CN103053429A - 牵牛子离体胚轴植株再生的方法 - Google Patents
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Abstract
牵牛子离体胚轴植株再生的方法由“建立无菌苗培养体系—胚轴诱导产生不定芽—继代增殖培养得到分化芽—培养生根苗—练苗移栽获得再生植株”5个环节组成，选用圆叶牵牛子外植体接种到特制的培养基上，在无菌的条件下进行培养，形成再生植株，该方法繁殖速度快，成苗性状一致，不受季节限制，并可防止真菌、细菌、特别是病毒对牵牛子危害。
Description
技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域，特别适用于牵牛子离体胚轴植株再生的方法。
背景技术
牵牛子系旋花科植物裂叶牵牛(Pharbitis nil L.)或圆叶牵牛(Pharbitis purpurea L.)的成熟种子。牵牛子始载于名医别录，又名黑丑、白丑。具有泻水通便消痰涤饮杀虫攻积的功效，用于治疗水肿胀满、二便不通、痰饮积聚气逆喘咳、虫积腹痛及蛔虫、绦虫病等。现代临床医学亦多见有关牵牛子的报道，如在利用钙调神经磷酸酶的分子模型筛选针对老年痴呆症的天然药物时,发现牵牛子粗提物具有明显激活钙调神经磷酸酶的作用，并有药理试验证明它能明显改善记忆，目前市场的需求量很大且在年年增加。牵牛为1年生缠绕性草本植物，秋末果实成熟、果壳未开裂时采割植株，晒干，打下种子。目前入药的牵牛子来自野生种和栽培种的都有，野生种因生长分散，采收种子非常不容易，总体品质也较差；种植牵牛存在着种子质量差异大、保存期短、发芽率低、发芽时间差别大、幼苗生长缓慢等问题；采用扦插、分株、贮根等方法繁殖牵牛子种苗，常常因为感染病害、真菌和细菌等，造成病毒长期累积而导致牵牛子产量及效力降低；另外，种子采收每年只有一次，产量有限，很难满足实际需求。应用植物组织培养方法生产药用植物是一个理想的选择，这种方法通过培养植物的离体器官、组织或细胞产生完整植株，组织培养中的细胞生长速度要比植物正常生长速度快，接近于分生组织的生长速度，亦可以将各种初级化合物，转化成医药上更有效的化合物，并且具有不受地区、季节与气候限制，便于工厂化生产等优势。植物的组织，甚至单个细胞都具有再生能力，因此利用组织培养手段快速繁殖药用植物种苗，或者利用组织培养或细胞培养手段直接生产药物便随之日益发展。植物组织培养技术中，激素或生长调节物质对离体培养组织的分化起着重要的作用，激素的种类、相对浓度和绝对浓度直接影响根和芽再生，培养组织内的激素水平与再生过程关系密切，另外，由于同一植物的不同部位的再生能力差异很大，不同器官的组织培养需要不同的方法和培养基配比，因此，不同的植物或器官对组织培养的方法有不同的要求。到目前为止，有关牵牛子的组织培养技术或方法还未见有报道。
发明内容
本发明的目的在于利用组织培养技术，提供一种用于牵牛子离体胚轴植株再生的方法。
本发明采用圆叶牵牛的种子—牵牛子，通过组织培养的方法，取其无菌苗的胚轴离体培养获得牵牛子再生植株，技术方案由“建立无菌苗培养体系—胚轴诱导产生不定芽—继代增殖培养得到分化芽—培养生根苗—练苗移栽获得再生植株”五个环节组成，无菌苗由圆叶牵牛种子经过处理接种于MS固体培养基培养获得，使用0.1％氯化汞溶液进行种子表面消毒的时间控制为10min；无菌苗胚轴诱导产生不定芽所用的诱导培养基为MS培养基+1.0～2.0mg/l BA+0.1～0.2mg/l AA+3%蔗糖+0.9%琼脂；不定芽经继代增殖培养得到分化芽所用的增殖培养基为MS培养基+1.0～2.0 mg/l BA + 0.1～0.2mg/l AA+ 3%蔗糖+ 0.9%琼脂；分化芽培养生根苗所用的生根培养基为1/2MS培养基+0.3～0.5mg/l NAA+ 3%蔗糖+0.9%琼脂；生根苗的根长至1cm左右时进行练苗移栽，培植成再生植株，技术方案的前4个环节在无菌条件下进行，炼苗移栽培养基质为灭菌草炭+珍珠岩=2:1。
