CN103052642A - 三环吡唑并嘧啶衍生物的晶体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了抑制HSP90作用的三环吡唑并嘧啶化合物的盐酸盐及其晶体。本发明提供了抑制HSP90的ATP酶活性并且具有抗肿瘤活性的2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺的盐酸盐，其晶体，包含其的药物，包含其的抗癌剂等。

Description

三环吡唑并嘧啶衍生物的晶体
技术领域
本发明涉及具有抑制热休克蛋白90 (HSP90)作用的三环吡唑并嘧啶骨架的化合物的盐酸盐。
背景技术
HSP90是主要的细胞内伴侣蛋白。伴侣蛋白是结合各种蛋白质以帮助折叠结合蛋白的蛋白质。通常将折叠需要HSP90的一组蛋白质称为HSP90客户蛋白(client protein)。
据推测，HSP90以及多种蛋白质如辅陪伴分子(cochaperone)、伙伴蛋白(partner protein)和免疫亲和素参与HSP90折叠客户蛋白的机制并推测它们协作地帮助折叠HSP90客户蛋白(非专利文献1)；然而，机制的细节仍不足够清楚。
据推测HSP90客户蛋白与HSP90、辅陪伴分子等形成复合物，然后构象变化为成熟蛋白质并推测当它们未正常地被HSP90等折叠时蛋白质被蛋白酶体泛素化并降解 (非专利文献1至4)。
近年来，预期将HSP90抑制剂作为多种疾病的治疗剂的候选者 (例如，癌症、神经退行性疾病如阿尔茨海默病、心血管疾病、传染病、自身免疫疾病和与凋亡细胞损伤有关的疾病) (非专利文献2)。
特别地，由于包括用于抗癌剂的分子靶标的许多癌症相关的蛋白质是HSP90客户蛋白，因此预期将HSP90抑制剂作为抗癌剂的候选者。例如，与癌症发生和发展有关的多种蛋白质如Her2、Raf、Akt和端粒酶被称为HSP90客户蛋白(非专利文献1)。据推测，这些癌症相关的蛋白质从未成熟蛋白质变为成熟蛋白质并起作用以分别通过使用HSP90作为伴侣蛋白引起细胞的恶性转化。HSP90是不仅在癌细胞中而且在正常细胞中存在的蛋白质，并且据报道，癌细胞中与客户蛋白的亲合力以及其伴侣活性必须的ATP酶活性比正常细胞中高 (非专利文献1至3)。因此，认为HSP90抑制剂能够以癌细胞-特异性方式同时使多种癌症相关的蛋白质失活，并被预期作为有效并具有广泛的抗肿瘤范围的抗癌剂的候选者。
通常将格尔德霉素、除莠霉素、17-烯丙基氨基格尔德霉素 (17-AAG)等称为HSP90抑制剂 (非专利文献1至4)。这些化合物在HSP90的N-末端处结合ATP结合囊并抑制HSP90与ATP的结合从而抑制HSP90作为伴侣蛋白的功能。除了上述化合物之外报道了多种抑制HSP90的化合物 (专利文献1、专利文献2、专利文献3、非专利文献5和非专利文献6)并且还报道了三环吡唑并嘧啶衍生物 (专利文献4)。
此外，许多公开报道了三环吡唑并嘧啶衍生物和具有稠环结构的化合物（其还具有三个组成性杂环）的用于抗癌目的的预期用途(专利文献5至9以及非专利文献7和8)。
引用列表
专利文献
专利文献1：WO2005/28434
专利文献2：WO2008/049105
专利文献3：WO2008/093075
专利文献4：WO2008/035629
专利文献5：WO2004/047755
专利文献6：WO2006/015263
专利文献7：WO2005/021568
专利文献8：WO1998/043991
专利文献9：WO2008/100447
非专利文献
非专利文献1：Medicinal Research Reviews (2006) Vol. 26, No. 3, 310-338
非专利文献2：TRENDS in Molecular Medicine (2004) Vol. 10, No. 6, 283-290
非专利文献3：British Journal of Pharmacology (2005) 146, 769-780
非专利文献4：TRENDS in Biochemical Sciences (2006) Mar, 31 (3), 164-172
非专利文献5：Journal of Medicinal Chemistry (2005) Vol. 48, No. 13, 4212-4215
非专利文献6：Journal of Medicinal Chemistry (2006) Vol. 49, No. 1, 381-390
非专利文献7：Organic & Biomolecular Chemistry (2003) Vol. 1, No. 23, 4166-4172
非专利文献8：Organic & Biomolecular Chemistry (2006) Vol. 4, No. 9, 1723-1729。
发明概述
本发明要解决的问题
三环吡唑并嘧啶衍生物显示优异的HSP90抑制活性并预期用作药物，并且特别地用作抗癌剂。此外，如果通过改善这类衍生物的物理性质能提高其效能，例如改善溶解度以增强其吸收性，或者如果通过减少其剂量能降低其副作用，则所述衍生物用于医学目的的有用性能被进一步提高。
此外，要求用于药物的物质具有特别高的纯度从而不具有通过其杂质导致的不期望的副作用(例如，毒性)。此外，对于药物的药物物质重要的是长时间储存而保持其质量。因此，工业上重要的是发现能被长时间储存的高度稳定的晶体。
解决问题的方法
为了提高三环吡唑并嘧啶衍生物作为用于医学目的的新化合物的有效性，所述衍生物抑制HSP90的ATP酶活性并具有抗肿瘤活性，本发明人进行了广泛研究，包括制备衍生物的盐等用于提高其溶解度、纯度、稳定性等。结果，发明人发现三环吡唑并嘧啶衍生物的二盐酸盐和单盐酸盐，其在溶解度方面优于吡唑并嘧啶衍生物本身(游离形式)，并且还发现三环吡唑并嘧啶衍生物的单盐酸盐，其在溶解度方面优于三环吡唑并嘧啶衍生物本身并且具有少的杂质含量、少的残留溶剂含量以及优异的稳定性。此外，本发明人建立了用于可靠制备这种单独的盐的方法，由此完成本发明。
更具体地，本发明涉及下列[1]至[18]：
[1] 由下式(1)表示的2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺的盐酸盐：
Figure 2011800408532100002DEST_PATH_IMAGE001
。
[2] 由[1]所述的式(1)表示的2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺的二盐酸盐的晶体。
[3] 如[2]所述的晶体，在通过使用铜Kα辐射 (波长λ = 1.54埃)照射获得的X射线粉末衍射图中，其具有图1显示的X射线衍射图。
[4] 如[2]所述的晶体，在通过使用铜Kα辐射 (波长λ = 1.54埃)照射获得的X射线粉末衍射图中，其显示在衍射角2θ为7.73、24.70、26.01和27.29处的特征峰。
[5] 如[2]或[4]所述的晶体，在通过使用铜Kα辐射 (波长λ = 1.54埃)照射获得的X射线粉末衍射图中，其显示在衍射角2θ为7.73、9.78、12.58、14.36、15.84、16.71、17.17、18.40、19.58、21.31、22.85、23.62、24.13、24.70、26.01、27.29、28.58、29.37、30.65、31.38、33.52、35.25和36.87处的主峰。
[6] 由[1]所述的式(1)表示的2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺的单盐酸盐的晶体。
[7] 如[6]所述的晶体，在通过使用铜Kα辐射 (波长λ = 1.54埃)照射获得的X射线粉末衍射图中，其具有图2显示的X射线衍射图。
[8] 如[6]所述的晶体，在通过使用铜Kα辐射 (波长λ = 1.54埃)照射获得的X射线粉末衍射图中，其显示在衍射角2θ为9.43、12.70、13.03、15.33、16.10、16.84、18.55、20.21、20.89、21.32、22.93、24.73、25.10、25.40、26.10、26.53、26.95、27.60、27.88、28.52、29.63、29.95、31.55、32.13、33.40、34.95和38.70处的主峰。
[9] 如[6]所述的晶体，在通过使用铜Kα辐射 (波长λ = 1.54埃)照射获得的X射线粉末衍射图中，其具有图3显示的X射线衍射图。
[10] 如[6]所述的晶体，在通过使用铜Kα辐射 (波长λ = 1.54埃)照射获得的X射线粉末衍射图中，其显示在衍射角2θ为8.07、9.45、13.07、15.39、16.16、16.90、20.83、24.29、24.80、28.56、28.85、31.26、32.17、32.87和34.11处的主峰。
[11] 由[1]所述的式(1)表示的2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺的盐酸盐的晶体，其中乙醇的含量为5000 ppm或更少。
[12] 如[11]所述的晶体，其中所述盐酸盐是单盐酸盐。
[13] 制备[1]所述的盐酸盐的方法，其包括将氯化氢溶液滴加至由[1]所述的式(1)表示的2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺的溶液或悬浮液中。
[14] 制备[2]所述的二盐酸盐晶体的方法，其包括以相对于下述化合物的2当量或更多的量将氯化氢溶液滴加至由权利要求1所述的式(1)表示的2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺的溶液或悬浮液中。
[15] 制备[6]所述的单盐酸盐晶体的方法，其包括以相对于下述化合物的1当量或更多至5当量或更少的量将氯化氢溶液滴加至由权利要求1所述的式(1)表示的2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺的溶液或悬浮液中。
[16] 药物，其包含[1]所述的盐酸盐作为活性成分。
[17] 抗肿瘤剂，其包含[1]所述的盐酸盐。
[18] 药物组合物，其包含[2]至[12]中任一个所述的晶体。
发明优点
根据本发明，提供了具有HSP90抑制活性的2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺的二盐酸盐和单盐酸盐，其具有甚至更好的溶解度。还提供了单盐酸盐，其具有少的杂质含量、少量的残留溶剂以及优异的稳定性。本发明的化合物适合用作抗癌剂。
附图简述
 图1示出了在实施例2中获得的晶体的X射线粉末衍射图。图的纵轴 (从底部添加至标度的数值为0、10、20、30和40)显示衍射强度 (Lin (计数))，并且横轴 (从左边添加至标度的数值为3、10、20、30和40)显示衍射角2θ的值。
 图2示出了在实施例3中获得的晶体的X射线粉末衍射图。图的纵轴 (从底部添加至标度的数值为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30)显示衍射强度 (Lin (计数))，并且横轴 (从左边添加至标度的数值为3、10、20、30和40)显示衍射角2θ的值。
 图3示出了在实施例6中获得的晶体的X射线粉末衍射图。图的纵轴 (从底部添加至标度的数值为0、10、20、30、40、50、60和70)显示衍射强度 (Lin (计数))，并且横轴 (从左边添加至标度的数值为3、10、20、30和40)显示衍射角2θ的值。
 图4示出了在实施例2中获得的晶体的X射线粉末衍射图，所述X射线粉末衍射图已经添加了峰数。图的纵轴 (从底部添加至标度的数值为0、10、20、30和40)显示衍射强度 (Lin (计数))，并且横轴 (从左边添加至标度的数值为3、10、20、30和40)显示衍射角2θ的值。
 图5示出了在实施例3中获得的晶体的X射线粉末衍射图，所述X射线粉末衍射图已经添加了峰数。图的纵轴 (从底部添加至标度的数值为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30)显示衍射强度 (Lin (计数))，并且横轴 (从左边添加至标度的数值为3、10、20、30和40)显示衍射角2θ的值。
 图6示出了在实施例6中获得的晶体的X射线粉末衍射图，所述X射线粉末衍射图已经添加了峰数。图的纵轴 (从底部添加至标度的数值为0、10、20、30、40、50、60和70)显示衍射强度 (Lin (计数))，并且横轴 (从左边添加至标度的数值为3、10、20、30和40)显示衍射角2θ的值。
 图7示出了在实施例1中获得的晶体的X射线粉末衍射图。图的纵轴 (从底部添加至标度的数值为0、200、400、600、800和1000)显示以计数/秒(cps)为单位的衍射强度，并且横轴 (从左边添加至标度的数值为10.000、20.000和30.000)显示衍射角2θ的值。
 图8示出了在实施例4中获得的晶体的X射线粉末衍射图。图的纵轴 (从底部添加至标度的数值为0、200、400、600、800、1000、1200和1400)显示以计数/秒(cps)为单位的衍射强度，并且横轴 (从左边添加至标度的数值为10.000、20.000和30.000)显示衍射角2θ的值。
 图9示出了在实施例5中获得的晶体的X射线粉末衍射图。图的纵轴 (从底部添加至标度的数值为0、200、400、600、800、1000和1200)显示以计数/秒(cps)为单位的衍射强度，并且横轴 (从左边添加至标度的数值为10.000、20.000和30.000)显示衍射角2θ的值。
 图10为在实施例7中获得的晶体的X射线粉末衍射图。图的纵轴 (从底部添加至标度的数值为0、1000、2000、3000和4000)显示以计数/秒(cps)为单位的衍射强度，并且横轴 (从左边添加至标度的数值为10.000、20.000和30.000)显示衍射角2θ的值。
 图11示出了在实施例8中获得的晶体的X射线粉末衍射图。图的纵轴 (从底部添加至标度的数值为0、500、1000、1500和2000)显示以计数/秒(cps)为单位的衍射强度，并且横轴 (从左边添加至标度的数值为10.000、20.000和30.000)显示衍射角2θ的值。
 图12示出了在实施例9中获得的晶体的X射线粉末衍射图。图的纵轴 (从底部添加至标度的数值为0、1000、2000、3000、4000和5000)显示以计数/秒(cps)为单位的衍射强度，并且横轴 (从左边添加至标度的数值为10.000、20.000和30.000)显示衍射角2θ的值。
 图13示出了在实施例10中获得的晶体的X射线粉末衍射图。图的纵轴 (从底部添加至标度的数值为0、1000、2000、3000、4000和5000)显示以计数/秒(cps)为单位的衍射强度，并且横轴 (从左边添加至标度的数值为10.000、20.000和30.000)显示衍射角2θ的值。
 图14示出了在实施例11中获得的晶体的X射线粉末衍射图。图的纵轴 (从底部添加至标度的数值为0、1000、2000、3000、4000、5000和6000)显示以计数/秒(cps)为单位的衍射强度，并且横轴 (从左边添加至标度的数值为10.000、20.000和30.000)显示衍射角2θ的值。
