CN103054894A - 叶下珠多糖在制备抗乙肝病毒的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种叶下珠多糖PUIPⅢ在制备抗乙肝病毒的药物中的应用，PUIPⅢ是由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖和葡萄糖4个单糖组成，鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖和葡萄糖的摩尔比为0.27:0.28:0.1:0.35，分子量为418793.5。由药用植物叶下珠经人工提取、分离纯化而成。体外生物活性实验表明，PUIPⅢ具有抑制HepG2.2.2.15细胞培养中HBsAg、HBeAg的分泌和HBV-DNA的复制，具有一定的体外抗HBV活性作用；体内活性实验表明，PUIPⅢ在鸭体内对DHBVDNA有明显抑制作用，且反弹较小，可用于制备抗乙肝病毒的药物和保肝护肝保健品。

Description

叶下珠多糖在制备抗乙肝病毒的药物中的应用

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及一种叶下珠多糖PUIPⅢ在制备抗乙肝病毒的药物中的应用。 

背景技术

乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus，HBV)从发现至今已有四十余年。1963年，Blumberg等发现澳大利亚血友病患者血清中含有一种能与美国血友病患者血清起反应的抗原，称其为澳大利亚抗原（即乙型肝炎病毒表面抗原，Hepatitis B Virus Surface Antigen，HBsAg）。1970年Dane等在乙肝病人血清中发现了42nm大小的HBV颗粒，其外膜成分中含有HBsAg，1986年国际病毒命名委员会正式将HBV归为嗜肝DNA病毒科。 

乙型肝炎病毒（HBV）感染是一个世界性的健康问题，呈世界性分布，它不仅可以导致急、慢性HBV感染与75%―90%的原发性肝癌相关。全球慢性HBV感染约有3.5亿人，我国属HBV感染的高流行区。据我国传染病报告和疾病监测统计，乙肝占急性肝炎病例的25%左右，与HBV感染有关的肝病死亡率约23/10万，其中肝癌死亡率约13/10万，乙肝对人类健康危害最为严重，是我国最重要的公共卫生问题之一。由一些数据估计，我国慢性无症状HBV携带者（AsC）超过1.2亿，占全世界HBV感染的1/3，其中慢性乙型肝炎有3000万人，先、现患率约为2770/10万，这些患者10%―30%可发展为肝硬化，一部分可进一步发展为肝癌，累计现行的和既往的，我国已有一半以上人口经受HBV感染，所以慢性乙肝的治疗是亟待解决的问题。 

目前临床上用于治疗HBV感染的药物除干扰素（Interferon，IFN）外，还有少数天然药物及众多化学合成药物如核苷类似物阿糖腺苷（adenine arabinside，Ara-A）、拉米夫定（lamivudine）、泛昔洛韦（famciclovir）、阿地福韦（adefovir）、恩他卡韦（ontacavir）等。这些药物已在实验室和临床应用中证实能显著抑制HBV DNA的复制或抑制HBsAg、HBeAg的表达与分泌。然而这些药物却存在一定的不足，干扰素的缺点主要表现在：①价格昂贵；②注射制剂；③对患者的选择有严格的限制性；④明显的不良反应，如发热、血小板减少、暂时性脱发等；⑤在失代偿性肝病患者中应用有一定的风险。核苷类药物的不足表现在：①需要长期治疗；②耐药性病毒变异的发生率高；③停药后发生ALT反跳，甚至发生重症肝炎。上述的种种不足都使得临床应用受到了极大的限制。因此，寻找和开发无污染、低毒副作用、价格低廉、安全有效的新型抗HBV药物具有十分重要的理论、经济和社会意义。 

随着天然植物及其提取物或有效成分抗病毒、抗肿瘤、调节免疫等研究的不断深入，人们发现，天然药物具有对人体低毒副作用，不易产生耐药性等显著特点。针对目前病毒性肝炎治疗中的困难，寻找与证实有效天然药物已经成为临床治疗病毒性肝炎的希望与重要手段。传统中草药品种繁多，已广泛应用于临床治疗慢性乙型肝炎并取得一定疗效，积累了丰富的临床经验，但中草药抗HBV的作用机理还有待于深入研究，所以筛选中草药抗HBV这方面的工作尚有很大的潜力；而且传统中草药不良反应少，价格低，日益受到国内外研究者的普遍重视，寻求有抗病毒作用的天然药物是当前研究的热点。目前国内外对天然药物生物活性与功能的研究已发展为研究与分析天然药物的活性部位、活性成分及至活性成分的结构或构型，以进一步明确药物的作用机理，真正实现“天然药物现代化”这一目标。如美国Holk等在天然植物茜草抗HBV作用的深入研究中，发现其抑制HBsAg、HBeAg表达的具体有效成分为三种奈-氢醌化合物。日本学者Nin等研究证明治疗肝炎的传统药物甘草中起免疫调节作用的成分为一种糖类（甘草甜素）。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种叶下珠多糖PUIPⅢ在制备抗乙肝病毒的药物中的应用，PUIPⅢ是由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖和葡萄糖4个单糖组成，鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖和葡萄糖的摩尔比为0.27:0.28:0.1:0.35，分子量为418793.5。由药用植物叶下珠经人工提取、分离纯化而成。体外生物活性实验表明，PUIPⅢ具有抑制HepG2.2.2.15细胞培养中HBsAg、HBeAg的分泌和HBV-DNA的复制，具有一定的体外抗HBV活性作用；体内活性实验表明，PUIPⅢ在鸭体内对 DHBV DNA 有明显抑制作用，且反弹较小，可用于制备抗乙肝病毒的药物和保肝护肝保健品。 

