CN103038331A

CN103038331A - 试剂流体分配装置和试剂流体的分配方法

Info

Publication number: CN103038331A
Application number: CN2011800318127A
Authority: CN
Inventors: 李孟皇; 应仪如; 徐国林; 李玉山; 埃姆瑞里·穆罕默德·阿里; 谢铮鸣
Original assignee: Agency for Science Technology and Research Singapore
Current assignee: Agency for Science Technology and Research Singapore
Priority date: 2010-05-04
Filing date: 2011-05-04
Publication date: 2013-04-10
Anticipated expiration: 2031-05-04
Also published as: SG185391A1; WO2011139234A1; SG10201503375UA; CN103038331B; US20130136671A1; US9707563B2

Abstract

根据各个实施例，可提供试剂流体分配装置。试剂流体分配装置包括：用于接收试剂流体的腔室，该腔室具有第一开口和第二开口；第一流体导管，其连接于腔室的第一开口；贮存箱，其连接于第一流体导管，贮存箱具有第一开口，其中贮存箱的第一开口连接于第一流体导管以形成被动阀，其中贮存箱的大小设计为用于存储预定体积的试剂流体；以及气动导管，其连接于腔室的第二开口，其中，通过气动导管对腔室选择性地施加气动压强以使试剂流体从贮存箱通过第一流体导管而传输到腔室。根据各个实施例，可提供包括试剂流体分配装置的微流体装置，以及试剂流体的分配方法。

Description

试剂流体分配装置和试剂流体的分配方法

相关文件的交叉引用

本申请要求2010年5月4日提交的新加坡专利申请201003158-1号的优先权，为了一切目的而将其全部内容通过引用并入此处。

技术领域

本发明涉及试剂流体分配装置以及试剂流体的分配方法。

背景技术

用于诊断诸如流感等疾病的传统方法需要数种人工处理，例如，病毒颗粒的溶解、病毒核酸的病毒核糖核酸(RNA)提取和检测，这些处理常常在集中化的实验室范围内进行。整个实验计划需要5到6小时，且需要由熟练的操作员冒着意外的病毒暴露和疾病传染的风险来进行。

在例如H1N1-2009等高传染性疾病的情况下尤其如此。在2009年4月23日出现的H1N1-2009的第一报道病例之后不到一个月，有39个国家向世界卫生组织(WHO)官方地报道了8480例H1N1-2009传染和72例死亡。

本领域当前的疾病诊断方法包括基于核酸的分子诊断，这涉及三个主要步骤：(i)脱氧核糖核酸/核糖核酸(DNA/RNA)样品制备，(ii)通过聚合酶链式反应(PCR)进行的核酸扩增，以及(iii)对所扩增DNA的检测。尽管已有人报道了使用DNA微芯片、无标签方式以及电泳分析的检测方法，然而实时PCR(RT-PCR)凭借其简单性和有效性仍然是用于病原体检测的最流行且健全的方法。

人们已经开发了许多小型化疾病诊断装置。它们中的多数或者专注于用于病原体DNA/RNA纯化的样品制备，或者专注于以内置微型阀、加热器和传感器进行的片上PCR扩增。尽管有这些优点，然而样品纯化和分子检测的整合仍然是便携式疾病诊断装置的主要任务。缺少复用能力也限制了将这些装置应用到检测下述病毒的能力，所述病毒诸如流感、肠病毒以及引起手足口疾病的病毒，诸如柯萨奇病毒(Coxsackie virus)和肠道病毒(Enterovirus)，其包含具有相似病症的各种血清型。此外，通常的用于从外部引入试剂和释放处理过的废料的开放式装置设计易于引起硬件交叉污染和意外的病毒暴露。

鉴于上述方面，仍然需要一种改善了的用于诊断疾病的方法，其可迅速识别被传染的病人以进行隔离和治疗，还需要一种设备，其可用于在诸如机场、火车站以及移民检查点等分散位置进行诊断，以抑制高传染性疾病的传播，并减轻卫生人员在诊断巨大数量的疑似病例方面的压力。

发明内容

在第一方面中，各个实施例涉及一种试剂流体分配装置，其包括：

■用于接收试剂流体的腔室，该腔室具有第一开口和第二开口；

■第一流体导管，其连接于腔室的第一开口；

■贮存箱，其连接于第一流体导管，该贮存箱具有第一开口，其中贮存箱的第一开口连接于第一流体导管以形成被动阀，其中贮存箱的大小设计为用于存储预定体积的试剂流体；以及

■气动导管，其连接于腔室的第二开口，其中通过气动导管对腔室选择性地施加气动压强使得试剂流体从贮存箱通过第一流体导管而传输到腔室。

在第二方面中，各个实施例涉及包括第一方面的试剂流体分配装置的微流体装置。

在第三方面中，各个实施例涉及试剂流体的分配方法，该方法包括：

■提供第一方面的试剂流体分配装置；

■在贮存箱中提供试剂流体；

■通过气动导管对腔室施加气动压强以将试剂流体从贮存箱通过第一流体导管而传输到腔室。

附图说明

参照下面的详细描述，结合非限制性示例以及附图，可以更好地理解各个实施例，所述附图中：

图1A是根据一个实施例的试剂流体分配装置100的示意图。试剂流体分配装置100包括腔室102。腔室102具有第一开口101和第二开口103。试剂流体分配装置100还包括第一流体导管104，第一流体导管104连接于腔室102的第一开口101。贮存箱106连接于第一流体导管104。贮存箱106的大小设计为可用于存储预定体积的试剂流体。贮存箱106具有第一开口105，第一开口105连接于第一流体导管104以形成被动阀108。气动导管110连接于腔室102的第二开口103。

图1B是根据另一实施例的试剂流体分配装置100的示意图。在该实施例中，贮存箱106具有第二开口107。第二流体导管109连接于贮存箱106的第二开口107。

图1C是根据又一实施例的试剂流体分配装置100的示意图。在该实施例中，被动阀108的横截面积小于第一流体导管104的横截面积。

图1D是根据一个实施例的具有试剂流体分配装置100的微流体装置150的示意图。所示的微流体装置150包括腔室152，腔室152例如可用于存储试剂流体。试剂流体可经由流体导管171进入微流体装置150。可设有阀161以调节通过流体导管171流入腔室152的试剂流体。试剂流体可通过第二流体导管109流入贮存箱106中，第二流体导管109经由贮存箱106的第二开口107连接于贮存箱106。贮存箱106的大小设计为可用于存储预定体积的试剂流体。多余的试剂流体可引导到腔室154以进行存储。气动导管172可连接于腔室154。气动导管172可连接于腔室102的气动导管110。可在气动导管中设置阀162、163和164以调整通过导管的气动压强。

图1E是根据一个实施例的具有试剂流体分配装置的微流体装置180的三维示意图。所示的试剂流体分配装置包括三个贮存箱106、116和126，贮存箱106经由第一流体导管104连接到腔室102，贮存箱116经由第一流体导管114连接到腔室112，贮存箱126经由第一流体导管124连接到腔室122。试剂流体可通过连接于每个贮存箱的第二开口的第二流体导管109而流入三个贮存箱106、116和126的每一个中。贮存箱106、116和126的大小设计为可用于存储预定体积的试剂流体，其中每个贮存箱的容积可相同或不同。试剂流体可填充到每个被动阀108、118和128的水平。如图所示，各腔室102、112和122连接于气动导管110、120和130。通过各自的气动导管110、120和130对每个腔室102、112和122施加的气动压强和通过第二流体导管109对试剂流体施加的气动压强的合成值可大于通过每个被动阀108、118和128而传输试剂流体所需要的压强，从而试剂流体可通过连接于每个贮存箱106、116和126的第一开口的第一流体导管104、114和124而流入每个腔室102、112和122。

图1F是根据一个实施例的试剂流体的分配方法的流程图190。该方法包括：提供根据一个实施例的试剂流体分配装置(192)，在贮存箱中提供试剂流体(194)，以及通过气动导管向腔室施加气动压强以将试剂流体从贮存箱通过第一流体导管传输到腔室(196)。

图2A是根据一个实施例的使用一体化模块(cartridge)而集成有样品制备和3通道荧光检测的实时PCR(RT-PCR)系统的示意图。图中使用了下述附图标记。200表示根据一个实施例的包含试剂流体分配装置的微流体装置；210表示光电倍增管(PMT)；212表示排放过滤器；214表示准直透镜；216表示发光二极管(LED)；218表示激发过滤器；220表示帕尔贴(peltier)加热器；且222表示散热器。该自动化系统能够从样品提取DNA/RNA，进行试剂流体分配，并执行用于疾病诊断的RRT-PCR(实时逆转录酶PCR)。

