CN103012639B - 一种端基为荧光基团芘的水溶性阳离子聚电解质及其制备方法及应用 - Google Patents

一种端基为荧光基团芘的水溶性阳离子聚电解质及其制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种荧光高分子聚合物及其制备方法，尤其涉及一种端基为荧光基团芘的水溶性阳离子聚电解质及制备方法，并应用于检测核酸分子碱基序列。这种端基为荧光基团芘的水溶性阳离子聚电解质和单链寡聚核酸分子（发夹结构DNA和直链结构DNA）之间的静电吸附和疏水作用使其形成一个新型复链荧光探针。当遇到与之碱基序列结构互补的核酸分子时，通过Watson-Crick碱基配对原则杂化，由于端基荧光基团芘插入DNA双螺旋结构中，使得碱基对芘荧光的淬灭能力增强，导致其荧光强度相比于与非靶向核酸分子作用显著降低；从而通过芘荧光聚电解质的荧光性能差异实现对核酸分子碱基序列结构的特异性识别。

Description

一种端基为荧光基团芘的水溶性阳离子聚电解质及其制备方法及应用
技术领域
本发明涉及一种荧光高分子聚合物及其制备方法，尤其涉及一种端基为荧光基团芘的水溶性阳离子聚电解质及制备方法，并通过与DNA相互作用后的荧光性能变化实现对核酸分子碱基序列结构的高效、稳定、特异性识别，属于功能高分子，材料及荧光传感等技术领域。
背景技术
核酸分子碱基序列的定量分析和特异识别对生物医学领域的发展具有重要意义。核酸的检测方法多种多样，其中，荧光检测系统因其选择性好、灵敏度高而被广泛应用。特别是荧光高分子在检测生物大分子方面的研究已引起国内外科学工作者的密切关注。芘由于能通过多种方式进行化学修饰，荧光量子产率较高以及其荧光强度受环境因素如溶剂，核酸碱基等影响较大而被广泛应用到核酸检测中。荧光基团芘以共价键连接的核酸分子探针由于其在与碱基序列互补的核酸分子杂化形成复链后荧光性能发生改变而被用于荧光探针特异性识别核酸分子。同时它也能克服一些小分子荧光染料如吖啶、菲啶类染料和菁类染料对核酸分子的序列不能特异识别的不足。比利时鲁汶大学研究人员设计合成了一类新型荧光探针,芘修饰的以HNA、RNA和DNA为骨架的寡核苷酸荧光探针，探针分子与靶向分子杂化后，芘的单体态荧光(380nm)大大增强而激基复合物荧光(480nm)消失(ChemBioChem.2009,10,1175-1185)。美国Hrdlicka教授等研发的芘修饰的寡核苷酸荧光探针，可通过杂化诱导荧光增强和特异性鸟苷酸荧光淬灭机制有效地来识别单核苷酸多态性(Chem.Commun.2010,46,4929-4931)。日本Yamana等合成了一种芘修饰的RNA和DNA荧光探针，发现RNA探针在与靶向RNA杂化后荧光大大增强，而DNA荧光探针在与靶向DNA杂化后荧光并未有明显的变化(NucleicAcidsRes.2005,33,5887-5895)。还有一类发夹式荧光探针，其分子具有发夹结构，荧光功能基团A和B位于探针分子的两端，即发夹结构分子的茎部。美国佛罗里达大学的Tan等对发夹式分子信标检测DNA/RNA核酸分子进行了广泛深入研究。但是这些标记型荧光探针需要将荧光基团通过共价键连结到寡聚核酸分子链上以实现特异性识别核酸分子，其中的合成与操作较繁杂，花费较高。
