CN103060308A - 一种通过染色体加倍诱变和筛选小球藻高产新种质的方法 - Google Patents

一种通过染色体加倍诱变和筛选小球藻高产新种质的方法 Download PDF

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蒋立科
卢文轩
杨坤
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Abstract

本发明公开一种通过染色体加倍诱变和筛选小球藻高产新种质的方法，主要步骤包括：对液体原藻种进行诱变前的活化培养，配制小球藻诱变剂梯度浓度培养液进行诱变处理，对诱变处理后的小球藻在培养液中进行恢复培养和初筛，然后将初筛获得的小球藻转接到固体分离培养基进行分离培养，筛选优势突变藻株并进行连续多代的纯化培养，检测其生长性能。本发明筛选的小球藻优势突变藻株发酵培养液应用于淡水养殖水体，可提高水质净化效果，并能提高滤食性鱼类及鱼苗的产量。

Description

一种通过染色体加倍诱变和筛选小球藻高产新种质的方法
技术领域
本项发明涉及一种通过染色体加倍诱变和筛选小球藻高产新种质的方法，适用于淡水养殖池塘水质净化和渔业增产。
背景技术
池塘集约化养殖模式下，大量投喂配合饲料，其中的氮磷仅有9.1% 和17. 4%被鱼类同化，残留饲料和鱼类排泄物形成水体污染物，危害水生动物生长发育，诱发多种疫病，造成水产品质量下降。如何净化和回用养殖废水已成为制约渔业经济发展的技术瓶颈。
利用小球藻等微藻处理水产养殖废水，一方面可以净化污水，另一方面可以获得有价值的藻类，促进养殖业的可持续发展。蛋白核小球藻（Chlozella pyrenoidosa）粉粗蛋白含量63%，不仅是一种高效的污水处理物种，也是一种优良的生物饵料资源。Domenico等利用小球藻在光暗循环为14∶10的条件下处理模拟氨氮废水，发现氮的去除过程主要发生在有光的时段。小球藻去除水体污染物效果的好坏取决于其光合活性，并受控于氮、磷初始浓度、水温、光强、进水负荷、停留时间等一系列基本参数。虽然小球藻在处理水产养殖废水中显示了其优越性并取得了很大进展，但仍然存在一些问题有待解决。其中，选育和改良具有高效净化能力、营养价值高的新型小球藻藻种是重要的研发方向。
发明内容
本发明旨在提供一种淡水小球藻诱变培育方法，该方法可有效地诱变培育出水质净化能力强的小球藻高产优势藻株。
为实现上述目的，本发明提供的一种淡水小球藻诱变培育方法包括以下步骤：
（1）前培养：吸取1ml液体原藻种接种到含30ml HB-4液体培养基的三角瓶中进行诱变前的活化培养,无菌操作，于27℃±1 ℃、 光照强度30001ux、光照周期为12h∶12h条件下光照培养至对数生长期备用。
（2）诱变处理：在HB-4培养液中添加不同浓度秋水仙碱，制成0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06% 6个浓度梯度的小球藻诱变培养液，接种原藻种后于温度27℃±1 ℃、140r/min、光照强度3000lux、光照周期12h∶12h条件下，分别培养6 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、84 h、96 h、120h进行诱变处理。
（3）初筛和恢复培养：每一时间水平诱变结束后，离心分离经诱变的藻细胞，接种到HB-4液体培养基，于27℃±1 ℃、140～170r/min、光照强度30001ux，光照周期为12h∶12h、通气条件下进行恢复培养，每隔6h测定OD530nm值，以OD530nm峰值出现最早和峰值最大的实验组为优势突变组。
（4）复筛和纯化培养：运用涂布平板法，将将初筛获得的小球藻转接到HB-5固体分离培养基上进行分离培养，挑选色泽浓绿、半径大的藻株群落，获得优势突变型小球藻纯藻株，转接到试管内HB-4固体斜面培养基上纯化培养。
（5）性能检测：经分离筛选的藻株进行下面各项指标的检测：
①小球藻核及叶绿体DNA含量检测；
②小球藻叶绿素含量检测；
③小球藻稳定期藻细胞浓度测定；
④小球藻胞内可溶性蛋白质含量鉴定；
⑤小球藻水质净化效能鉴定。
附图说明
以上给出了本发明的一种通过染色体加倍诱变和筛选创造小球藻高产新种质的方法，下面以具体实施方式并结合附图对本发明作详细描述。
图1 小球藻核及叶绿体DNA的流式细胞仪测定结果。
具体实施方式
（1）前培养：吸取1ml液体原藻种接种到含30ml HB-4（配方见表1和表3）液体培养基的三角瓶中进行诱变前的活化培养，无菌操作，于27℃±1 ℃、光照强度30001ux、光照周期为12h∶12h条件下培养至对数生长期备用。
表1 HB-4配方
Figure 514080DEST_PATH_IMAGE002
    
表2 HB-5配方
Figure 634483DEST_PATH_IMAGE004
表3 A5配方
Figure 945379DEST_PATH_IMAGE006
 
