CN103014078B - 海洋多粘类芽孢杆菌l1-9发酵产物提取dehp的方法与用途 - Google Patents
海洋多粘类芽孢杆菌l1-9发酵产物提取dehp的方法与用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明是一种海洋多粘类芽孢杆菌L1-9发酵产物提取DEHP的方法，该方法以禾谷镰刀菌为指示菌，利用硅胶柱层析、SephadexLH-20柱层析、高效液相色谱（HPLC）等方法对多粘类芽孢杆菌L1-9菌株产生的抗菌活性组分进行了分离纯化，得到了1个抗真菌化合物B2，通过ESI-MS、1HNMR、13CNMR等波谱技术对其进行结构鉴定，确定B2为邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯（DEHP）。本发明方法从多粘类芽孢杆菌代谢产物中分离得到邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯，并且实验证明DEHP对禾谷镰刀菌具有明显的抑制作用。细菌具有生长周期短、易于在实验室大量培养、发酵产物物质更易提纯等优点，利于大规模发酵实现工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种从海洋菌发酵产物中提取有效成份的方法，特别是一种海洋多粘类芽孢杆菌L1-9发酵产物提取DEHP的方法，本发明还涉及前述DEHP的用途。
背景技术
多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）作为重要的植物病害生防细菌和植物根际促生菌在农业领域已得到广泛应用。多粘类芽孢杆菌能产生肽类、蛋白质类、核苷类、吡嗪类和酚类等多种抗菌物质，如多粘类芽孢杆菌VLB16所产生的蛋白能够抑制稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）和稻纹枯病菌（Rhizoctonia solani）的生长，其分子量为37KDa，并且能耐121℃的高温。Beatty等从多粘类芽孢杆菌PKB1菌株的细胞中分离到一簇分子量大小分别为883、897、948 和916 D的抗菌多肽，陈海英等从多粘类芽孢杆菌CP7代谢产物中分离到3种抗革兰氏阴性菌的小分子多肽，其中组分C1为多粘菌素E1，范磊等从多粘类芽孢杆菌HY96-2发酵液中分离到一个抗真菌活性化合物6B，经光谱学方法鉴定为Fusaricidin A，该化合物对西瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. niveum）、水稻纹枯病菌（Rhizoctonia solani）、灰霉病菌（Botrytis cinerea）等多种植物病原真菌均具有较好的抑制作用。
已有研究的多粘类芽孢杆菌主要分离自土壤，少数为植物内生菌，均为陆生环境，未见有关来自海洋的多粘类芽孢杆菌的研究报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种提取方法简便合理、可操作性强、产物纯度高的海洋多粘类芽孢杆菌L1-9发酵产物提取DEHP的方法。
本发明所要解决的另一技术问题是提供上述方法得到的DEHP的用途。
本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种海洋多粘类芽孢杆菌L1-9发酵产物提取DEHP的方法，其特点是，其步骤如下：
（1） L1-9菌株发酵液的制备：用发酵罐对L1-9菌株进行分批发酵，发酵条件为：种子液的菌龄24h、浓度为109个细胞/mL，接种量8%，温度28℃，pH 6.3，初始搅拌速度250r/min，通气量3L/min，发酵时间36h；得L1-9菌株发酵液；L1-9菌株发酵液经10000r/min离心后，以50μl/孔对禾谷镰刀菌进行抗菌活性检测，抑菌带宽度大于5mm的L1-9菌株发酵液进行初步提取；