近年来，共轭聚电解质作为荧光探针检测蛋白质、核酸等生物大分子的研究倍受青睐。这种共轭聚电解质可与生物大分子形成静电组装体，通过荧光共振能量转移或电子转移等机制使其荧光性能改变，进而对生物大分子进行检测。加州大学的Bazan教授，中国科学院化学研究所，中国科学院长春应用化学研究所的研究人员对共轭聚电解质荧光检测生物大分子进行了深入研究，取得了重要科研成果。Bazan等利用碱基序列互补的DNA核酸分子与固定在基片上的电中性肽核酸靶向杂化形成复链，阳离子共轭聚电解质通过静电吸附连结到核酸复链，从而使基片显示共轭聚电解质的荧光(Chem.Commun.2004,2508-2509)。这种技术为无标记荧光探针特异性识别核酸分子开辟了新的研究方向。但这项技术的制备较复杂，且被固定的肽核酸是单分子膜，会限制杂化复链吸附荧光聚电解质的数量，从而使检测的荧光强度受限。
发明内容
本发明的目的在于提供一种端基为荧光基团芘的水溶性阳离子聚电解质，其结构通式如下：
CH3；R2＝CH3,CH2CH3,CH2CH2CH3,CH2CH2CH2CH3；X1＝Cl,I,Br；X2＝I,Br。
本发明的另一个目的是提供所述的端基为荧光基团芘的水溶性阳离子聚电解质的制备方法，通过以下步骤实现：
(1)合成原子转移自由基聚合引发剂的溴代反应：
将芘甲醇溶于干燥THF和三乙胺，并置于反应容器中，冰水浴中冷却到0-5摄氏度。逐滴加入1-2当量的2-溴-异丁酰溴和四氢呋喃的混合溶液，在室温下回流反应8个小时。反应完成后，两次抽滤掉不溶物溴胺盐，旋蒸除去大部分的四氢呋喃溶剂。剩余物质用二氯甲烷稀释，并用饱和碳酸钾溶液萃取，有机相通过无水硫酸镁干燥过滤后旋蒸得到粗产物，用无水甲醇重结晶，真空干燥得淡黄色固体。
(2)采用原子转移自由基聚合制备端基为荧光基团芘的聚(甲基)丙烯酸二甲氨乙酯：
将步骤(1)中得到的原子转移自由基聚合引发剂置于四氢呋喃溶剂中；再加入催化剂,配位剂，聚合单体，在70摄氏度下进行原子转移自由基聚合1.5小时，用中性氧化铝柱层析提纯，旋蒸除去溶剂，并用冷正己烷沉淀，真空干燥得白色固体。
(3)端基为荧光基团芘的聚(甲基)丙烯酸二甲氨乙酯的季铵盐反应：
将步骤(2)中得到的端基为芘荧光基团的聚(甲基)丙烯酸二甲氨乙酯置于乙醇溶剂中，逐滴加入6当量的季胺化小分子，在85摄氏度下回流反应24个小时。用四氢呋喃沉淀出产物，并索氏提取12个小时，(四氢呋喃作提取剂)，真空干燥得白色固体。
本发明所述的端基为芘荧光基团的新型水溶性阳离子聚电解质的制备所用的催化剂为氯化亚铜、溴化亚铜或是碘化亚铜；所用的配位剂为1,1,4,7,10,10-六甲基三亚乙基四胺或是N,N,N,N,N-五甲基二亚乙基三胺；所用的季胺化小分子为卤代烷烃，如溴代丁烷，碘甲烷等。
本发明所述的端基为芘荧光基团的新型水溶性荧光聚电解质的制备所用的聚合单体为丙烯酸二甲氨基乙脂、甲基丙烯酸二甲氨基乙酯或它们的任意混合物，该类聚合单体兼具有胺基和可聚合的乙烯基，并且有较好的水溶性和生物相容性。
本发明所述的端基为芘荧光基团的新型水溶性荧光聚电解质的制备是聚合物的端基上引入了荧光基团，侧链上引入了亲水性的胺基基团，使合成的聚电解质具有荧光性和水溶性，使得这种荧光聚电解质在荧光生化传感等领域得到很好的应用。
本发明的再一个目的就是提供所述的端基为荧光基团芘的水溶性阳离子聚电解质作为一种聚电解质荧光探针在核酸分子碱基序列结构特异性识别中的应用。