图2B是根据一个实施例的模块的示意图，其图示了用于DNA/RNA提取、试剂等分样本分配和实时PCR的腔室。图中使用了下述附图标记。202表示PCR小瓶或腔室；204表示第一流体导管；206表示贮存箱或测量腔室；208表示被动阀；252表示洗提液腔室；254表示多余洗提液腔室；256表示样品腔室；258表示漂洗1缓冲液；260表示废料腔室；262表示隔膜腔室；264表示洗提液缓冲液腔室；266表示漂洗2缓冲液腔室；268表示乙醇冲刷腔室；270表示连接槽；272表示流体通道；274表示气动通道；276表示隔膜腔室中的氧化硅膜。在一些实施例中，腔室的尺寸可为如下。贮存箱206可为大约10μl；洗提液腔室252可为大约0.3ml；多余洗提液腔室254可为大约0.3ml；样品腔室256可为大约1ml；漂洗1缓冲液腔室258可为大约0.7ml；废料腔室260可为大约5ml；隔膜腔室262可为大约1ml；洗提液缓冲液腔室264可为大约0.4ml；漂洗2缓冲液腔室266可为大约0.7ml；乙醇冲刷腔室268可为大约0.7ml。可将用于DNA/RNA提取的试剂预加载到模块中并以粘合膜密封。PCR预混合物可冷冻并存储于标准的0.2ml PCR腔室或PCR管中，并可在使用之前插入模块中。黑箭头表示试剂流，而白箭头表示施加的负压强。

图2C是根据一个实施例的诸如图2B中所示的模块的俯视图和仰视图的示意图。使用了与图2B中使用的附图标记相同的附图标记。模块仰视图的示意图标示了第一压强入口p1、第二压强入口p2、第三压强入口p3、第四压强入口p4、第五压强入口p5和第六压强入口p6，以及第一真空入口v1、第二真空入口v2、第三真空入口v3、第四真空入口v4、第五真空入口v5和第六真空入口v6。可使用大气压或真空、或大气压与真空的组合来实现试剂流体的泵送。可使用两个成推拉式设置的注射泵来产生大气压和真空。黑箭头表示试剂流，而白箭头表示施加的负压强。

图3A(I)是根据一个实施例的使用一体化模块而集成有样品制备和3通道荧光检测的实时PCR(RT-PCR)系统的操作的示意图。图中使用了下述附图标记。C1表示样品腔室；C2表示漂洗1缓冲液腔室；C3表示漂洗2缓冲液腔室；C4表示乙醇腔室；C5表示洗提缓冲液腔室；C6表示废料腔室；C7表示洗提液腔室；C8表示多余洗提液腔室；X1表示氧化硅膜腔室；p1指第一(压强)夹管阀；p2指第二(压强)夹管阀；p3指第三(压强)夹管阀；p4指第四(压强)夹管阀；p5指第五(压强)夹管阀；p6指第六(压强)夹管阀；v1指第一(真空)夹管阀；v2指第二(真空)夹管阀；v3指第三(真空)夹管阀；v4指第四(真空)夹管阀；v5指第五(真空)夹管阀；v6指第六(真空)夹管阀；T1指第一PCR腔室(或PCR管)，T2指第二PCR腔室(或PCR管)；T3指第三PCR腔室(或PCR管)；且M1指第一贮存箱(或等分样本腔室)；M2指第二贮存箱(或等分样本腔室)；M3指第三贮存箱(或等分样本腔室)。夹管阀的状态使用符号“X”和箭头(T或↓)表示。在夹管阀处的符号“X”表示阀关闭，而在夹管阀处使用箭头↑或↓表示阀打开。施加的压强(针对第一(压强)夹管阀p1～第六(压强)夹管阀p6)或施加的真空(针对第一(真空)夹管阀v1～第六(真空)夹管阀v6)的方向由箭头的方向所指示。

在图3A(I)中，将腔室C1中包含的溶解的生物样品加载到氧化硅膜腔室X1中，并依次以来自腔室C2的漂洗1缓冲液、来自腔室C3的漂洗2缓冲液以及来自腔室C4的乙醇进行漂洗。在图3A(II)中，将由来自腔室C5的洗提缓冲液洗提过的纯化的DNA/RNA传输到洗提液腔室C7中。在图3A(III)中，以包括被动阀的试剂流体贮存箱(M1～M3)将纯化的DNA/RNA分配成等分样本。试剂流体贮存箱M1～M3的大小设计为可存储预定体积的试剂流体。在图3A(IV)中，将多余的DNA/RNA冲刷到多余洗提液腔室C8。在图3A(V)中，将提取的RNA分配到包含RT-PCR预混合物的PCR腔室(T1～T3)。在图3A(VI)中，进行RT-PCR。涂敷于PCR腔室上的蜡熔化，且液体蜡保持于RT-PCR混合物上，并避免试剂流体在热循环期间的蒸发。

图3B是根据一个实施例的试剂流体分配装置的示意图。被动阀上的压强变化可使用下述公式确定：

ΔP = 4 σ \cos (θ_{c}) [\frac{1}{R_{1}} - \frac{1}{R_{2}}] - - - (I)

其中，ΔP表示推动试剂液体穿过被动阀所需要的压强；σ表示液体/空气界面的表面张力；θ_c表示接触角；R₁表示贮存箱306的半径；R₂表示被动阀308或第一流体导管304的半径。

图3C(I)～图3C(IV)是表示根据一个实施例的试剂流体分配装置的操作的示意图。

图3D是根据一个实施例的具有四个贮存箱Ch1～Ch4的试剂流体分配装置的示意图。

图4A是根据一个实施例的使用被动阀的试剂流体试剂分配装置的3D模型。黑箭头表示试剂流，而白箭头表示施加的负压强。

图4B是图示了分配到三个等分样本贮存箱中的目标体积为10μl的流体等分样本的精度的图。◇表示以水进行的16次重复测量的平均体积。图中使用的误差棒具有值为3的标准差。

图5A～图5I是根据一个实施例的使用试剂流体分配装置进行的RNA洗提液的等分样本分配的时序照片。以蓝色食用色素对RNA洗提液进行染色。在图5A中，洗提液已穿过X1中的氧化硅膜并被传输到洗提液腔室C7。在图5B中，洗提液开始填满洗提液腔室C7。在图5C～图5E中，贮存箱M1～M3被依次填充到贮存箱的收缩处。在图5F中，将多余的洗提液引导到多余洗提液腔室C8，并且至贮存箱的连接管道被冲刷。在图5G～图5I中，将每个等分样本贮存箱之内的流体隔离，并将精确体积的洗提液分配到各自的PCR腔室T1～T3(图中标示为1～3)中。

图6是表示连续稀释的(1～10⁴倍或1000～0.1ng/μl)肝总RNA的实时荧光曲线的图：使用(-)一体化模块(603、605、608和612)、(-)Qiagen旋转柱(601、606、609和611)、和(-)未纯化样品进行提取，并使用Bio-RadCFX-96(602、604、607、610和613)(□＝1000ng/μl，Δ＝100ng/μl，x＝10ng/μl，◇＝1ng/μl；·＝0.1ng/μl)进行逆转录扩增。插图表示荧光曲线的C_T值。实线为(-)一体化模块(斜率＝-3.68，E＝87％，R²＝0.990)(653)、(-)Qiagen旋转柱(斜率＝-3.40，E＝97％，R²＝0.972)(652)、和(-)未纯化样品(斜率＝-3.48，E＝94％，R²＝0.994)(651)的线性回归拟合，其中E＝10^(-1/斜率)-1为RT-PCR效率。起始循环(≤10个PCR循环数)中的荧光信号由捕获的气泡造成。

图7A是表示根据一个实施例的PCR热循环仪的热循环曲线的图：(-)为设定温度(701)且(---)为测量温度(702)。从该图估计出的加热和冷却速率分别为2.5℃/s和2.2℃/s。

图7B表示以10倍稀释的GAPDH cDNA混合物进行的(o)左PCR管、(◇)中央PCR管和(□)右PCR管的实时PCR曲线。三个PCR管的归一化荧光强度高度一致。

图8是表示如下值的图：以根据一个实施例的(×)热循环仪和检测系统、(◇)MJ Research Opticon系统以及(Δ)Bio-Rad CFX96系统进行扩增并测量的连续稀释(1～10⁶倍)的GAPDH cDNA的循环阈值(C_T)的值。实线为(-)一体化模块(斜率＝-3.89，E＝81％，R²＝0.999)(803)，(-)MJ ResearchOpticon系统(斜率＝-3.84，E＝82％，R²＝0.998)(802)以及(-)Bio-Rad CFX96系统(斜率＝-3.71，E＝86％，R2＝0.994)(801)的线性回归拟合，其中E＝10^(-1/ ^斜率)-1为RT-PCR效率。

图9A～图9C是用于比较模块上(on-cartridge)实时PCR的性能的图，其中图9A中所示为以根据一个实施例的热循环仪进行扩增和测量的连续稀释的(1～106倍)3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)cDNA的实时荧光曲线；图9B中所示为MJ Rearch Opticon系统；且图9C中所示为Bio-Rad CFX96系统。根据一个实施例的热循环仪使用发光二极管(LED)作为光源并使用光电倍增管(PMT)进行检测。MJ Research Opticon采用LED加PMT，且Bio-Rad CFX96使用LED和光电二极管。