（2）抗菌活性物质的初步提取：L1-9菌株发酵液用等体积乙酸乙酯萃取2次，静置12h后，合并有机相，减压浓缩后得到红褐色油状粗提物，以50μl/孔粗提物对禾谷镰刀菌进行抗菌活性检测，抑菌带宽度大于5mm的粗提物进行分离纯化；
（3）抗菌活性物质的分离纯化：
a. 硅胶柱层析：粗提物采用2.5×60cm硅胶柱进行初步分离，装柱体积为200mL，湿法上样，以体积比为100~80：0~20的二氯甲烷：甲醇为洗脱液进行梯度洗脱，每种比例洗脱液体积400mL，流速0.5mL/min，每管收集10mL，洗脱液通过薄层色谱法TLC分析，合并相同组分，洗脱液减压浓缩，以50μl/孔对禾谷镰刀菌进行抗菌活性检测，抑菌带宽度大于5mm的洗脱液进行Sephadex LH-20柱层析；
b．Sephadex LH-20柱层析：洗脱液用1.5×50cm的Sephadex LH-20柱进行层析分离，湿法上样，以体积比为3:2的二氯甲烷：甲醇为洗脱液进行等度洗脱，流速4 mL/h，每管收集2-3mL，洗脱液通过薄层色谱法TLC分析，采用体积比为5：1的石油醚-乙酸乙酯溶液或者98：2的二氯甲烷-甲醇溶液作展开剂，合并相同组分，洗脱液减压浓缩，以50μl/孔对禾谷镰刀菌进行抗菌活性检测，抑菌带宽度大于5mm的洗脱液经TLC检测有3个斑点，3个斑点迁移率分别为0.47、0.66、0.91，再采用制备薄层层析进一步分离纯化；
c.制备薄层层析：采用体积比为5：1的石油醚-乙酸乙酯溶液或者98：2的二氯甲烷-甲醇溶液作展开剂，得到迁移率分别为0.47、0.66、0.91的3个组分B1、B2、B3，3个组分分别以50μl/孔对禾谷镰刀菌进行抗菌活性检测，B1、B2的抑菌带宽度均大于5mm；
（4）高效液相色谱法检测纯度：分别取适量B1、B2溶于甲醇后，经0.22μm一次性针头过滤器过滤，利用分析型HPLC，以甲醇和水为流动相进行梯度洗脱，色谱条件为：以柱规格为6mm×250mm的YMC-Pack ODS-A分析柱，波长为254nm 的UV 检测器进行检测，进样量为20μL，以1 mL/min 的流速洗脱40 min，B1、B2的质量含量达为95%以上后进行结构鉴定；
（5）结构鉴定：采用质谱和核磁共振方法对B1、B2分别进行结构鉴定，确定B2为邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯，即DEHP。
本发明方法提取得到的DEHP具有对禾谷镰刀菌的抑菌用途。
本发明方法所涉及的生物材料“多粘类芽孢杆菌L1-9（ Paenibacillus polymyxa isolate L1-9）”菌株已于2008年9月30日在Genebank公开（登录号为FJ178378），网址为：
（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=nuccore&cmd=search&term=FJ178378）。该菌株为公知公用材料，在该专利申请日期起二十年内，公众如果需要，淮海工学院海洋学院实验室可对外提供。
本发明方法以禾谷镰刀菌（F. graminearum）为指示菌，利用硅胶柱层析、Sephadex LH-20柱层析、高效液相色谱（HPLC）等方法对多粘类芽孢杆菌L1-9产生的抗菌活性组分进行了分离纯化，得到了两个抗真菌化合物B1、B2，通过ESI-MS、1H NMR、13C NMR等波谱技术对其进行结构鉴定，确定B2为邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯（DEHP）。
以下对本发明方法进行具体的阐述。
1 材料与方法
1.1 菌种及培养基
多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）L1-9由淮海工学院海洋学院实验室从连云港海域潮间带海泥中分离获得并保存。供试病原真菌禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）由中国农科院植保所提供，淮海工学院海洋学院实验室保藏。