当这种新型的聚电解质荧光探针，即端基为荧光基团芘的水溶性阳离子聚电解质与单链寡聚核酸分子(发夹结构和直链结构)通过静电吸附和疏水作用形成的新型复链荧光探针，遇到与之碱基序列结构互补的核酸分子时，通过Watson-Crick碱基配对原则杂化，由于端基荧光基团芘插入DNA双螺旋结构中，使得碱基对芘荧光的淬灭能力增强，导致其荧光强度显著降低；而与非靶向核酸分子相互作用后，其荧光强度则没有明显的降低，从而通过芘荧光聚电解质的荧光性能差异实现对核酸分子碱基序列结构的高效、稳定、特异性识别。圆二色谱和碘离子淬灭芘荧光实验也证实了这种芘荧光基团嵌插的作用机理。所述的聚电解质用于核酸分子碱基序列结构特异性识别中的步骤如下：
(1)用磷酸盐缓冲溶液将端基为荧光基团芘的水溶性阳离子聚电解质配置成10-4mol/L的稀溶液。
(2)将冷冻储存的不同种类的DNA引物离心后溶解在适量磷酸盐缓冲溶液配置成DNA稀溶液。所述的DNA引物种类及碱基序列如下：
DNA1—发夹结构DNA(GCA CAA ACA AGT AGA ATG TAT GTG C)；
DNA2—与DNA1互补的直链DNA(GCA CAT ACA TTC TAC TTG)；
DNA3—与DNA2互补的直链DNA(GCA CAT ACA TTC TAC TTG)；
DNAa—碱基全是A的直链DNA(AAA AAA AAA AAA AAA AAA)；
DNAc—碱基全是C的直链DNA(CCC CCC CCC CCC CCC CCC)；
DNAt—碱基全是T的直链DNA(TTT TTT TTT TTT TTT TTT)；
(3)取适量聚电解质溶液、适量不同类型的DNA引物溶液和磷酸盐缓冲液混配成样品溶液。所述的样品溶液可分为两个系列：
系列a：(聚电解质和发夹结构DNA)聚电解质、聚电解质+DNA1、聚电解质+DNA1+DNA2、聚电解质+DNA1+DNAa、聚电解质+DNA1+DNAc和聚电解质+DNA1+DNAt样品溶液；
系列b：(聚电解质和直链结构DNA)聚电解质、聚电解质+DNA2、聚电解质+DNA2+DNA3、聚电解质+DNA2+DNAa、聚电解质+DNA2+DNAc和聚电解质+DNA2+DNAt样品溶液；
(4)对样品溶液进行加热处理：80摄氏度下加热10分钟后自然冷却到室温，测定样品溶液的荧光发射光谱。根据荧光强度变化来识别靶向DNA的碱基序列。其中所用到的狭缝宽度是2.5nm，激发波长是344nm。
(5)将DNA1和DNA2互补的DNA双链溶液1、DNA2和DNA3互补的DNA双链溶液2和聚电解质分别与DNA1和DNA2互补的DNA双链及DNA2和DNA3互补的DNA双链混配得到混合溶液3和4进行如步骤(4)所属的加热处理，然后测定4种溶液的圆二色谱。
(6)向步骤(3)混配得到的系列a和系列b样品溶液中分别加入适量碘化钾溶液，并在波长为344nm的光激发下，测得各混合溶液的荧光发射光谱，得到不同样品溶液的荧光淬灭效率。
本发明所述的聚电解质对核酸分子碱基序列的特异性识别的作用机理如图1所示。
本发明将荧光基团芘通过溴化作用引入引发剂，通过原子转移自由基聚合(甲基)丙烯酸二甲胺基乙酯，并将其季胺化生成最终的端基为芘的水溶性阳离子聚电解质。这种聚电解质不但具有较好的亲水性和生物相容性，还因端基所含的荧光基团，而用于核酸分子碱基序列特异性识别中。本发明的发明点在于所设计的芘聚电解质复链荧光探针与标记型荧光探针及共轭聚电解质结合肽核酸的荧光探针相比，制备简单、结构及性能可控，在特异性识别核酸分子碱基序列结构方面开辟一种新的荧光传感方法。
附图说明
图1为本发明所述的聚电解质对核酸分子碱基序列的特异性识别的作用机理图。