 图15示出了在实施例12中获得的晶体的X射线粉末衍射图。图的纵轴 (从底部添加至标度的数值为0、1000、2000、3000、4000、5000和6000)显示以计数/秒(cps)为单位的衍射强度，并且横轴 (从左边添加至标度的数值为10.000、20.000和30.000)显示衍射角2θ的值。
 图16示出了在实施例13中获得的晶体的X射线粉末衍射图。图的纵轴 (从底部添加至标度的数值为0、1000、2000、3000、4000、5000和6000)显示以计数/秒(cps)为单位的衍射强度，并且横轴 (从左边添加至标度的数值为10.000、20.000和30.000)显示衍射角2θ的值。
 图17示出了在实施例14中获得的晶体的X射线粉末衍射图。图的纵轴 (从底部添加至标度的数值为0、1000、2000、3000、4000、5000和6000)显示以计数/秒(cps)为单位的衍射强度，并且横轴 (从左边添加至标度的数值为10.000、20.000和30.000)显示衍射角2θ的值。
 图18示出了在实施例15中获得的晶体的X射线粉末衍射图。图的纵轴 (从底部添加至标度的数值为0、1000、2000、3000、4000、5000和6000)显示以计数/秒(cps)为单位的衍射强度，并且横轴 (从左边添加至标度的数值为10.000、20.000和30.000)显示衍射角2θ的值。
 图19示出了在实施例16中获得的晶体的X射线粉末衍射图。图的纵轴 (从底部添加至标度的数值为0、1000、2000、3000、4000和5000)显示以计数/秒(cps)为单位的衍射强度，并且横轴 (从左边添加至标度的数值为10.000、20.000和30.000)显示衍射角2θ的值。
 图20示出了在实施例17中获得的晶体的X射线粉末衍射图。图的纵轴 (从底部添加至标度的数值为0、1000、2000、3000、4000和5000)显示以计数/秒(cps)为单位的衍射强度，并且横轴 (从左边添加至标度的数值为10.000、20.000和30.000)显示衍射角2θ的值。
 图21示出了在实施例18中获得的晶体的X射线粉末衍射图。图的纵轴 (从底部添加至标度的数值为0、1000、2000、3000、4000和5000)显示以计数/秒(cps)为单位的衍射强度，并且横轴 (从左边添加至标度的数值为10.000、20.000和30.000)显示衍射角2θ的值。
 图22示出了在实施例19中获得的晶体的X射线粉末衍射图。图的纵轴 (从底部添加至标度的数值为0、1000、2000、3000、4000和5000)显示以计数/秒(cps)为单位的衍射强度，并且横轴 (从左边添加至标度的数值为10.000、20.000和30.000)显示衍射角2θ的值。
 图23示出了在实施例20中获得的晶体的X射线粉末衍射图。图的纵轴 (从底部添加至标度的数值为0、500、1000、1500、2000、2500和3000)显示以计数/秒(cps)为单位的衍射强度，并且横轴 (从左边添加至标度的数值为10.000、20.000和30.000)显示衍射角2θ的值。
 图24示出了在实施例21中获得的晶体的X射线粉末衍射图。图的纵轴 (从底部添加至标度的数值为0、500、1000、1500、2000、2500和3000)显示以计数/秒(cps)为单位的衍射强度，并且横轴 (从左边添加至标度的数值为10.000、20.000和30.000)显示衍射角2θ的值。
 图25示出了在实施例22中获得的晶体的X射线粉末衍射图。图的纵轴 (从底部添加至标度的数值为0、1000、2000、3000和4000)显示以计数/秒(cps)为单位的衍射强度，并且横轴 (从左边添加至标度的数值为10.000、20.000和30.000)显示衍射角2θ的值。
 图26示出了在实施例23中获得的晶体的X射线粉末衍射图。图的纵轴 (从底部添加至标度的数值为0、1000、2000、3000和4000)显示以计数/秒(cps)为单位的衍射强度，并且横轴 (从左边添加至标度的数值为10.000、20.000和30.000)显示衍射角2θ的值。
 图27示出了在实施例24中获得的晶体的X射线粉末衍射图。图的纵轴 (从底部添加至标度的数值为0、2000、4000、6000和8000)显示以计数/秒(cps)为单位的衍射强度，并且横轴 (从左边添加至标度的数值为10.000、20.000和30.000)显示衍射角2θ的值。
 图28示出了在实施例25中获得的晶体的X射线粉末衍射图。图的纵轴 (从底部添加至标度的数值为0、1000、2000、3000、4000和5000)显示以计数/秒(cps)为单位的衍射强度，并且横轴 (从左边添加至标度的数值为10.000、20.000和30.000)显示衍射角2θ的值。
 图29示出了在实施例26中获得的晶体的X射线粉末衍射图。图的纵轴 (从底部添加至标度的数值为0、1000、2000、3000、4000、5000和6000)显示以计数/秒(cps)为单位的衍射强度，并且横轴 (从左边添加至标度的数值为10.000、20.000和30.000)显示衍射角2θ的值。
 图30示出了在实施例27中获得的晶体的X射线粉末衍射图。图的纵轴 (从底部添加至标度的数值为0、1000、2000、3000、4000、5000和6000)显示以计数/秒(cps)为单位的衍射强度，并且横轴 (从左边添加至标度的数值为10.000、20.000和30.000)显示衍射角2θ的值。
 图31示出了在实施例28中获得的晶体的X射线粉末衍射图。图的纵轴 (从底部添加至标度的数值为0、1000、2000、3000和4000)显示以计数/秒(cps)为单位的衍射强度，并且横轴 (从左边添加至标度的数值为10.000、20.000和30.000)显示衍射角2θ的值。
 图32示出了在实施例29中获得的晶体的X射线粉末衍射图。图的纵轴 (从底部添加至标度的数值为0、500、1000、1500、2000、2500和3000)显示以计数/秒(cps)为单位的衍射强度，并且横轴 (从左边添加至标度的数值为10.000、20.000和30.000)显示衍射角2θ的值。
 图33示出了在实施例30中获得的晶体的X射线粉末衍射图。图的纵轴 (从底部添加至标度的数值为0、500、1000、1500、2000、2500和3000)显示以计数/秒(cps)为单位的衍射强度，并且横轴 (从左边添加至标度的数值为10.000、20.000和30.000)显示衍射角2θ的值。
 图34示出了在实施例31中获得的晶体的X射线粉末衍射图。图的纵轴 (从底部添加至标度的数值为0、1000、2000、3000、4000和5000)显示以计数/秒(cps)为单位的衍射强度，并且横轴 (从左边添加至标度的数值为10.000、20.000和30.000)显示衍射角2θ的值。
 图35示出了在实施例32中获得的晶体的X射线粉末衍射图。图的纵轴 (从底部添加至标度的数值为0、1000、2000、3000、4000和5000)显示以计数/秒(cps)为单位的衍射强度，并且横轴 (从左边添加至标度的数值为10.000、20.000和30.000)显示衍射角2θ的值。
 图36示出了在实施例33中获得的晶体的X射线粉末衍射图。图的纵轴 (从底部添加至标度的数值为0、1000、2000、3000和4000)显示以计数/秒(cps)为单位的衍射强度，并且横轴 (从左边添加至标度的数值为10.000、20.000和30.000)显示衍射角2θ的值。
[图37] 图37显示在实施例1中获得的晶体的差示扫描量热图。图的纵轴显示差示扫描热量 (DSC) (mcal/s)，并且横轴显示温度 (℃)。
[图38] 图38显示在实施例4中获得的晶体的差示扫描量热图。图的纵轴显示差示扫描热量 (DSC) (mcal/s)，并且横轴显示温度 (℃)。
[图39] 图39显示在实施例11中获得的晶体的差示扫描量热图。图的纵轴显示差示扫描热量 (DSC) (mcal/s)，并且横轴显示温度 (℃)。
实施方案的描述
本发明涉及由下示的式(1)表示的2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺(下文还称为“化合物(1)”)的盐酸盐以及所述盐酸盐的晶体：
Figure 2011800408532100002DEST_PATH_IMAGE002
。
此处，术语“晶体”是指内部结构由构成原子(或其基团)的三维规律重复组成的固体。因此，晶体能区别于不具有这种规律的内部结构的无定形固体。
即使来自一种化合物，仍可能存在产生具有不同内部结构和不同物理化学性质的多种晶体(晶体多晶型)的情况，其取决于结晶的条件。本发明的晶体可为这些多晶型物中的任一种，并且还可能为两种或多种多晶型物的混合物。
此外，下文以优选晶形示出的本申请发明的晶体可能仅由晶形组成，可能与其它晶体一起包含在混合物中，或者可能与无定形物质一起包含在混合物中。因此，可能存在本发明晶体的情况不受特别限制。
通过被放置在空气中本发明的晶体可吸收水，因此水可能与其表面粘附，或者在普通环境条件下通过被加热至25℃至150℃的温度本发明的晶体可能形成水合物。此外，在本发明的晶体的情况下，用于结晶的溶剂可包含在残留溶剂或溶剂化物中。
在本说明书中，基于X射线粉末衍射数据鉴定本发明的晶体。可通过通常用于本技术领域的方法进行这种X射线粉末衍射数据的测定和/或分析。例如，可通过实施例中描述的方法进行X射线粉末衍射 。通常，水合物或脱水产物的晶格常数由于粘附或去除结晶水而变化，因此它可能改变X射线粉末衍射中的衍射角(2θ)。此外，峰强度可能依赖晶体(晶癖)等的生长面中的差异而变化。因此，当基于X射线粉末衍射数据鉴定本发明的晶体时，不仅X射线粉末衍射中具有相同峰衍射角和相同X射线衍射图的晶体，而且从上述晶体获得的水合物和脱水产物都包括在本发明的范围内。
本发明晶体的优选形式是化合物(1)的二盐酸盐的晶体。在通过使用铜Kα辐射 (波长λ = 1.54埃)照射获得的X射线粉末衍射图中，化合物(1)的二盐酸盐的晶体具有图1显示的X射线衍射图。此外，在通过使用铜Kα辐射 (波长λ = 1.54埃)照射获得的X射线粉末衍射图中，化合物(1)的二盐酸盐的晶体具有衍射角2θ为7.73、24.70、26.01和27.29处的特征峰。此处使用的术语“特征峰”是指当在X射线粉末衍射图中将最大峰强度设置在100时相对强度为50或更大的峰。此外，本发明化合物(1)的二盐酸盐的晶体还是在通过使用铜Kα辐射 (波长λ = 1.54埃)照射获得的X射线粉末衍射图中显示在衍射角2θ为7.73、9.78、12.58、14.36、15.84、16.71、17.17、18.40、19.58、21.31、22.85、23.62、24.13、24.70、26.01、27.29、28.58、29.37、30.65、31.38、33.52、35.25和36.87处的主峰的晶体。此处使用的术语“主峰”是指当在X射线粉末衍射图中将最大峰强度设置在100时相对强度为15或更大的峰。
本发明的晶体的另一优选形式为化合物(1)的单盐酸盐的晶体。化合物(1)的单盐酸盐的晶体的一种形式为在通过使用铜Kα辐射 (波长λ = 1.54埃)照射获得的X射线粉末衍射图中具有图2显示的X射线衍射图的晶体。此外，本形式的晶体还是在通过使用铜Kα辐射 (波长λ = 1.54埃)照射获得的X射线粉末衍射图中显示在衍射角2θ为9.43、12.70、13.03、15.33、16.10、16.84、18.55、20.21、20.89、21.32、22.93、24.73、25.10、25.40、26.10、26.53、26.95、27.60、27.88、28.52、29.63、29.95、31.55、32.13、33.40、34.95和38.70处的主峰的晶体。此处使用的术语“主峰”是指当在X射线粉末衍射图中将最大峰强度设置在100时相对强度为30或更大的峰。
本发明化合物(1)的单盐酸盐的晶体的另一形式为在通过使用铜Kα辐射 (波长λ = 1.54埃)照射获得的X射线粉末衍射图中具有图3显示的X射线粉末衍射图的晶体。此外，本形式的晶体还是在通过使用铜Kα辐射 (波长λ = 1.54埃)照射获得的X射线粉末衍射图中显示在衍射角2θ为8.07、9.45、13.07、15.39、16.16、16.90、20.83、24.29、24.80、28.56、28.85、31.26、32.17、32.87和34.11处的主峰的晶体。此处使用的术语“主峰”是指当在X射线粉末衍射图中将最大峰强度设置在100时相对强度为12或更大的峰。
通常，通过将氯化氢溶液滴加至2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺的溶液或悬浮液进行2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺至盐酸盐的转化。
只要将2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺和氯化氢溶于溶剂达到一定程度并且2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺至盐酸盐的转化不被溶剂抑制，则使用的溶剂不受特别限制。这种溶剂的实例包括：烃，如戊烷、己烷、庚烷、辛烷、异辛烷、环己烷、甲基环己烷、苯、甲苯和二甲苯；卤代烃，如二氯甲烷、氯仿、1,2-二氯乙烷和氯苯；醚，如乙醚、二异丙基醚、二丁基醚、四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、二噁烷和甲基环戊基醚；酯，如乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、丙酸甲酯和丙酸乙酯；酮，如丙酮、甲基乙基酮、环戊酮和环己酮；腈，如乙腈和丙腈；酰胺，如N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、N,N’-二甲基咪唑啉酮和六甲基磷酰三胺；亚砜，如二甲基亚砜；醇，如甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇和异丁醇；水；及其混合物。溶剂的优选实例包括酮、醇、水及其混合物。更优选实例包括醇、水及其混合物。其它优选实例包括甲醇、乙醇、水及其混合物。
用于制备2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺的溶液或悬浮液的溶剂可与用于制备氯化氢溶液的溶剂相同或不同。
使用的氯化氢溶液的浓度不受特别限制。其通常为0.1 mol/L至饱和溶液，且优选为0.5 mol/L至饱和溶液。
在上述化合物转化为盐酸盐的过程中使用的温度不受特别限制，除非使用的溶剂在所述温度下为固体。通常其为-70℃至70℃，且优选为-20℃至50℃。
当制备二盐酸盐时，使用的氯化氢的量不受特别限制，只要其为足以将2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺转化为二盐酸盐的量。通常其为2当量或更多至100当量或更少，优选为2当量或更多至20当量或更少，且更优选为2当量或更多至10当量或更少。
当制备单盐酸盐时，使用的氯化氢的量不受特别限制，只要其为足以将2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺转化为单盐酸盐并且其中二盐酸盐不沉淀的量。这样的量依赖使用的溶剂的类型、使用的溶剂的量和温度。通常其为1当量或更多至10当量或更少，优选为1当量或更多至5当量或更少，且更优选为1当量或更多至3当量或更少。
