CN103027909A - 香豆素类化合物的应用及其从瑞香中提取的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了三种香豆素类化合物瑞香新素、瑞香素和7-羟基-8-甲氧基香豆素在制备丙型肝炎病毒蛋白酶NS3/4A抑制剂和治疗丙型肝炎药物中的应用及其从瑞香(Daphnepapyracea Wall.ex Steud.var. crassiuscula Rehd.)中提取、分离和纯化方法,上述三种香豆素类物质对丙型肝炎病毒蛋白酶NS3/4A有较强的抑制作用,活性较高,可单独用于制备预防和治疗丙型肝炎的药物,也可与其它组分复配用于预防和治疗丙型肝炎;并且,发明人采用现代植物化学分离纯化技术首次从瑞香植物中提取分离得到三种香豆素类化合物,化合物纯度在98%,可作为药品检验中的化学标准品应用。
Description
技术领域
本发明涉及药物技术领域,特别是涉及香豆素类化合物的药物应用及其从瑞香(Daphne papyracea Wall. ex Steud. var. crassiuscula Rehd.)中提取的方法。
背景技术
人体感染丙型肝炎病毒所致的丙型肝炎,已成为全球最棘手的健康问题,目前全世界已有1.7亿人感染。若无药物的治疗,长期感染丙型肝炎病毒将发展成为慢性肝炎、肝坏死、肝癌等疾病。当前最有效的治疗方法是聚乙二醇干扰素联合利津巴韦,该方法对于广大发展中国家普遍存在的I型丙型肝炎治疗有效率低于50%,长期使用干扰素存在许多副作用,如:白细胞、血小板、嗜中性白血球的减少和抑郁症等;长期使用利津巴韦,也将产生溶血性贫血等副作用,使得患者不能持续治疗,因此发展独特、有效、更安全的丙型肝炎治疗药物尤为紧迫。
丙型肝炎病毒蛋白酶NS3/4A 在病毒圆熟过程中起着重要的作用,已被证实是发现治疗丙型肝炎药物的有效靶点之一。目前三种丙型肝炎NS3/4A蛋白酶抑制剂,BILN 2061,VX-950和SCH 503034,已被临床证实疗效显著,但多为肽类抑制剂,合成困难,并有一定的毒副作用。
中药瑞香(Daphne papyracea Wall. ex Steud. var. crassiuscula Rehd.)系瑞香科瑞香属常绿灌木,又名山辣子皮,麝囊,蓬莱花,雪花、夺香花,野梦花、山梦花,雪地开花、红总管、雪冻花。主要分布于四川、贵州、云南等地海拔1000-3100米的山坡灌丛或草坡中,具有治咽喉肿痛,齿痛,风湿痛等功效。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有治疗丙型肝炎的药物合成困难、副作用多的缺陷,提供三种天然香豆素类化合物在制备丙型肝炎病毒NS3/4A蛋白酶抑制剂和治疗丙型肝炎药物中的应用,同时提供从瑞香(Daphne papyracea Wall. ex Steud. var. crassiuscula Rehd.)中提取、分离和纯化三种化合物的方法。
为了解决上述技术问题,本发明采用如下的技术方案:
本发明提供了瑞香新素、瑞香素和7-羟基-8-甲氧基香豆素在制备丙型肝炎病毒NS3/4A蛋白酶抑制剂和治疗丙型肝炎药物中的应用。
本发明还提供了从瑞香(Daphne papyracea Wall. ex Steud. var. crassiuscula Rehd.)中提取、分离和纯化上述三种香豆素类化合物的方法:取瑞香植物全株,粉碎,用乙醇加热回流提取,提取液浓缩成乙醇浸膏,用水分散,用乙酸乙酯萃取,浓缩得乙酸乙酯浸膏,经硅胶柱层析,以体积比为50:1的氯仿-甲醇梯度洗脱,在氯仿:甲醇的体积比为25:1的梯度获得A流份、氯仿:甲醇的体积比为10:1的梯度获得B流份、氯仿:甲醇的体积比为8:1的梯度获得C流份,三流份分别经ODS柱层析分离,A流份以体积比为6:4的甲醇-水洗脱、B流份以体积比为1:9的甲醇-水洗脱、C流份以体积比为1:9的甲醇-水洗脱,洗脱液分别用甲醇重结晶,A流份获得瑞香新素、B流份获得7-羟基-8-甲氧基香豆素、C流份获得瑞香素。
进一步的,乙酸乙酯浸膏的提取方法为:取瑞香植物全株,粉碎,加5~10重量倍70~95%的乙醇加热回流提取2~4次,每次1~2小时,滤过,合并滤液,滤液减压浓缩至无醇味,用等体积的水分散,再用2倍体积量的乙酸乙酯萃取2~3次,浓缩得乙酸乙酯浸膏。
在前述方法中,硅胶柱层析时的硅胶为200~300目,上柱硅胶为浸膏用量的50~150重量倍,ODS柱层析时反相硅胶为100-200目,上柱反相硅胶为浸膏用量的50~100倍。