本发明的技术方案通过以下步骤完成：
步骤1.建立无菌苗培养体系，获得无菌苗：种子处理是挑选成熟饱满的圆叶牵牛种子，流水冲洗20min，放入75％乙醇中浸泡30s，取出，用无菌水冲洗3-5次，加入0.1％氯化汞溶液中，进行种子表面消毒，控制消毒时间10min，时间不足达不到消毒效果，时间过长影响种子发芽率，将消毒好的种子取出用无菌水冲洗4-5次后接种于MS固体培养基上，整个操作在超净工作台进行，最后将接种后的MS固体培养基放入培养室，培养20～25d，获得无菌苗。
步骤2.胚轴诱导产生不定芽：将步骤1中无菌苗的胚轴切成0.3～0.5cm大小的段儿，置于诱导培养基培养，诱导培养基为MS基本培养基+1.0～2.0mg/l 6-BA + 0.1～0.2mg/l NAA+ 3%蔗糖+ 0.9%琼脂，pH5.8-6.0， 7～9d即产生黄绿色愈伤，15～20d分化出不定芽。
步骤3.继代增殖培养得到丛生芽：将步骤2分化出的不定芽切分后置于增殖培养基上进行继代培养，增殖培养基为MS培养基+1.0～2.0mg/l 6-BA+0.1～0.2mg/l NAA+3%蔗糖+0.9%琼脂，pH5.8-6.0，培养13～17d分化成丛生芽，芽的增殖数量达到6-8个，此过程可重复操作，使其不断增殖。
步骤4.培养生根苗，获得完整植株：丛生芽经培养长至约2~3cm高时，将其分成单株，转移到生根培养基上进行生根培养，生根培养基为：1/2MS + 0.3～0.5mg/l NAA+ 3%蔗糖+ 0.9% 琼脂，pH5.8-6.0，7d左右可分化出不定根，形成完整的牵牛子植株—生根苗，生根率达100%。
以上4个步骤均在无菌条件下进行，培养条件同为温度25±2°C，光照时间12h/d，光照强度2000～3000Lux，夜间保持黑暗。
步骤5.练苗移栽：当生根苗的根长到1cm左右时将生根苗转移到智能温室，在自然光照下驯化3天，使生根苗逐渐适应周围环境，取出生根苗洗净根部的附着物，用0.1%的高锰酸钾溶液浸苗消毒1min，移入苗床进行种苗培育，移栽基质选用灭菌草炭加珍珠岩，二者比例为2:1，移栽期内保持部分遮光和适当的湿度，长出新根后，适当增加光照，13～15d可至正常生长，期间每周喷洒1次0.1%多菌灵，最后移入土壤形成再生植株。
本发明利用植物细胞的全能性和再生能力，选用牵牛子外植体接种到特制的培养基上，在无菌的条件下进行培养，产生愈伤组织、长出不定芽、生出不定根、最终形成再生植株。该发明技术使牵牛子的繁殖达到如下效果：（1）繁殖速度快：不受种子发芽率的影响，选用优良母株的外植体，经离体培养，一年能繁殖几万到十几万株新的优良个体；（2）脱毒：本技术是防止真菌、细菌、特别是病毒对牵牛子危害的一项最有效、最快捷、最实用的方法；（3）辅助育种：本技术可将诱变和筛选出的优良品种快速繁殖，提高选择效率，培育出高产、优质、抗病、抗逆性强的新品种；（4）组培苗性状一致：本技术繁殖的牵牛子能够保持后代植株的一致性和整齐度，便于工厂化生产的管理，这点对于药用植物尤为重要；（5）不受季节限制：本技术采用人工可控条件，室内培养，可以周年生产；（6）节省土地和资源：本方法可在室内集中实施，立体分层生产，集中管理，最大限度地节省土地、人力等资源。另外，该技术建立了牵牛子分子育种的受体系统，为以后牵牛子开展转基因试验受体的培养、开展分子育种目的性状基因的供体总DNA片段导入、分离目的基因和构建重组分子等技术的应用提供了基础材料和技术支持。
附图说明
图1为无菌苗；
图2为胚轴愈伤及不定芽；
图3为丛生苗；
图4为生根苗。
具体实施方式
实施例1.
