CN103045750B

CN103045750B - 棕色固氮菌pcr检测试剂盒

Info

Publication number: CN103045750B
Application number: CN201310016882.6A
Authority: CN
Inventors: 杨茂生; 史开志; 杨莉; 徐景峨; 吴位珩; 梁应林
Original assignee: GUIZHOU FARMING ANIMAL SCIENCE AND VETERINARY RESEARCH INSTITUTE
Current assignee: GUIZHOU FARMING ANIMAL SCIENCE AND VETERINARY RESEARCH INSTITUTE
Priority date: 2013-01-16
Filing date: 2013-01-16
Publication date: 2015-07-29
Anticipated expiration: 2033-01-16
Also published as: CN103045750A

Abstract

本发明公开了一种棕色固氮菌PCR检测试剂盒,它包括4.5ul质量百分比浓度为50%的甘油、1.0ul二甲基亚砜、2ul dNTP，dNTP中的ATP,GTP,TTP及CTP均为2.5mol/L、2.0ul浓度为25mmol/L Tris-HCl、2ul浓度为25mmol/L的MgCl₂、0.5ul浓度为2U/ul的Taq酶、引物两条，均为1.0ul、11.0ul超纯水、2ul DL2000 DNA Marker、2ul阳性对照及2ul阴性对照；每次PCR反应加入DNA模板0.5～1.5ul。本发明通过引物设计和模板制备建立针对棕色固氮菌固氮酶基因和藻酸盐algE,algJ,algC等基因的PCR方法，能有效提高棕色固氮菌地方株的检出率，使用效果好。

Description

棕色固氮菌PCR检测试剂盒

技术领域

本发明涉及一种试剂盒，尤其是一种棕色固氮菌PCR检测试剂盒。

背景技术

棕色固氮菌为有益微生物，被列入国内外微生物肥料菌种目录。1990年以来，国内外众多学者对棕色固氮菌藻酸盐基因和固氮酶基因进行了分析研究。由棕色固氮菌产生的藻聚糖（又称藻酸盐）与从天然海洋褐藻中提取的藻聚糖具有相似的功能和作用（Rehm,B.H.A.,and S.Valla.1997; Uwe Remminghorst and Bernd H. A.Rehm，2006），可作外科敷料、牙模、食品及药物缓释剂等用途，或是用作固定化酶和细胞工程方面。目前，通过引物设计和模板制备建立针对棕色固氮菌固氮酶基因和藻酸盐algE,algJ,algC等基因的PCR方法具有较高的适用价值。

发明内容

本发明的目的是：提供一种棕色固氮菌PCR检测试剂盒，它可以提高棕色固氮菌地方株的检出率。

本发明是这样实现的：棕色固氮菌PCR检测试剂盒,它包括4.5ul 质量百分比浓度为50%的甘油、1.0ul二甲基亚砜、2ul dNTP，dNTP中的ATP,GTP,TTP及CTP均为2.5mol/ L、2.0ul浓度为25 mmol/ L Tris-HCl、2ul浓度为25mmol/ L的MgCl₂、0.5ul浓度为2U/ul的Taq酶、引物两条，均为1.0ul、11.0ul超纯水、2ul DL2000 DNA Marker、2ul阳性对照及2ul阴性对照；每次PCR反应加入DNA模板0.5～1.5ul；其中引物包括上游引物及下游引物，上游引物的序列为5’-GACCTTGCCGCTGGTGTTG-3’，下游引物的序列为5’-CGCCGAGCAGTTCGTTTT-3’。

阴性对照为超纯水。

阳性对照为棕色固氮菌标准菌株DNA模板或重组质粒pGEMT Easy:algE的PCR扩增产物。

为了验证本发明的效果进行了如下实验：

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株

大肠埃希氏杆菌，沙门氏菌、土壤放线杆菌等均由本实验室从环境中分离保存。棕色固氮菌地方株由非豆科作物根际土壤中分离；棕色固氮菌标准菌株购于上海富众（亚平宁）生物科技发展有限公司。