L1-9菌株菌种培养及保藏培养基为海水配制的PDA培养基；植物病原真菌活化及抑菌试验用培养基为淡水配制的PDA培养基；L1-9种子液和发酵培养基：豆饼粉1%，玉米粉1.5%，麦麸1%，大米粉0.5%，NaCl 3%，KH2PO4 0.07%，MgSO4 0.03%，CaCO3 0.1%，pH 6.5，海水配制。
1.2 仪器与试剂
分析型高效液相色谱仪为Waters 600 controller（美国waters）；分析型色谱柱为YMC-Pack ODS-A（北京慧德易科技有限公司）；柱层析硅胶（100~ 200目，青岛海洋化工）；Sephadex LH-20（美国Pharmacia公司）；薄层层析用分析板和制备板均为GF254型（安徽良臣硅源材料有限公司）；核磁共振仪为Avance-400型（瑞士布鲁克）；质谱仪为LCQ-Advantage液质联用（美国菲尼根质谱公司）；高效液相色谱和ESI-MS所用甲醇为色谱纯（国药集团化学试剂有限公司），其他试剂为化学纯或分析纯。
1.3 L1-9菌株发酵液的制备
参照文献的方法，利用50L发酵罐对L1-9菌株进行分批发酵，发酵条件为：接种量8%（菌龄24h、浓度为109个细胞/mL）、温度28℃、pH 6.3、初始搅拌速度250r/min、通气量3L/min、发酵时间36h。
1.4 抗菌活性物质的初步提取
获得的L1-9菌株发酵液90L经10000r/min离心，上清液用等体积乙酸乙酯萃取2次，静置12h后，合并有机相，减压浓缩后得到红褐色油状粗提物，置于-20℃冰箱保存，用于活性检测和分离纯化。
1.5 抗菌活性物质的分离纯化
1.5.1 硅胶柱层析
粗提物采用硅胶柱（2.5×60cm）进行初步分离，装柱体积为200mL，湿法上样，以二氯甲烷-甲醇（100:0~80:20，体积比（下同））为洗脱剂进行梯度洗脱，每种比例洗脱液体积400mL，流速约0.5mL/min，每管收集10mL，洗脱液通过薄层色谱法（TLC）分析，合并相同组分，减压浓缩后测定抑菌活性，获得的抑菌活性的组分置于-20℃保存备用。
1.5.2 Sephadex LH-20柱层析
硅胶柱层析后获得的抑菌活性组分，采用葡聚糖凝胶层析柱（1.5×50cm）进一步分离，所用色谱分离介质为Sephadex LH-20，湿法上样，以二氯甲烷-甲醇（3:2）为洗脱液进行等度洗脱，流速4 mL/h，每管收集2-3mL，洗脱液通过薄层色谱法（TLC）分析，合并相同组分，减压浓缩后测定抑菌活性，保存活性组分。
1.5.3 制备型薄层层析分离纯化
硅胶柱层析和Sephadex LH-20柱层析后获得的抑菌活性组分，经TLC检测斑点较少且各斑点的迁移率差别较大时，采用制备薄层层析进一步分离纯化，展开剂根据组分极性不同选用不同配比的石油醚-乙酸乙酯溶液或二氯甲烷-甲醇溶液，分离得到的不同组分进行抗菌活性测定，获得的抑菌活性组分置于-20℃保存备用。
1.6 抑菌活性测定
以禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）为指示菌，采用琼脂扩散法及牛津杯法，对分离纯化过程中各组分的进行抗菌活性测定。
1.7 抗菌活性组分的纯度检测
分离纯化过程中的各组分采用薄层层析法和高效液相色谱法进行纯度检测。
薄层层析法：硅胶板为GF254型，展开剂选用石油醚-乙酸乙酯(5:1)或二氯甲烷-甲醇（98:2），紫外灯254 nm、365nm 波长处显影和茴香醛染色观察。
高效液相色谱法：取少量样品溶于甲醇后，经0.22μm一次性针头过滤器过滤，利用分析型HPLC，以甲醇和水为流动相进行梯度洗脱。色谱条件为：YMC-Pack ODS-A分析柱（6mm×250mm），UV 检测器，检测波长为254nm，进样20μL，以1 mL/min 的流速洗脱40 min。
1.8 抗菌活性组分的结构鉴定
采用ESI-MS和核磁共振波谱技术，结合相关文献对其抑菌活性组分进行结构解析。
ESI-MS工作条件：采用MS 柱（2.6 mm×250 mm，2 μm）进行分析，HPLC条件中流动相和比例与1.7相同，检测波长为254 nm，流速为0.5 mL/min；电喷雾操作电压4.02kV，操作电流0.39μA，毛细管温度275℃，干燥气（N2）流速为19.92L/min。