前述提取、分离和纯化方法中所用到的瑞香为瑞香科瑞香属植物Daphne papyracea Wall. ex Steud. var. crassiuscula Rehd.的全株
为了确认所提取化合物的结构及验证其抗丙型肝炎病毒作用,发明人做了相关的实验如下:
1、化合物结构的确认
采用上述技术方案从A、B、C三流份中所提取得到的三个化合物,经1H-NMR,13C-NMR,MS和与文献对照,分别被确定为:
A流份获得的化合物:淡黄色粉末,MS (ESI), m/z 409 [M+Na]+, mp. 235-237℃, 1H NMR (Pyridine-d 5 , 400 MHz) δ: 3.81 (6H, s, 2×-OCH3), 3.90 (2H, d, J = 2.7, 13.0 Hz), 4.29 (1H, d, J = 1.7, 13.0 Hz), 4.31 (1H, d, J =8.1, 10.3 Hz), 5.59 (1H, d, J = 8.2 Hz), 6.38 (1H, d, J = 9.5 Hz), 7.04 (1H, d, J = 8.1 Hz), 7.69 (1H, d, J = 9.5 Hz). 13C NMR (Pyridine-d 5 , 100 MHz) δ: 56.4, 60.8, 78.0, 80.1, 106.2, 113.4, 113.8, 113.9, 120.0, 126.6, 132.4, 138.5, 144.3, 144.6, 147.8, 160.6。以上光谱数据与文献报道的瑞香新素波谱数据一致(Liu Yan Ze, et al., Chin Chem. Lett., 1997, 8(3):229)。A流份化合物被确定为瑞香新素。
分子式为:C20H18O8,结构式如下:
B流份获得的化合物:无色针晶;Gibbs 反应呈阴性,EI-MS m/z 192 [M]+, 1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ: 3.29 (3H, s, -OCH3), 6.17 (1H, d, J = 9.2 Hz), 6.81 (1H, d, J = 8.6 Hz), 7.17 (1H, d, J = 8.6 Hz), 7.80 (1H, d, J = 9.2 Hz ). 13C NMR (MeOD, 100 MHz) δ: 60.4, 111.1, 112.7, 113.3, 123.5, 134.5, 145.1, 148.3, 154.1, 161.7。以上光谱数据与文献报道的7-羟基-8-甲氧基香豆素波谱数据一致(王明时等,中草药,1980,11(2),49)。B流份化合物被确定为7-羟基-8-甲氧基香豆素。
分子式为:C10H8O4,结构式如下:
C流份获得的化合物:无色针晶;MS (ESI), m/z 191 [M+ Na]+, 1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ: 6.17 (1H, d, J = 9.2 Hz), 6.80 (1H, d, J = 8.6 Hz), 6.98 (1H, d, J = 8.6 Hz), 7.81 (1H, d, J = 9.2 Hz ). 13C NMR (MeOD, 100 MHz) δ: 110.0 (C-3), 112.4 (C-10), 112.6 (C-6), 118.8 (C-5), 132.2 (C-8), 143.6 (C-4), 145.3 (C-9), 149.8 (C-7), 162.1 (C-2)。以上光谱数据与文献报道的瑞香素波谱数据一致(Sadtler Standard Carbon-13 NMR Spectra, No. 2157. Sadtler Research Laboratories, Philadelphia, 1977)。C流份化合物被确定为瑞香素。
分子式为:C9H6O4,结构式如下:
2、 纯度检查:
2.1 薄层色谱法:照《中国药典》2005年版一部附录 VI B薄层色谱法测定。
分别取提纯得到的瑞香新素、7-羟基-8-甲氧基香豆素和瑞香素加甲醇制成1mg/ml的溶液,作为供试品溶液。