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案： 

一种叶下珠多糖PUIPⅢ在制备抗乙肝病毒的药物和保肝护肝保健品中的应用。

本发明所述的叶下珠多糖PUIPⅢ的提取分离方法，包括如下步骤： 

1）叶下珠全草蒸馏水洗涤去土，干燥后，粉碎，用石油醚浸没药材且液面高出药材0.5～1cm，在80℃和常压力回流提取3次，每次2小时，弃去回流液。药渣继续用50～100%乙醇按同样方法在80℃ ℃下回流提取3次，每次2小时，弃去回流液。药渣再用90 ℃水浸提3次，每次2小时，合并3次浸提液进行离心分离，离心速度4000r/min，取滤液浓缩至原体积1/4，加入4倍体积的95%乙醇，静置24h，离心，取醇沉物即为粗总多糖；粗总多糖经2）除蛋白，即用Sevag法脱蛋白：将步骤1）得到的醇沉物用蒸馏水复溶得粗多糖溶液，在粗多糖溶液中加入氯仿和正丁醇混合液的优选体系是粗多糖溶液：氯仿和正丁醇混合液以体积比计量是3：1，混合液= 氯仿：正丁醇=4:1（体积比计量），磁力搅拌30min，充分静置分层，弃去沉淀。重复7～8次后直至界面无白色沉淀。3）洗涤，除杂：在除蛋白后的多糖溶液中加入4倍体积的95%乙醇沉淀24h，离心，弃滤液，沉淀依次用无水乙醇、丙酮、乙醚清洗、重复3次。4）透析，干燥：即醇沉洗涤后滤渣加适量蒸馏水，充分复溶后透析，透析在磁力搅拌下进行，样品液与透析液（蒸馏水）体积比优选条件为1:20， 8h换一次水，透析72h。透析完毕后将糖溶液放入冷冻干燥机中干燥得叶下珠总多糖（PULP），经测定本发明总多糖（PULP）含量在95%以上。5）总多糖各组分分离纯化：经过脱蛋白，透析处理后的叶下珠精总多糖（PULP）溶于适量的重蒸水中（8 mg/mL），过DEAE-52阴离子交换柱分离。使用前将DEAE-52纤维素填料用蒸馏水浸泡48h，期间3h换一次水，并用倾泻法除去悬浮杂质，然后进行碱－酸－碱处理。先用0.5 mol/L的NaOH溶液浸泡30 min后蒸馏水洗至中性，再用0.5 mol/L的 HCl溶液浸泡30 min后蒸馏水洗至中性，最后用0.5 mol/L 的NaOH溶液浸泡30 min后蒸馏水洗至中性，得到OH^-型纤维素。湿法装柱（柱尺寸为500×50mm），蒸馏水平衡48h，装柱过程中避免气泡及断层现象。将叶下珠精总多糖样液，过0.45μm滤膜后上样。依次用0、0.1、0.25、0.5、0.75mol/L NaCl梯度洗脱，每10min收集一管，流速4mL/min，苯酚－硫酸法跟踪检测。以收集的管序（管数）为横坐标，溶液的光吸收度为纵坐标绘图得洗脱曲线，从曲线上能够明显宣示出四个峰形对称的洗脱峰，分别代表四个组分，按照出峰的顺序分别记为PULPⅠ、PULPⅡ、PULPⅢ和PULPⅣ。其中第2个、第3个两个洗脱峰较大，收集第3主峰组分，浓缩，重蒸水透析48h，冷冻干燥得叶下珠多糖PULPⅢ纯组分。纯度在98%以上，符合生物活性试验要求，可直接用于下述的抗病毒活性试验，样品也可干燥后密封保存备用。

本发明的有益效果：1、叶下珠多糖PULPⅢ目前未有报道具有抗乙肝病毒作用，本发明发现叶下珠多糖PULPⅢ能作为抗乙肝病毒药物，此药物其最大优点是天然产物，与现有抗病毒药相比，毒副小，无不良反应，且还有抗氧化、提高机体免疫力等作用，可长期使用；2、与直接使用中草药相比，叶下珠多糖PULPⅢ作为具体化学组分的物质直接作为抗病毒的药效成分，用药量少，无其它非药用组分，因而能减少其它成分可能对肌体的伤害（副作用），临床用药简单；3、叶下珠中草药原料易得，价廉，提取分离工艺简单，生产方便，开发价值高。 

附图说明

图1是葡萄糖标准曲线。 

图2是多糖梯度洗脱曲线。 

图3是HepG2.2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg的规律。 

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细说明： 

叶下珠多糖的提取

叶下珠全草蒸馏水洗涤去土，50℃低温干燥 后，粉碎，密封备用。其粉末为黄绿色。

石油醚80 ℃回流脱脂→95%乙醇80 ℃回流脱小分子糖→90 ℃水回流提取3次，合并3次滤液4000r/min离心，浓缩至1/4体积→加入4倍体积的95%乙醇，静置24h，离心，蒸馏水复溶→sevag法除蛋白（氯仿：正丁醇=4:1，多糖溶液：混合液=3:1），磁力搅拌30min，充分静置分层，重复7～8次操作即可除去游离蛋白质→除蛋白后的多糖溶液加入4倍体积的95%乙醇沉淀24h→依次用无水乙醇、丙酮、乙醚清洗、重复三次→透析72h→冷冻干燥得叶下珠总多糖（PULP）。 

葡萄糖标准液和样品供试液的制备 

精密称取葡萄糖标准品（在105℃下干燥到重量不再发生变化）10mg，用蒸馏水溶解后，置于100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，制成0.1mg/mL的葡萄糖标准液，备用。

精密称取干燥至恒重的叶下珠多糖10mg，用蒸馏水溶解后，置于100mL容量瓶中加蒸馏水定容至刻度，摇匀，制成0.1mg/mL的样品供试液备用。 

吸收波长的确定  

取葡萄糖标准液和样品溶液各1 mL，分别加入1mL 5%苯酚溶液（取5g重蒸苯酚于100mL棕色容量瓶中加蒸馏水定容），摇匀后，悬空垂直加入5mL浓硫酸，置沸水浴中加热15min，然后置冷水浴中冷却，在400～600 nm范围内全波长扫描，确定吸收波长。 

葡萄糖标准曲线制作 

精密吸取葡萄糖标准液0.2、0.4、0.6、0.8、1mL于10mL具塞刻度试管中，依次添加水使终体积为1mL，空白对照为1mL水，然后加入1mL 5%苯酚溶液摇匀，迅速加入5mL浓硫酸（悬空垂直加入），置沸水浴中加热15min，然后置冷水浴中冷却，于490nm处测定吸光度。以吸光度为Y轴，葡萄糖质量为X轴，绘制标准曲线，并计算回归方程。