图10是以亚型分类式分类来表示由一体化模块检测到的季节性流感H1N1病毒的实时RT-PCR荧光曲线的图：(·)A类(C_T＝24.23)，(■)亚型H1(C_T＝27.45)以及(□)阳性对照(C_T＝24.38)。以通过Qiagen旋转柱(QiagenSpin Column)提取的相同病人样品的RNA进行阳性对照。以0.2的归一化阈值获得C_T值。

图11是表示由(Δ)Qiagen旋转柱加Bio-Rad CFX96、(◇)模块上RNA提取加Bio-Rad CFX96、以及(x)一体化系统获得的连续稀释(1～10⁴倍)的A型流感病人样品的实时荧光曲线的C_T值的图。实线为获得的(-)具有Bio-Rad CFX96的Qiagen旋转柱的线性回归拟合(斜率＝-3.37，E＝99％，R²＝0.994)(1103)、(-)以Bio-Rad CFX96进行的模块上RNA提取的线性回归拟合(斜率＝-3.37，E＝99％，R²＝0.995)(1102)、和(-)一体化系统的线性回归拟合(斜率＝-3.59，E＝90％，R²＝0.991)(1101)，其中E＝10^(-1/斜率)-1为RT-PCR效率。

图12是表示模块上实时PCR的图。以根据一个实施例的热循环仪和检测系统进行扩增和测量的连续稀释的((·)0倍、(■)10倍、(o)10²倍和(□)10³倍)A型流感的实时荧光曲线。

图13A是表示DNA提取的PCR结果的表。

图13B是将DNA提取的PCR结果与图13A中所示的值进行比较的图。1301为初始未纯化的DNA样品的曲线；1302为具有Bio-Rad CFX96的Qiagen旋转柱的曲线、且1303为根据一个实施例的微型试剂盒(micro kit)的曲线。

图14A～图14F是图示了根据一个实施例的用于PCR腔室中的混合物的缓慢分散的步骤的示意图。图14A表示了在PCR腔室中添加20μl PCR预混合物。图14B表示将蜡添加到PCR腔室的侧壁。图14C表示蜡熔化以形成PCR溶液上的密封。图14D表示添加洗提缓冲液。图14E表示洗提缓冲液穿过蜡层而到PCR容积的缓慢移动。图14F表示在蜡密封的情况下进行PCR预混合物与洗提缓冲液混合。

图15是表示PCR引物和水解探针(probe)序列的表。

图16是表示DNA提取的PCR曲线的图。

图17A是简要示出RNA提取的PCR结果的表。图17B是简要示出RNA提取的PCR结果的图。表中的值为初始样品、来自旋转柱和微型试剂盒的样品的C_T值。

图18是表示RNA提取的PCR曲线的图。

图19A是表示PCR曲线的图，且图19B是表示PCR反应体积为10μl(A01～A04)以及20μl(A05～A08)且使用10μl(A02和A06)、20μl(A03和A07)以及40μl(A04和A08)的蜡进行密封时的C_T值的表。A01和A05是使用标准反应管获得的C_T值。

图20A是表示蜡体积对PCR的影响的图。

图20B是表示PCR管中有10μl和20μl的蜡时的照片。

图21A是在使用20μl的蜡时的C_T值和标准值之间进行比较的图。

图21B是表示在添加洗提液之前使用20μl的蜡进行密封并进行PCR的PCR曲线的图。

图22是表示通过一体化系统提取的、通过Qiagen旋转柱提取的以及初始的未纯化的样品的0.1ng/μl～1000ng/μl RNA的实时RT-PCR的C_T值的表。

图23是用于对连续稀释的(1～10⁴倍)A型流感病人样品的实时荧光曲线的C_T值进行比较的表，所述A型流感病人样品分别通过下述方式进行提取和检测：1)使用Qiagen旋转柱进行病毒样品提取并使用Bio-RadCFX96进行PCR扩增，2)使用一体化系统进行病毒提取并使用Bio-RadCFX96进行PCR扩增，以及3)使用一体化系统进行病毒提取和扩增。

具体实施方式

在第一方面中，各个实施例涉及一种试剂流体分配装置。这里所用的术语“分配”指分配或管理材料的过程。通常，诸如液体或悬浮液等任意类型的试剂流体都可使用所述装置进行分配。在一些实施例中，试剂流体为包含用于分析的样品的液体。

试剂流体分配装置包括用于接收试剂流体的腔室。腔室可为任意形状，诸如圆筒状、圆锥状、球状或不规则形状。在一些实施例中，腔室大致为具有锥形底的圆筒体。在一些实施例中，腔室大致为具有平坦底的圆筒体。腔室可由任意材料制成，所述材料例如为金属、陶瓷、硅、玻璃或为诸如聚碳酸酯(PC)或聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)的聚合物。腔室可为任意尺寸，所述尺寸进而取决于应用的类型。通常，腔室有足够的容积以执行需要的处理或加工。例如，在生物应用的情况下，通常样品量小，因此腔室的容积可以为微升级。在诸如化学分析的一些其他应用场合中，样品量可较大，因此腔室的容积可为毫升级。腔室的容积可为大约1微升～大约100毫升，例如大约1微升～大约10毫升、大约1微升～大约1毫升、或大约1微升～大约50微升。

根据本发明的用于接收试剂流体的腔室具有第一开口和第二开口。第一开口和第二开口的尺寸可取决于样品量和腔室的尺寸。第一开口和第二开口可为任意形状，诸如圆形、椭圆形或矩形。通常，腔室的第一开口和第二开口为圆孔。腔室的第一开口和第二开口的最大尺寸可在大约0.2mm～大约1mm的范围内，诸如大约0.2mm～大约0.6mm、或大约0.4mm～大约0.8mm。腔室的第一开口和第二开口的至少一个可处于高于腔室中的液位的高度。

第一流体导管可连接于腔室的第一开口。这里所用的术语“流体导管”指用于传送流体的管路、管道、管、沟道或通道。第一流体导管可大致为圆筒状。也可使用其他横截面形状(诸如椭圆形或矩形)的流体导管。通常，第一流体导管为短长度的圆筒管。圆筒管的长度可处于大约5mm～大约100mm的范围内。

第一流体导管可连接于腔室的第一开口，使得第一流体导管和腔室被紧密地密封、并形成在第一流体导管和腔室之间实现流体连通的封闭导管。在一些实施例中，第一流体导管的一端可通过焊接或胶接而连接于腔室的第一开口。例如，第一流体导管可小于腔室的第一开口，从而第一流体导管可延伸进入腔室的第一开口中。腔室可通过焊接或胶接至流体导管的外壁而连接于第一流体导管。在一些实施例中，腔室可拆卸地连接于第一流体导管。例如，第一流体导管和腔室的第一开口都有螺纹，从而腔室可经由螺纹而可拆卸地连接于第一流体导管。在一些实施例中，腔室和第一流体导管可一体地形成。例如，腔室和第一流体导管都可使用诸如聚碳酸酯等合适的聚合物制造，并可通过注模法一体地形成。

根据本发明的试剂流体分配装置包括贮存箱。这里所用的术语“贮存箱”指用于容纳流体的容器或腔室。贮存箱可为任意形状，诸如圆筒状、圆锥状、球状或不规则形状的腔室。在一些实施例中，贮存箱至少大致呈圆筒状。贮存箱可由任何合适的材料制成，所述材料诸如这里提到的用于形成腔室的材料。

贮存箱可具有第一开口，贮存箱经由该开口而连接到第一流体导管。贮存箱可连接于第一流体导管，使得第一流体导管和贮存箱紧密地密封、并形成使贮存箱到腔室之间经由第一流体导管而实现流体连通的封闭导管。在一些实施例中，第一流体导管通过焊接或胶接而连接于贮存箱的第一开口。在一些实施例中，第一流体导管和贮存箱通过注模法一体地形成。

贮存箱的大小设计为可用于存储分配到腔室中的预定体积的试剂流体。该预定体积可由用户规定并可取决于应用的类型。通常，贮存箱的容积大约为1微升～大约50微升，诸如为大约1微升～大约30微升、大约1微升～大约10毫升、或大约10微升。

根据本发明的试剂流体分配装置包括气动导管。术语“气动导管”指用于传递压强或真空的管路、管道、管子、沟道或通道。气动导管可连接于腔室的第二开口，并通过气动导管对腔室选择性地施加气动压强，这样可将试剂流体从贮存箱通过第一流体导管传输到腔室。

如此处所述，腔室的第一开口可连接于第一流体导管，第一流体导管可进而连接于贮存箱。在一些实施例中，通过气动导管施加于腔室的气动压强为负，例如为真空。可使用连接于气动导管的真空泵来产生真空。作为腔室，第一流体导管和贮存箱紧密地密封，以形成在贮存箱到腔室之间经由第一流体导管而实现流体连通的封闭导管，通过气动导管对腔室施加真空可将试剂流体从贮存箱通过第一流体导管传输到腔室中。