（2）诱变处理：称取0.10g秋水仙碱于50mL烧杯中，用10mL无菌水溶解，转入100mL容量瓶中，用无菌水定容至刻度，经摇匀制得秋水仙碱溶液。
秋水仙碱结构简式： 
Figure 2013100111160100002DEST_PATH_IMAGE007
在HB-4培养液中添加不同量秋水仙碱溶液，制成0、0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06% 7个浓度梯度的小球藻诱变培养液。以无诱变剂组为对照，设计7个因素10个水平的正交试验，观察并检测各因素对藻株生长的影响和可能发生的协同作用（表4），每个因素的每个水平设计3个平行试验项。接种原藻种后于温度27℃±1 ℃、140r/min、光照强度3000lux、光照周期12h∶12h条件下，进行诱变处理。
表4 小球藻诱变处理正交试验设计表
Figure 527539DEST_PATH_IMAGE008
（3）初筛和恢复培养：每一时间水平诱变结束后，将试管中液体转移至离心管中，于3500r/min离心30min并用无菌水洗涤3次，前2次上清液倒去2/3，最后一次上清液全部弃去，沉淀转移至试管，加1ml无菌蒸馏水，搅拌摇匀，用移液枪取0.1ml于装有20~30ml HB-4培养液的锥形瓶中进行再培养。培养条件为：27℃±1 ℃、140～170r/min、光照强度30001ux、光照周期为12h∶12h、通气。培养过程中，每隔6h测定OD530nm值，进行方差分析，比较行列最后结果，以OD530nm峰值出现最早和峰值最大的实验组为优势突变组。
（4）优势突变型小球藻纯藻株的筛选和纯化培养：将初筛获得的小球藻用无菌水稀释为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-66个浓度梯度，运用涂布平板法涂布于20mL含1.0%琼脂的HB-5固体分离培养基(配方见表3)上，用培养皿封口膜封口，避免因长时间培养导致培养基水分丧失。然后将培养皿置光照培养箱培养，培养条件：温度27±1℃，光强3000±100Lux、光照周期为12h∶12h。挑选色泽浓绿、藻落半径大、细胞饱满的藻株作为种子藻株，用接种环转接到试管内HB-4固体培养基平面上纯化培养，经过4轮回转接纯化培养，建立优势突变藻株纯种系。
（5）优势突变小球藻株性能检测：
①小球藻核及叶绿体DNA含量检测：
取培养至稳定期的小球藻液各2mL于5mL试管内，均量加入0.5mL细胞周期试剂盒（GENMED GMS10021）中的检测剂摇匀后，采用BDFACS Calibur流式细胞仪于350nm检测核DNA和叶绿体DNA。
②小球藻叶绿素含量检测：
称0.5g鲜重小球藻，加入25ml浓度为80％的丙酮液，放在黑暗处浸提36h后取出，稀释4倍后分别在波长665nm、649nm和470nm下测定光密度，以80％的丙酮液为空白。
③小球藻稳定期藻细胞浓度测定：
取培养至稳定期的小球藻培养液100mL，测OD680nm，然后于3500r/min离心20min，去上清液，沉淀物采用细胞等渗溶液梯度稀释，然后用血球计数板计数，测算试验组与对照组的藻细胞含量。
④小球藻胞内可溶性蛋白质含量鉴定：
参照蒋立科等主编的《生物化学实验设计与实践》（高等教育出版社，2007.10）所提出的蛋白质定量测定法，将细胞内可溶性蛋白质快速提取，然后采用考马斯亮蓝G-250比色法测定。对于线粒体内蛋白含量的测定，则采用超速离心法提取线粒体蛋白质，然后用动态激光散射法测定。
⑤小球藻水质净化效能鉴定：
实验池9个，面积10m2，注入养殖池塘水至水深1m，均投放相同数量和规格的实验鱼。实验分成A 、B、C为3组，A组接种优势突变株M4发酵液，B组接种原藻株发酵液，C组为对照组，不接种小球藻，各实验池初始接种量均为6.0×108 cells /mL。测试期间平均水温26℃，测试周期30 d。每3d测量水温、pH、DO、透明度、总氮、总磷、氨氮、硝酸氮、亚硝酸氮、高锰酸盐指数，用显微镜检测藻类种类和计数。根据各实验池的水质变化和浮游生物种群变化，判断优势小球藻水质净化效能。
按上述实施方式获得四种小球藻优势突变藻株，分别是0.05%诱变剂48h（定为M4）、0.05%诱变剂24h（定为M3）、0.03%24h诱变剂（定为M2）、0.01%诱变剂12h（定为M1），原藻株即定为M0。筛选的4株优势突变藻株细胞体积增大，核DNA及胞内可溶性蛋白含量提高，对养殖池塘水体的净化能力较原藻株增强。
图1是小球藻核及叶绿体DNA含量的流式细胞仪检测结果，图中：曲线1为M4核DNA含量，曲线2为M0核DNA含量，曲线3为M4叶绿体DNA含量，曲线4为M0叶绿体DNA含量。突变藻株M4核DNA含量最高，为原藻株的2倍，且表达丰度提高1.5倍；突变藻株M4叶绿体DNA含量最高，较原藻株提高35%。
表5是小球藻原藻株与优势突变藻株叶绿素含量检测结果。突变藻株叶绿素a和类胡萝卜素的含量均明显高于原藻株，而叶绿素b的含量则明显低于原藻株。
表5 原藻株与突变藻株叶绿素含量变化。
叶绿素μg/mg M0 M1 M2 M3 M4
叶绿素a 96.28 144.29 158.52 158.43 164.66
叶绿素b 112.17 61.35 83.78 78.92 82.68
类胡萝卜素 5.98 22.74 18.93 25.69 26.98
表6是小球藻原藻株与优势突变藻株稳定期藻细胞含量的测定结果。各突变藻株的单位产量均高于原藻株，其突变藻株M4和M2的生长性能最优。
表6 原藻株与突变藻株稳定期藻细胞含量
Figure 2013100111160100002DEST_PATH_IMAGE009
表7是小球藻胞内可溶性蛋白质含量测定结果。各突变藻株的胞内可溶性蛋白质含量均高于原藻株，其中突变藻株M4胞内可溶性蛋白质含量最高，达435.7μg /mg小球藻干重；其次为M3，达426.4μg /mg小球藻干重。
表7 小球藻胞内可溶性蛋白质含量
样号 M0 M1 M2 M3 M4
蛋白质量(μg) 15.1395 19.7907 20.9535 27.0000 27.2326
藻样品干重(mg) 0.06332 0.06305 0.05737 0.06332 0.06251
样品蛋白质含量(μg /mg干重) 239.1 313.9 365.2 426.4 435.7
表8是小球藻对淡水养殖水体的净化效果。施加小球藻可显著降低养殖水体的氮、磷及有机污染物，增加溶解氧含量。优势突变株M4发酵液的水质净化效果明显优于原藻株。
表8 小球藻对养殖水体的净化效果
Figure 279594DEST_PATH_IMAGE010