图2为制得的原子转移自由基聚合引发剂的差示扫描量热图谱。
图3为制得的原子转移自由基聚合引发剂的氢谱核磁图谱。
图4为制得的端基芘的聚甲基丙烯酸二甲氨乙酯的氢谱核磁图谱。
图5为制得的端基芘的聚甲基丙烯酸二甲氨乙酯的凝胶渗透色谱。
图6为制得的最终产物，所得到的季胺盐的氢谱核磁图谱。
图7为制得的聚电解质(10-6mol/L)与发夹结构DNA系列(10-6mol/L)(系列a)混配的样品溶液的荧光发射图谱。
图8为制得的聚电解质(5×10-7mol/L)与直链结构DNA系列(10-6mol/L)(系列b)混配的样品溶液的荧光发射图谱。
图9为制得的聚电解质(5×10-7mol/L)与直链结构DNA系列(10-7mol/L)(系列b)混配的样品溶液的荧光发射图谱。
图10为DNA1：DNA2互补双链DNA(10-6mol/L)溶液和制得的聚电解质(5×10-5mol/L)与DNA1：DNA2互补双链DNA混合溶液的圆二色谱。
图11为DNA2：DNA3互补双链DNA(10-6mol/L)溶液和制得的聚电解质(5×10-5mol/L)与DNA2：DNA3互补双链DNA混合溶液的圆二色谱。
图12为碘化钾对制得的聚电解质(10-6mol/L)与发夹结构DNA系列(10-6mol/L)(系列a)混配的样品溶液的荧光淬灭的线形图。
图13为碘化钾对制得的聚电解质(5×10-7mol/L)与直链结构DNA系列(10-6mol/L)(系列b)混配的样品溶液的荧光淬灭的线形图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明做进一步阐述，而不是要以此对本发明进行限制。
实施例1：
(1)所用的原子转移自由基聚合引发剂是由芘甲醇和2-溴-异丁酰溴合成，其合成路线如下式所示：
引发剂具体合成方法如下：称取0.500g(0.0021mmol)芘甲醇，5ml干燥的四氢呋喃，0.5ml(0.0038mmol)三乙胺于50ml的圆底烧瓶中，加入磁子，置于冰水浴中。量取2ml的四氢呋喃,0.5ml(0.0039mmol)2-溴-异丁酰溴于滴液漏斗中,将其缓慢滴加入圆底烧瓶中；并在室温下搅拌10小时。反应结束后，抽滤掉不溶物溴胺盐，将大部分的四氢呋喃溶液旋蒸去除。剩余的物质用二氯甲烷稀释，此时溶液呈淡黄色。用饱和碳酸钾溶液150ml分三次进行萃取，分离出有机相；加无水硫酸镁搅拌30分钟,静置10小时,常压过滤出固体硫酸镁。在32摄氏度下旋蒸直至液体呈粉末状。用无水甲醇重结晶，过滤，真空干燥24小时，得到含芘的引发剂，产率约为42％，所制得的引发剂的熔点是95摄氏度。1HNMR(400MHz，CDCl3)：8.3-8.0(m，9H),5.9(s，2H)，1.9(s，6H)。
(2)由于购买的用于聚合的单体甲基丙烯酸二甲氨基乙酯中含有阻剂，不可直接使用，需经过减压蒸馏得到不含阻聚剂的单体。取可聚合单体70g加入到250ml圆底烧瓶中，再加入0,7g阻聚剂4-甲氧基酚，聚合单体与阻聚剂的摩尔比为100:1，减压蒸馏收集到约62g纯净的聚合单体甲基丙烯酸二甲氨基乙酯。
通过原子转移自由基聚合甲基丙烯酸二甲氨基乙酯，其合成路线如下式所示：