1.1.2酶及试剂

TaqDNA聚合酶、dNTP(mix)、Marker2000、 ProteinaseK、RNaseA、生化微量鉴定管、pGEMTEasy等由New England Biolab 公司、Pomega公司、大连宝生生物有限公司和恒因生物公司提供。乙酸钠、冰乙酸、乙醇、结晶紫等常用试剂均为国产分析纯，由北京三药科技开发公司购入。无氮源培养基由上海富众（亚平宁）生物科技发展有限公司购入或自配。DNA提取试剂盒由恒因生物技术公司购入；革兰氏染色液自配。

1.1.3仪器设备

梯度PCR扩增仪（德国）；紫外光分光光度计；台式高速冷冻离心机（德国）；凝胶成像分析系统；核酸电泳系统；酸度计（德国）；超纯水器（10L）；控温、控湿全自动生化培养箱；卧式高压消毒柜；欧林巴氏显微镜系列（摄影显微镜、光学显微镜、莹光显微镜、倒置显微镜）；超净工作台（单人双面）以及其它常规仪器设备。

1.2方法

1.2.1固氮菌分离培养

分别从土壤的表层(如大田和园田的表层土壤、花盆中的表层土)中采集土样3～5g，用50mL水制成混浊液，吸取5mL悬浮液装入盛有30mL富集培养液的250mL三角瓶中，100rpm，28℃，培养3～5天。取富集培养后的培养液，稀释涂布平板分离培养基，28℃培养2天。之后生长较大的菌落移入斜面。

1.2.2镜检

取灭菌过的载玻片，在载玻片中央滴一滴无菌水。然后在火焰旁，用灭过菌的接种环从培养基上挑取少许黏液涂在载玻片的水滴中，革兰氏染色，涂片自然干燥；依次在低倍镜和高倍镜观察，仔细观察各种自生固氮菌的形态和大小。

1.2.3棕色固氮菌生化鉴定

取2只淀粉，甘露醇，鼠李糖，乳糖，硝酸盐，过氧化氢酶，钼酸盐生化微量鉴定管接种培养物，恒温箱培养24—36h。

1.2.4固氮酶活性测定

微量凯氏定氮法,用以下公式计算含氮量：

EA2=((V1-V2)×14×1000)/V(mg/L)

V1：样品滴定时用去的0.01N标准硫酸溶液毫升数;

V2：空白滴定时用去的0.01N标准硫酸溶液毫升数;

14：是1个毫克当量氮的毫克数;

V：发酵液样品毫升数。

1.2.5 PCR引物的选择

1.2．5.1 PCR引物的选择，设计与合成

按菌株Azotobacter vinelandii DJ chromosome algE基因(GenBank登录号: CP001157,菌株) 自行设计的一对引物为：上游引物：5’-GACCTTGCCGCTGGTGTTG-3’，下游引物：5’-CGCCGAGCAGTTCGTTTT-3’。由上海生物技术公司合成，其预期扩增片段长度为850 bp。并用DNAstar软件和BLAST分析比较引物的各个参数和同源性。

1.2.5.2 DNA的提取

挑取少许菌落于1.5ml离心管中加入TE缓冲液稀释至微浊，取1ml装入离心管中9000r/min离心10秒,弃上清,在细菌沉淀管中加入20ulDB液,160ullysozyme和20ulRNaseA，彻底振荡悬浮，３７℃温浴45分钟，期间来回颠倒离心管数次。加入400ulDL和25ul蛋白消化酶Ｋ（ProteinaseK）迅速温和地来回颠倒离心管彻底混匀。置65℃温浴45分钟,离心１分钟，取上清液。加入200ul异丙醇，剧烈颠倒离心管使溶液混合后，移取600ul至吸附柱中，离心30秒。弃去收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。将剩余的全部移至吸附柱中，离心30秒。弃去收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。加入500ulW1液，静置一分钟后，离心30秒。将吸附柱放入另外一个收集管中。加入500ulW1液，离心15秒。弃掉收集管中的液体，再将吸附柱放入同一个收集管中。离心1分钟。将吸附柱移入一个干净的1.5ml离心管中。在吸附膜中央加入100 ulT1液，65℃静置5分钟后，离心1分钟。将1.5ml离心管（DNA）4℃保存备用。

