CN103059031A - 桑黄菌中环二肽c7的高压反相制备分离技术 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种桑黄菌(火木层孔菌Phellinus igniarius(LexFr)Quel、裂蹄木层孔菌phellinus linteus(BerketCurt)Teng、鲍氏层孔菌、哈蒂针层孔菌Phellinus hartigii(AlleschetSchnabl)Imaz)中环二肽C7的分离方法。首先制备桑黄菌粗提物,然后进行正相硅胶层析,然后是甲醇梯度洗脱,再次进行正相硅胶层析,经HPLC检测,进行高压反相制备,再次甲醇凝胶层析,然后HPLC检测最后是1D-HNMR检测,最终即得环二肽C7,即(L-脯氨酸L-苯丙氨酸)。
Description
技术领域
本发明属于生物工程制药领域。
背景技术
桑黄(Phellinus),子实体无柄,菌盖扁半球形或马蹄形,2-12*3-21厘米,厚1.5-10厘米,木质,浅肝褐色至暗灰色或黑色,老时常龟裂,无皮壳,初期有细微绒毛,后变无毛,有同心环棱.边缘钝,深肉桂色至浅咖啡色,下侧无子实层.菌肉深咖啡色,硬,木质.菌管与菌肉近同色,多层,但层次不明显,年老的菌管层充满白色菌丝.管口锈褐色至酱色,圆形,每毫米4-5个.孢子近球形,光滑,无色,5-6*3-4微米.刚毛顶端尖锐,基部膨大,10-25*5-7微米.菌丝不分枝,无横隔,直径3-5微米。
目前,真菌产物的纯化方法较多,主要有分级沉淀法、制备性高效液相层析、柱层析法、超滤法、离心沉淀色谱法、等几种方法。而其中应用最多的当属柱层析法,分为两类:一是只有分子筛作用的凝胶柱层析, 常用的凝胶有葡聚糖凝胶及琼脂糖凝胶。二是离子交换层析。但,主要用于分离多糖,透明质酸等,多数分离后得到的产物为混合物。本发明使用多种层析技术相结合,分离度高,应用此发明可以精致到纯品。
发明内容
本发明公开了一种桑黄菌(火木层孔菌Phellinus igniarius(L ex Fr) Quel、裂蹄木层孔菌 phellinus linteus (Berk et Curt) Teng 、鲍氏层孔菌、哈蒂针层孔菌 Phellinus hartigii (Allesch et Schnabl) Imaz)中环二肽C7的分离方法。首先制备桑黄菌粗提物,然后进行正相硅胶层析,然后是甲醇梯度洗脱,再次进行正相硅胶层析,经HPLC检测,进行高压反相制备,再次甲醇凝胶层析,然后HPLC检测最后是1D-HNMR检测,最终即得环二肽C7,即(L-脯氨酸L-苯丙氨酸)。此化合物目前已报道具有广谱抗菌作用。
本发明的技术方案如下:
桑黄粗提物,由下述方法制得:
(1)发酵培养基配方以克/100毫升计是:
玉米淀粉 1-5% 葡萄糖 1-5%
蛋白胨 0.1-0.5% 酵母膏 0.1-0.5%
硫酸镁 0.1-0.5% 磷酸二氢钾 0.01-0.05%
(2)将桑黄菌种以常规方法接种到装有液体培养基的三角烧瓶内,以20~35℃温度,摇瓶转速为80~280r/min,pH 3~8条件下,震动培养7~15天;培养中当pH值降到2.5~4时,将摇瓶中的种子接种到50L发酵罐的培养液中,以温度20~35℃,发酵罐压力0.1~0.2公斤/平方厘米,pH 3~8,通气量0.5~1.1vvm,搅拌速度100~280转/分的条件,培养7~15天,即可利用桑黄菌丝体发酵全液制备桑黄粗提物;
(3)取步骤(2)中所得桑黄菌丝体发酵全液,将其以常规方式减压浓缩,使其体积浓缩到原体积的1/2~1/5;
(4)用体积百分比为60~95%的乙醇对上述步骤(3)浓缩后的发酵液进行提取,其中,加入乙醇的量是浓缩液体积的2~5倍,能够使提取液中乙醇浓度达到60~90%;