具体合成方法如下：将希莱克瓶充满高纯氮气。量取1,1,4,7,10,10-六甲基三亚乙基四胺76ul(0.237mmol)于希莱克瓶中，继续通氮气。称取0.024g(0.237mmol)的氯化亚铜立即加入瓶中，盖紧盖子，超声1分钟后继续通氮气。在氮气氛围下，顺序加入甲基丙烯酸二甲氨乙酯3ml(23.7mmol)，2.5毫升干燥四氢呋喃，引发剂68mg(0.178mmol)。密闭容器，与真空泵相连。用液氮冷却希莱克瓶3分钟至液体完全冷冻，抽真空10分钟，从液氮中移除，升温直至完全融化，观察有无气泡冒出；重复用液氮冷却—抽真空—升温过程5-10次，直至无气泡冒出；在70摄氏度条件下密闭反应1.5小时；用中性氧化铝装柱，将反应得到的溶液以二氯甲烷为淋洗剂过柱。以二氯甲烷为展开剂点板，直至没有产物点，板为纯白。将收集到的所有溶液减压旋蒸至淡黄色油状，用冷正己烷两次沉淀，将上层清液倒出，下层沉淀取出，于60摄氏度干燥24小时，得到白色产物，产率约为19％，所做的凝胶渗透色谱显示聚合物的分子量是22313。1HNMR(400MHz,CDCl3)：4.1(t，2H)，2.6(t，2H)，2.3(s，6H),，2.1-1.6(br，2H)，1.3-0.7(br，3H)。
(3)将步骤(2)得到的端基为芘的聚甲基丙烯酸二甲氨基乙酯进行季胺盐化反应，其合成路线如下式所示：
具体合成方法如下：称取157mg(1mmol)的端基为芘的聚甲基丙烯酸二甲氨基乙酯于25ml的烧瓶中，并加入4.5ml乙醇溶解。向烧杯中缓慢滴加647ul(6mmol)正溴丁烷，85摄氏度回流反应24小时。反应结束后，用40ml四氢呋喃沉淀出产物，安装索氏提取器装置，四氢呋喃作溶剂，提取12小时，真空45摄氏度下干燥24小时得到乳白色固体产物，产率约为80％。1HNMR(400MHz，D2O)：3.32(t，2H)，2.9-3.2(br，8H),2.7-2.9(br，2H)，1.67-1.70(br，4H)，1.1-1.4(br，2H)，0.6-1.0(br，6H)。
实施例2：端基为荧光基团芘的水溶性阳离子聚电解质作为一种聚电解质荧光探针在核酸分子碱基序列结构特异性识别中的应用。
(1)用磷酸盐缓冲溶液将端基为荧光基团芘的水溶性阳离子聚电解质配置成10-4mol/L的稀溶液。
(2)将冷冻储存的不同种类的DNA引物离心后溶解在适量磷酸盐缓冲溶液配置成DNA稀溶液。所述的DNA引物种类及碱基序列如下：
DNA1—发夹结构DNA(GCA CAA ACA AGT AGA ATG TAT GTG C)；
DNA2—与DNA1互补的直链DNA(GCA CAT ACA TTC TAC TTG)；
DNA3—与DNA2互补的直链DNA(GCA CAT ACA TTC TAC TTG)；
DNAa—碱基全是A的直链DNA(AAA AAA AAA AAA AAA AAA)；
DNAc—碱基全是C的直链DNA(CCC CCC CCC CCC CCC CCC)；
DNAt—碱基全是T的直链DNA(TTT TTT TTT TTT TTT TTT)；
(3)取适量聚电解质溶液、适量不同类型的DNA引物溶液和磷酸盐缓冲液混配成样品溶液。所述的样品溶液可分为两个系列：
系列a：(聚电解质和发夹结构DNA)聚电解质、聚电解质+DNA1、聚电解质+DNA1+DNA2、聚电解质+DNA1+DNAa、聚电解质+DNA1+DNAc和聚电解质+DNA1+DNAt样品溶液；
系列b：(聚电解质和直链结构DNA)聚电解质、聚电解质+DNA2、聚电解质+DNA2+DNA3、聚电解质+DNA2+DNAa、聚电解质+DNA2+DNAc和聚电解质+DNA2+DNAt样品溶液；