或参照Birnboim and Doly(1979)提供的方法提取样品DNA。挑取数个菌落悬浮于含100 μL超纯水的小试管中，震荡混匀，用PCR仪95℃加热10 min或煮沸10 min后置于冰上冷却15 min，12 000 r／min离心2 min，取上清作为PCR反应的粗制DNA模板，置-20 ℃保存备用。

1.2.5.3 棕色固氮菌algE基因的PCR扩増

4.5ul 质量百分比浓度为50%的Glycerol（甘油）、1.0ul DMSO（二甲基亚砜）、2ul dNTP（脱氧核糖核苷三磷酸）（各2.5mol/ L）、2.0ul浓度为25 mmol/ L Tris-HCl、2ul浓度为25mmol/ L的MgCl₂、0.5ul浓度为2U/ul的Taq酶、引物两条，均为1.0ul、11.0ul超纯水、2ul DL2000 DNA Marker、2ul阳性对照及2ul阴性对照；每次PCR反应加入DNA模板0.5～1.5ul。按下列参数进行PCR反应：95 ℃预变性3 min，然后94 ℃变性30 s，58 ℃退火40s，72 ℃延伸2 min30s，33个循环，最后72 ℃终延伸4 min。产物于-20 ℃保存。

1.2.5.4 PCR产物的检测

取5μL扩增产物加2 μL载样缓冲液（Stopmix）在150 V电压，10 g/L琼脂糖凝胶上进行电泳(含1%溴化乙锭2μL，后改为Goldview)。电泳液用1×TBE缓冲液。紫外灯下观察扩增结果，并一次成像拍照。

1.2.6试剂盒组装

1.2.6.1棕色固氮菌PCR检测试剂盒成分的确立

按照棕色固氮菌PCR检测方法，确定试剂盒必备内容。

1.2.6.2棕色固氮菌PCR检测试剂保存期检验

将试剂保存在-20℃，分别于1月、3月、6月、12个月期间对阳性样品DNA进行检测，确定试剂盒的保存时间。

1.2.6.3棕色固氮菌PCR检测方法重复性试验

应用建立的PCR方法，重复检查3次，检验副猪嗜血杆菌DNA的可靠性。

结果

2.1 通过调查、土壤样品收集、细菌分离培养、生化鉴定，已分离出棕色固氮菌贵州地方株。该菌经过3-4d后，取出培养皿，观察发现培养基上长出菌落及其培养物黏液。黏液初为无色透明，以后为乳白色，最后变成褐色，里面就含有棕色固氮菌。

2.2 显微镜下其形态结构为短杆状，周身鞭毛，革兰氏染色阴性。大小0.8-1.0×2.0-3.0um。最适温度25-30℃，最适PH6.5~7.5。营养琼脂平板上形成白色扁平，边缘不整齐，生长良好的菌落。无氮平板培养基上菌落平滑，有光泽或粘稠，透明，无色，菌落较小。

2.3生化试验结果表明：棕色固氮菌分离株淀粉试验阴性，甘露醇发酵阳性，鼠李糖发酵试验阴性，乳糖发酵试验阴性，硝酸盐还原阳性，过氧化氢酶试验阳性，钼酸盐试验阳性，明胶穿刺液化，石蕊牛奶变清。

2．4从非豆科作物根际土壤中分离得到棕色固氮菌地方菌株，用微量凯氏定氮法测定它们的固氮酶活性。获得固氮能力(含氮量1～10mg/mL)和较强固氮能力 (含氮量>10mg/mL)的菌株。