当制备二盐酸盐时，可添加晶种。当添加这样的晶种时，添加它的时间不受特别限制。通常，在二盐酸盐变得过饱和的氯化氢浓度范围下添加这样的晶种。氯化氢浓度依赖溶剂的组成而不同。通常，需要以约2当量或更多的量添加氯化氢。使用的晶种的量不受限制。其通常为0.0000001当量或更多至1当量或更少，优选为0.000001当量或更多至0.5当量或更少，且更优选为0.00001当量或更多至0.1当量或更少。
当制备单盐酸盐时，可添加待获得的单盐酸盐的晶种。当添加这样的晶种时，添加它的时间不受特别限制。通常，在单盐酸盐变得过饱和的氯化氢浓度范围下添加这样的晶种。氯化氢浓度依赖溶剂的组成而不同。通常，需要以约1当量或更多的量添加氯化氢。使用的晶种的量不受限制。其通常为0.0000001当量或更多至1当量或更少，优选为0.000001当量或更多至0.5当量或更少，且更优选为0.00001当量或更多至0.1当量或更少。
关于单盐酸盐的晶体，能分别通过下文描述的实施例3至5中描述的方法和通过下文描述的实施例6至33中描述的方法制备具有图2显示的X射线粉末衍射图的晶体和具有图3显示的X射线粉末衍射图的晶体。然而，制备方法不受其限制。当制备具有图3显示的X射线粉末衍射图的晶体时，期望以逐步的方式增加氯化氢浓度，例如，通过将待添加的氯化氢分为二至约十个小量，大约为盐酸盐在反应溶液中变成过饱和时的氯化氢浓度。具有图3显示的X射线粉末衍射图的晶体具有优异的稳定性，并且在晶体中还具有少量的残留溶剂，例如，在晶体中少量的残留乙醇。在晶体中残留溶剂的量优选为6000 ppm或更少，且更优选为5000 ppm或更少。
本发明的其它实施方案是包含本发明的盐酸盐或晶体作为活性成分的药物和包含本发明的盐酸盐或晶体的抗肿瘤剂。本发明的另一实施方案还涉及包含本发明的盐酸盐或晶体的药物组合物。
优选以包含本发明的晶体和一种或两种或多种药理学可接受的载体的药物组合物的形式提供包含本发明的盐酸盐或晶体作为活性成分的药物。本发明药物的剂型不受特别限制，并且能口服或肠胃外给予本药物。优选口服给药。
本发明的药物组合物包含至少一部分本发明的盐酸盐或晶体作为化合物(I)。本药物组合物还可包含除了本申请发明的晶体之外的晶形作为化合物(I)。基于本药物组合物中化合物(I)的总重量，本申请发明的晶体在本药物组合物中的比例可为0.01重量%至99.9重量%，例如，0.01重量%或更多、0.05重量%或更多、0.1重量%或更多、0.5重量%或更多、1重量%或更多、2重量%或更多、3重量%或更多、4重量%或更多、5重量%或更多、10重量%或更多、20重量%或更多、30重量%或更多、40重量%或更多、50重量%或更多、60重量%或更多、70重量%或更多、80重量%或更多、90重量%或更多、95重量%或更多、96重量%或更多、97重量%或更多、98重量%或更多、99重量%或更多、99.5重量%或更多、99.6重量%或更多、99.7重量%或更多、99.8重量%或更多或99.9重量%或更多。能通过本说明书描述的仪器分析方法 (例如，X射线粉末衍射、热分析、红外吸收光谱等)确认本申请发明的晶体存在或不存在药物组合物中。
本发明的盐酸盐或晶体能用作HSP90抑制剂、抑制HSP90的ATP酶活性的药剂或抑制HSP90与ATP结合的药剂。因此，其能用作包含本发明的盐酸盐或晶体的药物，并且特别优选用作抗癌剂。
能通过本领域技术人员通常使用的ATP酶检验检测HSP90的ATP酶活性。例如，能在存在或不存在测试化合物的情况下使用重组HSP90蛋白质和ATP检测HSP90的ATP酶活性。或者，在ATP酶检验中，例如，可适当地进行Analytical Biochemistry 327，176-183 (2004)或Nature 425，407-410 (2003)中描述的方法。
能通过本领域技术人员通常使用的Northern印迹法、Western印迹法、ELISA等检验HSP90表达的抑制。例如，从在存在或不存在测试化合物的情况下培养的细胞中提取mRNA以进行Northern印迹法。当从在存在测试化合物的情况下培养的细胞中提取的mRNA中的HSP90 mRNA的量低于从在不存在测试化合物的情况下培养的细胞中提取的mRNA中的HSP90 mRNA的量时，将测试化合物识别为抑制HSP90的表达的化合物。或者，例如，可通过使用Cancer. Res. 65，6401-6408 (2005)中描述的方法进行Western印迹法适当地检验HSP90蛋白的量。
能通过例如本领域技术人员通常使用的免疫沉淀法和Western印迹法检验HSP90与客户蛋白结合的抑制。例如，在免疫沉淀法和Western印迹法中，可适当地进行J. Biol. Chem. 277，10346-10353 (2002)中描述的方法。
例如，能通过本领域技术人员通常使用的免疫沉淀法和Western印迹法检验抑制HSP90与辅陪伴分子或免疫亲和素结合的化合物。例如，可在存在或不存在测试化合物的情况下通过进行Nature 425，407-410 (2003)中描述的方法适当地检验HSP90与辅陪伴分子或免疫亲和素的结合。
例如，能通过标记的ATP与HSP90结合的试验检验HSP90与ATP结合的抑制。例如，可在存在或不存在测试化合物的情况下通过进行J. Biol. Chem. 272，18608-18613 (1997)中描述的方法适当地检验HSP90与标记的ATP的结合。
例如，能通过使用双-ANS (1,1’-双(4-苯胺基-5-萘磺酸))的构象试验检验HSP90构象变化的抑制。例如，在构象检验中，可适当地进行J. Med. Chem. 47，3865-3873 (2004)中描述的方法。
能使用本领域技术人员通常使用的生长抑制试验法检验细胞生长抑制活性。能通过例如，如在下列试验实施例1中描述的在存在或不存在测试化合物的情况下比较细胞生长 (例如，肿瘤细胞)水平测定细胞生长抑制活性。能使用用于检验活细胞的试验体系检验生长水平。检验活细胞的方法的实例包括[3H]-胸苷摄取试验、BrdU法和MTT试验。
此外，能使用本领域技术人员通常使用的测试抗肿瘤活性的方法检验体内抗肿瘤活性。例如，将各种类型的肿瘤细胞移植到小鼠、大鼠等，并在确认移植的细胞存活后，通过口服给药、静脉内给药等将本发明的化合物给予动物。此后，几天至几周后，将药剂非给予组中的肿瘤生长与化合物给予组比较以确认本发明化合物的体内抗肿瘤活性。
例如，本发明的盐酸盐或晶体能用于治疗肿瘤或癌症，例如肺癌、胃肠癌、卵巢癌、子宫癌、乳腺癌、肝癌、头颈癌、血癌、肾癌、睾丸肿瘤、前列腺癌、多发性骨髓瘤、皮肤癌如恶性黑素瘤、肉瘤。
由于本发明的盐酸盐或晶体具有HSP90抑制作用，因此其能用于治疗其中HSP90依赖性增加的癌症。这种其中HSP90依赖性增加的癌症包括其中HSP90客户蛋白过度表达的癌症、其中HSP90客户蛋白变异的癌症等。更具体的实例包括其中Her2、c-Met、Flt3等过度表达的癌症和其中c-kit、PDGFR、Raf等变异的癌症。然而，实例不限于此。
此外，许多与癌症有关的因子组(RAS-MAPK、PI3K、端粒酶等)存在于HSP90的下游。如果HSP90被抑制，则对这类因子的信号转导也被抑制。结果，上述因子的激活也被抑制。因此，同样地由此看来，作为HSP90抑制剂的本发明的盐酸盐或晶体能优选用于治疗各种类型的癌症。
本发明的药物组合物包含本发明的盐酸盐或晶体以及药理学可接受的载体。其能用作各种类型的注射剂如静脉内注射剂、肌内注射剂或皮下注射剂，或能通过多种方法如口服给药或经皮给药将其给予。药理学可接受的载体是指药理学可接受的物质 (例如，赋形剂、稀释剂、添加剂、溶剂等)，其与本发明的盐酸盐或晶体或包含本发明的盐酸盐或晶体的组合物从某些装置或器官运输至另一装置或器官相关。
作为用于制备制剂的方法，选择合适的制剂 (例如，口服制剂或注射剂)并能依赖给药方法而应用制备各种类型制剂通常使用的方法。口服制剂的实例包括片剂、粉末剂、颗粒剂、胶囊剂、丸剂、锭剂、溶液剂、糖浆剂、酏剂、乳剂和油性或水性悬浮剂。在口服给药的情况下，试剂可为游离形式或盐形式。能通过与药理学可接受的酸形成酸加合物或形成碱金属如钠的盐制备水性制剂。当制剂为注射剂时，稳定剂、防腐剂、增溶剂等也能用于制剂。通过在容器中储存可能包含这样的佐剂等的溶液然后通过冻干等将其转化为固体制剂可将注射剂提供为待使用前制备的制剂。可在一个容器中储存一个剂量或可在一个容器中储存多个剂量。
固体制剂的实例包括片剂、粉末剂、颗粒剂、胶囊剂、丸剂和锭剂。这些固体制剂可包含药物可接受的添加剂连同本发明的盐酸盐或晶体。添加剂的实例包括填充剂、膨胀剂、粘合剂、崩解剂、增溶剂、润湿剂和润滑剂。能根据需要将这些有选择地混合以提供制剂。
液体制剂的实例包括溶液剂、糖浆剂、酏剂、乳剂和悬浮剂。这些液体制剂可包含药物可接受的添加剂连同本发明的盐酸盐或晶体。添加剂的实例包括悬浮剂和乳化剂。能根据需要将这些有选择地混合以提供制剂。
能连同其它抗肿瘤剂使用本发明的晶体。这种其它抗肿瘤剂的实例包括抗肿瘤抗生素、抗肿瘤植物成分、BRM (生物反应调节剂)、激素、维生素、抗肿瘤抗体、分子靶向剂和其它抗肿瘤剂。
更具体地，烷化剂的实例包括：烷化剂，例如氮芥、氮芥N-氧化物或苯丁酸氮芥；氮丙啶烷化剂，例如卡波醌或噻替哌；环氧化物烷基化试剂，例如二溴甘露醇或二溴卫矛醇；亚硝基脲烷化剂，例如，卡莫司汀、洛莫司汀、司莫司汀、尼莫司汀盐酸盐、链脲霉素、氯脲霉素或雷莫司汀；白消安；甲磺丙胺和达卡巴嗪。
各种类型的抗代谢物的实例包括：嘌呤抗代谢物，例如6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤或硫肌苷；嘧啶抗代谢物，例如氟尿嘧啶、替加氟、替加氟-尿嘧啶、卡莫氟、去氧氟尿苷、溴尿苷、阿糖胞苷或依诺他滨和抗叶酸剂，例如甲氨蝶呤或trimethotrexate。
抗肿瘤抗生素的实例包括：蒽环类抗生素抗肿瘤剂，例如丝裂霉素C、博来霉素、培洛霉素、柔红霉素、阿克拉霉素、阿霉素、吡喃阿霉素、THP-亚德里亚霉素、4’-表阿霉素或表柔比星；色霉素A3和放线菌素D。
抗肿瘤植物成分的实例包括：长春花生物碱类，例如长春地辛、长春新碱或长春花碱；紫杉烷，例如紫杉醇或多烯紫杉醇和表鬼臼毒素，例如依托泊苷或替尼泊苷。
BRM的实例包括肿瘤坏死因子和吲哚美辛。
激素的实例包括氢化可的松、地塞米松、甲基强的松龙、泼尼松龙、普拉睾酮、倍他米松、曲安西龙、羟甲烯龙、诺龙、甲基异睾酮、磷雌酚、炔雌醇、氯地孕酮和甲羟孕酮。
维生素的实例包括维生素C和维生素A。
抗肿瘤抗体和分子靶向剂的实例包括曲妥单抗、利妥昔单抗、西妥昔单抗、尼妥珠单抗、德尼单抗(denosumab)、贝伐单抗、英夫利昔单抗、甲磺酸伊马替尼、吉非替尼、埃罗替尼、舒尼替尼、拉帕替尼和索拉非尼。
其它抗肿瘤剂的实例包括顺铂、卡铂、奥沙利铂、它莫西芬、喜树碱、异环磷酰胺、环磷酰胺、美法仑、L-天冬酰胺酶、aseclatone、裂褶菌素、毕西巴尼、甲基苄肼、哌泊溴烷、新制癌菌素、羟基脲、乌苯美司和云芝多糖。
本发明包括预防癌症的方法和/或治疗癌症的方法，其包括给予本发明的盐酸盐或晶体。
包含本发明的盐酸盐或晶体作为活性成分的药物组合物的剂量不受特别限制。能依赖多种条件如患者的年龄、体重和症状而根据情况选择它。期望以每日剂量为1 mg至1000 mg，优选为5 mg至500 mg，更优选为5 mg至300 mg且甚至更优选为5 mg至100 mg给予成人药物组合物的活性成分，依据症状每天一次或分几次给予且优选每天给予一次或两次。
例如，根据下文描述的参照例1能制备2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺 (游离形式)，其为本发明的2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺的盐酸盐的原材料。
将在下列实施例中详细描述本发明。
实施例
(参照例1) 2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺(游离形式)的制备
(1) 1-(2-氨基-4,6-二氯嘧啶-5-基)-3-丁烯-1-醇
Figure 2011800408532100002DEST_PATH_IMAGE003
将铟粉 (0.23 g)和锌粉 (1.31 g)添加至由商购的2-氨基-4,6-二氯嘧啶-5-甲醛 (1.92 g)和N,N-二甲基甲酰胺 (20 ml)组成的混合物中。此后，在室温下将碘化钠 (0.15 g)和烯丙基溴 (1.73 ml)添加至混合物。将生成的混合物搅拌3小时。此后，通过硅藻土过滤反应混合物，然后将乙酸乙酯添加至滤液。以该顺序使用1 N盐酸和饱和盐水相继洗涤生成的混合物。在无水硫酸钠上干燥有机层，然后浓缩。此后，将己烷添加至剩余物，然后通过过滤收集沉淀以获得固体形式的上述标题化合物 (1.75 g)。
1H-NMR (DMSO-D6) δ：2.55-2.69 (2H, m), 4.95-5.09 (3H, m), 5.37 (1H, d, J=4.1 Hz), 5.67-5.77 (1H, m), 7.42 (2H, s)。
(2) 1-(2-氨基-4,6-二氯嘧啶-5-基)-2-(2,2-二甲基-[1,3]二氧杂环戊烷-4-基)乙烷-1-醇
将由1-(2-氨基-4,6-二氯嘧啶-5-基)-3-丁烯-1-醇 (57.24 g)、N-甲基吗啉-N-氧化物 (147.6 g)、四氢呋喃 (500 ml)、丙酮 (500 ml)、水(500 ml)和四氧化锇 (62 mg)组成的混合物在室温下搅拌2天。在确认物质消失后，将饱和硫代硫酸钠水溶液 (1 L)添加至反应溶液，然后将反应混合物在减压下浓缩至约1.5 L。用氯化钠将剩余物饱和，随后使用四氢呋喃萃取。在无水硫酸钠上干燥有机层。在过滤后，在减压下浓缩滤液，然后蒸馏掉溶剂。将N,N-二甲基甲酰胺 (500 ml)、2,2-二甲氧基丙烷 (210 ml)和对甲苯磺酸一水合物 (18.61 g)添加至生成的剩余物。将生成的混合物在室温下搅拌14小时。将饱和碳酸氢钠溶液 (1 L)和水(1 L)添加至反应混合物，随后使用乙酸乙酯萃取。以该顺序使用水和饱和盐水相继洗涤有机层，然后在无水硫酸钠上将其干燥。在过滤后，将滤液在减压下浓缩至约100 ml。将己烷添加至剩余物，然后通过过滤收集沉淀以获得固体形式的标题化合物(53.88 g)。
1H-NMR (DMSO-D6) δ：1.22-1.32 (6H, m), 1.72-2.23 (2H, m), 2.50 (1H, s), 3.50 (1H, td, J=14.2, 6.9 Hz), 4.22-3.92 (2H, m), 5.06-5.36 (2H, m), 7.43 (2H, d, J=12.8 Hz)。
ESI-MS m/z：308 (M+H)+。
(3) 1-(2-氨基-4,6-二氯嘧啶-5-基)-2-(2,2-二甲基-[1,3]二氧杂环戊烷-4-基)乙烷-1-酮
在室温下，在冰浴中冷却下将乙酸酐 (149 ml)滴加至由上述1-(2-氨基-4,6-二氯嘧啶-5-基)-2-(2,2-二甲基-[1,3]二氧杂环戊烷-4-基)乙烷-1-醇 (74.70 g)和二甲基亚砜 (600 ml)组成的混合物时间为15分钟。然后在与上述相同的温度下将反应混合物搅拌18小时。在确认物质消失后，将反应溶液倾入冰水中。通过过滤收集沉淀的固体以获得标题化合物 (68.26 g)。