步骤1.建立无菌苗培养体系，获得无菌苗：挑选成熟饱满的圆叶牵牛种子，流水冲洗20min，放入75％乙醇中浸泡30s，取出，用无菌水冲洗4次，加入0.1％氯化汞溶液中，进行种子表面消毒，控制时间10min，将消毒好的种子取出用无菌水冲洗4次后接种于MS固体培养基上，整个操作在超净工作台进行，最后将接种后的MS固体培养放入培养室，培养时间25d，获得无菌苗，见图1。
步骤2.胚轴诱导产生不定芽：将步骤1中无菌苗的胚轴切成0.3～0.5cm大小，置于诱导培养基培养，诱导培养基为MS基本培养基+1.0 mg/l 6-BA + 0.1mg/l NAA+ 3%蔗糖+ 0.9%琼脂，pH5.8-6.0，9d即产生黄绿色愈伤，20d分化出不定芽，见图2。
步骤3.继代增殖培养：将步骤2分化出的不定芽切分后置增殖培养基上进行继代培养，增殖培养基为MS培养基+1.0mg/l 6-BA + 0.1mg/l NAA+ 3%蔗糖+ 0.9%琼脂，pH5.8-6.0，培养17d分化成丛生芽，见图3，芽的增殖数量为7个。
步骤4.培养生根苗：选2～3cm高的丛生芽，将其分成单株，转移到生根培养基上进行生根培养，生根培养基为1/2MS+0.3mg/l NAA+3% 蔗糖+0.9%琼脂，pH5.8-6.0，8d即分化出不定根，形成完整的牵牛子植株—生根苗，生根率100%，见图4。
以上4个步骤均在无菌条件下进行，培养条件同为温度25±2°C，光照时间12h/d，光照强度2000～3000Lux，夜间保持黑暗。
步骤5.练苗移栽：当生根苗的根长到1cm左右时将生根苗转移到智能温室，在自然光照下驯化3天，使生根苗逐渐适应周围环境，取出生根苗洗净根部的附着物，用0.1%的高锰酸钾溶液浸苗消毒1min，移入苗床进行种苗培育，移栽基质选用灭菌草炭加珍珠岩，二者比例为2:1，移栽期内保持部分遮光和适当的湿度，长出新根后，适当增加光照，15d可至正常生长，期间每周喷洒1次0.1%多菌灵，最后移入土壤形成再生植株。
实施例2.
步骤1.建立无菌苗培养体系，获得无菌苗：挑选成熟饱满的圆叶牵牛种子，流水冲洗20min，放入75％乙醇中浸泡30s，取出，用无菌水冲洗5次，加入0.1％氯化汞溶液中，进行种子表面消毒，控制时间10min，将消毒好的种子取出用无菌水冲洗4-5次后接种于MS固体培养基上，整个操作在超净工作台进行，最后将接种后的MS固体培养放入培养室，培养时间20d，获得无菌苗。
步骤2.胚轴诱导产生不定芽：将步骤1中无菌苗的胚轴切成0.3～0.5cm大小，置于诱导培养基培养，诱导培养基为MS基本培养基+2.0 mg/l 6-BA + 0.2mg/l NAA+ 3%蔗糖+ 0.9%琼脂，pH5.8-6.0，7d即产生黄绿色愈伤，15d分化出不定芽。
步骤3.继代增殖培养：将步骤2分化出的不定芽切分后置增殖培养基上进行继代培养，增殖培养基为MS培养基+2.0mg/l 6-BA + 0.2mg/l NAA+ 3%蔗糖+ 0.9%琼脂，pH5.8-6.0，培养14d分化成丛生芽，增殖倍数为8。
步骤4.培养生根苗：选2～3cm高的丛生芽，将其分成单株，转移到生根培养基上进行生根培养，生根培养基为1/2MS+0.5mg/l NAA+3% 蔗糖+0.9% 琼脂，pH5.8-6.0，6d即分化出不定根，形成完整的牵牛子植株—生根苗，生根率100%。
以上4个步骤均在无菌条件下进行，培养条件同为温度25±2°C，光照时间12h/d，光照强度2000～3000Lux，夜间保持黑暗。
步骤5.练苗移栽：当生根苗的根长到1cm左右时将生根苗转移到智能温室，在自然光照下驯化3天，使生根苗逐渐适应周围环境，取出生根苗洗净根部的附着物，用0.1%的高锰酸钾溶液浸苗消毒1min，移入苗床进行种苗培育，移栽基质选用灭菌草炭加珍珠岩，二者比例为2:1，移栽期内保持部分遮光和适当的湿度，长出新根后，适当增加光照，13d可至正常生长，期间每周喷洒1次0.1%多菌灵，最后移入土壤形成再生植株。
实施例3.