(4)对样品溶液进行加热处理：80摄氏度下加热10分钟后自然冷却到室温，测定样品溶液的荧光发射光谱。根据荧光强度变化来识别靶向DNA的碱基序列。其中所用到的狭缝宽度是2.5nm，激发波长是344nm。参见附图6，附图7和附图8，可看出向聚电解质纯溶液中加入DNA1(DNA2)时，由于碱基对芘荧光的淬灭作用，芘荧光强度降低，当再加入与之碱基序列互补的DNA2(DNA3)时，芘荧光强度由于端基荧光基团芘插入DNA双螺旋结构中，使得碱基对芘荧光的淬灭能力增强，导致其荧光强度相比于加入碱基序列不互补的DNAa(DNAc、DNAt)时显著降低，从而实现对核酸分子碱基序列的特异性识别。
(5)将DNA1和DNA2互补的双链DNA溶液1、DNA2和DNA3互补的双链DNA溶液2和所述的聚电解质分别与DNA1和DNA2互补的双链DNA及DNA2和DNA3互补的双链DNA混配得到混合溶液3和4进行如步骤(4)所属的加热处理，然后测定4种溶液的圆二色谱。参见附图9和附图10，可看出向互补的DNA双链溶液中加入所述的聚电解质后，DNA的圆二色谱的正负峰强度均明显减少，表明聚电解质与双链DNA发生嵌插作用,使得DNA碱基的堆积和双螺旋结构变得松散，但没有解链。
(6)向步骤(3)混配得到的系列a和系列b样品溶液中分别加入适量碘化钾溶液，并在波长为344nm的光激发下，测得各混合溶液的荧光发射光谱，得到不同样品溶液的荧光淬灭效率。参见附图11和附图12，它们是碘化钾对所述的聚电解质在缓冲溶液中的荧光淬灭实验的线形图，图中I0/I为体系的起始荧光强度(I0)与加入淬灭剂碘化钾后的荧光强度(I)的比值。从图中可看出，当向聚电解质+DNA1(DNA2)中加入碱基序列互补的DNA2(DNA3)时，直线斜率最小，说明由于荧光基团芘嵌插到DNA双螺旋结构中，使得DNA对其起到了保护作用，因而碘化钾对芘荧光的淬灭程度最小。

Claims (6)

1.一种端基为荧光基团芘的水溶性阳离子聚电解质的制备方法，所述的方法步骤包括：
(1)合成原子转移自由基聚合引发剂的溴代反应：
将芘甲醇溶于干燥THF和三乙胺，并置于反应容器中，冰水浴中冷却到0-5摄氏度；逐滴加入1-2当量的2-溴-异丁酰溴和四氢呋喃的混合溶液，在室温下回流反应8个小时；反应完成后，两次抽滤掉不溶物溴胺盐，旋蒸除去大部分的四氢呋喃溶剂，剩余物质用二氯甲烷稀释，并用饱和碳酸钾溶液萃取，有机相通过无水硫酸镁干燥过滤后旋蒸得到粗产物，用无水甲醇重结晶，真空干燥得淡黄色固体；
(2)采用原子转移自由基聚合制备端基为荧光基团芘的聚(甲基)丙烯酸二甲氨乙酯：
将步骤(1)中得到的原子转移自由基聚合引发剂置于四氢呋喃溶剂中；再加入催化剂,配位剂，聚合单体，在70摄氏度下进行原子转移自由基聚合1.5小时，用中性氧化铝柱层析提纯，旋蒸除去溶剂，并用冷正己烷沉淀，真空干燥得白色固体；
(3)端基为荧光基团芘的聚(甲基)丙烯酸二甲氨乙酯的季铵盐反应：
将步骤(2)中得到的端基为荧光基团芘的聚(甲基)丙烯酸二甲氨乙酯置于乙醇溶剂中，逐滴加入6当量的季胺化小分子，在85摄氏度下回流反应24个小时；用四氢呋喃沉淀出产物，并索氏提取12个小时，四氢呋喃作提取剂，真空干燥得白色固体。
2.按照权利要求1所述端基为荧光基团芘的新型水溶性阳离子聚电解质的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中，所用的聚合单体为丙烯酸二甲氨基乙脂、甲基丙烯酸二甲氨基乙酯或它们的任意混合物。