核磁共振工作条件：样品用氘代氯仿（CDCl3）溶解，在Bruker Avance 400 MHz上进行扫描，测定氢谱和碳谱，测试温度为302.7K，氢谱碳谱均以四甲基硅烷（TMS）为内标，1H NMR谱测试谱宽为6009.615Hz，13C NMR谱测试谱宽22058.824 Hz。
2 结果与分析
2.1 抗菌物质粗提液的抑菌活性
取L1-9菌株抗菌物质的粗提液，以50μl/孔粗提液对禾谷镰刀病原菌的抗菌活性检测结果见图1，粗提液的抑菌带宽度约为19.5mm，而对照（发酵培养基的浓缩液）没有抑菌活性，表明菌株L1-9抗菌物质的粗提液对指示菌具有明显的抑菌活性。
2.2 抗菌活性物质的分离纯化
粗提液经硅胶柱吸附柱初步分离，共收集得到洗脱液180管，经TLC检测后合并相同组份，获得7种组分Ⅰ~Ⅶ，其中组分Ⅰ具有明显抑菌活性。将组分Ⅰ旋蒸浓缩后进行Sephadex LH-20柱层析分离，获得2种组分A和B，抗菌活性测定结果显示组分B具有明显的抑菌活性，抑菌带宽度约为15.5mm。组分B经TLC检测有3个斑点，且3个斑点迁移率分别为0.47、0.66、0.91相差较大，适宜用制备薄层层析继续分离纯化。活性组分B通过制备型薄层层析进一步分离，得到3个组分B1、B2、B3，结果见图2。抑菌活性测定结果表明B1、B2具有明显的抑菌活性，其中组份B1的抑菌带宽度为11.0mm，组份B2的抑菌带宽度为8.0mm。
B1、B2组分通过紫外荧光显影和茴香醛染色显示其斑点单一且清晰，说明得到了纯化，进一步采用HPLC检测其纯度，其中组分B1含量为95%，组分B2含量为97%，达到结构鉴定要求。
2.3 抗菌活性组分的结构鉴定
2.3.1 组分B2的结构鉴定结果
从图3可以看出， ESI-MS (positive) 图谱给出离子峰[M+Na]+= 414，提示该化合物的相对分子质量为390。
从图4可以看出，1H-NMR谱图中共显示38个氢信号，低场区氢信号δ 7.53-7.71，提示有邻二取代芳香环的存在；在高场区有包括：两组甲基氢信号δ 0.82-0.97；一组连氧亚甲基氢信号δ 4.23（4H，d，H-1′，1"）；四组亚甲基氢信号δ 1.47-1.26；一组次亚甲基氢信号δ 1.67(2H，m，H-2′，2")。
从图5可以看出，13C-NMR谱图共显示12根谱线，三个碳信号（δ 132.51，130.83，128.83）进一步验证了苯环的对称结构，此外，δ 167.70为羰基碳信号，δ13.99，10.99为甲基碳信号，δ 68.17为连氧亚甲基碳信号，δ 30.45，28.93，22.95，23.78为亚甲基碳信号，δ 38.78为次甲基碳信号。
结合ESI-MS、1H NMR、13C NMR谱图，确定组分B2分子式为C24H38O4，不饱和度为6，通过文献对比，确定该化合物的结构为邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯，其分子结构如下：
其1H-NMR和13C-NMR数据见下表。
组分B2的1H NMR、13C NMR数据表(400MHz，CDCl3)
| NO. | δC（ppm） | δH（ppm） |
| 1, 2 | 130.83 | |
| 3, 6 | 128.83 | 7.71(2H, dd) |
| 4, 5 | 132.51 | 7.53(2H, dd) |
| 7, 8 | 167.70 | |
| 1′, 1" | 68.17 | 4.23 (4H, d) |
| 2′, 2" | 38.78 | 1.67(2H, m) |
| 3′, 3" | 30.45 | 1.47-1.26(4H, m) |
| 4′, 4" | 28.93 | 1.47-1.26(4H, m) |
| 5′, 5" | 22.95 | 1.47-1.26(4H, m) |
| 6′, 6" | 13.99 | 0.82-0.97(6H, t) |