分别取供试液5mL,点于硅胶GF254薄层板上,采用上行展开方式,瑞香新素以氯仿-丙酮(5:1)、7-羟基-8-甲氧基香豆素以石油醚-丙酮(3:1),瑞香素以石油醚-乙酸乙酯(2:1)为展开剂分别展开,随后硅胶GF254薄层板在紫外灯下(254 nm)检识后,碘显后,置于日光下检查。结果表明:经三种展开系统多种显色方式检识,均呈单一斑点。点样量为所适用检测方法点样量的10倍量时,色谱中未见明显杂质斑点。故经薄层色谱法检识瑞香新素、7-羟基-8-甲氧基香豆素和瑞香素为纯品。
2.2 高效液相色谱法:照《中国药典》2005年版一部附录 VI D 高效液相色谱法测定。
色谱条件与系统适用性实验 用十八烷机基硅烷键合硅胶为填充检验瑞香素,甲醇-0.5%磷酸(48:52)为流动相,流速1 mL/min,,检测波长为323 nm,柱温 室温。理论板数以瑞香素峰计算应不低于2500。
样品溶液的制备:取瑞香素适量,加甲醇溶解,配成1.25 mg/mL的溶液。
测定法:吸取样品溶液10 ml,注人高效液相色谱仪,记录色谱图的时间为瑞香素峰出峰时间的2倍以上,外标法以峰面积归一化法计算结果,纯度在98%以上。
3、化合物的抗丙型肝炎病毒NS3/4A蛋白酶作用
测试原理:荧光法
检测仪器:TECAN GENios,电子分析天平METTLER AE-240 瑞士。
试剂盒:SensoLyte 520 HCV蛋白酶试剂盒 (批号:AK71145-1011,美国圣何塞 AnaSpec。)
蛋白酶:HCV NS3/4A蛋白酶 (批号:046-079,美国圣何塞 AnaSpec)。
受试药物:瑞香新素、瑞香素、7-羟基-8-甲氧基香豆素。
阳性对照:Embelin (日本 富山大学 和汉医药研究所 药物代谢工学分野 化学标准品)
数据处理与分析:数据以均数标准差表示(X ± S),通过微软Windows 2003 Excel软件完成统计学处理,计量资料采用STDEV-t检验计算抑制率。
抑制率计算公式:
抑制率% = 100×(Fvehicle- Fsample)/ Fvehicle;式中的F 为对照组和样品组荧光值。
实验方法及结果:
测试溶液的配制(按试剂盒说明手册操作):
缓冲溶液:将2X实验缓冲液(Component D)、1M DDT(Component F)和去离子水按1:0.06:1进行混合,冰浴备用。
HCV NS3/4A蛋白酶底物溶解:加0.12 ml的DMSO (Component C)到HCV NS3/4A蛋白酶底物[Ac-Asp-Glu-Dap(QXLTM520)-Glu-Glu-Abu-COO-Ala-Ser-Cys
(5-FAMsp)-NH2](Component A), 作为储备液-20℃冻存。每次实验前取储备液,用缓冲溶液按1:100比例稀释,现配现用。
HCV NS3/4A蛋白酶溶液:用缓冲溶液将蛋白酶溶液稀释20或60倍。
测定方法(按试剂盒说明手册操作):在384孔黑色平板 (美国BD Falcon公司)中,先分别加入底物空白溶液(Substrate Control,SC)、溶剂空白溶液(Vehicle Control,VC)、阳性对照(Positive Control, PC)、 抑制剂对照(Inhibitor Control, IC)、测试化合物对照(Test Compound Control, TCC), 再加入HCV NS3/4A蛋白酶和底物。每个浓度均为3个复孔,震荡混匀后,室温下暖孵30分钟,经TECAN GENios在激发波长485 nm和发射波长535 nm下测试荧光强度。实验结果见表1。
表1 三种化合物(100 mg/ml)对HCV NS3/4A蛋白酶的抑制率 (n=3)
物质名称 | 抑制率% |
瑞香新素 | 69.9 ± 5.7 % |
7-羟基-8-甲氧基香豆素 | 72.5 ± 4.5 % |
瑞香素 | 79.5 ± 1.5 % |
PC | 100.2± 0.1 % |
阳性对照(PC): Embelin,数据为:平均值±相对标准偏差 (三次独立实验值)
目前离体实验认为,单体化合物的IC50在10 mg/mL以下就具有较强的抗HCV NS3/4A蛋白酶作用。瑞香新素、瑞香素和7-羟基-8-甲氧基香豆素在100 m g/mL时,对HCV NS3/4A蛋白酶抑制率达70~80%,对丙型肝炎HCV NS3/4A蛋白酶有较高的抑制作用。