糖含量的计算 

精密吸取供试液1mL，于490nm处测定吸光度。

按照公式计算糖含量： 

糖含量=C /（C₀× V）×100%

C：由标准曲线查得的葡萄糖微克数

C₀：样品溶液的浓度（0.1 mg/mL）

V：测定时用的样品溶液体积（1.0mL）

多糖的提取率

多糖的提取率=多糖的质量/原材料的质量×100 %

样品溶液和葡萄糖标准液的最大吸收峰波长都在490 nm左右处，所以选取490 nm作为多糖含量的测定波长。

以吸光度为Y轴，葡萄糖微克数（μg）为X轴，绘制标准曲线，如图1，可以看出在20～100μg范围内，葡萄糖量与吸光度有良好的线性关系。 

测得样品液的吸光度A为0.388，根据回归方程计算其相应葡萄糖的微克数为28.27μg。根据公式得糖含量： 

糖含量=C /（C₀× V）×100%=28.27/(0.1×1) ×100%=28.27%

多糖的提取率==1.5/100×100 %=1.5%

本实验通过石油醚脱脂，再以95%的乙醇脱去低聚糖等小分子物质，然后以水提醇沉法从叶下珠中分离出多糖，并采用sevag法脱蛋白，苯酚－硫酸法测定其含量，其最大吸收波长为490nm，多糖提取率为1.5%，糖含量为28.27%。

叶下珠多糖的分离纯化

柱分离

DEAE-52填料预处理

DEAE-52纤维素填料用蒸馏水浸泡48h，期间4～5h换一次水，并用倾泻法除去悬浮杂质，然后进行碱-酸-碱处理。先用0.5 mol/L的NaOH溶液浸泡30 min后蒸馏水洗至中性，再用0.5 mol/L的 HCl溶液浸泡30 min后蒸馏水洗至中性，最后用0.5 mol/L 的NaOH溶液浸泡30 min后蒸馏水洗至中性，得到OH^-型纤维素。湿法装柱（柱尺寸为500×50mm），蒸馏水平衡48h，装柱过程中避免气泡及断层现象。

过DEAE-52层析柱分离纯化 

称取640mg叶下珠总多糖溶于80mL重蒸水中（8 mg/mL），过0.45μm滤膜后上样。依次用0、0.1、0.25、0.5、0.75mol/L NaCl梯度洗脱，每10min收集一管，流速4mL/min；苯酚-硫酸法跟踪检测，收集各主峰组分，浓缩，重蒸水透析48h，冷冻干燥得叶下珠多糖各组分。

SephadexG-200葡聚糖凝胶过滤法 

的预处理：SephadexG-200填料加适量蒸馏水浸泡24h，期间4～5h换一次水，并用倾泻法除去悬浮杂质，然后超声脱气直到凝胶液中没有气泡出现为止。湿法装柱（柱尺寸为500×25mm），用0.05 mol/L的NaCl溶液平衡48 h后备用。

柱层析：将上面收集的各组分配制成25mg/mL的样品液，上样2mL，用0.05 mol/L的NaCl洗脱。自动部分收集器收集，每管5 mL，每30 min收集一管，苯酚-硫酸法跟踪检测。 

HPLC高效液相色谱法 

将纯化后的各组分多糖配制成1mg/mL的样品液，过0.45 μm的滤膜后进样。

高效液相色谱条件： 

色谱柱：PolySep-SEC 4000 Part No:00H-3144-K0 Column Size:300×7.8mm；

检测器：示差检测器；柱温：30℃；流动相：双蒸水；流速：0.8 mL/min；进样量：20 μL。

柱层析分离结果 

经过脱蛋白，透析处理后的叶下珠精多糖（PULP），过DEAE－52离子交换柱，依次用0、0.1、0.25、0.5、0.75mol/L NaCl溶液梯度洗脱，苯酚－硫酸法跟踪检测，得如图2所示中洗脱曲线。由图2可以看出，PULP经DEAE-52柱层析分离后，能够明显分离出四个峰形对称的洗脱峰，分别代表四个组分，记为PULPⅠ、PULPⅡ、PULPⅢ和PULPⅣ。收集含量较大的组分PULPⅢ做进一步分析。

柱和HPLC纯度鉴定 

SephadexG-200柱结果

取叶下珠多糖组分PULPⅢ过SephadexG-200凝胶柱，NaCl洗脱，苯酚－硫酸法跟踪检测，用吸光度值与洗脱管数作洗脱曲线，PULPⅢ在Sephadex G-200柱上的洗脱曲线是对称的单一峰，说明PULPⅢ组分是分子量相对均一的多糖组分。

HPLC法纯度鉴定 

利用HPLC法检测叶下珠多糖组分PULPⅢ的纯度时，结果显示，经DEAE-52纤维素柱分离纯化后的多糖组分PULPⅢ，在高效液相图谱上峰型比较对称，且经过面积归一法计算其纯度达到95%以上，与Sephadex G-200凝胶色谱图结果相吻合，说明纯度比较高，可以用来做结构鉴定。

水提醇沉脱蛋白后的叶下珠多糖经过DEAE-52纤维素柱分离纯化后得到四个组分，分别记为PULPⅠ、PULPⅡ、PULPⅢ和PULPⅣ。收集含量较大的组分PULPⅢ，用SephadexG-200凝胶柱层析法和高效液相色谱法（HPLC）两种方法进行纯度鉴定，证明其组分相对均一，可以进一步做结构分析。 

Ⅲ的理化性质及结构分析

状态、溶解性试验

称取适量分离纯化后的多糖组分PULPⅢ溶解于纯水、无水乙醇、丙酮、乙醚和乙酸乙酯等溶剂，观察其溶解性。

茚三酮反应 

取1.0mg/mL 样品溶液1.0mL于试管中，加入1.0mL 0.5%茚三酮试剂，沸水浴5min，冷却后观察颜色变化，若出现紫红色，则证明有蛋白质，反之则无。以蒸馏水和小牛血清溶液作为对照。