在一些实施例中，被动阀可由贮存箱和第一流体导管之间的连接形成。这里所用的术语“被动阀”指没有活动部件且主要因其几何构造而用作流体阀的静态阀。使用所述被动阀是优选的，这是因为其不需要活动部件或额外的控制电路以打开或者关闭该阀。本发明的被动阀基于使用气动压强来克服毛细管力，所述毛细管力可阻挡液体在具有不同横截面积的流体导管区域之间流动。例如，将容纳液体的流体导管的内表面完全或部分地浸润的该液体在从较小横截面的流体导管流到一个较大横截面的流体导管时，会受到流动阻力。相反地，不浸润这些表面的液体在从较大横截面的流体导管流到一个较小横截面的流体导管时会受到阻力。毛细管压强的大小可能取决于流体导管的尺寸、流体的表面张力以及流体在流体导管的材料上的接触角。

本发明的被动阀的横截面积可等于或小于第一流体导管的横截面积。在被动阀的横截面积小于第一流体导管的横截面积的实施例中，被动阀的横截面积与第一流体导管的横截面积的比率可在大约1∶1～大约1∶2500之间，诸如在大约1∶1～大约1∶2000之间、在大约1∶1～大约1∶1000之间、在大约1∶1～大约1∶500之间、在大约1∶1～大约1∶100之间、在大约1∶500～大约1∶2500之间、在大约1∶1000～大约1∶2500之间、或在大约1∶500～大约1∶1500之间。

贮存箱的横截面积可大于被动阀的横截面积。被动阀的横截面积与贮存箱的横截面积的比率可在大约1∶4～大约1∶4000的范围内，诸如在大约1∶4～大约1∶3000之间、在大约1∶4～大约1∶2000之间、在大约1∶4～大约1∶1000之间、在大约1∶4～大约1∶500之间、在大约1∶100～大约1∶4000之间、在大约1∶500～大约1∶4000之间、在大约1∶1000～大约1∶4000之间、或在大约1∶500～大约1∶2000之间。

在一些实施例中，贮存箱具有第二开口。在一些实施例中，第二开口位于贮存箱的底处。在一些实施例中，第二开口对应于贮存箱的底。换言之，第二开口可与贮存箱的底具有一样大的尺寸。第二流体导管可连接于贮存箱的第二开口。第二流体导管可大致为圆筒状。也可使用其他横截面形状的流体导管，诸如椭圆形或矩形的。通常，第二流体导管为圆筒状的管。第二流体导管的横截面积可为任意值，诸如在大约0.001mm²～大约10mm²之间、在大约0.01mm²～大约10mm²之间、在大约0.1mm²～大约10mm²之间、在大约1mm²～大约10mm²之间、在大约0.001mm²～大约1mm²之间、在大约0.001mm²～大约0.1mm²之间或在大约0.01mm²～大约1mm²之间。

第二流体导管可连接于贮存箱的第二开口，使得第二流体导管和贮存箱紧密地密封，以形成在第二流体导管和贮存箱之间实现流体连通的封闭导管。第二流体导管可通过焊接或胶接而连接于贮存箱的第一开口。在一些实施例中，第二流体导管可通过注模法或精确注模法而与贮存箱一体地形成。

在第二流体导管中的试剂流体流动的方向可大致垂直于贮存箱中的试剂流体流动的方向。例如，贮存箱的底可经由第二流体导管的侧壁而连接于第二流体导管。在一些实施例中，贮存箱和第二流体导管的位置使得试剂流体从第二流体导管沿与重力相反的向上方向或部分地沿与重力相反的向上方向流到贮存箱。当试剂流体通过第二流体导管流动时，通过气动导管以真空形式施加于腔室的气动压强可将试剂流体传输到贮存箱中，从而使贮存箱基本上被试剂流体填充。在一些实施例中，允许将贮存箱填充到被动阀的高度。也可通过第二流体导管而将气动压强施加于试剂流体，以将试剂流体传输到贮存箱中。可使用诸如离心泵或正排量型泵的泵，以对试剂流体提供气动压强。

在一些实施例中，通过第二流体导管将气动压强施加于试剂流体，以便将试剂流体从贮存箱通过第一流体导管而传输到腔室。通过气动导管对腔室施加的气动压强以及通过第二流体导管对试剂流体施加的气动压强的合成值可大于通过被动阀传输试剂流体所需要的压强。以此方式，试剂流体可从贮存箱穿过被动阀和第一流体导管而传输到腔室中。

在一些实施例中，贮存箱和第一流体导管布置为使得试剂流体从贮存箱沿与重力相反的向上方向或部分地沿与重力相反的向上方向流到第一流体导管。通过气动导管对腔室施加的气动压强以及通过第二流体导管对试剂流体施加的气动压强的合成值可大于通过被动阀沿与重力相反的向上方向或部分地沿与重力相反的向上方向传输试剂流体所需要的压强。

在将贮存箱的大小设计为用于存储分配到腔室中的预定体积的试剂流体的实施例中，由于贮存箱中的基本上所有的试剂流体都可分配到腔室中，因此也可预先确定分配到腔室中的试剂流体的精确的量。

通常，通过气动导管对腔室施加的气动压强和通过第二流体导管对试剂流体施加的气动压强的合成值处于大约0.1KPa～大约10KPa之间，诸如在大约0.1KPa～大约1KPa之间、在大约0.1KPa～大约0.5KPa之间、在大约0.5KPa～大约10KPa之间、在大约1KPa～大约10KPa之间、或在大约大约5KPa～大约10KPa之间。

在一些实施例中，可在试剂流体分配装置中设有多个贮存箱。根据用户的需要，贮存箱的数量可为任意数量，诸如为两个、三个、四个或五个。每个贮存箱可具有相同的尺寸和/或形状。在一些实施例中，每个贮存箱可具有不同的尺寸和/或形状，这可根据用户的需要而加以规定。例如，每个贮存箱可有用于分配不同量的试剂流体的不同预定体积。每个贮存箱可连接于独立的第一流体导管，第一流体导管可进而连接于独立的腔室和气动导管，从而可独立地操作和/或控制贮存箱、第一流体导管、腔室和气动导管组件。在一些实施例中，每个流体导管、腔室和气动导管可有不同的尺寸和/或形状，这可根据用户的需要加以规定。例如，流体导管、腔室和气动导管的尺寸可根据贮存箱的尺寸确定。每个贮存箱的第二开口可连接于不同的第二流体导管。在一些实施例中，每个贮存箱的第二开口对应于贮存箱的底。每个贮存箱可经由第二流体导管的侧壁上的不同开口而连接于相同的第二流体导管。根据经由气动导管和/或第二流体导管对贮存箱选择性地施加气动压强，可依次或同时地对每个贮存箱进行填充。因此，每个腔室的气动导管中可以设有诸如夹管阀(pinch valve)的阀门，以在导管的开和关状态之间进行切换，以用于控制贮存箱中的试剂流体的流动。

根据本发明的腔室可填充或预加载有液体。液体可为试剂液体、缓冲液、样品或任意其他指定的液体。在一些实施例中，诸如石蜡等蜡形成于腔室的内壁的至少一部分上。蜡可使用诸如旋涂、涂刷、喷雾、刷涂、气相沉积、辊式涂布以及浸涂等沉积技术形成。腔室中的蜡的体积可为大约5微升～大约30微升，诸如为大约10微升～大约30微升、大约10微升～大约20微升、或大约10微升。

如本领域的技术人员所可以理解的，本发明的试剂流体分配装置可使用诸如微注模法和计算机化数字控制(CNC)加工或精确注模法等传统的加工技术而制造。可根据需要而对组成试剂流体分配装置的腔室、贮存箱和流体导管的内表面进行清洁或者灭菌。在一些案例中，腔室和通道的内表面可涂敷有其他材料以便改变表面的表面属性。例如，试剂流体分配装置的至少一部分内表面可通过涂敷合适的材料(诸如疏水的聚合物)而成为疏水性的。

在第二方面中，各个实施例涉及包括根据第一方面的试剂流体分配装置的微流体装置。在一些实施例中，在微流体装置中可设有一个以上试剂流体分配装置。例如，在微流体装置之内可串联地设置有一个以上试剂流体分配装置，诸如一个、两个、三个或四个试剂流体分配装置。试剂流体分配装置可与其他单元组合使用而形成微流体装置。例如，试剂流体分配装置可与诸如PCT/SG2008/000222中所示例的互连的多腔室装置或诸如PCT/SG2005/000251中所示例的生物芯片一体制成，以形成用于在模块之内进行样品制备和样品处理的集成模块。可将集成的模块应用于诸如PCT/SG2008/000425中所示例的设备中，以执行和监测化学反应。

在第三方面中，各个实施例涉及试剂流体的分配方法。所述方法包括提供根据第一方面的试剂流体分配装置。在贮存箱中提供试剂流体。本发明的方法包括通过气动导管对腔室施加气动压强，以将试剂流体从贮存箱通过第一流体导管传输到腔室。