与现有技术相比,本发明发现三种香豆素类物质瑞香新素、瑞香素和7-羟基-8-甲氧基香豆素对丙型肝炎病毒蛋白酶NS3/4A有较强的抑制作用,活性高,可单独用于制备丙型肝炎病毒蛋白酶NS3/4A抑制剂以及预防和治疗丙型肝炎的药物,也可与其它组分复配用于预防和治疗丙型肝炎;并且,发明人采用现代植物化学分离纯化技术首次从瑞香(Daphne papyracea Wall. ex Steud. var. crassiuscula Rehd.)中提取分离得到三种香豆素类化合物,化合物纯度在98%,可作为药品检验中的化学标准品应用。
具体实施方式
实施例1:化合物的提取、分离和纯化
瑞香药材于2005年3月采自贵州贵阳,由贵阳中医学院陈德媛教授(生药学专家)鉴定为瑞香(Daphne papyracea Wall. ex Steud. var. crassiuscula Rehd.),植物标本存放在贵阳中医学院药学系中药化学实验室(标本号GY200503D)。
取瑞香植物全株5.5kg,粉碎,用80~95%乙醇(料液重量比为1:6)加热回流提取3次,合并提取液,提取液减压浓缩至30℃相对密度为1.05~1.35的浸膏,用水分散(料液重量比为1:2)后用等体积的乙酸乙酯萃取3次,合并萃取液,减压浓缩并干燥得乙酸乙酯干浸膏132g。
乙酸乙酯浸膏经硅胶柱层析(硅胶200~300目,硅胶重量:浸膏重量 =50:1),以体积比为50:1的氯仿-甲醇梯度洗脱,在氯仿:甲醇的体积比为25:1的梯度获得A流份、氯仿:甲醇的体积比为10:1的梯度获得B流份、氯仿:甲醇的体积比为8:1的梯度获得C流份,三流份分别经ODS柱层析分离(硅胶100~200目,硅胶重量:浸膏重量=100:1),A流份以体积比为6:4的甲醇-水洗脱、B流份以体积比为1:9的甲醇-水洗脱、C流份以体积比为1:9的甲醇-水洗脱,洗脱液分别用甲醇重结晶,A流份获得瑞香新素1.84g、B流份获得7-羟基-8-甲氧基香豆素2.15g、C流份获得瑞香素5.47g。
实施例2:经试验验证,三种化合物在100 m g/mL时,对丙型肝炎病毒蛋白酶NS3/4A的抑制率分别为:瑞香新素69.9%、7-羟基-8-甲氧基香豆素72.5%、瑞香素79.5%,可用于制备治疗丙型肝炎的药物。
实施例3:取瑞香新素、瑞香素、7-羟基-8-甲氧基香豆素中的一种或两种以上,干燥,粉碎,加入适当的辅料,制成颗粒剂、胶囊剂、片剂、口服液、软胶囊剂、滴丸剂等药剂上可以接受的剂型。
实施例4:取瑞香新素、瑞香素、7-羟基-8-甲氧基香豆素中的一种或两种以上,干燥,粉碎,加入其它原料药复配,制成颗粒剂、胶囊剂、片剂、口服液、软胶囊剂、滴丸剂等药剂上可以接受的剂型。
Claims (5)
1.瑞香新素、瑞香素和7-羟基-8-甲氧基香豆素在制备丙型肝炎病毒NS3/4A蛋白酶抑制剂和治疗丙型肝炎药物中的应用。
2.从瑞香中提取、分离和纯化权利要求1所述三种香豆素类化合物的方法,其特征在于:取瑞香植物全株,粉碎,用乙醇加热回流提取,提取液浓缩成乙醇浸膏,用水分散,用乙酸乙酯萃取,浓缩得乙酸乙酯浸膏,经硅胶柱层析,以体积比为50:1的氯仿-甲醇梯度洗脱,在氯仿:甲醇的体积比为25:1的梯度获得A流份、氯仿:甲醇的体积比为10:1的梯度获得B流份、氯仿:甲醇的体积比为8:1的梯度获得C流份,三流份分别经ODS柱层析分离,A流份以体积比为6:4的甲醇-水洗脱、B流份以体积比为1:9的甲醇-水洗脱、C流份以体积比为1:9的甲醇-水洗脱,洗脱液分别用甲醇重结晶,A流份获得瑞香新素、B流份获得7-羟基-8-甲氧基香豆素、C流份获得瑞香素。
3.按照权利要求2所述从瑞香中提取、分离和纯化香豆素类化合物的方法,其特征在于:乙酸乙酯浸膏的提取方法为:取瑞香植物全株,粉碎,加5~10重量倍70~95%的乙醇加热回流提取2~4次,每次1~2小时,滤过,合并滤液,滤液减压浓缩至无醇味,用等体积的水分散,再用2倍体积量的乙酸乙酯萃取2~3次,浓缩得乙酸乙酯浸膏。
4.按照权利要求2所述从瑞香中提取、分离和纯化香豆素类化合物的方法,其特征在于:硅胶柱层析时的硅胶为200~300目,上柱硅胶为浸膏用量的50~150重量倍,ODS柱层析时反相硅胶为100-200目,上柱反相硅胶为浸膏用量的50~100倍。
5.按照权利要求2所述从瑞香中提取、分离和纯化香豆素类化合物的方法,其特征在于:所述瑞香是瑞香科瑞香属植物Daphne papyracea Wall. ex Steud. var. crassiuscula Rehd.的全株。
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