1H-NMR (CDCl3) δ：1.37 (3H, s), 1.42 (3H, s), 2.98-3.06 (1H, m), 3.32-3.40 (1H, m), 3.67-3.72 (1H, m), 4.25-4.30 (1H, m), 4.57-4.64 (1H, m), 5.72 (2H, s)。
ESI-MS m/z：306 (M+H)+。
(4) 4-氯-3-[(2,2-二甲基-1,3-二氧杂环戊烷-4-基)甲基]-1-(4-甲氧基苄基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-胺
在冰浴中冷却下将三乙胺 (83.68 ml)添加至由上述1-(2-氨基-4,6-二氯嘧啶-5-基)-2-(2,2-二甲基-[1,3]二氧杂环戊烷-4-基)乙-1-酮 (61.23 g)、通过美国专利US2003/18197描述的方法制备的(4-甲氧基苄基)-肼盐酸盐 (41.50 g)和二氯甲烷 (600 ml)组成的混合物时间为30分钟。此后，当反应溶液的温度逐渐升高时，将其搅拌17小时。此后，将10%柠檬酸水溶液添加至反应混合物，随后使用二氯甲烷萃取。在无水硫酸钠上干燥有机层然后在减压下浓缩。将5%柠檬酸水溶液添加至生成的剩余物，然后通过过滤收集沉淀。使用水洗涤生成物以获得固体形式的标题化合物 (73.84 g)。
1H-NMR (CDCl3) δ：1.36 (3H, s), 1.43 (3H, s), 3.11 (1H, dd, J=14.7, 8.1 Hz), 3.43 (1H, dd, J=14.7, 5.2 Hz), 3.73-3.78 (4H, m), 4.08 (1H, dd, J=8.1, 6.0 Hz), 4.54-4.61 (1H, m), 4.77 (2H, brs), 5.22 (2H, s), 6.83 (2H, d, J=8.5 Hz), 7.24 (2H, d, J=8.5 Hz)。
ESI-MS m/z：404 (M+H)+。
(5) {4-氯-3-[(2,2-二甲基-1,3-二氧杂环戊烷-4-基)甲基]-1-(4-甲氧基苄基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基}酰亚胺二碳酸二叔丁酯
Figure 2011800408532100002DEST_PATH_IMAGE007
将4-二甲基氨基吡啶 (2.20 g)和二碳酸二叔丁酯 (86.59 g)添加至由上述4-氯-3-[(2,2-二甲基-1,3-二氧杂环戊烷-4-基)甲基]-1-(4-甲氧基苄基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-胺 (72.83 g)和四氢呋喃 (700 ml)组成的混合物，然后将生成的混合物在室温下搅拌12小时。此后，将反应混合物过滤，然后在减压下浓缩滤液。通过硅胶柱层析 (乙酸乙酯-己烷)纯化生成的剩余物以获得无定形物形式的标题化合物 (70.00 g)。
1H-NMR (CDCl3) δ：1.37 (3H, s), 1.40 (3H, s), 1.44-1.46 (18H, m), 3.21-3.29 (1H, m), 3.48-3.55 (1H, m), 3.74-3.81 (4H, m), 4.09-4.15 (1H, m), 4.58-4.66 (1H, m), 5.48 (2H, dd, J=17.3, 15.1 Hz), 6.81 (2H, d, J=7.8 Hz), 7.27-7.30 (2H, m)。
ESI-MS m/z：604 (M+H)+。
(6) [4-氯-3-(2,3-二羟基丙基)-1-(4-甲氧基苄基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基]酰亚胺二碳酸二叔丁酯
Figure 2011800408532100002DEST_PATH_IMAGE008
将上述{4-氯-3-[(2,2-二甲基-1,3-二氧杂环戊烷-4-基)甲基]-1-(4-甲氧基苄基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基}酰亚胺二碳酸二叔丁酯 (53.85 g)溶于乙腈 (500 ml)，然后将氯化铜 (II)二水合物 (30.39 g)添加至溶液。将生成的混合物在室温下搅拌2小时。此后，将饱和氯化铵水溶液添加至反应溶液，随后使用乙酸乙酯萃取。使用饱和盐水洗涤有机层，然后在无水硫酸钠上将其干燥，随后在减压下浓缩。通过硅胶柱层析 (乙酸乙酯-己烷)纯化生成的剩余物以获得无定形物形式的标题化合物 (37.70 g)。
1H-NMR (CDCl3) δ：1.46 (18H, s), 3.15 (1H, d, J=3.7 Hz), 3.23-3.33 (2H, m), 3.62-3.82 (5H, m), 4.26-4.34 (1H, m), 5.49 (2H, t, J=15.9 Hz), 6.82 (2H, d, J=8.1 Hz), 7.25-7.30 (2H, m)。
ESI-MS m/z：564 (M+H)+。
(7) [8-羟基-2-(4-甲氧基苄基)-2,7,8,9-四氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-4-基]酰亚胺二碳酸二叔丁酯
在冰浴中冷却下将甲烷磺酰氯 (4.23 ml)滴加至由上述[4-氯-3-(2,3-二羟基丙基)-1-(4-甲氧基苄基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基]酰亚胺二碳酸二叔丁酯 (28.00 g)、2,4,6-三甲吡啶 (16.53 ml)和无水二氯甲烷 (400 ml)组成的混合物。然后将生成的混合物在4℃下搅拌15小时。此后，将10%柠檬酸水溶液添加至反应混合物，随后使用二氯甲烷萃取。在无水硫酸钠上干燥有机层，然后将其在减压下浓缩。将生成的剩余物溶于N,N-二甲基甲酰胺 (300 ml)，然后在冰浴中冷却下将硫氢化钠一水合物 (5.52 g)添加至该溶液。此后，将生成的混合物在室温下搅拌1.5小时。此后，将碳酸钾 (10.29 mg)添加至反应混合物，然后将生成的混合物加热至50℃，随后进一步搅拌操作5小时。随后，将乙酸乙酯添加至反应混合物，然后使用10%柠檬酸水溶液然后使用饱和盐水相继洗涤生成物。在无水硫酸钠上干燥生成物，然后将其在减压下浓缩。通过硅胶柱层析 (乙酸乙酯-己烷)纯化生成的剩余物以获得固体形式的标题化合物 (20.59 g)。
1H-NMR (CDCl3) δ：1.45 (18H, s), 2.39 (1H, brs), 3.29-3.51 (4H, m), 4.58 (1H, brs), 3.76 (3H, s), 5.42-5.49 (2H, m), 6.82 (2H, d, J=8.6 Hz), 7.30 (2H, d, J=8.6 Hz)。
ESI-MS m/z：544 (M+H)+。
(8) 4-[二(叔丁氧羰基)氨基]-2-(4-甲氧基苄基)-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基乙酸酯
在氮气环境中，在冰上冷却下将乙酸酐 (14 ml)滴加至由上述[8-羟基-2-(4-甲氧基苄基)-2,7,8,9-四氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-4-基]酰亚胺二碳酸二叔丁酯 (8.17 g)、二甲基亚砜 (74 ml)和吡啶 (12 ml)组成的混合物，然后将生成的混合物搅拌30分钟。此后，将反应溶液在室温下进一步搅拌15小时。在确认物质消失后，使用乙酸乙酯稀释反应混合物，然后使用饱和盐水将其洗涤。在无水硫酸钠上干燥有机层，随后在减压下浓缩。通过硅胶柱层析 (乙酸乙酯-己烷)纯化生成的剩余物以获得无定形物形式的标题化合物 (6.15 g)。
1H-NMR (CDCl3) δ：1.44 (18H, s), 2.26 (3H, s), 3.77 (3H, s), 3.88 (2H, s), 5.50 (2H, s), 6.68 (1H, s), 6.83 (2H, d, J=8.8 Hz), 7.31 (2H, d, J=8.8 Hz)。
ESI-MS m/z：584 (M+H)+。
(9) [2-(4-甲氧基苄基)-8-氧代-2,7,8,9-四氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-4-基]酰亚胺二碳酸二叔丁酯
Figure DEST_PATH_IMAGE011
在冰浴中冷却下，将由上述4-[二(叔丁氧羰基)氨基]-2-(4-甲氧基苄基)-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基乙酸酯 (6.15 g)、甲醇 (200 ml)和碳酸钾 (0.73 g)组成的混合物搅拌1.5小时。在确认物质消失后，将饱和氯化铵水溶液添加至反应混合物，随后使用乙酸乙酯萃取。使用饱和盐水洗涤有机层，然后将其在无水硫酸钠上干燥，随后在减压下浓缩以获得无定形物形式的标题化合物 (5.70 g)。
1H-NMR (CDCl3) δ：1.46 (18H, s), 3.84 (2H, s), 3.77 (3H, s), 4.23 (2H, s), 5.48 (2H, s), 6.83 (2H, d, J=8.6 Hz), 7.32 (2H, d, J=8.6 Hz)。
ESI-MS m/z：542 (M+H)+。
(10) {4-[二(叔丁氧羰基)氨基]-2-(4-甲氧基苄基)-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}乙酸乙酯
Figure DEST_PATH_IMAGE012
将由上述[2-(4-甲氧基苄基)-8-氧代-2,7,8,9-四氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-4-基]酰亚胺二碳酸二叔丁酯 (5.19 g)、(三苯基膦)乙酸乙酯(ethyl (triphenylphosphanylidene)acetate) (3.51 g)和甲苯 (300 ml)组成的混合物在65℃下搅拌13小时。此后，将反应混合物在减压下浓缩，然后通过硅胶柱层析 (乙酸乙酯-己烷)纯化剩余物以获得无定形物形式的标题化合物 (3.78 g)。
1H-NMR (CDCl3) δ：1.29 (3H, t, J=7.1 Hz), 1.69-1.77 (1H, m), 2.37-2.40 (1H, m), 2.46-2.52 (1H, m), 2.68-2.71 (2H, m), 4.20 (2H, q, J=7.1 Hz), 5.10-5.13 (1H, m), 5.20 (2H, brs)。
ESI-MS m/z：612 (M+H)+。
(11) 2-(4-氨基-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基)-N-甲基乙酰胺三氟乙酸酯
Figure DEST_PATH_IMAGE013
将上述{4-[二(叔丁氧羰基)氨基]-2-(4-甲氧基苄基)-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}乙酸乙酯 (2.2 g)溶于40%的甲胺/甲醇溶液(40 ml)，然后将混合溶液在室温下搅拌2小时。通过LC-MS确认反应的完成，然后将溶剂在减压下蒸馏掉。此后，将苯甲醚 (2 ml)和三氟乙酸 (40 ml)添加至生成的剩余物，然后将生成的混合物在65℃下搅拌15小时。此后，将反应溶液在减压下浓缩，然后将异丙基醚-醚混合溶液添加至剩余物。通过过滤收集沉淀以获得固体形式的标题化合物 (1.53 g)。
ESI-MS m/z：277 (M+H)+。
(12) 5-氯-4-羟基-6-甲基烟酸
将商购的4-羟基-6-甲基-烟酸 (300 mg)悬浮于3 ml的乙腈，然后将N-氯代丁二酰亚胺 (380 mg)添加至悬浮液。将生成的混合物在室温下搅拌30分钟。此后，将反应溶液在回流下加热45分钟。在确认物质消失后，将反应溶液在冰上冷却，然后通过过滤收集沉淀以获得固体形式的标题化合物 (324 mg)。
1H-NMR (CD3OD) δ：2.56 (3H, s), 8.50 (1H, s)。
ESI-MS m/z：188 (M+H)+。
(13) 4,5-二氯-6-甲基烟酸甲酯
Figure DEST_PATH_IMAGE015
将磷酰氯 (1.13 ml)添加至上述5-氯-4-羟基-6-甲基烟酸 (320 mg)，然后将生成的混合物在回流下加热2小时。此后，将反应溶液在减压下浓缩，然后在冰上冷却下将甲醇 (3 ml)滴加至剩余物。将生成的混合物在室温下搅拌30分钟，随后在减压下浓缩。在冰上冷却下将饱和碳酸氢钠溶液添加至剩余物，随后使用乙酸乙酯萃取。在无水硫酸钠上干燥有机层，然后将溶剂蒸馏掉以获得固体形式的标题化合物的粗产物 (436 mg)。
ESI-MS m/z：220 (M+H)+。
(14) 5-氯-4-甲氧基-6-甲基烟酸甲酯
Figure DEST_PATH_IMAGE016
将粗4,5-二氯-6-甲基烟酸甲酯 (380 mg)溶于3 ml的甲醇，然后在氮气流中，在冰上冷却下将甲醇钠 (120 mg)添加至溶液。将反应溶液的温度逐渐升高至室温，并将其搅拌18小时。在确认物质消失后，在冰上冷却下将饱和氯化铵水溶液添加至反应溶液，随后使用氯仿萃取。在无水硫酸钠上干燥有机层，然后将溶剂蒸馏掉。通过硅胶层析 (乙酸乙酯-己烷)纯化剩余物以获得固体形式的标题化合物 (210 mg)。
1H-NMR (CDCl3) δ：2.67 (3H, s), 3.95 (4H, s), 4.00 (3H, s), 8.76 (1H, s)。
ESI-MS m/z：216 (M+H)+。
(15) (5-氯-4-甲氧基-6-甲基吡啶-3-基)甲醇
将上述5-氯-4-甲氧基-6-甲基烟酸甲酯 (1.0 g)溶于30 ml的甲醇，然后将硼氢化钠 (1.75 g)添加至溶液。将生成的混合物在回流下加热1小时。此后，在冰上冷却下将饱和氯化铵水溶液添加至反应溶液，随后使用氯仿萃取三次。在无水硫酸钠上干燥有机层，然后将溶剂蒸馏掉以获得油状物形式的标题化合物 (0.92 g)。
1H-NMR (CDCl3) δ：2.63 (3H, s), 4.00 (3H, s), 4.71 (2H, brs), 8.33 (1H, s)。
ESI-MS m/z：188 (M+H)+。
(16) 3-氯-5-(氯甲基)-4-甲氧基-2-甲基吡啶
Figure DEST_PATH_IMAGE018
将上述(5-氯-4-甲氧基-6-甲基吡啶-3-基)甲醇(520 mg)溶于20 ml的氯仿，然后在冰上冷却下将亚硫酰氯 (0.38 ml)添加至溶液。将生成的混合物在与上述相同的温度下搅拌3小时。此后，将反应溶液浓缩，然后将乙酸乙酯添加至浓缩物。以该顺序使用饱和碳酸氢钠溶液、水和饱和盐水洗涤生成的混合物。在无水硫酸钠上干燥有机层，然后将溶剂蒸馏掉。通过硅胶层析 (乙酸乙酯-己烷)纯化剩余物以获得油状物形式的标题化合物 (550 mg)。