| 7′, 7" | 23.78 | 1.47-1.26(4H, m) |
| 8′, 8" | 10.99 | 0.82-0.97(6H, t) |
3 结论与讨论
本发明以禾谷镰刀菌（F. graminearum）为指示菌，用牛津杯法进行抗菌活性追踪，采用硅胶吸附柱层析、Sephadex LH-20柱层析、制备型薄层层析、HPLC等等系技术，对来自海洋的多粘类芽孢杆菌L1-9菌株发酵液的抑菌物质进行分离纯化，最终从乙酸乙酯萃取相中分离得到2个抗菌活性组分B1和B2。通过ESI-MS，NMR等波谱技术，查阅相关文献，确定组分B2的结构为邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯。
本发明从多粘类芽孢杆菌（P. polymyxa）代谢产物中分离到邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯，并且实验证明DEHP对禾谷镰刀菌（F. graminearum）具有明显的抑制作用。细菌具有生长周期短、易于在实验室大量培养、发酵产物物质更易提纯等优点，利于大规模发酵实现工业化生产，从细菌代谢产物中提取DEHP比植物和放线菌更具有优势。
附图说明
图1为 L1-9抗菌物质粗提物抑菌活性检测结果图，图中：a为乙酸乙酯萃取L1-9菌株发酵液的萃取相浓缩液；ck为发酵培养基的浓缩液；
图2 为组分B的制备薄层层析结果图；
图3为组份B2的ESI-MS (positive)谱图；
图4为组分B2的1H NMR谱图；
图5为组分B2的13C NMR谱图。
具体实施方式
以下进一步描述本发明的具体技术方案，以便于本领域的技术人员进一步地理解本发明，而不构成对其权利的限制。
实施例1，一种海洋多粘类芽孢杆菌L1-9发酵产物提取DEHP的方法，其步骤如下：
（1） L1-9菌株发酵液的制备：用发酵罐对L1-9菌株进行分批发酵，发酵条件为：种子液的菌龄24h、浓度为109个细胞/mL，接种量8%，温度28℃，pH 6.3，初始搅拌速度250r/min，通气量3L/min，发酵时间36h；得L1-9菌株发酵液；L1-9菌株发酵液经10000r/min离心后，以50μl/孔对禾谷镰刀菌进行抗菌活性检测，抑菌带宽度大于5mm的L1-9菌株发酵液进行初步提取；
（2）抗菌活性物质的初步提取：L1-9菌株发酵液用等体积乙酸乙酯萃取2次，静置12h后，合并有机相，减压浓缩后得到红褐色油状粗提物，以50μl/孔粗提物对禾谷镰刀菌进行抗菌活性检测，抑菌带宽度大于5mm的粗提物进行分离纯化；
（3）抗菌活性物质的分离纯化：
a. 硅胶柱层析：粗提物采用2.5×60cm硅胶柱进行初步分离，装柱体积为200mL，湿法上样，以体积比为100~80：0~20的二氯甲烷：甲醇为洗脱液进行梯度洗脱，每种比例洗脱液体积400mL，流速0.5mL/min，每管收集10mL，洗脱液通过薄层色谱法TLC分析，合并相同组分，洗脱液减压浓缩，以50μl/孔对禾谷镰刀菌进行抗菌活性检测，抑菌带宽度大于5mm的洗脱液进行Sephadex LH-20柱层析；
b．Sephadex LH-20柱层析：洗脱液用1.5×50cm的Sephadex LH-20柱进行层析分离，湿法上样，以体积比为3:2的二氯甲烷：甲醇为洗脱液进行等度洗脱，流速4 mL/h，每管收集2-3mL，洗脱液通过薄层色谱法TLC分析，采用体积比为5：1的石油醚-乙酸乙酯溶液或者98：2的二氯甲烷-甲醇溶液作展开剂，合并相同组分，洗脱液减压浓缩，以50μl/孔对禾谷镰刀菌进行抗菌活性检测，抑菌带宽度大于5mm的洗脱液经TLC检测有3个斑点，3个斑点迁移率分别为0.47、0.66、0.91，再采用制备薄层层析进一步分离纯化；
c.制备薄层层析：采用体积比为5：1的石油醚-乙酸乙酯溶液或者98：2的二氯甲烷-甲醇溶液作展开剂，得到迁移率分别为0.47、0.66、0.91的3个组分B1、B2、B3，3个组分分别以50μl/孔对禾谷镰刀菌进行抗菌活性检测，B1、B2的抑菌带宽度均大于5mm；