Molish反应 

取1.0mg/mL 样品溶液1.0mL于试管中，滴加两滴Molish试剂，摇匀。倾斜试管，沿管壁加入约1mL浓硫酸，小心竖直后，2～3min后仔细观察两层液面交界处的颜色变化，若有紫红色出现，则证明有糖类物质。以蒸馏水和淀粉溶液作为对照。

苯酚－硫酸反应 

取1.0mg/mL 样品溶液1.0mL于试管中，加入1mL 5%的苯酚，再加入5mL浓硫酸，振荡，若呈橙黄色，说明含糖。以蒸馏水为对照。

碘-碘化钾反应 

取1.0mL 1.0mg/mL的样品溶液，滴加250μL碘-碘化钾溶液后，若不显蓝色，说明此多糖为非淀粉类。以蒸馏水为阴性对照，0.5%的淀粉指示液为阳性对照。

硫酸－咔唑反应 

取1.0mg/mL 样品溶液1.0mL于试管中，在冰水浴中向管中加入6mL浓硫酸，摇匀后置于85℃水浴中20min，取出冷却至室温，加入0.2mL 0.1% 的咔唑液,室温下保持2h，若有紫红色物质出现，说明含有糖醛酸，是酸性糖,以蒸馏水为阴性对照。

斐林反应 

取1.0mg/mL 样品溶液1.0mL于试管中，加入过量的斐林试剂，煮沸2 min，若产生红色的氧化亚酮沉淀，则证明含还原糖。

三氯化铁试验 

取1.0mg/mL 样品溶液1.0mL于试管中，调节pH值为4～5，加入1%的三氯化铁水溶液，若出现蓝、墨绿或蓝紫色，则证明含有鞣质类或酚类。

硫酸基定性试验 

取2mg多糖样品，加入1.0mL 1mol/L HCl，110℃ 密闭水解3h，然后滴加0.5mL的氯化钡-明胶试剂，若有白色沉淀生成，说明含有硫酸基。

法测定分子量 

高效液相色谱条件

色谱柱：PolySep-SEC 4000 Part No:00H-3144-K0 Column Size:300×7.8mm；

检测器：示差检测器；柱温：30℃；流动相：双蒸水；流速：0.8 mL/min；进样量：20 μL。

样品溶液的制备 

将多糖组分PULPⅢ配制成浓度为1mg/mL的溶液，以10000r/min 离心10 min后，过0.45 μm滤膜，备用。

标准对照溶液  

将各种已知分子量的葡聚糖标准品系列（T-10、T-20、T-110、T-500、T-2000）配制成浓度为1mg/mL的溶液，处理方法同样品溶液，备用。

标准曲线的绘制 

将各种已知分子量的葡聚糖标准品由小分子到大分子依次平均进样3次，记录相应的保留时间t_R和色谱图，以保留时间t_R为横坐标，分子量的对数值为纵坐标绘制标准曲线。

PULPⅢ相对分子质量的测定 

将上面配制好的样品溶液各进样三次，HPLC色谱条件同标准品一样，记录相应的保留时间t_R和色谱图，根据标准曲线得到的回归方程计算分子量。

标准曲线的绘制 

采用硫酸咔唑法测定糖醛酸含量。配制0.2mg/mL的葡萄糖醛酸溶液25mL,依次量取0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL上述溶液，定容于10mL容量瓶中，制成5、10、20、30、40、50μg/mL的标准溶液置4℃冰箱中备用。

量取5mL硼砂硫酸溶液(0.025 mol/L)于具塞试管中，冰浴，然后将1mL葡萄糖醛酸标准溶液小心加入酸液层上方，以蒸馏水作为空白对照，边摇匀（先轻轻摇匀，后剧烈摇晃）边冰浴冷却。然后将试管在沸水浴中加热10min，冷却至室温后加入0.2mL咔唑溶液(0.125%的无水乙醇溶液)，摇匀，沸水加热15min，冷却至室温，测定530nm处的吸光值，以葡萄糖醛酸的浓度为横坐标，吸光值纵坐标绘制标准曲线。 

样品中糖醛酸含量的测定 

将多糖组分PULPⅢ配成5μg/mL的溶液，操作同上，测定其在530nm处的吸光值。

蛋白质和核酸测定 

将纯化后的多糖组分PULPⅢ配制成1mg/mL的多糖水溶液，用UV紫外分光光度计在200～400nm范围内扫描看其在260nm(核酸)，280nm（Pr）处是否有吸收峰，以判定有无蛋白质和核酸的存在。

、H、N元素分析 

分别称取两份完全干燥的PULPⅢ样品2.5mg，采用Elementar Vario EL Ⅲ元素分析仪测定C、H、N的含量。

IR）的检测 

取2mg多糖样品，用溴化钾（KBr）压片后在400～4000cm^-1波长范围内做红外光谱分析。

采用糖腈乙酸酯衍生物的气相色谱法进行单糖组成测定。根据出峰时间可以确定样品的单糖组成成分，根据出峰面积可以确定单糖的组成比例。 

单糖糖腈乙酸酯衍生化  分别称取鼠李糖（Rha）、木糖(Xyl)、半乳糖（Gal）、葡萄糖（Glc）、阿拉伯糖(Ara)，甘露糖（Man）各10 mg，分别加入10mg盐酸羟胺，0.5 mL吡啶振荡后，90 ℃水浴30 min，并不时振荡，取出冷却至室温后，加入0.5 mL乙酸酐，于90 ℃水浴中酰化30 mim，得到的产物即是糖腈乙酸酯衍生物，直接注入GC分析。 

多糖糖腈乙酸酯衍生化 称取多糖 10mg，加入 2mol/L 三氟乙酸 5mL，110℃ 真空封管水解4h后，在40℃下减压浓缩至干，然后加入4mL甲醇，旋转蒸发至干，重复3～4次，以除去三氟乙酸。然后加入10 mg 盐酸羟胺和0.5 mL 吡啶，放入 90℃水浴加热反应 30 min，并不时振荡 取出后冷至室温，加入 0.5 mL 醋酸酐，在 90℃ 水浴中继续反应 30 min进行乙酰化，反应产物可直接进行气相色谱分析 