2．5棕色固氮菌PCR检测

2．5．1棕色固氮菌的优化试验

结果如图1所示。

2．5．2 PCR方法的敏感性试验

通过DNA的提取，紫外分光光度计测定，实验室的标准DNA模板的平均OD260值为0.01046nm,以DNA模板含量为0.05412ug/ul按10倍稀释法进行稀释后，取2UL进行扩增，结果如图2所示，可检出的棕色固氮菌DNA模板最低含量为1.0228pg。

2．5．3 PCR特异性检测

采用大肠杆菌、沙门氏菌、放线杆菌、葡萄菌、动物绿脓杆菌、副猪嗜血杆菌DNA为模板做PCR，如图3所示，仅棕色固氮菌出现特异性DNA阔增带，证明了该方法的特异性。

2.6 PCR检测方法对棕色固氮菌贵州地方株的检测结果如图4所示。

采用针对贵州省棕色固氮菌的PCR实验室检测方法该方法对150份土壤样品的培养菌株进行PCR检测，PCR检出率为60%(见表1)。

2.7棕色固氮菌PCR检测试剂盒组成成分

（1）Glycerol

（2）DMSO

（3）dNTP

（4）Taq酶

（5）MgCl2

(6) DL2000 DNA Marker

(7)引物

(8) 超纯水

(9) 阳性对照

(10) 阴性对照

其规格为每盒20头份

2.8棕色固氮菌PCR检测试剂保存期检验

将试剂保存在-20℃，分别于1月、3月、6月、12个月期间对阳性样品DNA进行检测，确定试剂盒的保存时间。结果表明: -20℃，保存1月、3月、6月、12个月，DNA条带结果无影响。

2.9棕色固氮菌PCR检测方法重复性试验

应用建立的PCR方法，重复检查3次，重复检测结果一致。

3 讨论

3.1自生固氮菌适于生活在中性或偏碱性的土壤中，本次试验分别当地耕作土壤的表层(如大田和园田的表层土壤、花盆中的表层土)中采集pH在6.5以上土样，采集到土样以后，应除去杂质。经过细菌分离培养、显微镜形态结构观察、生化鉴定和固氮酶活性测定，获得棕色固氮菌菌株。

3.2用实验室保存的大肠杆菌、沙门氏菌、放线杆菌、副猪嗜血杆菌等DNA为模板进行PCR扩增试验，仅棕色固氮菌出现特异性DNA阔增带，证明了该方法的特异性。通过DNA的提取，紫外分光光度计测定，实验室的标准DNA模板的平均OD260值为0.01062nm,以DNA模板含量为0.05114ug/ul按10倍稀释法进行稀释后，取2UL进行扩增，则棕色固氮菌DNA浓度依次为102.28ng,10.228ng,1.0228ng,102.28pg,10.228pg,1.0228pg,102.28fg,10.228fg,1.0228fg,可检出的棕色固氮菌DNA模板最低含量为1.0228pg。菌细胞的灵敏度为200个左右。PCR退火温度为49℃～60℃；模板DNA浓度：0.85μL～2.0 μL。当地不同县（市）土壤样品PCR平均检出率60%。此方法对棕色固氮菌的检测而言，具有特异、敏感、检出率高、快速、简便、易自动化等突出优点。今后还有望继续应用PCR、基因克隆等方法检测其它相关基因和功能关系，加深了解了不同来源、不同地区间、不同棕色固氮菌菌株固氮酶或藻酸盐等基因结构与表达方式的差异。

由于采用了上述技术方案，本发明通过引物设计和模板制备建立针对棕色固氮菌固氮酶基因和藻酸盐algE,algJ,algC等基因的PCR方法，能有效提高棕色固氮菌地方株的检出率，使用效果好。