（4）高效液相色谱法检测纯度：分别取适量B1、B2溶于甲醇后，经0.22μm一次性针头过滤器过滤，利用分析型HPLC，以甲醇和水为流动相进行梯度洗脱，色谱条件为：以柱规格为6mm×250mm的YMC-Pack ODS-A分析柱，波长为254nm 的UV 检测器进行检测，进样量为20μL，以1 mL/min 的流速洗脱40 min，B1、B2的质量含量达为95%以上后进行结构鉴定；
（5）结构鉴定：采用质谱和核磁共振方法对B1、B2分别进行结构鉴定，确定B2为邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯，即DEHP。
以上所述的一种海洋多粘类芽孢杆菌L1-9发酵产物提取DEHP的方法所提取得到的DEHP对禾谷镰刀菌具有抑菌作用。
Claims (2)
1.一种海洋多粘类芽孢杆菌L1-9发酵产物提取DEHP的方法，其特征在于，其步骤如下：
(1)L1-9菌株发酵液的制备：用发酵罐对L1-9菌株进行分批发酵，发酵条件为：种子液的菌龄24h、浓度为109个细胞/mL，接种量8％，温度28℃，pH6.3，初始搅拌速度250r/min，通气量3L/min，发酵时间36h；得L1-9菌株发酵液；L1-9菌株发酵液经10000r/min离心后，以50μl/孔对禾谷镰刀菌进行抗菌活性检测，抑菌带宽度大于5mm的L1-9菌株发酵液进行初步提取；
(2)抗菌活性物质的初步提取：L1-9菌株发酵液用等体积乙酸乙酯萃取2次，静置12h后，合并有机相，减压浓缩后得到红褐色油状粗提物，以50μl/孔粗提物对禾谷镰刀菌进行抗菌活性检测，抑菌带宽度大于5mm的粗提物进行分离纯化；
(3)抗菌活性物质的分离纯化：
a.硅胶柱层析：粗提物采用2.5×60cm硅胶柱进行初步分离，装柱体积为200mL，湿法上样，以体积比为100～80：0～20的二氯甲烷：甲醇为洗脱液进行梯度洗脱，每种比例洗脱液体积400mL，流速0.5mL/min，每管收集10mL，洗脱液通过薄层色谱法TLC分析，合并相同组分，洗脱液减压浓缩，以50μl/孔对禾谷镰刀菌进行抗菌活性检测，抑菌带宽度大于5mm的洗脱液进行Sephadex LH-20柱层析；
b.Sephadex LH-20柱层析：洗脱液用1.5×50cm的Sephadex LH-20柱进行层析分离，湿法上样，以体积比为3:2的二氯甲烷：甲醇为洗脱液进行等度洗脱，流速4mL/h，每管收集2-3mL，洗脱液通过薄层色谱法TLC分析，采用体积比为5：1的石油醚-乙酸乙酯溶液或者98：2的二氯甲烷-甲醇溶液作展开剂，合并相同组分，洗脱液减压浓缩，以50μl/孔对禾谷镰刀菌进行抗菌活性检测，抑菌带宽度大于5mm的洗脱液经TLC检测有3个斑点，3个斑点迁移率分别为0.47、0.66、0.91，再采用制备薄层层析进一步分离纯化；
c.制备薄层层析：采用体积比为5：1的石油醚-乙酸乙酯溶液或者98：2的二氯甲烷-甲醇溶液作展开剂，得到迁移率分别为0.47、0.66、0.91的3个组分B1、B2、B3，3个组分分别
以50μl/孔对禾谷镰刀菌进行抗菌活性检测，B1、B2的抑菌带宽度均大于5mm；
(4)高效液相色谱法检测纯度：分别取适量B1、B2溶于甲醇后，经0.22μm一次性针头过滤器过滤，利用分析型HPLC，以甲醇和水为流动相进行梯度洗脱，色谱条件为：以柱规格为6mm×250mm的YMC-Pack ODS-A分析柱，波长为254nm的UV检测器进行检测，进样量为20μL，以1mL/min的流速洗脱40min，B1、B2的质量含量达95％以上后进行结构鉴定；
(5)结构鉴定：采用质谱和核磁共振方法对B1、B2分别进行结构鉴定，确定B2为邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯，即DEHP。
2.权利要求1所述的一种海洋多粘类芽孢杆菌L1-9发酵产物提取DEHP的方法所提取得到的DEHP用于制备抑制禾谷镰刀菌的药物的用途。
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