色谱条件：

色谱柱：OV1701（30.0 m×0.32 μm×0.25 μm）毛细管柱；

进样口温度：250 ℃；（FID ）检测器温度：240 ℃；

载气压力：0.4 MPa；程序升温：150 ℃下保持 4 min，然后以10 ℃/min 升至200 ℃，保持8 min，再以 15 ℃/min升至280 ℃，保持8 min。

取20mg PULPⅢ多糖组分，用2mL 0.05mol/L三氟乙酸进行部分酸水解，水解16h后离心，沉淀进行GC分析。上清液中加入甲醇旋转蒸发，重复3～4次除去三氟乙酸，然后用水复溶后，透析袋（分子截留量3500）透析。透析结束后，袋外部分真空干燥后进行GC分析；袋内部分加入4倍体积的乙醇醇析，上清部分和醇沉部分分别真空干燥后进行GC分析。 

smith降解 

高碘酸钠标准曲线的制作

取6支干燥试管，按下表操作制作标准曲线：

分别取0.1mL上述溶液，定容至25 mL，在223 nm处测定光密度。然后以高碘酸钠浓度为横坐标，光密度值为纵坐标，绘制标准曲线。

样品处理 

准确称取糖样25 mg，溶解于15 mmol/L NaIO₄ 溶液中，置25 mL 容量瓶中，定容摇匀。4℃下在暗处反应，分别在0、6、12、24、36、48、60h……后依次取样 0.1 mL，置于25mL棕色容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，即稀释250倍，以蒸馏水做空白对照，测定223 nm处的吸光度，直到吸光度值稳定后，加入乙二醇放置20min，破坏过量的高碘酸终止反应。根据测得的光密度稳定值，根据高碘酸钠标准曲线，可计算出高碘酸的消耗量。

甲酸测定 

取2mL上述乙二醇处理过的反应溶液，在溴甲酚绿为指示剂的条件下，用0.01mol/L的 NaOH溶液（以邻苯二甲酸氢钾为标定液）滴定，计算甲酸的生成量。

Smith降解 

把乙二醇处理后的多糖样品溶液透析48h，在40℃下减压浓缩至10mL左右，室温下加入70mg NaBH₄ 后，置于暗处搅拌24h，以便还原多糖醛。24h后，加入50% HAc 中和剩余的NaBH₄，至 pH 为 6～7后透析48h(流水和蒸馏水分别24h)。透析完成后，加入相同体积的 1 mol/L 的H₂SO₄，真空封管，100℃条件下水解8h，然后加入BaCO₃ 调节 pH至6，用定量滤纸过滤，滤液真空浓缩蒸干，乙酰化后进行GC分析。

PULPⅢ为土黄色片状固体，易溶于水，不溶于乙醇、丙酮等有机溶剂。Molish反应、苯酚-硫酸反应、硫酸- 咔唑反应阳性，茚三酮反应、碘-碘化钾反应、斐林反应、三氯化铁反应和硫酸基反应为阴性。 

Ⅲ的分子量 

根据各标样的色谱图及t_R，求得分子量的对数值log Mw与t_R关系的回归方程为y（log Mw） = -0.5487x（t_R）+9.3541(R²=0.9995)。PULPⅢ的保留时间为 6.801 min，根据回归方程求得样品PULPⅢ的相对分子量为418793.5。

硫酸-咔唑法测定糖醛酸含量的回归方程为：y=0.0146x+0.0917(R²=0.9994)。 

测得叶下珠多糖组分PULPⅢ在530nm处的吸光值为0.75，根据回归方程计算可知，糖醛酸含量为45.1% 。 

Ⅲ分子中蛋白质和核酸 

PULPⅢ的紫外吸收图谱显示无无蛋白质和核酸吸收，故PULPⅢ中无蛋白质和核酸存在。

Ⅲ元素分析 

PULPⅢ元素分析结果如表2-1所示：

表2-1 元素分析结果

    由表2-1看出，多糖中N百分含量在7％以下，结合前面紫外吸收光谱分析结果，可以说明样品中不含氨基，为非氨基糖。因为如果是氨基糖，则N元素的含量至少应在7％以上。

Ⅲ的红外吸收图谱 

红外图谱表明，PULPⅢ在3100～3500 cm^-1，2800～2900 cm^-1，1400～1530 cm^-1，1000～1100 cm^-1处有明显的多糖的特征吸收峰。且PULPⅢ在1010～1100 cm^-1有三个强吸收峰，说明有吡喃糖苷键存在。

Ⅲ的单糖组成 

按照水解乙酰化步骤及GC条件，测定标准单糖混合衍生物的GC图谱，求出各种标准单糖及混合单糖的保留时间。

表2-2标准糖与PULPⅢ水解衍生物的保留时间 

根据表2-2可以看出，PULPⅢ中的单糖组成及其比例为Rha:Ara:Man:Glc为0.27:0.28:0.1:0.35。

Ⅲ部分酸水解结果 

PULPⅢ部分酸水解产物的分析（GC）表明：

(1)PULPⅢ主要由Rha、Ara、Man和Glc组成；

(2)PULPⅢ部分酸水解后离心得到的沉淀中含有Rha、Ara、Man和Glc，说明PULPⅢ主链主要由Rha、Ara、Man和Glc构成。

Ⅲ高碘酸和Smith降解结果 

高碘酸氧化结果

NaIO₄氧化后浓度与吸光值关系的回归方程为：y（吸光度值） = 0.0416x（NaIO₄浓度） - 0.0188，R²= 0.999.

