSHV裂解复制相对抑制数。以KSHV相对抑制数为纵坐标，药物浓度为横坐标绘制各化合物对KSHV裂解复制的抑制曲线图，并计算各药物的复制半数抑制剂量（IC₅₀）以评价各化合物对KSHV裂解复制的抑制活性。如图1、表2所示，化合物C28和C33的IC₅₀分别为14.71μM和1.12μM，说明C28和C33能有效抑制KHSV的裂解复制。

表2C28和C33抑制KSHV裂解复制活性及细胞毒性

实施例3抑制KSHV病毒颗粒释放实验

1.细胞培养。体外培养BCBL-1细胞。使用含有10%胎牛血清，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素的RPMI1640培养基，在37℃，5%二氧化碳浓度条件下进行常规维持培养和传代。

2.药物干预。调整对数生长期BCBL-1细胞密度为3×10⁵cells/ml，使用20ng/ml TPA诱导BCBL-1细胞进入裂解复制期。使用DMSO将待测化合物配置为不同浓度溶液。BCBL-1细胞经TPA处理3小时后，对细胞进行不同浓度的化合物（上述7个化合物）处理，每个浓度设3个平行复孔，并设不经化合物处理以及不进行TPA诱导的对照组进行比较。

3.测试方法。细胞经TPA诱导处理5天后，收集细胞培养液1,000rpm离心5min，弃除细胞沉淀。上清再次100,000g离心1h，弃除上清，使用200ul PBS重悬病毒颗粒。使用DNase I在37℃处理浓缩病毒液1小时，去除病毒颗粒外的杂质DNA分子。随后使用细胞裂解液和蛋白酶K处理病毒浓缩液，并用酚氯仿法抽提KSHV病毒DNA。提取得到的病毒DNA经冰乙醇沉淀后，最终使用50ul TE缓冲液溶解。应用实时定量PCR技术，使用LightCycler FastStart DNA Master^Plus SYBR green试剂盒、LANA引物检测细胞培养液上清中的KSHV DNA拷贝数，以评价KSHV产毒水平。

4.结果处理。按照公式：KSHV产毒相对抑制数=（LANA_{TPA+&compound+}－LANA_{TPA+&compound-}）/（LANA_{TPA+&compound-}－LANA_{TPA-&compound-}）计算各化合物不同浓度下的KSHV产毒相对抑制数。以KSHV产毒相对抑制数为纵坐标，药物浓度为横坐标绘制各化合物对KSHV产毒的抑制曲线图，并计算各化合物对KSHV的产毒半数抑制剂量（EC₅₀）以评价各化合物对KSHV产毒的抑制活性。如图1、表2所示，化合物C28和C33的EC₅₀分别为16.91μM和1.62μM，说明C28和C33能有效抑制KSHV产生病毒颗粒，即说明能有效抑制KSHV裂解复制。

实施例4对宿主细胞毒性测试

1.细胞培养。体外培养BCBL-1细胞。使用含有10%胎牛血清，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素的RPMI1640培养基，在37℃，5%二氧化碳浓度条件下进行常规维持培养和传代。

2.测试方法。调整BCBL-1细胞密度为3×10⁵cells/ml，使用不同浓度各化合物处理细胞，每个浓度设3个平行复孔，2天后使用台盼蓝染色，光镜下计数活细胞数。

3.结果处理。按照公式：相对毒性=1－live cell_compound+/live cell_compound-计算各化合物不同浓度下的相对毒性和半数致死剂量（CC₅₀），用于评价各化合物的细胞毒性。另按照公式：选择抑制常数(SI)=CC₅₀/IC₅₀计算各化合物的选择抑制常数，以评价各化合物的用药安全性。如图1、表2所示，化合物C28和C33的SI分别为6.71和71.18，说明C28和C33对于KSHV的裂解复制抑制活性具有很高的选择性，药用安全性很高，有很高的成药性。

实施例5对细胞增殖力的影响

1.细胞培养。体外培养BCBL-1，均使用含有10%胎牛血清，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素的RPMI1640培养基，在37℃，5%二氧化碳浓度条件下进行常规维持培养和传代。

2.测试方法。调整BCBL-1细胞密度为3×10⁵cells/ml，IC₅₀和5×IC₅₀浓度各化合物处理细胞，每个浓度设3个平行复孔，正常传代培养，每天计数活细胞数，连续记录5天。

3.结果处理。结合传代稀释倍数将上述细胞计数数据换算为总活细胞数，以总活细胞数为纵坐标，时间为横坐标作图，分别获得对各化合物IC₅₀和5×IC₅₀浓度下的细胞增殖抑制曲线，如图2所示，IC₅₀浓度下C28和C33均对细胞增殖无明显抑制作用。

实施例6ori-Lyt依赖型病毒DNA复制检测

1.细胞培养。体外培养BCBL-1细胞。使用含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基，在37℃，5%二氧化碳浓度条件下进行常规维持培养和传代。

2.测试方法。使用pOri-A和pCR3.1-ORF50共转染BCBL-1，其中pOri-A是将KSHV基因组22409-26491位的裂解复制起始位点序列克隆至pBluescript构建得到，pCR3.1-ORF50是将KSHV的ORF50基因克隆至pCR3.1得到。转染完成后细胞使用含有不同浓度各化合物的培养基培养72小时，使用Hirt DNA提取法提取细胞非染色质DNA。5μg上述所提DNA经KpnI/SacI或KpnI/SacI/DpnI限制性内切酶酶切后进行琼脂糖电泳分离，分离后转移至GeneScreen膜上，使用³²P标记的探针进行southern blot检测ori-Lyt依赖型复制的水平，已评价各化合物抑制ori-Lyt依赖型复制的能力。结果如图3所示,C33能有效抑制KSHV ori-Lyt依赖型病毒DNA复制。

实施例7TopoisomeraseII抑制实验

使用DMSO配置不同浓度各化合物溶液。20μl反应体系中，控制条件如下，50mM Tris-HCl,85mM KCl,10mM MgCl2,0.5mM Na2EDTA,1mM ATP,30μg/ml BSA,pH7.5。加入kDNA反应底物200ng，加入Topoisomerase II2units，加入不同浓度待测化合物，37℃反应30分钟。反应完成后加入stop buffer，进行琼脂糖凝胶电泳成像，以评价各化合物对Topoisomerase II的抑制活性。结果如图4所示，C33能有效抑制Topoisomerase II的活性。

Claims (5)

1.苯骈α-吡喃酮类化合物及其药学上可接受的盐类在制备抗γ型人类疱疹病毒药物中的应用，所述化合物为以下中的一种：

。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述的化合物为

或。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述的盐为与酸或碱形成的药学上可接受的盐。

4.苯骈α-吡喃酮类化合物与药学上可接受的载体和/或赋形剂所构成的组合物在制备治疗和/或预防由γ型人类疱疹病毒感染引起的相关疾病的药物中的用途，所述化合物为以下中的一种：

。

5.如权利要求1或4所述的应用，其特征在于所述的γ型人类疱疹病毒为卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒或Epstein-Barr病毒。