Claims (6)

1.一种通过染色体加倍诱变和筛选创造小球藻高产新种质的方法，包括以下步骤：
（1）前培养：对液体原藻种进行诱变前的活化适应培养；
（2）诱变处理：配制小球藻诱变剂梯度浓度培养液，培养不同时间进行诱变处理；
（3）初筛和恢复培养：每一时间水平诱变处理结束后，在培养液中进行恢复培养，分别筛选小球藻浓度峰值出现时间最早和峰值最大的实验组；
（4）优势突变型小球藻纯藻株的筛选和纯化培养：运用涂布平板法，将初筛获得的小球藻转接到固体分离培养基进行分离培养，筛选优势突变藻株并进行连续多代的纯化培养；
（5）对分离的优势突变小球藻株进行生理性能检测。
2.根据权利要求1所述的通过染色体加倍诱变和筛选创造小球藻高产新种质的方法，其特征在于，其中步骤（1）所述的前培养条件是：原藻种于27 ℃±1 ℃、光照强度30001ux、光照周期12h∶12h条件下液体培养至稳定期。
3.根据权利要求1所述的通过染色体加倍诱变和筛选创造小球藻高产新种质的方法，其特征在于，其中步骤（2）所述的诱变处理方法是：在HB-4培养液中添加不同浓度秋水仙碱，制成0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06% 6个浓度梯度的小球藻诱变培养液，接种原藻种后于温度27 ℃±1 ℃、140r/min、光照强度3000lux、光照周期12h∶12h条件下，分别培养6 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、84 h、96 h、120h。
4.根据权利要求1所述的通过染色体加倍诱变和筛选创造小球藻高产新种质的方法，其特征在于，其中步骤（3）所述的初筛和恢复培养方法是：诱变后的藻细胞接种到HB-4液体培养基于27℃±1 ℃、140～170r/min、光照强度30001ux、光照周期为12h∶12h、通气条件下恢复培养，以OD530nm峰值出现最早和峰值最大的实验组为优势突变组。
5.根据权利要求1所述的通过染色体加倍诱变和筛选创造小球藻高产新种质的方法，其特征在于，其中步骤（4）所述的优势突变型小球藻纯藻株的筛选和纯化培养方法为：在HB-5固体分离培养基上，挑选色泽浓绿、半径大的藻株群落，转接到试管内HB-4固体斜面培养基上纯化培养。
6.根据权利要求1所述的通过染色体加倍诱变和筛选创造小球藻高产新种质的方法，其特征在于，其中步骤（5）所述的优势突变小球藻株生理性能检测是按下列指标进行：
①小球藻核及叶绿体DNA含量检测；
②小球藻叶绿素含量检测；
③小球藻稳定期藻细胞浓度测定；
④小球藻胞内可溶性蛋白质含量鉴定；
⑤小球藻水质净化效能鉴定。
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