在一些实施例中，所述方法可包括将第二流体导管连接到贮存箱，以通过使试剂流体流过第二流体导管而将试剂流体提供到贮存箱。例如，可使用加压空气冲刷第二流体导管，从而在将试剂流体分配到腔室中之前，使试剂流体基本上容纳于贮存箱之内。在第二流体导管和贮存箱布置为使得试剂流体从第二流体导管沿与重力相反的向上方向或部分地沿与重力相反的向上方向流到贮存箱的实施例中，由于气动压强通过气动导管施加于试剂流体上，在冲刷第二流体导管期间，试剂流体可容纳并保持于贮存箱之内。在一些实施例中，贮存箱的大小设计为用于存储预定量的试剂流体。因此，通过将基本上容纳在贮存箱之内的试剂流体分配到腔室中，可预先确定分配到腔室中的试剂流体的量。可通过第二流体导管对试剂流体施加气动压强，以将试剂流体从贮存箱通过第一流体导管而传输到腔室。

所述方法可包括将蜡涂敷到腔室的内壁的至少一部分上。可在低于95℃的温度下，将蜡涂敷于腔室的内壁的至少一部分上。通常，对于熔点低的蜡，温度大约为60℃。在一些实施例中，在向腔室中分配试剂流体之前，将蜡涂敷于腔室的内壁的至少一部分上。在腔室中分配试剂流体之前，可使蜡熔化以在腔室中形成蜡层，其中蜡层可用作腔室中的试剂流体的气相密封。在一些实施例中，可使用液体蜡(或石蜡油)。在该案例中，当在腔室中分配试剂流体之前，液体蜡可沉积到腔室中而不需要涂敷于腔室的内壁的至少一部分上。

在缺少此处未具体公开的任何一个或者多个元件、一个限制或多个限制的情况下，这里所描述的本发明仍可适当地实施。于是，例如，术语“包括”、“包含”、“含有”等应作扩大性解释而不加限制。此外，这里采用的术语和表述是用作描述性的术语而非限制，且所述术语和表述的使用不期望排除所示及所描述的特征的任何等同特征或者其部分，而应当明白在本发明所要求保护的范围内，可以做出各种变化。于是，应当明白，尽管通过优选实施例和可选特征而具体公开了本发明，然而，本领域的技术人员可以采取这里公开的本发明的实施例的改变和变化，而所述改变和变化都应认为是处于本发明的范围之内。

这里宽泛而一般性地描述了本发明。落入上位公开范围之内的每个更细化的种类和下位分组也形成了本发明的一部分。这包括本发明的从种类中去除任何主要事项的限制性或否定性限定后的上位描述，而无论这里是否具体提及到删去的材料。

其他实施例处于下面权利要求书和非限制性示例范围之内。此外，当以马库什组合的方式描述本发明的特征或方面时，本领域的技术人员应当明白，也因此以马库什组中的任何个体成员或者成员的子组合的方式对本发明进行了描述。

实验部分

在下面段落中，将描述实时PCR(RT-PCR)热循环。所述实时PCR(聚合酶链式反应)通过使用内部制造的热循环仪进行。通常，可使用任意热循环仪进行实时PCR。所使用的热循环仪包括风扇、热电(TE)加热器/冷却器(9501/127/030，FerroTec)，以及包括FTA600H桥放大器和FTC100温度控制器在内的TE控制套件(FerroTec，美国)。TE加热器/冷却器由FTA600H桥放大器供电，所述FTA600H桥放大器进而由FTC100温度控制器进行控制。T型热电偶(5TC-TT-T-40-36，OMEGA Engineer)安装于TE加热器/冷却器上以测量温度，并用作对FTC100温度控制器的反馈。通过以由相同体积的PCR试剂和液体蜡制成的对照样品直接测量PCR腔室内部的温度，来校准TE加热器和PCR腔室内部的实际温度之间的温度差。

图2A是根据一个实施例的使用一体化模块而集成有样品制备和3通道荧光检测的实时PCR(RT-PCR)系统的示意图。该自动化系统能够从初始样品进行DNA/RNA提取、试剂流体分配以及用于疾病诊断的RT-PCR。

实时PCR(RT-PCR)系统包括三个蓝发光二极管(LED)(λp＝470nm，Δλ＝25nm，LLB52050，Dotlight)、光电倍增管(PMT)(H5784-20，Hamamatsu)、准直透镜(AC254-040-A1，Thorlabs)以及用于6-羧基荧光素(FAM)和SYBR Green I荧光染料的滤波器组(ex.：BG-12，Edmund；em.：HQ535/50m，Chroma)。通过使用电源(NI9265，National Instruments)依次将每个LED点亮200ms，在每个扩展循环(通常在72℃时)的终点进行荧光测量。使来自PCR腔室中的受激发的荧光探针的荧光信号收集并对准到PMT，在PMT中，所获得的信号由数据采集卡(NI9206，NationalInstruments)以1kHz的采样速度进行平均50次(在200ms之内)。LED相对于PCR管以45°倾斜，以使传输到PMT检测器的漫射光最少。

在下面的段落中，将描述微流体装置的制造。图2B是根据本发明的一个实施例的模块的示意图。该图表示了用于DNA/RNA提取、试剂等分样本分配和实时PCR的腔室。用于DNA/RNA提取的试剂被预加载到模块中并由粘合膜密封。将PCR预混合物冷冻并存储于标准的0.2ml PCR腔室或PCR管中，并在使用之前插入到模块中。黑箭头表示试剂流，而白箭头表示施加的负压强。

一体化模块(33.7mm×34.1mm×69.1mm)由聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)制成，以SolidWorks设计，并通过计算机数字控制(CNC)机器(Whits Technologies，新加坡)制造。连接槽高度为1mm且宽度为1mm。穿过模块的气动和流体通道的直径为1mm。腔室容积设计为容纳需要量的试剂(Qiagen DNA/RNA提取试剂盒)。

为了除去油和污染物，将各模块浸泡于0.2％的漂洗剂(Decon90，Decon Lab.Ltd.)中12小时，以去离子水彻底地漂洗，并在60℃中烘干6小时。随后，以0.5％(w/w)的溶解于3M FC-40Fluorinert(以10μm隔膜过滤器(Vacu-Guard，Whatman)过滤过)的DuPont AF1600含氟聚合物浸涂各模块，并在60℃中烘干一夜。

可将涂敷有特富龙(Teflon)的模块在3％的H₂O₂(MGC PureChemicals)中浸泡12小时，以0.1％的焦碳酸二乙酯(DEPC，Sigma-Aldrich)漂洗以除去核糖核酸酶(RNase)和脱氧核糖核酸酶(DNase)，并在60℃中烘干6小时。将用于DNA/RNA提取的富士氧化硅膜(Fujifilm QuickgeneRNA Cultured Kit S)插入隔膜腔室的底部。随后以MicroAMP光学粘合膜(4306311，Applied Biosystems)将模块的顶部和底部密封。

参照图2B，使用了下述附图标记。202表示PCR小瓶或腔室；206表示测量腔室或贮存箱；208表示被动阀；252表示洗提液腔室；254表示多余洗提液腔室；256表示样品腔室；258表示漂洗1缓冲液腔室；260表示废料腔室；262表示隔膜腔室；264表示洗提液腔室；266表示漂洗2缓冲液腔室；268表示乙醇冲刷腔室；270表示连接槽；272表示流体通道；274表示气动通道；276表示氧化硅膜。

在下面段落中，将描述流体泵送和调节。图2C是规定有压强入口(p1～p6)和真空入口(v1～v6)的一体化模块的俯视图和仰视图的示意图。使用了两个体积各为25ml的内部制造的注射泵以产生大气压和真空力。这些注射泵由线性致动器(E43H4N-12，Haydon)和步进电机驱动器(DCS4010，Haydon)驱动，最大流量为12ml/分。在压强入口(p1～p6)和真空入口(v1～v6)处的大气压和真空力通过由15-V电源(S-35-15，MeanWell)供电的单独夹管阀歧管(P/N 075P2NC12-23S，Bio-Chem Fluidics)加以调整。这些气动力经由O形圈和气动连接器(M-3AU，SMC)而连接到模块，所述气动连接器在模块加载时刺过底部密封膜。整个系统使用LabView(National Instruments)程序进行控制。

在下面段落中，将描述样品制备。基于制造商的指示，使用来自QIAamp Viral RNA MiniKit(Qiagen)的试剂进行RNA提取。在1.5ml管中，对连续稀释(1～10⁴倍或1000～0.1ng/μl)的小鼠肝总RNA(10μl)添加280μl的AVL缓冲液、2.8μl的载体RNA(Carrier RNA)(1μg/μl处于AVE缓冲液中)和160μl的无核酸酶水(AM9938，Applied Biosystems)。在室温的条件下，使混合物孵育10分钟。随后，将280μl的乙醇(96％～100％)添加到混合物中，随后将所述混合物传输到被DEPC处理过的模块(样品腔室)。