PULPⅢ在120h处，吸光度值达到稳定。根据回归方程，高碘酸氧化分析结果见表2-3。

表2-3 PULPⅢ高碘酸氧化分析 

根据表2-3分析，得出PLUPⅢ的高碘酸氧化结果：(1)都有甲酸生成说明一定有1→6连接；(2)高碘酸的消耗量都大于甲酸生成量的二倍，说明可能存在只消耗高碘酸不生成甲酸类型的糖苷键及存在不与高碘酸起反应糖苷键类型的，即可能还有1→2、1→4或1→2，4连接存在及1→3连接。

PULPⅢSmith 降解结果 

PULPⅢ高碘酸氧化产物进行Smith 降解，结果分析见表2-4。

表2-4 Smith 降解产物的气相色谱分析结果 

Smith降解结果表明，PULPⅢ（1）存在不同含量的鼠李糖、阿拉伯糖和葡萄糖，说明存在不被高碘酸氧化的键型（1→3连接方式）；（2）降解产物中存在赤藓醇，而不存在甘油，说明均含有1→4糖苷键。

综合上述高碘酸氧化和Smith降解结果分析，PULPⅢ糖苷键的连接方式以1→6连接为主，同时还存在1→4和1→3连接方式。 

（1）PULPⅢ的理化性质及分子结构初步分析结果： 

由理化性质，糖醛酸含量测定，元素分析、红外和紫外，HPLC综合分析表明PULPⅢ中是一类不含有N、S元素酸性多糖，相对平均分子量为418793.5；

IR图谱显示PULPⅢ具有多糖的特征吸收峰，并且在1010～1100 cm^-1有三个强吸收峰，表明存在吡喃糖苷键；

由单糖组成和部分酸水解结果分析，PULPⅢ单糖组成及其比例为Rha:Ara:Man:Glc为0.27:0.28:0.1:0.35；主链主要由Rha、Ara、Man和Glc组成。

综合高碘酸氧化和Smith降解结果分析， PULPⅢ糖苷键以1→6连接为主，同时还存在1→4和1→3连接方式。关于糖苷键的构型，还有待于用NMR ¹H谱和¹³C谱进行进一步的研究。 

叶下珠多糖PUIPⅢ的体外抗氧化活性初步研究

实验参考Oyaizu 方法，略做稍微改动。取1 mL不同浓度（1、2、3、4、5mg/mL）的多糖溶液于具塞试管中，然后分别加入2.5 mL 0.2 mol/L pH 6.6 磷酸缓冲溶液及1%铁氰化钾溶液，50 ℃水浴反应20 min 后冰浴迅速冷却，加入2.5 mL 10%的三氯乙酸溶液，摇匀，离心（3000 r/min，10 min）。取上清液2.5 mL，加2.5 mL双蒸水和0.5 mL 0.1% FeCl₃，摇匀，反应10 min后，测定700 nm 处的吸光度。

OH）清除率的测定 

在Fenton 反应体系中，H₂O₂ 与Fe^2 + 混合产生﹒OH。由于﹒OH反应活性强，存活时间很短，加入水杨酸，就能有效地捕捉到﹒OH，并生成在510 nm 处有强吸收的有色物质。同时，若在此体系中加入与水杨酸有竞争作用的能够清除﹒OH的物质，则有色物质的生成量变少，吸光度变低，吸光度越低，证明该物质清除﹒OH的能力越强。

在具塞试管中分别加入2 mL 9 mmol/L 的FeSO₄ 溶液、2 mL 9 mmol/L 的水杨酸乙醇溶液，不同浓度（1、2、3、4、5mg/mL）的多糖溶液，最后加入2 mL 8.8mmol/L 的H₂O₂ 溶液启动反应，室温下反应30 min，测定510 nm 处的吸光度，以蒸馏水代替多糖溶液做空白对照。 

自由基清除率计算公式：P=（A₀-A_i）/A₀×100% 

A₀：空白吸光度，A_i：样品吸光度

吸取0.4 mL卵黄悬液[V（卵黄）:V（PBS）=1:25]，1 mL 不同浓度（1、2、3、4、5mg/mL）的多糖溶液，0.4 mL 25 mmol/L的FeSO₄，于具塞试管中，加入0.1 mol/LpH7.45的PBS溶液至总体积为4.0 mL，37℃水浴恒温振荡15 min。取出后加入1.0 mL 20%的TCA，静置10 min后，离心(3500 r/min,10 min)。吸取4.0 mL上清液，加入2.0 mL 0.8%的硫代巴比妥酸，加塞，沸水浴15 min，冷却后，以PBS做参比，测定532 nm处的吸光值。

样品对卵黄脂蛋白脂质过氧化的抑制率表示样品的抗氧化活性的能力，即： 

抑制率I=（A₀-A）/A₀×100%

A₀-对照管的吸光度；A-样品的吸光度

Ⅲ的还原力

实验结果表明各浓度下的PULPⅢ多糖溶液都具有一定的还原能力，并且在1～5mg/mL的浓度范围内，其还原力随浓度的增高而增强。

Ⅲ体外羟基自由基清除率 

实验结果表明各浓度下的PULPⅢ多糖溶液对体外羟基自由基都有一定的清除能力，并且在1～5mg/mL的浓度范围内，其清除率随浓度的增高而增强。5mg/mL时，PULPⅢ的清除率为50.7%%。

Ⅲ抗脂质过氧化能力 

实验结果表明各浓度下的PULPⅢ多糖溶液对LPO具有一定的抑制作用，并且在1～5mg/mL的浓度范围内存在量效关系，其抑制率随浓度的增高而增强。5mg/mL时，PULPⅢ的抑制率为23.7%。

叶下珠多糖PULPⅢ具有一定的还原力、清除体外羟基自由基能力和抗脂质过氧化能力，并且随着多糖浓度的增大而增强。在5mg/mL时，PULPⅢ的还原力为0.940，对体外羟基自由的清除率达到50.7%，对LPO的抑制率分别为23.7%。这说明叶下珠多糖具有一定的抗氧化活性并且其抗氧化活性主要表现在清除体外羟基自由基上。 

叶下珠多糖PUIPⅢ体外抗乙肝病毒研究

本试验采用目前应用最广泛的体外抗乙肝病毒药物筛选模型HepG2.2.2.15细胞模型，从、叶下珠提取分离得到PUIPⅢ与HepG2.2.2.15细胞作用，取其细胞上清液，分别测定其乙肝表面抗原(HBsAg)、e抗原(HBeAg)的滴度变化，来判断该药物是否有效，并采用MTT法测定各部分的细胞毒性。综合这二个指标，对叶下珠多糖PUIPⅢ进行体外抗乙肝药效学试验，并选用临床上已证实的具有抗乙肝病毒作用的阿昔洛韦（ACV）作为阳性对照药物，以评价各部位抗乙肝病毒的效果，以此筛选有效部位或有效成分。