1H-NMR (CDCl3) δ：2.64 (3H, s), 4.05 (3H, s), 4.61 (2H, s), 8.35 (1H, s)。
ESI-MS m/z：206 (M+H)+。
(17) 3-氯-4-甲氧基-2,5-二甲基吡啶
Figure DEST_PATH_IMAGE019
将上述3-氯-5-(氯甲基)-4-甲氧基-2-甲基吡啶 (550 mg)溶于10 ml的甲醇，然后将10% Pd碳 (50 mg)添加至溶液。在冰上冷却下在混合物上进行常压接触氢化时间为3小时。此后，通过过滤去除催化剂，然后在减压下将甲醇蒸馏掉。用氯仿萃取剩余物。使用饱和碳酸氢钠溶液洗涤有机层，然后在无水硫酸钠上将其干燥。将溶剂蒸馏掉，并通过硅胶层析 (乙酸乙酯-己烷)纯化剩余物以获得油状物形式的标题化合物 (365 mg)。
1H-NMR (CDCl3) δ：2.25 (3H, s), 2.59 (3H, s), 3.89 (3H, s), 8.16 (1H, s)。
ESI-MS m/z：172 (M+H)+。
(18) 3-氯-4-甲氧基-2,5-二甲基吡啶 1-氧化物
Figure DEST_PATH_IMAGE020
将上述3-氯-4-甲氧基-2,5-二甲基吡啶 (181 mg)溶于5 ml的二氯甲烷，然后将过氧化脲 (169 mg)和邻苯二甲酸酐 (219 mg)添加至溶液。将生成的混合物在室温下搅拌2.5小时。此后，在冰上冷却下将饱和硫代硫酸钠水溶液添加至反应溶液，然后使用氯仿稀释生成的混合物。用氯仿将水层萃取两次。在无水硫酸钠上干燥有机层，然后将溶剂蒸馏掉以获得固体形式的标题化合物 (181 mg)。
1H-NMR (CDCl3) δ：2.24 (3H, s), 2.62 (3H, s), 3.87 (3H, s), 8.07 (1H, s)。
ESI-MS m/z：188 (M+H)+。
(19) (3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲醇
Figure DEST_PATH_IMAGE021
将上述3-氯-4-甲氧基-2,5-二甲基吡啶 1-氧化物 (530 mg)悬浮在15 ml的二氯甲烷中，然后在冰上冷却下将三氟乙酸酐 (0.39 ml)添加至悬浮液。将生成的混合物在室温下搅拌3小时。使用氯仿稀释反应溶液，然后使用饱和碳酸氢钠溶液洗涤。用氯仿萃取水层。在无水硫酸钠上干燥有机层，然后将溶剂蒸馏掉以获得油状物形式的标题化合物 (521 mg)。
1H-NMR (CDCl3) δ：2.29 (3H, s), 3.93 (3H, s), 4.29 (1H, brs), 4.72-4.74 (2H, m), 8.26 (1H, s)。
ESI-MS m/z：188 (M+H)+。
(20) 3-氯-2-(氯甲基)-4-甲氧基-5-甲基吡啶盐酸盐
Figure DEST_PATH_IMAGE022
将上述(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲醇 (530 mg)溶于20 ml的氯仿，然后在冰上冷却下将亚硫酰氯 (1.03 ml)滴加至溶液。将生成的混合物在室温下搅拌3小时。此后，将反应溶液浓缩，然后使用乙醚-己烷的混合溶剂将其洗涤以获得固体形式的标题化合物 (410 mg)。
1H-NMR (CDCl3) δ：2.47 (3H, s), 4.32 (3H, s), 5.09 (2H, s), 8.54 (1H, s)。
ESI-MS m/z：206 (M+H)+。
(21) 2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺
将二甲基甲酰胺 (1 ml)添加至2-(4-氨基-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基)-N-甲基乙酰胺三氟乙酸酯 (28 mg)、3-氯-2-(氯甲基)-4-甲氧基-5-甲基吡啶盐酸盐 (36 mg)和碳酸钾 (69 mg)。将生成的混合物在60℃下搅拌2.5小时。此后，通过过滤去除不溶物质，然后在氮气流中将溶剂蒸馏掉。将生成的剩余物溶于二甲基亚砜 (1 ml)，然后通过制备反相HPLC将其纯化。在减压下将溶剂蒸馏掉以获得固体形式的标题化合物 (27.0 mg)。
1H-NMR (CDCl3) δ：2.24 (4H, s), 2.82 (3H, d, J=4.9 Hz), 3.27 (2H, s), 3.80 (2H, s), 3.91 (3H, s), 5.21 (2H, s), 5.65 (2H, s), 5.87 (1H, s), 6.70 (1H, s), 8.16 (1H, s)。
ESI-MS m/z：446 (M+H)+。
(实施例1)
2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺二盐酸盐
将乙醇 (29.3 ml)和水 (0.74 ml)添加至2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺 (1.034 g, 2.243 mmol)，然后将混合物在25℃下搅拌。此后，将2 M 盐酸/乙醇(6.73 ml, 13.46 mmol)添加至反应混合物，然后将生成的混合物搅拌3小时45分钟。此后，过滤沉淀的晶体，然后使用乙醇(5 ml)洗涤，然后在40℃下在减压下干燥1小时以获得上述标题化合物 (1.118 g, 2.155 mmol)。产率：96%。
(实施例2)
2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺二盐酸盐
在室温下将3 M 盐酸(369.6 mL)滴加至2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺 (493.48 mg, 1.11 mmol)的丙酮 (30 mL)悬浮液，同时将悬浮液搅拌。将生成的混合物搅拌另外12小时。通过过滤收集生成的晶体，然后使用丙酮洗涤，然后在25℃下在减压下干燥3小时以获得上述标题化合物 (531.01 mg, 1.02 mmol)。产率：92%。
(实施例3)
2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺单盐酸盐
在25℃下，将3 M 盐酸(9.2 ml,27.8 mmol)滴加至2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺 (5446.6 mg, 11.6 mmol)的乙醇 (200 ml)悬浮液，同时将悬浮液搅拌。将生成的混合物搅拌3.5小时。通过过滤收集生成的晶体，然后使用乙醇 (50 ml)洗涤，然后在40℃下在减压下干燥14小时以获得上述标题化合物 (5436.1 mg, 116. mmol)。产率：99%。
(实施例4)
2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺单盐酸盐
在温度为21℃至22℃下将通过使用水 (4.5 L)稀释36.2%浓盐酸(1.75 kg, 17.4 mol)制备的3 M 盐酸滴加至2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺 (3.53 kg, 7.74 mol)的乙醇 (123 L)悬浮液时间为30分钟，同时将悬浮液搅拌。将生成的混合物搅拌4小时。通过过滤收集生成的晶体，然后使用乙醇 (17.6 L)洗涤，然后在40℃下在减压下干燥17小时以获得上述标题化合物 (3.50 kg, 7.2 mol)。产率：93%。
(实施例5)
2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺单盐酸盐
在25℃下将3 M 盐酸(0.527 ml, 1.58 mmol)滴加至2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺 (306 mg, 0.686 mmol)的乙醇(10.7 ml)悬浮液，同时将悬浮液搅拌。将生成的混合物搅拌4小时。通过过滤收集生成的晶体，然后使用乙醇 (1.5 ml)洗涤，然后在40℃下在减压下干燥1小时以获得上述标题化合物 (295 mg, 0.612 mmol)。产率：89%。
(实施例6)
2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺单盐酸盐
在室温下，将3 M 盐酸(0.393 ml, 1.18 mmol)以两部分滴加至2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺(527.5 mg, 1.18 mmol)的乙醇(30 ml)悬浮液，同时将悬浮液搅拌。此后，将生成的混合物搅拌1小时。通过过滤收集生成的晶体，然后使用乙醇 (6 ml)洗涤，然后在40℃下在减压下干燥30分钟以获得上述标题化合物 (525.3 mg, 1.09 mmol)。产率：92%。
(实施例7)
2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺单盐酸盐
将乙醇 (70 ml)添加至2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺 (2.044 g, 4.584 mmol)，然后将生成的混合物在23℃下搅拌。此后，将1.5 M 盐酸 (3.59 ml, 5.39 mmol)添加至反应混合物，然后将生成的混合物搅拌4小时。将沉淀的晶体过滤，然后使用乙醇 (10 ml)洗涤，然后在40℃下在减压下干燥1小时以获得上述标题化合物(1.893 g, 3.924 mmol)。产率：86%。
(实施例8)
2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺单盐酸盐
将乙醇 (72 ml)添加至2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺 (2.068 g, 4.485 mmol)，然后将生成的混合物在23℃下搅拌。此后，将1.87 M 盐酸(0.720 ml, 1.346 mmol)和充当晶种的2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺单盐酸盐添加至反应混合物，然后将生成的混合物搅拌30分钟。此后，将3.28 M 盐酸 (0.273 ml, 0.897 mmol)添加至反应混合物，然后将生成的混合物搅拌8分钟。将该操作重复另外八次。此后，将3.28 M 盐酸 (0.137 ml, 0.449 mmol)添加至反应混合物，然后将生成的混合物搅拌4小时。将沉淀的晶体过滤，然后使用乙醇 (10 ml)洗涤，然后在40℃下在减压下干燥1小时以获得上述标题化合物 (2.057 g, 4.264 mmol)。产率：95%。
(实施例9)
2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺单盐酸盐
将乙醇 (72 ml)添加至2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺 (2.068 g, 4.485 mmol)，然后将生成的混合物在24℃下搅拌。此后，将1 M 盐酸(2.691 ml, 2.691 mmol)和充当晶种的2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺单盐酸盐添加至反应混合物，然后将生成的混合物搅拌30分钟。此后，将9 M 盐酸 (0.100 ml, 0.897 mmol)添加至反应混合物，然后将生成的混合物搅拌10分钟。将该操作重复另外八次，然后将混合物搅拌4小时。将沉淀的晶体过滤，然后使用乙醇 (10 ml)洗涤，然后在40℃下在减压下干燥1小时以获得上述标题化合物 (2.044 g, 4.237 mmol)。产率：95%。
(实施例10)
2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺单盐酸盐
将乙醇(72 ml)添加至2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺 (2.068 g, 4.485 mmol)，然后将生成的混合物在24℃下搅拌。此后，将1 M 盐酸(1.346 ml, 1.346 mmol)和充当晶种的2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺单盐酸盐添加至反应混合物，然后将生成的混合物搅拌30分钟。此后，将1 M 盐酸(0.897 ml, 0.897 mmol)添加至反应混合物，然后将生成的混合物搅拌8分钟。将该操作重复另外三次。此后，将1 M 盐酸(0.449 ml, 0.449 mmol)添加至反应混合物，然后将生成的混合物搅拌2.5小时。此后，将9 M 盐酸 (0.100 ml, 0.897 mmol)添加至反应混合物，然后将生成的混合物搅拌1.5小时。然后，将9 M 盐酸 (0.050 ml, 0.449 mmol)添加至反应混合物，然后将生成的混合物搅拌1小时。将沉淀的晶体过滤，然后使用乙醇 (10 ml)洗涤，然后在40℃下在减压下干燥30分钟以获得上述标题化合物 (1.742 g, 3.611 mmol)。产率：81%。
(实施例11)
2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺单盐酸盐
将乙醇 (700 ml)添加至2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺 (20.00 g, 44.85 mmol)，然后将生成的混合物在24℃下搅拌。此后，将1 M 盐酸 (13.46 ml, 13.46 mmol)和充当晶种的2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺单盐酸盐添加至反应混合物，然后将生成的混合物搅拌30分钟。此后，将1 M 盐酸(8.97 ml, 8.97 mmol)滴加至反应混合物时间为9分钟。将该操作重复另外三次。然后，将1 M 盐酸 (4.49 ml, 4.49 mmol)添加至反应混合物，然后将生成的混合物搅拌1小时。此后，将9 M 盐酸(1.00 ml, 8.97 mmol)添加至反应混合物，然后将生成的混合物搅拌1小时50分钟。将沉淀的晶体过滤，然后使用乙醇 (100 ml)洗涤，然后在40℃下在减压下干燥1小时以获得上述标题化合物 (18.95 g, 39.28 mmol)。产率：88%。
(实施例12)
2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺单盐酸盐