(5)对步骤(4)所得提取液在50~70℃条件下,加热1~2小时;以常规方法进行分离,并通过二级过滤除去杂质,分离获得乙醇提取液;将上述乙醇提取液以常规方式减压浓缩,使其体积浓缩到原体积的1/5~1/10;
(6)将将步骤(5)所得的浓缩液以低温冷冻干燥的方法进行干燥,得桑黄粗提物。
分离环二肽C7的方法:
桑黄菌粗提物→正相硅胶层析→甲醇梯度洗脱→正相硅胶层析→HPLC检测→高压反相制备→HPLC检测→甲醇凝胶层析→1D-HNMR→环二肽C7。
具体方法为:
(1)制备桑黄粗提物;
(2)将上述步骤(1)所得的粗提物与正相硅胶混匀搅拌,并干燥,进行硅胶正相柱层析,用洗脱剂洗脱2-5次;
(3)收集上述步骤(2)得到的最后一次洗脱液,减压浓缩,使用甲醇溶解,甲醇凝胶柱层析,用洗脱剂洗脱;
(4)将步骤(3)得到的产物进行正相硅胶层析,用洗脱剂洗脱;
(5)使用HPLC检测收集的步骤(4)的洗脱液,适当合并洗脱液,减压干燥;
(6) 将步骤(5)得到的产物进行高压反相层析,洗脱剂为甲醇与水;
(7)收集洗脱液,减压蒸干,进行HPLC检测,
(8)再次进行甲醇凝胶层析,收集洗脱液,减压干燥,即为环二肽C7。
本发明由桑黄菌中环二肽C7的分离技术的显著优势:本方法采用多种层析技术相结合,可以精致到结构明确,纯度大于95%的环二肽C7。技术路线成熟明确,高效精确。
附图说明
图1为环二肽C7的结构式;
图2为环二肽C7的一维核磁共振H谱。
具体实施方式
实例1:
桑黄粗提物,由下述方法制得:
(1)发酵培养基配方以克/100毫升计是:
玉米淀粉 1% 葡萄糖 1%
蛋白胨 0.1% 酵母膏 0.1%
硫酸镁 0.1% 磷酸二氢钾 0.01%
(2)将桑黄菌种以常规方法接种到装有液体培养基的三角烧瓶内,以25℃温度,摇瓶转速为110r/min,pH 7条件下,震动培养7天;培养中当pH值降到3时,将摇瓶中的种子接种到50L发酵罐的培养液中,以温度25℃,发酵罐压力0.1公斤/平方厘米,pH 3,通气量0.5-1.1vvm,搅拌速度100转/分的条件,培养7天,即可利用桑黄菌丝体发酵全液制备桑黄粗提物;
(3)取步骤(2)中所得桑黄菌丝体发酵全液,将其以常规方式减压浓缩,使其体积浓缩到原体积的1/3;
(4)用体积百分比为70%的乙醇对上述步骤(3)浓缩后的发酵液进行提取,其中,加入乙醇的量是浓缩液体积的5倍,能够使提取液中乙醇浓度达到55%;
(5)对步骤(4)所得提取液在70℃条件下,加热1小时;以常规方法进行分离,并通过二级过滤除去杂质,分离获得乙醇提取液;将上述乙醇提取液以常规方式减压浓缩,使其体积浓缩到原体积的1/5;
(6)将将步骤(5)所得的浓缩液以低温冷冻干燥的方法进行干燥,得桑黄粗提物。
然后称取350g粗提物,与等体积100目正相硅胶混匀搅拌,进行硅胶正相柱层析。层析固定相为200目正相硅胶,柱高1.2m,直径20cm,洗脱剂为分别为氯仿,氯仿:甲醇=100:1,50:1分别洗脱3,4,4,4个柱体积。并将所得洗脱液分别命名为Fr-1,Fr-2,Fr-3,Fr-4。将Fr-4用甲醇溶解,进行甲醇凝胶层析,收集洗脱液,适当合并,再次与等体积硅胶拌样,使用硅胶为100目正相硅胶,五倍体积硅胶层析,使用的硅胶为200目正相硅胶,进行正相硅胶层析,洗脱剂为氯仿与甲醇。经HPLC检测,条件为0min:100%水,10min:100%甲醇,出峰时间为5.25。合并有目标吸收峰的洗脱液,然后,进行高压反相制备,A相为水,B相为甲醇。收集洗脱液,减压蒸干,HPLC检测,条件为0min:100%水,10min:100%甲醇,出峰时间为5.25。