步骤1.建立无菌苗培养体系，获得无菌苗：挑选成熟饱满的圆叶牵牛种子，流水冲洗20min，放入75％乙醇中浸泡30s，取出，用无菌水冲洗3次，加入0.1％氯化汞溶液中，进行种子表面消毒，控制时间10min，将消毒好的种子取出用无菌水冲洗4-5次后接种于MS固体培养基上，整个操作在超净工作台进行，最后将接种后的MS固体培养放入培养室，培养时间23d，获得无菌苗。
步骤2.胚轴诱导产生不定芽：将步骤1中无菌苗的胚轴切成0.3～0.5cm大小，置于诱导培养基培养，诱导培养基为MS基本培养基+1.5 mg/l 6-BA + 0.15mg/l NAA+ 3%蔗糖+ 0.9%琼脂，pH5.8-6.0，8d即产生黄绿色愈伤，17d分化出不定芽。
步骤3.继代增殖培养：将步骤2分化出的不定芽切分后置增殖培养基上进行继代培养，增殖培养基为MS培养基+1.5mg/l 6-BA + 0.15mg/l NAA+ 3%蔗糖+ 0.9%琼脂，pH5.8-6.0，培养15d分化成丛生芽，增殖倍数为6。
步骤4.培养生根苗：选2～3cm高的丛生芽，将其分成单株，转移到生根培养基上进行生根培养，生根培养基为：1/2MS + 0.4mg/l NAA+ 3% 蔗糖+ 0.9% 琼脂，pH5.8-6.0，7d即分化出不定根，形成完整的牵牛子植株—生根苗，生根率100%。
以上4个步骤均在无菌条件下进行，培养条件同为温度25±2°C，光照时间12h/d，光照强度2000～3000Lux，夜间保持黑暗。
步骤5.练苗移栽：当生根苗的根长到1cm左右时将生根苗转移到智能温室，在自然光照下驯化3天，使生根苗逐渐适应周围环境，取出生根苗洗净根部的附着物，用0.1%的高锰酸钾溶液浸苗消毒1min，移入苗床进行种苗培育，移栽基质选用灭菌草炭加珍珠岩，二者比例为2:1，移栽期内保持部分遮光和适当的湿度，长出新根后，适当增加光照，14d可至正常生长，期间每周喷洒1次0.1%多菌灵，最后移入土壤形成再生植株。
Claims (5)
1.牵牛子离体胚轴植株再生的方法，其特征在于：本方法由“建立无菌苗培养体系—胚轴诱导产生不定芽—继代增殖培养得到分化芽—培养生根苗—练苗移栽获得再生植株”5个环节组成，无菌苗由圆叶牵牛种子经过处理接种于MS固体培养基培养获得；无菌苗胚轴诱导产生不定芽所用的诱导培养基为MS培养基+1.0～2.0mg/l BA+0.1～0.2mg/l AA+3%蔗糖+0.9%琼脂；不定芽经继代增殖培养得到分化芽所用的增殖培养基为MS培养基+1.0～2.0mg/l BA+0.1～0.2mg/l AA+3%蔗糖+0.9%琼脂；分化芽培养生根苗所用的生根培养基为1/2MS培养基+0.3～0.5mg/l NAA+3%蔗糖+0.9%琼脂。
2.如权利要求1所述的牵牛子离体胚轴植株再生的方法，其特征在于：种子处理是将成熟饱满的圆叶牵牛种子，流水冲洗20min，放入75％乙醇中浸泡30s，取出，用无菌水冲洗3-5次，加入0.1％氯化汞溶液中，进行种子表面消毒，控制消毒时间10min，消毒好的种子取出用无菌水冲洗4-5次后接种于MS固体培养基上，放入培养室。
3.如权利要求1所述的牵牛子离体胚轴植株再生的方法，其特征在于：建立无菌苗培养体系、胚轴诱导产生不定芽、继代增殖培养得到分化芽和培养生根苗4个环节均无菌条件下进行，培养条件同为温度25±2°C，光照时间12h/d，光照强度2000～3000Lux，夜间保持黑暗。
4.如权利要求1所述的牵牛子离体胚轴植株再生的方法，其特征在于：无菌苗培养时间为20～25d，胚轴诱导产生不定芽时间为15～20d，继代增殖培养时间为13～17d，培养生根苗时间为7d，生根率为100%，练苗移栽时间为13～15d。
5.如权利要求1所述的牵牛子离体胚轴植株再生的方法，其特征在于：练苗移栽是在生根苗的根长到1cm左右时转移到智能温室，在自然光照下驯化3天，取出生根苗洗净根部附着物，用0.1%的高锰酸钾溶液浸苗消毒1min，移入移栽基质，每周喷洒1次0.1%多菌灵，最后移入土壤形成再生植株。
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