细胞的复苏 

基本步骤： 调配37℃~40℃的温水；从液氮罐中取出HepG2.2.2.15细胞冻存管，立即投入37℃~40℃的温水中快速晃动，直至冻存液完全融解，融解过程在1-2min内完成；将细胞冻存悬液移入离心管，加入约5mL培养液，轻轻吹匀；将细胞悬液800r-1000r/min离心5min，弃上清液；给细胞沉淀加入完全培养液，轻轻吹吸打匀，将细胞悬液移入培养瓶，加足培养液进行培养，置于37℃，5%CO₂细胞培养箱培养。

细胞的传代培养 

HepG2.2.2.15细胞置于5%CO₂，37℃培养。培养基为DMEM，添加10%的胎牛血清，3% L-谷氨酰胺1%，G418 200ug/mL，青霉素100u/mL，链霉素 100u/mL。2.2.15细胞长满培养瓶后，先用EDTA消化10-30秒，再用0.25%胰酶37℃消化3-10min，加培养液吹打，1：3或1：4传代，8天长满，采用细胞记数板记数，配制成10⁵个/mL接种细胞培养板，96孔板每孔0.1mL；24孔板每孔1mL，5%CO₂，37℃培养24小时进行实验。

细胞计数方法 

一般用血细胞计数板，按白细胞计数法进行计数。

取待稀释的细胞悬液1mL加生理盐水做5倍稀释，用10×10的倍数进行计数，中央为红细胞计数用，四角大格为白细胞计数用，计数时仅统计完整的细胞，若聚成一团的细胞按一个细胞进行计数，在一个方格中，如果有细胞位于线上，一般计上线不计下线，计左线不计右线，计数误差不超过±5%，计数后需计算每mL悬液中的细胞数，由于计数板中的每一方格的面积为0.1cm²，高为0.01cm，体积为0.0001cm³。每mL细胞数按式1计算： 

每mL细胞数=(n/4)×10000×5                         （1）

式中：n为四大格细胞总数

MTT比色法测细胞存活率

HepG2.2.2.15细胞培养于96孔培养板，每孔80μl培养液；加入20μlMTT，继续培养3-4h；吸去100μl培养液，加入等量0.04-0.1mol/L盐酸异丙醇溶液，室温下约10min（或将平板置于微型震荡器震荡），使结晶物溶解；在酶标仪上测定光吸收，测定波长为570nm。

MTT法测药物毒性 

将HepG2.2.2.15细胞按10⁵ 个/mL接种于96孔培养板中，0.1 mL/孔，次日用培养液将待测药物分别配成几种不同的浓度，加入细胞孔，每孔浓度加3孔，0.1mL/孔，并设无药细胞对照及阳性对照药。加药后培养4天，弃上清用MTT染色，每孔加1mg/mL的MTT无血清培养液0.1mL，孵育4小时，弃上清，加入0.04mol/L盐酸异丙醇0.1mL溶解后，用570nm波长比色测定OD值，实验重复3次。

测HBsAg、HBeAg分泌规律 

将HepG2.2.2.15细胞10⁵/mL接种于24孔细胞培养板，每孔1.0mL，共10孔，第3、5、8、11、13天收集上清250μl，培养液补足原量至第13天，培养上清于-20℃冻存，最后集中按试剂盒说明书，用ELISA法测定HBsAg、HBeAg。

药物对HBV抑制试验 

将HepG2.2.2.15细胞按10⁵/mL接种于24孔板，每孔1.0mL，次日弃培养液，以待测药物的HepG2.2.2.15细胞的半数毒性浓度为起始浓度用培养液进行倍比稀释，另设无药对照及阳性对照药，培养于37℃、5%CO₂培养箱中。每4天收取上清，并换加原浓度药液继续培养，将收集的上清-20℃冻存，于第12天收集完，集中用ELISA法测定HBsAg、HBeAg，实验重复3次。

ELISA法测HBsAg、HBeAg 

（1）将试剂盒各组分从盒中取出，平衡至室温（18~25℃）。

（2）浓缩洗涤液配制前充分摇匀如有晶体应充分融解，浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水按1：19稀释后使用。 

（3）将微孔板条固定于支架，按序编号。 

（4）每孔加入待测标本50μl，设阴、阳对照各2孔，每孔加入阴、阳对照各50μl，并设空白对照一孔； 

（5）每孔加入酶标记抗体50μl（除空白对照外）、充分混匀后封板，置于37℃环境中孵育30min；

（6）手工洗板；弃去孔内液体，洗涤液贮满各孔，静置5秒后甩干，重复5次后拍干；

（7）每孔加显色剂A液、B液各50μl，充分混匀，封板，置37℃环境中孵育15min；

（8）每孔加入终止液50μl，混匀；

（9）用酶标仪读数，取波长450nm，先用空白空校零。然后读取各孔OD值。（阴性对照OD值低于0.05作为0.05计算，高于0.05按实际OD值计算。）

数据分析

MTT法测药物毒性后可得：

             （2）

根据Red-Meuench法计算半数有毒浓度TC₅₀可得

    （3）

式中：B——

       A——

       C——A-B

采用ELISA法，显色反应完成后用自动酶标仪读取OD值，计算抑制率，以抑制率大于50%为有抑制作用。根据测定数据计算药物抑制抗原百分率；药物抑制抗原半数有效浓度IC₅₀，即HBsAg和HBeAg抑制率为50%时的药物浓度；选择治疗指数TI,TI大于1以上者为有效，在1~2之间说明药物有效，但有一定毒性；大于2则效果较好，毒性较小；指数越大，则疗效越好，安全范围越大。统计学处理，采用t检验作组间均数比较，数据统计分析由SPSS11.5软件处理，P<0.05表示差异有显著性。

    （4）                                                               

         （5）

式中：B——

       A——

       C——A-B

                                       （6）

结果分析

HepG2.2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg的规律

在试验方法所述的培养条件下，本试验所用的HepG2.2.2.15细胞于第3天开始测到有HBsAg、HBeAg分泌，在第8天达到高峰，以后逐渐减弱，持续到第13天，HBsAg、HBeAg分泌的规律如图3所示。