适当合并,进行1D-HNMR核磁共振分析,频率为400MHZ,分析结果为δ 7.29 (ddd, J = 31.0, 18.0, 7.0 Hz, 6H), 5.87 (s, 1H), 4.28 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 4.07 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 3.67 – 3.53 (m, 3H), 2.80 (dd, J = 14.5, 10.4 Hz, 1H), 2.36 – 2.28 (m, 2H), 2.08 – 1.80 (m, 5H).证明是(L-脯氨酸L-苯丙氨酸)。
实例2:
桑黄粗提物,由下述方法制得:
(1)发酵培养基配方以克/100毫升计是:
玉米淀粉 3% 葡萄糖 2%
蛋白胨 0.5% 酵母膏 0.5%
硫酸镁 0.5% 磷酸二氢钾 0.05%
(2)将桑黄菌种以常规方法接种到装有液体培养基的三角烧瓶内,以30℃温度,摇瓶转速为180r/min,pH6条件下,震动培养15天;培养中当pH值降到2.5时,将摇瓶中的种子接种到50L发酵罐的培养液中,以温度30℃,发酵罐压力0.2公斤/平方厘米,pH 3,通气量0.5-1.1vvm,搅拌速度180转/分的条件,培养15天,即可利用桑黄菌丝体发酵全液制备桑黄粗提物;
(3)取步骤(2)中所得桑黄菌丝体发酵全液,将其以常规方式减压浓缩,使其体积浓缩到原体积的1/5;
(4)用体积百分比为90%的乙醇对上述步骤(3)浓缩后的发酵液进行提取,其中,加入乙醇的量是浓缩液体积的4倍,能够使提取液中乙醇浓度达到70%;
(5)对步骤(4)所得提取液在55℃条件下,加热2.5小时;以常规方法进行分离,并通过二级过滤除去杂质,分离获得乙醇提取液;将上述乙醇提取液以常规方式减压浓缩,使其体积浓缩到原体积的1/10;
(6)将将步骤(5)所得的浓缩液以低温冷冻干燥的方法进行干燥,得桑黄粗提物。
然后称取100g粗提物,与等体积100目正相硅胶混匀搅拌,进行硅胶正相柱层析。层析固定相为200目正相硅胶,柱高0.8m,直径10cm,洗脱剂为分别为氯仿,氯仿:甲醇=200:1,100:1,50:1,分别洗脱2,3,3,3个柱体积。并将所得洗脱液分别命名为Fr-1,Fr-2,Fr-3,Fr-4。。将Fr-4用甲醇溶解,进行甲醇凝胶层析,收集洗脱液,适当合并,再次与等体积硅胶拌样,五倍体积硅胶层析,使用的层析硅胶为200目正相硅胶,进行正相硅胶层析,洗脱剂为氯仿与甲醇。经HPLC检测,条件为0min:100%水,10min:100%甲醇,出峰时间为5.25。,合并有目标吸收峰的洗脱液,然后,进行高压反相制备,A相为水,B相为甲醇。收集洗脱液,减压蒸干,HPLC检测,条件为0min:100%水,10min:100%甲醇,出峰时间为5.25。适当合并,进行1D-HNMR核磁共振分析,频率为400MHZ,分析结果为δ 7.29 (ddd, J = 31.0, 18.0, 7.0 Hz, 6H), 5.87 (s, 1H), 4.28 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 4.07 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 3.67 – 3.53 (m, 3H), 2.80 (dd, J = 14.5, 10.4 Hz, 1H), 2.36 – 2.28 (m, 2H), 2.08 – 1.80 (m, 5H).证明是(L-脯氨酸L-苯丙氨酸)。
Claims (12)
1.桑黄菌中环二肽C7的高压反相制备分离方法,其步骤顺序如下:
(1)制备桑黄菌粗提物;