使用来自QIAamp Viral RNA Mini Kit(Qiagen)的试剂，基于制造商的指示，示出了RNA提取。在1.5ml管中，对连续稀释(1～10⁴倍或1000～0.1ng/μl)的小鼠肝总RNA(10μl)添加280μl的AVL缓冲液、2.8μl的载体RNA(1μg/μl处于AVE缓冲液中)和160μl的无核酸酶水(AM9938，AppliedBiosystems)。在室温的条件下，将混合物孵育10分钟。接下来，将280μl的乙醇(96％～100％)添加到混合物中，随后将所述混合物传输到被DEPC处理过的模块(样品腔室(256))。模块预加载有如下的QIAamp的试剂：在漂洗1缓冲液腔室(258)中引入500μl的漂洗缓冲液AW1，在漂洗2缓冲液腔室(266)中加载500μl的漂洗缓冲液AW2，在洗提液缓冲液腔室(264)中引入200μl的洗提缓冲液，在乙醇冲刷腔室(268)中加载500μl的乙醇(96％～100％)。以MicroAMP光学粘合膜将模块(顶层)重新密封，并加载到流体泵送单元中，所述流体泵送单元自动地执行DNA/RNA提取。

根据制造商的实验计划以QIAamp Mini Spin Column(QIAamp迷你旋转柱)进行对照实验。简单地讲，将样品混合物(与模块实验中的混合物相同的混合物)传输到旋转柱，以8000rpm的速度旋转1分钟，以500μl的漂洗缓冲液AW1(8000rpm，1分钟)漂洗，以500μl的漂洗缓冲液AW2(14000rpm，3分钟)漂洗，并以200μl的AVE洗提缓冲液(8000rpm，1分钟)洗提。还以根据洗提缓冲液体积(200μl)调节后的RNA浓度而对以未处理过的小鼠肝总RNA进行的第二对照进行了研究。简单地讲，对10μl的经连续稀释的(1～10⁴倍或1000～0.1ng/μl)肝总RNA，添加190μl的无核酸酶水。通过RT-PCR测量RNA提取效率。

在下面段落中，将描述对模块上RNA提取和实时PCR的测量。选择小鼠肝总RNA以表征一体化模块系统的RNA提取效率。以TaqmanRNA-to-C_T 1-Step Kit(4392938，Applied Biosystems)在Bio-Rad CFX-96仪器中以20μl的反应混合物进行RT-PCR，所述反应混合物包括0.5μl的TaqMan RT Enzyme Mix、10μl的TaqMan RT-PCR Mix、1μl的TaqmanAssays-by-Design(Mm99999915_gl)和8.5μl的连续稀释的纯化或未纯化小鼠肝总RNA(7810，Ambion)。RRT-PCR(实时逆转录酶-聚合酶链式反应)在48℃下进行15分钟；在95℃下进行10分钟；以及在95℃下进行15s和在60℃下进行60s，40个循环。

选择小鼠3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)以评估根据一个实施例的热循环仪和实时PCR检测系统。根据制造商的实验方案，使用TaqmanReverse Transcription Kit(N8080234，Applied biosystems)，在Bio-RadCFX-96仪器中以100μl的反应混合物进行小鼠肝总RNA(1000ng，7810，Ambion)的逆转录。根据制造商的说明书，以根据一个实施例的热循环仪，将随机逆转录cDNA混合物(包含GAPDH cDNA和其他cDNA)以无核酸酶水(AM9939，Applied biosystems)连续地稀释1到10⁶倍，并使用Taqman FastUniversal PCR master mix(4352042，Applied biosystems)和包含引物和编码GAPDH的探针(Mm99999915_gl，Applied biosystems)的TaqmanAssays-by-Design进行扩增。简单地讲，以15μl液体蜡(Chill-out^TM液体蜡，Bio-Rad)覆盖20μl的PCR混合物，并在95℃下进行5分钟；在95℃下进行5s和在60℃下进行60s(以使退火和延伸结合)，40个循环。将由DNA复制引起的荧光记录为循环数的函数。

在下面段落中，将描述季节性流感筛查和亚型分类。病人的鼻咽拭子样品(处于病毒运送培养基(UTM-RT330C；COPAN)中)由新加坡国立大学医院的分子诊断中心提供。在机构审查委员会(IRB)的批准下，收集这些样品用于2009-H1N1筛查活动。以病毒运送培养基(AM9939，COPAN)对所述样品连续稀释1～10⁴倍，并按照样品制备部分所述的实验方案，使用具有来自QIAamp Virus RNA Mini Kit(Qiagen)的化学制品的一体化模块或Qiagen旋转柱对流感病毒的RNA(200μl)进行提取。以用于A型流感分类的探针和A型流感病毒母体基因特异性引物，以及用于季节性H1N1亚型分类的探针和H1-特异性引物(图15中的表1)进行RRT-PCR。对所有的探针，以6-羧基荧光素(FAM)报告基团染料在5′端进行标记，并以6-羧基四甲基罗丹明(TAMRA)淬灭基团染料在3′端进行标记。以40μl的反应混合物，使用Qiagen QuantiTect RT Probe Kit(一步RT-PCR)进行RRT-PCR分析，所述反应混合物包括0.4μl的QuantiTech RT Mix、20μl的QuantiTect ProbeRT-PCR Master Mix、20pmol的各引物、10pmol的探针以及10μl的所提取RNA混合物。在如下条件下进行RRT-PCR：在50℃下进行20分钟；在95℃下进行2分钟；在95℃下进行30s，在50℃下进行30s，以及在72℃下进行30s，50个循环；并在72℃下终延伸10分钟。这通过根据一个实施例的热循环仪(具有一体化模块)或Bio-Rad CFX96热循环仪(对照)进行。

对于一体化系统，PCR管预加载有30μl的RRT-PCR混合物(没有目标RNA)，所述RRT-PCR混合物覆盖有15μl的液体蜡(Chill-out^TM液体蜡，Bio-Rad)。在样品提取之前，将它们插入到一体化模块上。在样品提取期间，将10μl的提取出的病毒RNA自动地等分分配到每个PCR管中。随后由系统的实时PCR硬件进行热循环和检测。

在下面段落中，将描述装置操作。在操作之前，在一体化模块的各腔室中预加载RNA提取试剂(由WHO推荐的用于流感病毒RNA提取的QIAamp Viral RNA Mini Kit)，且以MicroAMP粘合带密封模块的顶部和底部表面。预加载PCR管也插入到模块中(图2B)。操作员将生物样品经由注射器针头引入到指定的样品腔室。一旦将模块加载到系统中之后，系统的气动连接器自动地刺入模块的底部膜，并将模块的压强和真空入口连接到外部气动系统(图2C)。

根据各个实施例，通过使用压缩空气和真空的组合而实现对流体的控制。这些推力和拉力分别由根据一个实施例的两个注射泵产生。使用两个夹阀歧管将气动力引导到模块之内的合适的腔室。注射泵和夹阀歧管提供了外部气动系统，其控制流体在模块的腔室之内的运动(图3)。由于模块设计为没有活动部件，这极大地简化了模块组件并允许经由注模法而批量生产模块，因此模块成本可显著降低。

模块可提供两个独立的气动和流体网络。每个腔室可设有一个气动入口(连接于腔室顶部)和两个流体连接点(底部出口和顶部入口)。两个腔室可由穿过模块的流体通道连接。当连接于泵时，例如，可对腔室施加压强和真空力，从而两个腔室之间可以存在压强梯度。以此方式，试剂被迫从源腔室的底部排出，向上流过穿过模块的流体通道，并进入目标腔室。与平面微流体结构不同，所述平面微流体结构常常需要片上阀在腔室之间分离和引导流体，在模块的腔室之内的试剂可由于重力而自动地隔离。鉴于试剂在整个操作期间可自容于流体通道和腔室之内，这也意味着可消除潜在的制程设备(run-to-run)和硬件交叉污染。

使用图3A(I)中的示意图图示了一体化模块的整体操作。图中使用了下述附图标记。C1表示样品腔室；C2表示漂洗1缓冲液腔室；C3表示漂洗2缓冲液腔室；C4表示乙醇腔室；C5表示洗提缓冲液腔室；C6表示废料腔室；C7表示洗提液腔室；C8表示多余洗提液腔室；X1表示氧化硅膜腔室；p1指第一(压强)夹管阀；p2指第二(压强)夹管阀；p3指第三(压强)夹管阀；p4指第四(压强)夹管阀；p5指第五(压强)夹管阀；p6指第六(压强)夹管阀；v1指第一(真空)夹管阀；v2指第二(真空)夹管阀；v3指第三(真空)夹管阀；v4指第四(真空)夹管阀；v5指第五(真空)夹管阀；v6指第六(真空)夹管阀；T1指第一PCR腔室(或PCR管)，T2指第二PCR腔室(或PCR管)；T3指第三PCR腔室(或PCR管)；且M1指第一贮存箱(或等分样本腔室)；M2指第二贮存箱(或等分样本腔室)；M3指第三贮存箱(或等分样本腔室)