阳性药物（ACV）的体外抗乙肝病毒试验结果 

阳性药物（ACV）对HepG2.2.2.15细胞的毒性

不同浓度ACV处理培养后，MTT试验结果显示对HepG2.2.2.15细胞生长有抑制作用，且其作用具有一定的浓度依赖性，浓度越大，抑制作用越明显。在浓度为0.3125mg/mL时的细胞抑制率为3.51%，此浓度下的细胞存活率为96.49%(>95%)，由此可知ACV的TC₀为0.3125mg/mL。根据公式（3）可得TC₅₀为4.56 mg/mL。ACV的细胞毒性测定结果见表3-1。

表3-1  ACV在HepG2.2.2.15细胞培养中的毒性 

阳性药物（ACV）抑制HepG2.2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg的作用

不同浓度ACV处理培养4天和8天后收集细胞上清液，ELISA法测HBsAg、HBeAg水平显示ACV对HBsAg、HBeAg均有抑制作用，且随着ACV浓度的增加，其抑制作用增强，抑制率增加，显示出一定的量效关系。并且随着培养时间的推移抑制作用也逐渐增强。不同浓度ACV在HepG2.2.2.15细胞培养中对HBsAg、HBeAg的抑制作用结果见表3-2和3-3.

表3-2  ACV在HepG2.2.2.15细胞培养中对HBsAg的抑制作用

表3-3 ACV在HepG2.2.2.15细胞培养中对HBeAg的抑制作用

阳性药物（ACV）体外抗乙肝病的治疗指数（TI）

根据公式（5），我们可以得到ACV在第8天抑制HepG2.2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg的时的IC₅₀分别为0.58mg/mL 和0.49mg/mL。根据公式（6）可以得到ACV对HBsAg、HBeAg的治疗指数TI分别为7.86和9.31。具体结果见表3-4。

表3-4  ACV在HepG2.2.2.15细胞培养中对HBsAg和HBeAg的IC₅₀和TI 

叶下珠多糖PUIPⅢ的体外抗乙肝病毒作用

叶下珠多糖PUIPⅢ对HepG2.2.2.15细胞的毒性

不同浓度叶下珠多糖PUIPⅢ处理组培养后，MTT试验结果显示对HepG2.2.2.15细胞生长有抑制作用，且其作用具有一定的浓度依赖性，浓度越大，抑制作用越明显。在浓度为3.12mg/mL时的细胞抑制率为1.52%，此浓度下的细胞存活率为98.48%(>95%)，由此可知叶下珠多糖PUIPⅢ的TC₀为3.12mg/mL。根据公式1-2可得TC₅₀为45.41 mg/ml。叶下珠多糖PUIPⅢ的细胞毒性测定结果见表3-5。

表3-5  叶下珠多糖PUIPⅢ在HepG2.2.2.15细胞培养中的毒性 

叶下珠多糖PUIPⅢ抑制HepG2.2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg的作用

不同浓度叶下珠多糖PUIPⅢ处理培养4天和8天后收集细胞上清液，ELISA法测HBsAg、HBeAg水平显示叶下珠多糖PUIPⅢ对HBsAg、HBeAg均有抑制作用，且随着叶下珠多糖PUIPⅢ浓度的增加，其抑制作用增强，抑制率增加，显示出一定的量效关系。并且随着培养时间的推移抑制作用也逐渐增强。不同浓度叶下珠多糖PUIPⅢ在HepG2.2.2.15细胞培养中对HBsAg、HBeAg的抑制作用结果见表3-6和3-7

表3-6 叶下珠多糖PUIPⅢ在HepG2.2.2.15细胞培养中对HBsAg的抑制作用

表3-7 叶下珠多糖PUIPⅢ在HepG2.2.2.15细胞培养中对HBeAg的抑制作用

叶下珠多糖PUIPⅢ体外抗乙肝病的治疗指数（TI）

根据公式（5），我们可以得到叶下珠多糖PUIPⅢ在第8天抑制HepG2.2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg的时的IC₅₀分别为3.82mg/mL 和14.60mg/mL。根据公式（6）可以得到叶下珠多糖PUIPⅢ对HBsAg、HBeAg的治疗指数TI分别11.89为和3.11。具体结果见表3-8。

表3-8  叶下珠多糖PUIPⅢ在HepG2.2.2.15细胞培养中对HBsAg和HBeAg的IC₅₀和TI 

讨论

本试验采用了MTT法进行细胞毒性检测，结果显示叶下珠多糖PUIPⅢHepG2.2.2.15细胞的最大无毒浓度(TC₀) 3.12 mg/mL；半数有毒浓度(TC₅₀) >45.41mg/mL。

本试验采用ELISA技术分析了叶下珠多糖PUIPⅢ在HepG2.2.2.15细胞培养中对HBsAg、HBeAg的抑制作用，结果显示叶下珠多糖PUIPⅢ在无毒浓度下设定的7个浓度中，除最低浓度外，其它各浓度组与细胞对照组相比均显示明显的抑制作用，且随着叶下珠多糖PUIPⅢ浓度的增加，其抑制作用增强，抑制率增加，显示出一定的量效关系。目前临床上用于评价药物的治疗效果指标为治疗指数(TI)，当TI<1时为药物无效，当1<TI<2时药物低效有毒，当TI>2时药物有效低毒。由此可知，叶下珠多糖PUIPⅢ对HBsAg、HBeAg的治疗指数有效低毒(TI分别为11.89和3.11)；阳性对照药物阿昔洛韦对HBsAg、HBeAg的治疗指数有效低毒(TI分别为7.86和9.31)。 

综上所述，叶下珠多糖PUIPⅢ在HepG2.2.2.15细胞培养中对HBsAg、HBeAg均有一定的抑制作用。 

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。 

Claims (3)

1.一种叶下珠多糖PUIPⅢ在制备抗乙肝病毒的药物中的应用。

2.一种叶下珠多糖PUIPⅢ在制备保肝护肝保健品中的应用。

3.根据权利要求1或2所述的叶下珠多糖PUIPⅢ的应用，其特征在于：所述的叶下珠多糖PUIPⅢ是由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖和葡萄糖4个单糖组成，鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖和葡萄糖的摩尔比为0.27：0.28：0.1：0.35，分子量为418793.5；由药用植物叶下珠经人工提取、分离纯化而成。

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