(2)将上述步骤(1)所得的粗提物与正相硅胶混匀搅拌,并干燥,进行硅胶正相柱层析,用洗脱剂洗脱2-5次;
(3)收集上述步骤(2)得到的最后一次洗脱液,减压浓缩,使用甲醇溶解,甲醇凝胶柱层析,用洗脱剂洗脱;
(4)将步骤(3)得到的产物进行正相硅胶层析,用洗脱剂洗脱;
(5)使用HPLC检测收集的步骤(4)的洗脱液,适当合并洗脱液,减压干燥;
(6) 将步骤(5)得到的产物进行高压反相层析,洗脱剂为甲醇与水;
(7)收集洗脱液,减压蒸干,进行HPLC检测,
(8)再次进行甲醇凝胶层析,收集洗脱液,减压干燥,即为环二肽C7。
2.如权利要求1所述的一种从桑黄菌中分离苯乙醇的方法,其特征在于所述桑黄粗提物,由下述方法制得:
(1)发酵培养基配方以克/100毫升计是:
玉米淀粉 1-5% 葡萄糖 1-5%
蛋白胨 0.1-0.5% 酵母膏 0.1-0.5%
硫酸镁 0.1-0.5% 磷酸二氢钾 0.01-0.05%
(2)如权利要求1所述桑黄粗提物的发酵培养方法是,将桑黄菌种以常规方法接种到装有液体培养基的三角烧瓶内,以20~35℃温度,摇瓶转速为80~280r/min,pH 3~8条件下,震动培养7~15天;培养中当pH值降到2.5~4时,将摇瓶中的种子接种到50L发酵罐的培养液中,以温度20~35℃,发酵罐压力0.1~0.2公斤/平方厘米,pH 3~8,通气量0.5~1.1vvm,搅拌速度100~280转/分的条件,培养7~15天,即可利用桑黄菌丝体发酵全液制备桑黄粗提物;
(3)取步骤(2)中所得桑黄菌丝体发酵全液,将其以常规方式减压浓缩,使其体积浓缩到原体积的1/2~1/5;
(4)用体积百分比为60~95%的乙醇对上述步骤(3)浓缩后的发酵液进行提取,其中,加入乙醇的量是浓缩液体积的2~5倍,能够使提取液中乙醇浓度达到60~90%;
(5)对步骤(4)所得提取液在50~70℃条件下,加热1~2小时;以常规方法进行分离,并通过二级过滤除去杂质,分离获得乙醇提取液;将上述乙醇提取液以常规方式减压浓缩,使其体积浓缩到原体积的1/5~1/10;
(6)将将步骤(5)所得的浓缩液以低温冷冻干燥的方法进行干燥,得桑黄粗提物。
3.分离环二肽C7的方法:
如权利要求1所述的桑黄菌中环二肽C7的分离方法,其特征在于所述的环二肽C7为(L-脯氨酸L-苯丙氨酸)。
4.如权利要求1所述的桑黄菌中环二肽C7的分离方法,其特征在于,步骤(2)中所述的拌样硅胶为100-200目正相硅胶,洗脱剂为氯仿和甲醇。
5.如权利要求1所述的桑黄菌中环二肽C7的分离方法,其特征在于,步骤(3)中所述的洗脱剂为甲醇。
6.如权利要求1所述的桑黄菌中环二肽C7的分离方法,其特征在于,步骤(4)中所述的正相硅胶为200-300目。
7.如权利要求1所述的桑黄菌中环二肽C7的分离方法,其特征在于,步骤(5)中所述的HPLC条件为0min:100%水,10min:100%甲醇。
8.如权利要求1所述的桑黄菌中环二肽C7的分离方法,其特征在于,步骤(6)所述的反相材料为C-18或者C-8。
9.如权利要求1所述的桑黄菌中环二肽C7的分离方法,其特征在于,步骤(6)所述的洗脱剂为甲醇:水=30%-80%。
10.如权利要求1所述的桑黄菌中环二肽C7的分离方法,其特征在于,步骤(6)所述的反相层析次数为2-4次。
11.如权利要求1所述的桑黄菌中环二肽C7的分离方法,其特征在于,步骤(7)所述的HPLC出锋时间为5.20-5.58min。
12.如权利要求1所述的桑黄菌中环二肽C7的分离方法,其特征在于,步骤(8)所述的凝胶类型为Sephadex LH-20。
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