使用符号“X”和箭头(↑或↓)表示夹管阀的状态。夹管阀处的符号“X”表示阀关闭，而在夹管阀处使用箭头↑或↓表示阀打开。施加的压强(针对p1～p6)或施加的真空(针对v1～v6)的方向由箭头的方向指示。

参照图3A(I)，T1～T3为包含RT-PCR预混合物的PCR腔室或PCR管，其中RT-PCR预混合物包含RT-PCR混合物(没有目标RNA)和液体蜡。可通过针头注射器将生物样品加载到样品腔室C1中，且以粘合带将模块重新密封。通过打开阀p1和v1(而保持其它的阀关闭)并分别以箭头所指示的方向经阀施加压强和真空，可将包含目标RNA的生物样品传输到腔室X1，在腔室X1中溶解和通过氧化硅膜过滤。RNA由隔膜捕获，且可将过滤出的废料引导到废料腔室C6。可依次使用容纳于C2中的漂洗1缓冲液、容纳于C3中的漂洗2缓冲液以及容纳于C4中的乙醇(流量：1ml/分)而冲掉杂质(在氧化硅膜之内捕获的)。依次通过轮流打开每个阀p2、p3或p4和v1，并经p2～p4施加压强且经v1施加真空，将试剂引导到腔室X1。随后，以空气(流量＝10ml/分；2分钟)大规模地冲刷腔室X1，以除去残留的漂洗缓冲液余物。

参照图3A(II)，当低离子浓度洗提缓冲液穿过氧化硅膜时，将纯化的RNA在提纯处理之后从氧化硅膜释放。通过打开阀p5和v2将带有RNA的洗提缓冲液引导到洗提液腔室C7，并分别经该阀(而保持其它的阀关闭)施加压强和真空。

在图3A(III)中，打开阀v3～v6以及p6(而关闭其它的阀)，且经v3～v6阀施加真空并经p6施加压强。通过在整个系统中应用该压强梯度机制，通过依次逐渐填充三个等分样本测量腔室M1～M3(流量＝0.1ml/分)而将洗提液腔室C7中的洗脱混合物等分分配，而将多余的洗脱混合物传递到多余洗提液腔室C8。

在图3A(IV)中，阀v3和p6打开(而其它的阀关闭)并经v3施加真空且经p6施加压强。残留在连接通道之内的纯化的RNA被空气冲刷到多余洗提液腔室C8(流量＝5.62ml/分)，而RNA等分样本或试剂流体借助于在等分样本腔室之内的表面张力而得以保持在位。

参照图3A(V)和图3A(VI)，将RNA等分样本分配到包含RT-PCR预混合物的PCR管或腔室T1～T3中。由于RNA样品较稠密，其穿过覆盖RT-PCR混合物的液体蜡薄层而直接进入RT-PCR混合物中。密度低于PCR混合物的液体蜡避免了试剂在PCR热循环期间蒸发。

在下面段落中，将描述试剂等分样本的分配。疾病诊断或筛查可能需要对提取的RNA等分样本进行多重PCR以用于划分疾病分类、亚型分类和阳性对照(以确保PCR酶混合物的活性)。在本方法中，可使用等分样本测量和表面张力阀的概念以将提取后的RNA样品精确地分配到三个PCR小瓶或腔室的每一个中。图4A是使用被动阀的试剂流度计和等分样本分配装置的示意图。如对图3A(III)和图3A(IV)的描述中所提到的，提取后的RNA可依次填充于三个等分样本贮存箱M1～M3的被动阀的收缩处，且残留于连接通道中的流体可用空气冲刷掉。

换言之，通过设计每个等分样本贮存箱，使得每个等分样本贮存箱的容积对应于施加于每个PCR管的提取的RNA的目标体积，可以以简单的方式精确地管理施加于PCR管的提取的RNA的量。图5A～图5I是使用根据一个实施例的试剂流度计装置等分分配RNA洗提液的时序照片。以蓝色食用色素对RNA洗提液进行染色。在图5A中，洗提液穿过X1中的氧化硅膜并被传输到洗提液腔室C7。在图5B中，洗提液开始填满洗提液腔室C7。在图5C～5E中，贮存箱M1～M3依次被填充到贮存箱的收缩处或被动阀处。在图5F中，将多余的洗提液引导到多余洗提液腔室C8并对贮存箱的连接管道进行冲刷。在图5G～5I中，将每个等分样本贮存箱之内的流体隔离，且将精确体积的洗提液分配到各个PCR管T1～T3(图中标示为1～3)中。

图4B是图示了在三个等分样本贮存箱中分配的具有10μl的目标体积的流体等分样本的精度的图。以水(重复16次)对三个PCR小瓶测量的平均体积为9.8μl～10.2μl，其标准差为0.7μl～0.9μl。这些差异可以归因于通过CNC铣削进行的模块制造，且在以空气冲刷连接通道期间流体在仪表的底部发生切变。通过将精确注模法用于模块制造并通过减少连接通道的尺寸，可使得这些差异最小化。

在下面段落中，将描述RNA提取。用于RT-PCR的示例性样品制备中的RNA提取需要几个步骤。首先，在高离子强度下，使RNA吸附到二氧化硅表面。可漂洗掉无束缚的杂质，且所吸附的RNA被释放到较高pH值的溶液中。将这些人工的、劳动强度大的处理集成到根据一个实施例的模块上RNA提取中。

使用了Qiagen Viral RNA Mini Kit以提取连续稀释的小鼠肝总RNA(0.1～1000ng/μl)。接下来，使用商业化的热循环仪(Bio-Rad CFX-96)，采用一步RRT-PCR(在同一混合物中合并进行了逆转录和cDNA扩增)以扩增小鼠GAPDH基因。通过Qiagen旋转柱或初始未处理过的样品进行了对照实验。选择小鼠肝总RNA以便以同时共存的人类总RNA和病毒RNA模拟临床生物样品。肝总RNA的模块上提取给出了关于RT-PCR扩增(图6插图)的线性曲线，表明可以以高的纯度对RNA实现定量的再隔离。与Qiagen旋转柱实验(对照)相比较，对小鼠GAPDH RRT-PCR，可获得颇相似的循环阈值(C_T)(图22中的表)和扩增效率(图6插图)(旋转柱：97％vs.模块上提取：87％)。差异非常可能是由一步RT-PCR的固有的低效率造成的，如初始未纯化的样品(94％)的低效率所示。

在下面段落中，将描述实时PCR热循环。使用具有散热器和风扇的热电模块以进行热循环。图7A图示了从反馈温度传感器所获得的热循环仪的温度曲线。测量和校准了在加热器表面和在PCR腔室之内的温度。从图7A估计出的加热和冷却速度分别为2.5℃/s和2.2℃/s，它们与商业化的热循环仪的加热和冷却速度估计相当。对于每个温度设定，超调量低于1℃，且热稳定性保持在±0.1℃之内。所达到的热控制和稳定性实现了PCR要求。

一体化模块包含用于疾病分类、亚型分类和阳性对照的三个0.2mlPCR管。这三个管同步地置于相同的PCR循环条件中。图8表示连续稀释的(1～10⁶倍)小鼠GAPDH cDNA(实时荧光信号见图9A～图9C)的模块上实时荧光曲线和循环阈值。PCR检测系统覆盖了高度线性(R²相关系数＞0.994)动态范围是商业化的实时热循环仪(Bio-Rad CFX96和MJResearch Option)的7个数量级大小，且扩增效率与之相当。图7B表示以10倍稀释的GAPDH cDNA混合物进行的(o)左、(◇)中和(□)右PCR管的实时PCR曲线。从图中可以看到，三个PCR管的归一化荧光强度高度一致。

在下面段落中，将描述迅速流感诊断和亚型分类。需要识别流感病毒的分类和亚型分类，尤其对于由世界卫生组织(WHO)所推荐的恰当的H1N1诊断更是如此。为演示此重要的复用能力，以来自被季节性A型流感H1N1传染的病人的鼻咽拭子样品进行模块上检测。三个模块上PCR小瓶中的两个包含有分别用于A型流感分类和H1亚型分类的引物和TaqMan探针。直接在这两个小瓶中对模块上提取的病人样品的RNA进行模块上PCR分类和亚型分类。第三小瓶(阳性对照)由来自由Qiagen旋转柱提取的相同病人样品的RNA、以及A型流感分类引物和探针构成。以此用于核实实时PCR硬件和模块上RNA提取的功能。一体化系统有效地识别出病人患有(C_T＝24.23)带有H1亚型分类(C_T＝27.45)的A型流感(见图10)。H1亚型分类的更高的C_T值可由用于流感分类和亚型分类的引物和探针的差异造成。RNA提取和检测完全在一体化系统之内执行，并且在2.5h(大约20分钟的RNA提取，大约20分钟的逆转录，以及大约110分钟的用于PCR检测的50个循环)之内结束。

还以连续稀释的A型流感鼻咽的拭子样品(以病毒传播媒介稀释1～10⁴倍)对一体化系统的灵敏度进行了进一步的研究，并以人工Qiagen旋转柱提取和Bio-Rad CFX96实时检测的传统方法为基准。还以模块上纯化的RNA(从多余洗提液腔室吸取)以及使用Bio-Rad CFX96系统的检测进行对照实验。