将乙醇 (2800 ml)添加至2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺 (80.00 g, 173.48 mmol)，然后将生成的混合物在20℃下搅拌。此后，将1 M 盐酸(52.06 ml, 52.06 mmol)和充当晶种的2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺单盐酸盐添加至反应混合物，然后将生成的混合物搅拌30分钟。此后，将1 M 盐酸 (34.69 ml, 34.69 mmol)滴加至反应混合物时间为8分钟，然后将生成的混合物搅拌4分钟。将该操作重复另外三次。然后，将1 M 盐酸 (17.37 ml, 17.37 mmol)滴加至反应混合物时间为5分钟，然后将生成的混合物搅拌4分钟。此后，将9 M 盐酸 (3.87 ml, 34.83 mmol)滴加至反应混合物时间为5分钟，并将生成的混合物搅拌2小时40分钟。将沉淀的晶体过滤，然后使用乙醇 (400 ml)洗涤，然后在室温下在减压下干燥30分钟然后在40℃下干燥2.5小时以获得上述标题化合物 (68.9 g, 142.8 mmol)。产率：82%。
(实施例13)
2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺单盐酸盐
将乙醇 (72 ml)添加至2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺 (2.068 g, 4.485 mmol)，然后将生成的混合物在24℃下搅拌。此后，将1 M 盐酸 (1.346 ml, 1.346 mmol)添加至反应混合物，然后将生成的混合物搅拌30分钟。然后，将1 M 盐酸 (0.897 ml, 0.897 mmol)添加至反应混合物时间为5分钟，然后将生成的混合物搅拌5分钟。将该操作重复另外三次。此后，将1 M 盐酸 (0.449 ml, 0.449 mmol)添加至反应混合物，然后将生成的混合物搅拌30分钟。将浓盐酸 (0.299 ml, 3.588 mmol)添加至反应混合物，并将生成的混合物搅拌4小时。将沉淀的晶体过滤，然后使用乙醇 (10 ml)洗涤，然后在40℃下在减压下干燥30分钟以获得上述标题化合物 (1.942 g, 4.026 mmol)。产率：90%。
(实施例14)
2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺单盐酸盐
将乙醇 (72 ml)添加至2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺 (2.068 g, 4.485 mmol)，然后将生成的混合物在23℃下搅拌。此后，将1 M 盐酸 (1.346 ml, 1.346 mmol)添加至反应混合物，并将生成的混合物搅拌25分钟。然后，将1 M 盐酸 (0.897 ml, 0.897 mmol)添加至反应混合物时间为4分钟，并将生成的混合物搅拌6分钟。将该操作重复另外三次。此后，将1 M 盐酸 (0.449 ml, 0.449 mmol)添加至反应混合物，并将生成的混合物搅拌30分钟。将浓盐酸 (0.299 ml, 3.588 mmol)添加至反应混合物，并将生成的混合物搅拌1小时。将反应混合物冷却至2℃时间为1小时。两小时后，将沉淀的晶体过滤，然后使用乙醇 (10 ml)洗涤，然后在40℃下在减压下干燥30分钟以获得上述标题化合物 (2.011 g, 4.169 mmol)。产率：93%。
(实施例15)
2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺单盐酸盐
将乙醇 (72 ml)和水 (3.052 ml)添加至2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺 (2.068 g, 4.485 mmol)，然后将生成的混合物在23℃下搅拌。此后，将浓盐酸 (0.045 ml, 0.54 mmol)添加至反应混合物时间为2分钟，并将生成的混合物搅拌10分钟。将该操作重复另外九次。此后，将反应混合物搅拌30分钟，并向其添加浓盐酸 (0.299 ml, 3.588 mmol)。将生成的混合物搅拌4小时。将沉淀的晶体过滤，然后使用乙醇 (10 ml)洗涤，然后在40℃下在减压下干燥30分钟以获得上述标题化合物 (2.022 g, 4.192 mmol)。产率：94%。
(实施例16)
2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺单盐酸盐
将乙醇 (36 ml)和水(3.052 ml)添加至2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺 (2.068 g, 4.485 mmol)，并将生成的混合物在25℃下搅拌。此后，将浓盐酸 (0.045 ml, 0.54 mmol)添加至反应混合物时间为1分钟，并将生成的混合物搅拌9分钟。将该操作重复另外九次。此后，将反应混合物搅拌30分钟，并向其添加浓盐酸 (0.299 ml, 3.588 mmol)。然后，向其添加乙醇 (36 ml)时间为45分钟，并将生成的混合物搅拌4小时。将沉淀的晶体过滤，然后使用乙醇 (10 ml)洗涤，然后在40℃下在减压下干燥30分钟以获得上述标题化合物 (2.020 g, 4.187 mmol)。产率：93%。
(实施例17)
2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺单盐酸盐
将乙醇 (72 ml)添加至2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺 (2.068 g, 4.485 mmol)，然后将生成的混合物在24℃下搅拌。此后，将1 M 盐酸 (1.346 ml, 1.346 mmol)添加至反应混合物，并将生成的混合物搅拌25分钟。然后，将1 M 盐酸 (0.897 ml, 0.897 mmol)添加至反应混合物时间为4分钟，并将生成的混合物搅拌7分钟。将该操作重复另外三次。将浓盐酸 (0.037 ml, 0.444 mmol)添加至反应混合物，并将生成的混合物搅拌30分钟。此后，将浓盐酸 (0.374 ml, 4.488 mmol)添加至反应混合物时间为8分钟，并将生成的混合物搅拌1小时20分钟。将反应混合物冷却至8℃时间为1小时。两小时后，将沉淀的晶体过滤，然后使用乙醇(10 ml)洗涤，然后在40℃下在减压下干燥30分钟以获得上述标题化合物 (2.026 g, 4.200 mmol)。产率：94%。
(实施例18)
2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺单盐酸盐
将乙醇 (72 ml)添加至2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺(2.068 g, 4.485 mmol)，然后将生成的混合物在24℃下搅拌。此后，将1 M 盐酸 (1.346 ml, 1.346 mmol)添加至反应混合物，并将生成的混合物搅拌25分钟。然后，将1 M 盐酸 (0.897 ml, 0.897 mmol)添加至反应混合物时间为4分钟，并将生成的混合物搅拌7分钟。将该操作重复另外两次。此后，将浓盐酸 (0.037 ml, 0.444 mmol)添加至反应混合物时间为1分钟，并将生成的混合物搅拌9分钟。将该操作重复另外两次，并将反应混合物搅拌30分钟。将浓盐酸 (0.374 ml, 4.488 mmol)添加至反应混合物，并将生成的混合物搅拌1小时。将反应混合物冷却至10℃时间为1小时。两小时后，将沉淀的晶体过滤，然后使用乙醇 (10 ml)洗涤，然后在40℃下在减压下干燥30分钟以获得上述标题化合物 (2.048 g, 4.246 mmol)。产率：95%。
(实施例19)
2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺单盐酸盐
将乙醇 (72 ml)添加至2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺(2.068 g, 4.485 mmol)，然后将生成的混合物在24℃下搅拌。此后，将1.2 M 盐酸 (1.346 ml, 1.615 mmol)添加至反应混合物，并将生成的混合物搅拌25分钟。然后，将1.2 M 盐酸(0.897 ml, 1.076 mmol)添加至反应混合物时间为5分钟，并将生成的混合物搅拌5分钟。将该操作重复另外两次。此后，将浓盐酸 (0.037 ml, 0.444 mmol)添加至反应混合物时间为1分钟，并将生成的混合物搅拌9分钟。将该操作重复另外两次，并将反应混合物搅拌30分钟。将浓盐酸 (0.374 ml, 4.488 mmol)添加至反应混合物，并将生成的混合物搅拌1小时。将反应混合物冷却至10℃时间为1小时。两小时后，将沉淀的晶体过滤，然后使用乙醇 (10 ml)洗涤，然后在40℃下在减压下干燥30分钟以获得上述标题化合物 (2.050 g, 4.250 mmol)。产率：95%。
(实施例20)
2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺单盐酸盐
将乙醇 (41 ml)添加至2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺(2.068 g, 4.485 mmol)，然后将生成的混合物在23℃下搅拌。此后，将1.8 M 盐酸(0.748 ml, 1.346 mmol)添加至反应混合物，并将生成的混合物搅拌27分钟。然后，将1.8 M 盐酸(0.498 ml, 0.896 mmol)添加至反应混合物时间为5分钟，并将生成的混合物搅拌5分钟。将该操作重复另外三次。将1.8 M 盐酸 (0.249 ml, 0.448 mmol)添加至反应混合物，并将生成的混合物搅拌30分钟。将浓盐酸 (0.299 ml, 3.588 mmol)添加至反应混合物，并将生成的混合物搅拌1小时。将反应混合物冷却至3℃时间为50分钟。两小时20分钟后，将沉淀的晶体过滤，然后使用乙醇 (10 ml)洗涤，然后在40℃下在减压下干燥30分钟以获得上述标题化合物 (2.070 g, 4.291 mmol)。产率：96%。
(实施例21)
2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺单盐酸盐
将乙醇 (51 ml)添加至2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺 (2.068 g, 4.485 mmol)，然后将生成的混合物在23℃下搅拌。此后，将1.4 M 盐酸(0.961 ml, 1.345 mmol)添加至反应混合物，并将生成的混合物搅拌26分钟。然后，将1.4 M 盐酸(0.641ml, 0.897 mmol)添加至反应混合物时间为4分钟，并将生成的混合物搅拌6分钟。将该操作重复另外三次。此后，将1.4 M 盐酸(0.320 ml, 0.448 mmol)添加至反应混合物，并将生成的混合物搅拌30分钟。将浓盐酸 (0.299 ml, 3.588 mmol)添加至反应混合物，并将生成的混合物搅拌1小时。将反应混合物冷却至2℃时间为50分钟。两小时30分钟后，将沉淀的晶体过滤，然后使用乙醇 (10 ml)洗涤，然后在40℃下在减压下干燥30分钟以获得上述标题化合物 (2.048 g, 4.246 mmol)。产率：95%。
(实施例22)
2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺单盐酸盐
将乙醇 (72 ml)添加至2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺 (2.068 g, 4.485 mmol)，然后将生成的混合物在25℃下搅拌。此后，将1 M 盐酸(4.037 ml, 4.037 mmol)添加至反应混合物时间为1小时。然后，将浓盐酸 (0.111 ml, 1.332 mmol)进一步添加至反应混合物时间为30分钟，并将生成的混合物搅拌30分钟。此后，将浓盐酸 (0.374 ml, 4.488 mmol)添加至反应混合物时间为6分钟，并将生成的混合物搅拌1小时。将反应混合物冷却至5℃时间为1小时。两小时后，将沉淀的晶体过滤，然后使用乙醇 (10 ml)洗涤，然后在40℃下在减压下干燥30分钟以获得上述标题化合物 (2.037 g, 4.223 mmol)。产率：94%。
(实施例23)
2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺单盐酸盐
将乙醇 (72 ml)添加至2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺(2.068 g, 4.485 mmol)，然后将生成的混合物在26℃下搅拌。此后，将1 M 盐酸(4.037 ml, 4.037 mmol)添加至反应混合物时间为15分钟。然后，将浓盐酸 (0.111 ml, 1.332 mmol)进一步添加至反应混合物时间为30分钟，并将生成的混合物搅拌30分钟。此后，将浓盐酸 (0.374 ml, 4.488 mmol)添加至反应混合物时间为7分钟，并将生成的混合物搅拌1小时。将反应混合物冷却至5℃时间为1小时。两小时后，将沉淀的晶体过滤，然后使用乙醇 (10 ml)洗涤，然后在40℃下在减压下干燥30分钟以获得上述标题化合物 (2.037 g, 4.223 mmol)。产率：94%。
(实施例24)
2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺单盐酸盐
将乙醇(72 ml)添加至2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺 (2.068 g, 4.485 mmol)，然后将生成的混合物在26℃下搅拌。此后，将1 M 盐酸 (4.037 ml, 4.037 mmol)添加至反应混合物时间为1小时。然后，将浓盐酸 (0.111 ml, 1.332 mmol)进一步添加至反应混合物时间为5分钟，并将生成的混合物搅拌30分钟。此后，将浓盐酸 (0.374 ml, 4.488 mmol)添加至反应混合物时间为6分钟，并将生成的混合物搅拌1小时。将反应混合物冷却至5℃时间为1小时。两小时后，将沉淀的晶体过滤，然后使用乙醇 (10 ml)洗涤，然后在40℃下在减压下干燥30分钟以获得上述标题化合物 (2.042 g, 4.233 mmol)。产率：94%。
(实施例25)
2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺单盐酸盐
将乙醇 (72 ml)添加至2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺 (2.068 g, 4.485 mmol)，然后将生成的混合物在26℃下搅拌。此后，将1 M 盐酸 (4.037 ml, 4.037 mmol)添加至反应混合物时间为1小时。然后，将浓盐酸 (0.111 ml, 1.332 mmol)进一步添加至反应混合物时间为30分钟，并将生成的混合物搅拌30分钟。此后，将浓盐酸 (0.374 ml, 4.488 mmol)添加至反应混合物时间为6分钟，并将生成的混合物搅拌30分钟。将反应混合物冷却至6℃时间为30分钟。两小时后，将沉淀的晶体过滤，然后使用乙醇 (10 ml)洗涤，然后在40℃下在减压下干燥30分钟以获得上述标题化合物 (2.040 g, 4.229 mmol)。产率：94%。