附图说明

附图1为图3 棕色固氮菌algE 基因片断PCR优化后电泳结果；

M：DL 2000 Marker；1：PCR产物（850 bp）；2：标准菌株PCR产物（850 bp）；

附图2 棕色固氮菌algE 基因片断PCR敏感性试验结果；

M：DL 2000 Marker；1：102.28ng基因片断 PCR产物；2：10.228ng基因片断PCR产物；3：1.0228ng基因片断 PCR产物；4：102.28 pg基因片断 PCR产物；5：10.228pg基因片断 PCR产物；6：1.228pg基因片断 PCR产物；

附图3为棕色固氮菌algE 基因片断特异性PCR 检测结果；

M：DL 2000 Marker； 1：大肠埃希氏杆菌；2：沙门氏菌；3：放线杆菌； 4：葡萄球菌； 5：动物绿脓杆菌； 6：副猪嗜血杆菌；7：PCR产物（850bP）；

附图4为棕色固氮菌贵州地方株algE 基因片断PCR检测结果；

M：标准DNA Marker 2000；1：分离株1PCR产物（850 bp）；2：分离株2PCR产物（850 bp）；3：分离株3 PCR产物（850 bp）；4：分离株4 PCR产物（850 bp）；5：灭菌双蒸水。

具体实施方式

本发明的实施例：棕色固氮菌PCR检测试剂盒,其特征在于：它包括：4.5ul 质量百分比浓度为50%的甘油、1.0ul二甲基亚砜、2ul dNTP，dNTP中的ATP,GTP,TTP及CTP均为2.5mol/ L、2.0ul浓度为25 mmol/ L Tris-HCl、2ul浓度为25mmol/ L的MgCl₂、0.5ul浓度为2U/ul的Taq酶、引物两条，均为1.0ul、11.0ul超纯水、2ul DL2000 DNA Marker、2ul阳性对照及2ul阴性对照；每次PCR反应加入DNA模板0.5～1.5ul。其中引物包括上游引物及下游引物，上游引物的序列为5’-GACCTTGCCGCTGGTGTTG-3’，下游引物的序列为5’-CGCCGAGCAGTTCGTTTT-3’ ；阴性对照为超纯水；阳性对照为棕色固氮菌标准菌株DNA模板或重组质粒pGEMT Easy:algE的PCR扩增产物。

SEQUENCE LISTING

序列表

<110> 贵州省畜牧兽医研究所

<120> 一种棕色固氮菌PCR检测试剂盒

<160> 2

<170> PatentIn version

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 根据GenBank中登录的(CP001157)菌株基因组序列，应用DNAStar软件设计, 以用于PCR扩增。

<400> 1

GACCT TGCCG CTGGT GTTG 19

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<400> 2

CGCCG AGCAG TTCGT TTT 18

Claims

1.一种棕色固氮菌PCR检测试剂盒,其特征在于：它包括4.5ul 质量百分比浓度为50%的甘油、1.0ul二甲基亚砜、2ul dNTP，dNTP中的ATP,GTP,TTP及CTP均为2.5mol/ L、2.0ul浓度为25 mmol/ L Tris-HCl、2ul浓度为25mmol/ L的MgCl₂、0.5ul浓度为2U/ul的Taq酶、引物两条，均为1.0ul、11.0ul超纯水、2ul DL2000 DNA Marker、2ul阳性对照及2ul阴性对照；每次PCR反应加入DNA模板0.5～1.5ul；其中引物包括上游引物及下游引物，上游引物的序列为5’-GACCTTGCCGCTGGTGTTG-3’，下游引物的序列为5’-CGCCGAGCAGTTCGTTTT-3’。

2.根据权利要求1所述的棕色固氮菌PCR检测试剂盒，其特征在于：阴性对照为超纯水。

3.根据权利要求1所述的棕色固氮菌PCR检测试剂盒，其特征在于：阳性对照为棕色固氮菌标准菌株DNA模板或重组质粒pGEMT Easy:algE的PCR扩增产物。