3.按照权利要求1所述端基为荧光基团芘的新型水溶性阳离子聚电解质的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中，聚合所用的催化剂为氯化亚铜、溴化亚铜或是碘化亚铜；所用的配位剂为1,1,4,7,10,10-六甲基三亚乙基四胺或是N,N,N,N,N-五甲基二亚乙基三胺。
4.按照权利要求1所述端基为荧光基团芘的新型水溶性阳离子聚电解质的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中，所用的季铵化小分子为卤代烷烃。
5.根据权利要求1所述方法制备的一种端基为荧光基团芘的水溶性阳离子聚电解质，其结构通式如下：
其中n代表聚电解质的重复单元数，为1～500之间的整数，R1＝H，CH3；R2＝CH3,CH2CH3,CH2CH2CH3,CH2CH2CH2CH3；X1＝Cl,I,Br；X2＝I,Br。
6.利用权利要求5所述的端基为荧光基团芘的新型水溶性阳离子聚电解质的特异性识别核酸分子碱基序列结构的应用方法，所述方法步骤如下：
(1)用磷酸盐缓冲溶液将端基为荧光基团芘的水溶性阳离子聚电解质配置成10-4mol/L的稀溶液；
(2)将冷冻储存的不同种类的DNA引物离心后溶解在适量磷酸盐缓冲溶液配置成DNA稀溶液，所述的DNA引物种类及碱基序列如下：
DNA1—发夹结构DNA(GCA CAA ACA AGT AGA ATG TAT GTG C)；
DNA2—与DNA1部分互补的直链DNA(GCA CAT ACA TTC TAC TTG)；
DNA3—与DNA2互补的直链DNA(CAA GTA GAA TGT ATG TGC)；
DNAa—碱基全是A的直链DNA(AAA AAA AAA AAA AAA AAA)；
DNAc—碱基全是C的直链DNA(CCC CCC CCC CCC CCC CCC)；
DNAt—碱基全是T的直链DNA(TTT TTT TTT TTT TTT TTT)；
(3)取适量聚电解质溶液、适量不同类型的DNA引物溶液和磷酸盐缓冲液混配成样品溶液。所述的样品溶液可分为两个系列：
系列a：(聚电解质和发夹结构DNA)聚电解质、聚电解质+DNA1、聚电解质+DNA1+DNA2、聚电解质+DNA1+DNAa、聚电解质+DNA1+DNAc和聚电解质+DNA1+DNAt样品溶液；
系列b：(聚电解质和直链结构DNA)聚电解质、聚电解质+DNA2、聚电解质+DNA2+DNA3、聚电解质+DNA2+DNAa、聚电解质+DNA2+DNAc和聚电解质+DNA2+DNAt样品溶液；
(4)对样品溶液进行加热处理：80摄氏度下加热10分钟后自然冷却到室温，测定样品溶液的荧光发射光谱，根据荧光强度变化来识别靶向DNA的碱基序列，其中所用到的狭缝宽度是2.5nm，激发波长是344nm；
(5)将DNA1和DNA2互补的DNA双链溶液1、DNA2和DNA3互补的DNA双链溶液2和聚电解质分别与DNA1和DNA2互补的DNA双链及DNA2和DNA3互补的DNA双链混配得到混合溶液3和4进行如步骤(4)所属的加热处理，然后测定4种溶液的圆二色谱；
(6)向步骤(3)混配得到的系列a和系列b样品溶液中分别加入适量碘化钾溶液，并在波长为344nm的光激发下，测得各混合溶液的荧光发射光谱，得到不同样品溶液的荧光淬灭效率。
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