(实施例26)
2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺盐酸盐
将乙醇 (72 ml)添加至2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺 (2.068 g, 4.485 mmol)，然后将生成的混合物在26℃下搅拌。此后，将1 M 盐酸 (4.037 ml, 4.037 mmol)添加至反应混合物时间为1小时。然后，将浓盐酸 (0.111 ml, 1.332 mmol)进一步添加至反应混合物时间为30分钟，将浓盐酸 (0.374 ml, 4.488 mmol)添加至反应混合物时间为6分钟，并将生成的混合物搅拌1小时。将反应混合物冷却至5℃ 时间为1小时。两小时后，将沉淀的晶体过滤，然后使用乙醇 (10 ml)洗涤，然后在40℃下在减压下干燥30分钟以获得上述标题化合物 (2.039 g, 4.227 mmol)。产率：94%。
(实施例27)
2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺单盐酸盐
将乙醇 (180 ml)添加至2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺 (5.252 g, 11.21 mmol)，然后将生成的混合物在26℃下搅拌。此后，将1 M 盐酸(10.09 ml, 10.09 mmol)添加至反应混合物时间为1小时。然后，将浓盐酸 (0.280 ml, 3.360 mmol)进一步添加至反应混合物时间为30分钟，并将生成的混合物搅拌30分钟。此后，将浓盐酸 (0.934 ml, 11.21 mmol)添加至反应混合物时间为7分钟，并将生成的混合物搅拌1小时。将反应混合物冷却至5℃时间为1小时。二十小时后，将沉淀的晶体过滤，然后使用乙醇 (25 ml)洗涤，然后在40℃下在减压下干燥1小时以获得上述标题化合物 (5.145 g, 10.67 mmol)。产率：95%。
(实施例28)
2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺单盐酸盐
将乙醇 (36.7 L)添加至2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺(1.07 kg, 2.28 mmol)，然后将生成的混合物在25℃下搅拌。此后，将1 M 盐酸(2.06 L, 2.06 mol)添加至反应混合物时间为55分钟。然后，将浓盐酸 (57 ml, 0.68 mol)进一步添加至反应混合物时间为33分钟，并将生成的混合物搅拌30分钟。此后，将浓盐酸 (191 ml, 2.29 mol)添加至反应混合物时间为11分钟，并将生成的混合物搅拌1小时。将反应混合物冷却至5℃时间为76分钟。二十二小时后，将沉淀的晶体过滤，然后使用乙醇 (5 L)洗涤，然后在40℃下在减压下干燥18小时以获得上述标题化合物(1.05 kg, 2.18 mol)。产率：95%。
(实施例29)
2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺单盐酸盐
将乙醇(36.7 L)添加至2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺(1.07 kg, 2.28 mol)，然后将生成的混合物在24℃下搅拌。此后，将1 M 盐酸(2.06 L, 2.06 mol)添加至反应混合物时间为68分钟。然后，将浓盐酸(57 ml, 0.68 mol)进一步添加至反应混合物时间为34分钟，并将生成的混合物搅拌30分钟。此后，将浓盐酸 (191 ml, 2.29 mol)添加至反应混合物时间为9分钟，并将生成的混合物搅拌1小时。将反应混合物冷却至5℃时间为76分钟。二十二小时30分钟后，将沉淀的晶体过滤，然后使用乙醇 (5 L)洗涤，然后在40℃下在减压下干燥18小时以获得上述标题化合物 (1.05 kg, 2.18 mol)。产率：95%。
(实施例30)
2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺单盐酸盐
将乙醇 (72 ml)添加至2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺(2.068 g, 4.485 mmol)，然后将生成的混合物在30℃下搅拌。此后，将1 M 盐酸 (4.037 ml, 4.037 mmol)添加至反应混合物时间为1小时。然后，将浓盐酸 (0.111 ml, 1.332 mmol)进一步添加至反应混合物时间为30分钟，并将生成的混合物搅拌30分钟。此后，将浓盐酸 (0.374 ml, 4.488 mmol)添加至反应混合物时间为6分钟，并将生成的混合物搅拌1小时。将反应混合物冷却至5℃时间为74分钟。两小时后，将沉淀的晶体过滤，然后使用乙醇 (10 ml)洗涤，然后在40℃下在减压下干燥30分钟以获得上述标题化合物(2.031 g, 4.210 mmol)。产率：94%。
(实施例31)
2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺单盐酸盐
将乙醇 (72 ml)添加至2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺 (2.068 g, 4.485 mmol)，然后将生成的混合物在20℃下搅拌。此后，将1 M 盐酸 (4.037 ml, 4.037 mmol)添加至反应混合物时间为1小时。然后，将浓盐酸 (0.111 ml, 1.332 mmol)进一步添加至反应混合物时间为30分钟，并将生成的混合物搅拌30分钟。此后，将浓盐酸 (0.374 ml, 4.488 mmol)添加至反应混合物时间为5分钟，并将生成的混合物搅拌1小时。将反应混合物冷却至4℃时间为46分钟。两小时后，将沉淀的晶体过滤，然后使用乙醇 (10 ml)洗涤，然后在40℃下在减压下干燥30分钟以获得上述标题化合物 (2.043 g, 4.235 mmol)。产率：94%。
(实施例32)
2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺单盐酸盐
将乙醇 (100.5 ml)和水(3.975 ml)添加至2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺 (3.00 g, 6.40 mmol)，然后将生成的混合物在25℃下搅拌。此后，将通过用乙醇 (19.0 ml)稀释浓盐酸(1.0 ml)制备的0.585 M的氯化氢的水-乙醇溶液 (3.28 ml, 1.92 mmol)添加至反应混合物。在与上述相同的温度下将晶种 (0.3 mg)添加至混合物，并将0.585 M氯化氢的水-乙醇溶液 (6.56 ml, 3.84 mmol)滴加至生成的混合物时间为2小时。将混合物搅拌30分钟。此后，将浓盐酸 (0.695 ml, 8.34 mmol)滴加至反应混合物时间为1小时，并将生成的混合物搅拌1小时。将沉淀的晶体过滤，然后使用乙醇 (15 ml)洗涤，然后在40℃下在减压下干燥14小时以获得上述标题化合物 (2.89 g, 5.96 mmol)。产率：93%。
(实施例33)
2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺单盐酸盐
将乙醇 (100.5 ml)和水(3.975 ml)添加至2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺 (3.00 g, 6.40 mmol)，然后将生成的混合物在30℃下搅拌。此后，将通过用乙醇 (19.0 ml)稀释浓盐酸(1.0 ml)制备的0.585 M的氯化氢的水-乙醇溶液 (3.28 ml, 1.92 mmol)添加至反应混合物。在与上述相同的温度下将晶种 (0.3 mg)添加至生成的混合物，并将0.585 M氯化氢的水-乙醇溶液 (6.56 ml, 3.84 mmol)滴加至生成的混合物时间为2小时。将生成的混合物搅拌30分钟。此后，将浓盐酸 (0.695 ml, 8.34 mmol)滴加至生成的混合物时间为1小时，并将生成的混合物搅拌1小时。将沉淀的晶体过滤，然后使用乙醇 (15 ml)洗涤，然后在40℃下在减压下干燥14小时以获得上述标题化合物 (2.86 g, 5.93 mmol)。产率：93%。
(实施例34)
X射线粉末衍射的检测1
使用X-射线衍射装置 (模型：具有GADDS CS的D8 DISCOVER，由Bruker AXS制造)。将样品填充进入由玻璃制成的样品固定器，然后在下列条件下进行检测。
<分析条件>
X-射线：Cu Kα1/40 kV/40 mA
测角仪：纵向型，双轴 (θ, θ)
2θ检测范围：3°至40°
在图4中显示通过上述方法检测的在实施例2中获得的二盐酸盐晶体的X射线粉末衍射图。表1显示当在图4中将最大峰强度设置在100处时相对强度为15或更大的峰。
[表1]
峰编号 2θ d值 相对强度 峰编号 2θ d值 相对强度
1 7.73 11.44 100 13 24.13 3.69 40
2 9.78 9.05 25 14 24.70 3.60 55
3 12.58 7.04 26 15 26.01 3.43 50
4 14.36 6.17 32 16 27.29 3.27 78
5 15.84 5.59 26 17 28.58 3.12 23
6 16.71 5.31 30 18 29.37 3.04 31
7 17.17 5.17 24 19 30.65 2.92 28
8 18.40 4.82 32 20 31.38 2.85 20
9 19.58 4.53 40 21 33.52 2.67 24
10 21.31 4.17 39 22 35.25 2.55 18
11 22.85 3.89 29 23 36.87 2.44 15
12 23.62 3.77 30        
在图5中显示通过上述方法检测的在实施例3中获得的单盐酸盐晶体的X射线粉末衍射图。表2显示当在图5中将最大峰强度设置在100处时相对强度为30或更大的峰。
[表2]
峰编号 2θ d值 相对强度 峰编号 2θ d值 相对强度
1 9.43 9.38 58 15 26.10 3.41 54
2 12.70 6.97 42 16 26.53 3.36 71
3 13.03 6.80 63 17 26.95 3.31 35
4 15.33 5.78 100 18 27.60 3.23 39
5 16.10 5.50 65 19 27.88 3.20 44
6 16.84 5.26 88 20 28.52 3.13 37
7 18.55 4.78 45 21 29.63 3.02 39
8 20.21 4.39 50 22 29.95 2.98 49
9 20.89 4.25 50 23 31.55 2.84 30
10 21.32 4.17 42 24 32.13 2.79 30
11 22.93 3.88 74 25 33.40 2.68 34
12 24.73 3.60 47 26 34.95 2.57 35
13 25.10 3.55 46 27 38.70 2.33 30
14 25.40 3.51 54        
在图6中显示通过上述方法检测的在实施例6中获得的单盐酸盐晶体的X射线粉末衍射图。表3显示当在图6中将最大峰强度设置在100处时相对强度为12或更大的峰。
[表3]
峰编号 2θ d值 相对强度 峰编号 2θ d值 相对强度
1 8.07 10.96 24 9 24.80 3.59 74
2 9.45 9.36 34 10 28.56 3.13 25
3 13.07 6.78 59 11 28.85 3.09 65
4 15.39 5.76 13 12 31.26 2.86 12
5 16.16 5.48 100 13 32.17 2.78 13
6 16.90 5.25 45 14 32.87 2.73 12
7 20.83 4.26 35 15 34.11 2.63 19
8 24.29 3.66 57        
(实施例35)
X射线粉末衍射的检测2
使用X-射线衍射装置 (模型：RINT2200V，由Rigaku Corporation制造)。将样品填充进入由玻璃制成的样品固定器，然后在下列条件下进行检测。
<分析条件>
X-射线：Cu Kα1/40 kV/40 mA
测角仪：Ultima + I型水平测角仪
2θ扫描范围：5°至40°。
<检测结果>
在图7中显示通过上述方法检测的在实施例1中获得的二盐酸盐晶体的X射线粉末衍射图。
在图8中显示通过上述方法检测的在实施例4中获得的单盐酸盐晶体的X射线粉末衍射图。
在图9中显示通过上述方法检测的在实施例5中获得的单盐酸盐晶体的X射线粉末衍射图。
在图10中显示通过上述方法检测的在实施例7中获得的单盐酸盐晶体的X射线粉末衍射图。
在图11中显示通过上述方法检测的在实施例8中获得的单盐酸盐晶体的X射线粉末衍射图。
在图12中显示通过上述方法检测的在实施例9中获得的单盐酸盐晶体的X射线粉末衍射图。
在图13中显示通过上述方法检测的在实施例10中获得的单盐酸盐晶体的X射线粉末衍射图。
在图14中显示通过上述方法检测的在实施例11中获得的单盐酸盐晶体的X射线粉末衍射图。
在图15中显示通过上述方法检测的在实施例12中获得的单盐酸盐晶体的X射线粉末衍射图。
在图16中显示通过上述方法检测的在实施例13中获得的单盐酸盐晶体的X射线粉末衍射图。
在图17中显示通过上述方法检测的在实施例14中获得的单盐酸盐晶体的X射线粉末衍射图。
在图18中显示通过上述方法检测的在实施例15中获得的单盐酸盐晶体的X射线粉末衍射图。
在图19中显示通过上述方法检测的在实施例16中获得的单盐酸盐晶体的X射线粉末衍射图。
在图20中显示通过上述方法检测的在实施例17中获得的单盐酸盐晶体的X射线粉末衍射图。
在图21中显示通过上述方法检测的在实施例18中获得的单盐酸盐晶体的X射线粉末衍射图。
在图22中显示通过上述方法检测的在实施例19中获得的单盐酸盐晶体的X射线粉末衍射图。
在图23中显示通过上述方法检测的在实施例20中获得的单盐酸盐晶体的X射线粉末衍射图。
在图24中显示通过上述方法检测的在实施例21中获得的单盐酸盐晶体的X射线粉末衍射图。
在图25中显示通过上述方法检测的在实施例22中获得的单盐酸盐晶体的X射线粉末衍射图。
在图26中显示通过上述方法检测的在实施例23中获得的单盐酸盐晶体的X射线粉末衍射图。
在图27中显示通过上述方法检测的在实施例24中获得的单盐酸盐晶体的X射线粉末衍射图。
在图28中显示通过上述方法检测的在实施例25中获得的单盐酸盐晶体的X射线粉末衍射图。
在图29中显示通过上述方法检测的在实施例26中获得的单盐酸盐晶体的X射线粉末衍射图。
在图30中显示通过上述方法检测的在实施例27中获得的单盐酸盐晶体的X射线粉末衍射图。