如图11所示，一体化系统能够以90％的PCR效率检测10³倍稀释的A型流感，而传统方法和对照实验能够以99％的PCR效率检测低至10⁴倍稀释。此外，相比于传统方法，一体化系统(ΔC_T＝2.71～3.72)和对照实验(ΔC_T＝1.34～1.75)需要较大的循环次数(见图23中的表)。以模块上提取的RNA进行的对照实验的RT-PCR扩增效率(99％)接近完美表明纯化的RNA试剂不受RT-PCR抑制剂影响。对照实验的C_T值相比于传统方法的C_T值稍高可能是由分别在模块上RNA提取中所采用的Fujifilm氧化硅膜(薄膜)和在传统提取中采用的Qiagen氧化硅柱(3维柱)的RNA提取效率中的差异造成(与表面积的差异有关)。

一体化系统的RT-PCR扩增效率(90％)可能比对照实验(99％)稍低。一体化系统可具有与MJ Research Opticon以及Bio-Rad-CFX96(图8)相当的灵敏度和扩增效率。于是，问题可能未必与装置在器械方面相关。可猜测，提取的RNA与RT-PCR预混合物的不充分的混合可能是实测差异的原因。在一体化系统中，提取的RNA可简单地分配到PCR小瓶中而没有积极的混合，于是在以用于逆转录处理的引物退火时，可能需要更多的时间以进行RNA扩散，导致C_T值的增加或RT-PCR的失败(见图12)。在将来，可通过结合磁性启动的混合而实现处理上的改善。尽管有该问题，一体化系统成功地演示了作为具有大约10⁵个副本/ml的最小病毒载荷需要、10³倍稀释的季节性A型流感的平均病毒载荷(3.28×10⁸个副本/ml)的自包含流感诊断试剂盒。该系统也可用于其他疾病诊断，诸如大流行病2009-H1N1流感，其具有1.84×10⁸个副本/ml的平均病人病毒载荷。

根据各个实施例的系统在具有用于迅速流感诊断的复用能力的模块中集成了样品制备和实时RT-PCR。所有用于病毒颗粒溶解、病毒的RNA提纯和RT-PCR检测而必需的化学物以及处理的废料必需地自包含于且完全密封在一次性的模块之内，从而消除了任何潜在的病毒暴露和硬件污染。通过各个实施例，表明系统可在2.5h之内自动地执行样品制备和诊断。该充分自动化的处理可通过推拉流体泵方法和由氧化硅膜、气动和流体网络、流度计和表面张力阀构成的新颖模块设计来实现。流体控制可通过由离模块的气动控制单元实现的同步的压强和真空力来实现。尽管本工作以加工后的模块证明了在设计优化方面具有快速的原型设计和迅速的周转期，然而也可以通过低成本且具有高精度的注模法而容易地批量制造所述聚合物模块。

使用与使用人工RNA提取进行的实验具有相当的灵敏度的一体化系统和商业化的热循环仪成功地实现了临床样品的季节性A型流感H1N1分类和亚型分类。通过连续稀释实验确定的最小可检测的病毒载荷为100个副本/μl。模块设计灵活，且可扩展以容纳多个通道(诸如用于5色、5通道检测)，而没有显著的设计变化。这可实现呼吸性病毒传染的小组的同步检测。简言之，根据各个实施例，可提供适用于分散的传染性疾病诊断的实用、低成本且全自动化的桌面系统。

Claims

1.一种试剂流体分配装置，其包括：

用于接收试剂流体的腔室，所述腔室具有第一开口和第二开口；

第一流体导管，其连接于所述腔室的第一开口；

贮存箱，其连接于所述第一流体导管，所述贮存箱具有第一开口，其中，所述贮存箱的第一开口连接于所述第一流体导管以形成被动阀，并且所述贮存箱的大小设计为用于存储预定体积的所述试剂流体；以及

气动导管，其连接于所述腔室的第二开口，其中，通过所述气动导管对所述腔室选择性地施加气动压强使得所述试剂流体从所述贮存箱通过所述第一流体导管而传输到所述腔室。

2.如权利要求1所述的试剂流体分配装置，其中，所述贮存箱和所述第一流体导管布置为使所述试剂流体从所述贮存箱沿与重力相反的向上方向或部分地沿与重力相反的向上方向流到所述第一流体导管。

3.如权利要求1或2所述的试剂流体分配装置，还包括连接于所述气动导管以对所述腔室施加气动压强的真空泵。

4.如权利要求1～3之任一项所述的试剂流体分配装置，其中，所述贮存箱具有第二开口。

5.如权利要求4所述的试剂流体分配装置，还包括连接于所述贮存箱的第二开口的第二流体导管。

6.如权利要求5所述的试剂流体分配装置，其中，通过所述第二流体导管对所述试剂流体选择性地施加气动压强使得所述试剂流体从所述贮存箱通过所述第一流体导管传输到所述腔室。

7.如权利要求1～6之任一项所述的试剂流体分配装置，其中，通过所述气动导管对所述腔室施加的气动压强和通过所述第二流体导管对所述试剂流体施加的气动压强的合成值大于通过所述被动阀传输所述试剂流体所需要的压强。

8.如权利要求7所述的试剂流体分配装置，其中，通过所述气动导管对所述腔室施加的气动压强和通过所述第二流体导管对所述试剂流体施加的气动压强的合成值在大约0.1KPa～大约10KPa之间。

9.如权利要求1～8之任一项所述的试剂流体分配装置，其中，所述被动阀的横截面积与所述第一流体导管的横截面积相同。

10.如权利要求1～8之任一项所述的试剂流体分配装置，其中，所述被动阀的横截面积小于所述第一流体导管的横截面积。

11.如权利要求10所述的试剂流体分配装置，其中，所述被动阀的横截面积与所述第一流体导管的横截面积的比率在大约1：1～大约1：2500之间。

12.如权利要求1～11之任一项所述的试剂流体分配装置，其中，所述贮存箱的横截面积大于所述被动阀的横截面积。

13.如权利要求12所述的试剂流体分配装置，其中，所述被动阀的横截面积与所述贮存箱的横截面积的比率在大约1：4～大约1：4000之间。

14.如权利要求1～13之任一项所述的试剂流体分配装置，其中，所述贮存箱至少大致为圆筒状。

15.如权利要求1～14之任一项所述的试剂流体分配装置，其中，所述贮存箱的容积在大约1μl～大约50μl之间。

16.如权利要求15所述的试剂流体分配装置，其中，所述贮存箱的容积为大约10μl。

17.如权利要求1～16之任一项所述的试剂流体分配装置，其中，所述腔室的第一开口和第二开口中的至少一个位于所述腔室中的液位上方。

18.如权利要求1～17之任一项所述的试剂流体分配装置，其中，所述腔室具有形成于所述腔室的内壁的至少一部分上的蜡。

19.如权利要求18所述的试剂流体分配装置，其中，所述蜡是使用从旋涂、涂刷、喷雾、刷涂、气相沉积、辊式涂布和浸涂中选出的沉积技术而形成的。

20.如权利要求18或19所述的试剂流体分配装置，其中，所述蜡的体积为大约10μl～大约40μl。

21.如权利要求20所述的试剂流体分配装置，其中，所述蜡的体积为大约10μl。

22.如权利要求1～21之任一项所述的试剂流体分配装置，其中，所述试剂流体分配装置是使用精确注模法而制造的。

23.如权利要求1～22之任一项所述的试剂流体分配装置，其中，所述试剂流体分配装置的至少一部分内表面为疏水的。

24.一种微流体装置，其包括根据权利要求1～23之任一项所述的试剂流体分配装置。

25.一种试剂流体的分配方法，所述方法包括：

提供根据权利要求1～23之任一项所述的试剂流体分配装置；

在所述贮存箱中提供试剂流体；

通过所述气动导管对所述腔室施加气动压强以使所述试剂流体从所述贮存箱通过所述第一流体导管传输到所述腔室。

26.如权利要求25所述的方法，还包括将第二流体导管连接到所述贮存箱。

27.如权利要求26所述的方法，其中，在所述贮存箱中提供所述试剂流体包括使所述试剂流体通过所述第二流体导管流到所述贮存箱。

28.如权利要求27所述的方法，还包括冲刷所述第二流体导管以使所述试剂流体基本容纳在所述贮存箱之内。

29.如权利要求28所述的方法，其中，使用加压空气进行所述冲刷。

30.如权利要求26～29之任一项所述的方法，还包括通过所述第二流体导管对所述试剂流体施加气动压强以使所述试剂流体从所述贮存箱通过所述第一流体导管而传输到所述腔室。

31.如权利要求25～30之任一项所述的方法，还包括将蜡涂敷在所述腔室的内壁的至少一部分上。

32.如权利要求31所述的方法，其中，在将所述试剂流体分配到所述腔室中之前，使所述蜡熔化以在所述腔室中形成蜡层。