在图31中显示通过上述方法检测的在实施例28中获得的单盐酸盐晶体的X射线粉末衍射图。
在图32中显示通过上述方法检测的在实施例29中获得的单盐酸盐晶体的X射线粉末衍射图。
在图33中显示通过上述方法检测的在实施例30中获得的单盐酸盐晶体的X射线粉末衍射图。
在图34中显示通过上述方法检测的在实施例31中获得的单盐酸盐晶体的X射线粉末衍射图。
在图35中显示通过上述方法检测的在实施例32中获得的单盐酸盐晶体的X射线粉末衍射图。
在图36中显示通过上述方法检测的在实施例33中获得的单盐酸盐晶体的X射线粉末衍射图。
(实施例36)
差示扫描量热法
<检测方法>
使用差示扫描量热仪 (模型：DSC3100，由Mac Science制造)。将5 mg的2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺的盐酸盐称重放入由铝制成的测量盘，然后通过在10℃/min的升温速率下使盘的温度从室温升高至250℃，同时盘处于打开状态进行检测。
<检测结果>
图37显示通过检测根据上述方法在实施例1中获得的二盐酸盐晶体获得的差示扫描量热图。
图38显示通过检测根据上述方法在实施例4中获得的单盐酸盐晶体获得的差示扫描量热图。
图39显示通过检测根据上述方法在实施例11中获得的单盐酸盐晶体获得的差示扫描量热图。
(实施例37)
残留乙醇的分析
如下所述通过气相色谱分析残留乙醇。
<标准溶液的制备>
1) 精确称量500 mg的乙醇(= WEtOH [mg])，然后将二甲基亚砜添加至乙醇以精确制备具有20 ml总量的溶液。将生成的溶液定义为溶液[1]。
2) 精确称量4 mL的溶液[1]，然后将二甲基亚砜添加至溶液[1]以精确制备具有20 ml总量的溶液。将生成的溶液定义为溶液[2]。
3) 精确称量4 mL的溶液[2]，然后将二甲基亚砜添加至溶液[2]以精确制备具有20 ml总量的溶液。将生成的溶液定义为溶液[3] (乙醇浓度 = WEtOH/500 [mg/ml])。
4) 精确称量2 mL的溶液[2]，然后将二甲基亚砜添加至溶液[2]以精确制备具有20 ml总量的溶液。将生成的溶液定义为溶液[4] (乙醇浓度 = WEtOH/1000 [mg/ml])。
5) 精确称量2 mL的溶液[4]，然后将二甲基亚砜添加至溶液[4]以精确制备具有20 ml总量的溶液。将生成的溶液定义为溶液[5] (乙醇浓度 = WEtOH/10000 [mg/ml])。
<样品溶液的制备>
精确称重50 mg的2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺单盐酸盐或2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺二盐酸盐 (= W样品[mg])。将由此获得的样品溶于1 ml的二甲基亚砜，并将生成的溶液用作样品溶液。
<分析条件>
检测器：火焰离子化检测器
柱：DB-624 (0.32 mmID × 30 m，膜厚度：1.8 μm，由Agilent制造)
柱温度：将柱的温度在40℃下保持5分钟，此后，以15℃/min的升温速率将温度升高至220℃。将温度在220℃下保持3分钟。
注射口温度：200℃
检测器温度：240℃
载气：氦气
柱流速：70 kpa
分流比：1 : 20
注射量：1 μL。
<检测和计算>
1) 将1 μL的溶液[3]注射进入柱以获得乙醇的峰面积(= AEtOH[3])。
2) 将1 μL的溶液[4]注射进入柱以获得乙醇的峰面积(= AEtOH[4])。
3) 将 1 μL的溶液[5]注射进入柱以获得乙醇的峰面积(= AEtOH[5])。
4) 将乙醇浓度定义为y，并将乙醇峰面积定义为x。基于溶液[3] (x = AEtOH[3], y = WEtOH/500)、溶液[4] (x = AEtOH[4], y = WEtOH/1000)和溶液[5] (x = AEtOH[5], y = WEtOH/10000)的数值，产生线性函数的回归方程式。
5) 将1 μL的样品溶液注射进入柱以获得乙醇的峰面积(= A样品)。将获得的值替换进入上述回归方程式中的x以获得样品溶液的乙醇浓度 (= C样品[mg/ml])作为y。
6) 使用下列方程式计算残留乙醇的量：[ppm] = 1000000 × C样品[mg/ml] × 1 [ml] ÷ W样品[mg]。
<检测结果>
通过上述方法测量在实施例1、4、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32和33中获得的各个晶体中残留乙醇的量。表4显示结果。
[表4]
实施例编号 盐形式 残留乙醇的量(ppm) 实施例编号 盐形式 残留乙醇的量(ppm)
实施例1 二盐酸盐 6150 实施例20 单盐酸盐 3480
实施例4 单盐酸盐 10980 实施例21 单盐酸盐 3680
实施例7 单盐酸盐 4730 实施例22 单盐酸盐 2370
实施例8 单盐酸盐 4790 实施例23 单盐酸盐 2670
实施例9 单盐酸盐 3830 实施例24 单盐酸盐 2650
实施例10 单盐酸盐 2060 实施例25 单盐酸盐 2360
实施例11 单盐酸盐 1910 实施例26 单盐酸盐 2460
实施例12 单盐酸盐 2150 实施例27 单盐酸盐 2380
实施例13 单盐酸盐 2120 实施例28 单盐酸盐 3190
实施例14 单盐酸盐 2420 实施例29 单盐酸盐 3140
实施例15 单盐酸盐 3620 实施例30 单盐酸盐 3010
实施例16 单盐酸盐 2550 实施例31 单盐酸盐 2820
实施例17 单盐酸盐 2430 实施例32 单盐酸盐 2465
实施例18 单盐酸盐 2520 实施例33 单盐酸盐 2064
实施例19 单盐酸盐 2990      
(实施例38)
纯度试验和稳定性试验
<加速试验的条件>
条件1：40℃，湿度：75%
条件2：60℃ (没有湿度控制)
如下所述，通过高效液相色谱测定上述加速试验条件下的样品。
<20 mM磷酸二氢钾水溶液的制备>
2.72 g的磷酸二氢钾溶于1000 ml的水以制备20 mM磷酸二氢钾水溶液。
<20 mM磷酸氢二钾水溶液的制备>
将3.48 g的磷酸氢二钾溶于1000 ml的水以制备20 mM磷酸氢二钾水溶液。
<20 mM磷酸钾缓冲液 (pH = 6.5)的制备>
将20 mM磷酸氢二钾水溶液添加至20 mM磷酸二氢钾水溶液使得混合溶液的pH被调节至pH 6.5。将由此制备的溶液定义为20 mM磷酸钾缓冲液 (pH = 6.5)。
<20 mM磷酸钾缓冲液 (pH = 7.0)的制备>
将20 mM磷酸氢二钾水溶液添加至20 mM磷酸二氢钾水溶液使得混合溶液的pH被调节至pH 7.0。将由此制备的溶液定义为20 mM磷酸钾缓冲液 (pH = 7.0)。
<流动相>
流动相 A：20 mM磷酸钾缓冲液 (pH = 6.5) / 乙腈= 9/1 (v/v)
流动相 B：20 mM磷酸钾缓冲液 (pH = 6.5) / 乙腈= 3/7 (v/v)
<样品-溶解的溶液>
从20 mM磷酸钾缓冲液 (pH =7.0) / 乙腈= 3/7制备样品-溶解的溶液。
<样品溶液的制备>
将用于加速试验的分析物溶于样品-溶解的溶液以制备约0.5 g/L的溶液。
<分析条件>
柱：YMC-Pack Pro C18RS, 3.0 mm ID × 150 mm，颗粒直径：3 μm
柱温度：约40℃
梯度条件：
0至5分钟，流动相 A：100 → 75 / 流动相 B：0 → 25
5至15分钟，流动相 A：75 / 流动相 B：25
15至45分钟，流动相 A：75 → 0 / 流动相 B：25 → 100
45至55分钟，流动相 A：0 / 流动相 B：100
流速：0.7 ml/min
检测范围：0至55分钟
检测波长：240 nm
注射的样品溶液的量：5 μl。
<计算>
1)将样品溶液注射进入柱以获得各个相关物质的峰面积(A)和化合物(1)的峰面积(T)。
2)将样品-溶解的溶液注射进入柱以获得各个空白的峰面积(B)。
3)使用下式计算各个相关物质的量[%]：
各个相关物质的量[%] = 100 × (A - B) ÷ T。
<检测结果>
表5显示在实施例4中获得的单盐酸盐晶体、在实施例12中获得的单盐酸盐晶体和在实施例28中获得的单盐酸盐晶体上进行加速试验的结果。
[表5]
Figure DEST_PATH_IMAGE024
*rrt表示当将化合物(1)的保留时间设置在1时，杂质的相对保留时间。
(测试例1：细胞生长抑制试验)
使用两种类型的细胞 (人乳腺癌细胞系SK-BR-3和人肺癌细胞系NCI-H460)进行细胞生长抑制试验。
将各个类型的细胞悬浮在培养基中并在SK-BR-3的情况下以2000细胞/150 μL/孔和在NCI-H460的情况下以500细胞/150 μL/孔接种进入96-孔多孔板中。将化合物(1)溶于DMSO并使用培养基将其稀释以制备样品溶液 (DMSO浓度：0.5%或更少)。在接种后第二天，将50 μL的未添加测试化合物的包含DMSO的培养基 (下文称为DMSO稀释的溶液；DMSO浓度：0.5%或更少)或50 μL的样品溶液进一步添加至细胞。在将样品溶液或DMSO稀释的溶液添加至细胞后立即和72小时后进行MTT试验。如下进行MTT试验。
以20 μL每孔添加5 mg/mL的MTT (3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物)溶液。此后，在5% CO2中在37℃下将板孵化四小时。将板在1200 rpm下离心五分钟，然后通过使用分配器吸出去除培养物上清液。以150 μL每孔添加DMSO，并将产生的甲瓒溶解。使用板混合器将板搅拌至均匀染色各个孔。在660 nm的参照下，在540 nm的OD下使用板读数器检测各个孔的吸光度。
基于假设在添加样品溶液后立即检测的OD值为S、在添加样品溶液后72小时检测的OD值为T和在添加DMSO稀释的溶液后72小时检测的OD值为C，通过下列计算式测定各个浓度的T/C (%)并绘制剂量-反应曲线以计算50%生长抑制浓度 (GI50值)。
T/C (%) = (T-S)/(C-S) × 100。
化合物(1)表现出对于SK-BR-3细胞为13 (nM)的GI50值和对于NCI-H460细胞为26 (nM)的GI50值。
(制剂实施例1) <胶囊剂>
使用V-形旋转混合器将5 g在实施例2、3或6中获得的晶体、115 g的乳糖、58 g的玉米淀粉和2 g的硬脂酸镁混合，然后以每个180 mg的量将生成的混合物填充进入3号胶囊以获得胶囊剂。
(制剂实施例2) <片剂>
使用V-形旋转混合器将5 g在实施例2、3或6中获得的晶体、90 g的乳糖、34 g的玉米淀粉、20 g的结晶纤维素和1 g的硬脂酸镁混合，然后以150 mg每片的质量使生成的混合物进入片剂-制造机器以获得片剂。
(制剂实施例3) <悬浮剂>
将甲基纤维素分散并溶于纯净水以制备分散介质。在研钵中将在实施例2、3或6中获得的晶体称重。向其添加少量的上述分散介质直至将它们完全混合。将纯净水添加至混合物以制备100 g的悬浮剂。

Claims (18)

1.由下式(1)表示的2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺的盐酸盐：
[式1]
。
2.由权利要求1所述的式(1)表示的2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺二盐酸盐的晶体。
3.如权利要求2所述的晶体，在通过使用铜Kα辐射 (波长λ = 1.54埃)照射获得的X射线粉末衍射图中其具有图1显示的X射线衍射图。
4.如权利要求2所述的晶体，在通过使用铜Kα辐射 (波长λ = 1.54埃)照射获得的X射线粉末衍射图中其显示在衍射角2θ为7.73、24.70、26.01和27.29处的特征峰。
5.如权利要求2或4所述的晶体，在通过使用铜Kα辐射 (波长λ = 1.54埃)照射获得的X射线粉末衍射图中其显示在衍射角2θ为7.73、9.78、12.58、14.36、15.84、16.71、17.17、18.40、19.58、21.31、22.85、23.62、24.13、24.70、26.01、27.29、28.58、29.37、30.65、31.38、33.52、35.25和36.87处的主峰。
6.由权利要求1所述的式(1)表示的2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺的单盐酸盐的晶体。
7.如权利要求6所述的晶体，在通过使用铜Kα辐射 (波长λ = 1.54埃)照射获得的X射线粉末衍射图中其具有图2显示的X射线衍射图。
8.如权利要求6所述的晶体，在通过使用铜Kα辐射 (波长λ = 1.54埃)照射获得的X射线粉末衍射图中其显示在衍射角2θ为9.43、12.70、13.03、15.33、16.10、16.84、18.55、20.21、20.89、21.32、22.93、24.73、25.10、25.40、26.10、26.53、26.95、27.60、27.88、28.52、29.63、29.95、31.55、32.13、33.40、34.95和38.70处的主峰。
9.如权利要求6所述的晶体，在通过使用铜Kα辐射 (波长λ = 1.54埃)照射获得的X射线粉末衍射图中其具有图3显示的X射线衍射图。
10.如权利要求6所述的晶体，在通过使用铜Kα辐射 (波长λ = 1.54埃)照射获得的X射线粉末衍射图中其显示在衍射角2θ为8.07、9.45、13.07、15.39、16.16、16.90、20.83、24.29、24.80、28.56、28.85、31.26、32.17、32.87和34.11处的主峰。
11.由权利要求1所述的式(1)表示的2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺盐酸盐的晶体，其中乙醇的含量为5000 ppm或更少。
12.如权利要求11所述的晶体，其中所述盐酸盐是单盐酸盐。
13.制备权利要求1所述的盐酸盐的方法，其包括将氯化氢溶液滴加至由权利要求1所述的式(1)表示的2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺的溶液或悬浮液。
14.制备权利要求2所述的二盐酸盐晶体的方法，其包括以相对于下述化合物的2当量或更多的量将氯化氢溶液滴加至由权利要求1所述的式(1)表示的2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺的溶液或悬浮液。
15.制备权利要求6所述的单盐酸盐晶体的方法，其包括以相对于下述化合物的1当量或更多至5当量或更少的量将氯化氢溶液滴加至由权利要求1所述的式(1)表示的2-{4-氨基-2-[(3-氯-4-甲氧基-5-甲基吡啶-2-基)甲基]-2,7-二氢-6-硫杂-1,2,3,5-四氮杂苯并[cd]薁-8-基}-N-甲基乙酰胺的溶液或悬浮液。
16.药物，其包含权利要求1所述的盐酸盐作为活性成分。
17.抗肿瘤剂，其包含权利要求1所述的盐酸盐。
18.药物组合物，其包含权利要求2至12中任一项所述的晶体。
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