CN103012610A

CN103012610A - 羧甲基化阴沟肠杆菌多糖及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN103012610A
Application number: CN2012105226819A
Authority: CN
Inventors: 汪以真; 黄明; 王友明; 路则庆; 靳明亮
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2012-12-04
Filing date: 2012-12-04
Publication date: 2013-04-03
Anticipated expiration: 2032-12-04
Also published as: CN103012610B

Abstract

本发明公开了一种羧甲基化阴沟肠杆菌胞外多糖的制备方法，包括如下步骤：1）将阴沟肠杆菌胞外多糖溶于异丙醇中，滴加NaOH水溶液，继续搅拌0.8～1.2h后，加入1.8～2.2g氯乙酸，然后于50℃～70℃恒温水浴中反应2～4h；2）将步骤1）所得的反应体系经调节pH、沉淀、透析、冷冻干燥；得到羧甲基化多糖。该羧甲基化阴沟肠杆菌胞外多糖取代度为0.68-0.86，该多糖的红外光谱中在1602cm^-1和1426cm^-1处出现了COO-的对称和非对称伸缩振动特征吸收峰。其能作为抗氧化剂。

Description

羧甲基化阴沟肠杆菌多糖及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于胞外多糖改性技术领域，具体涉及一种羧甲基化阴沟肠杆菌及其制备方法和它的应用。

背景技术

多糖（Polysaccharide）又称多聚糖，是一类由醛糖或酮糖通过糖苷键连接而成的天然高分子多聚物，广泛存在于动物、植物和微生物组织中，是天然界含量最丰富的生物多聚物（徐述明，2006）。活性多糖具有促进动物生长、提高畜禽免疫力和抗病毒、抗氧化等功效，同时具有毒副作用小、无残留、不易产生耐药性等优点。因此，在畜牧业生产中，将生物活性多糖开发为绿色环保的饲料添加剂以替代抗生素的使用，对确保畜产品的安全和畜牧业的可持续发展都具有重要的意义。

多糖的分子修饰是通过物理、化学及生物学等手段对其分子进行结构改造，以获得其它结构类型衍生物的方法。分子修饰可以通过改变多糖的空间结构、分子量及取代基种类、位置和数目等增强天然多糖的生物学活性或使多糖产生新的活性，有利于多糖类生物制剂在动物生产中的的开发与应用。常见的多糖分子修饰的方法有物理修饰法（如超声波降解、γ射线降解等）、化学修饰法（如硫酸酯化、羧甲基化、磷酸化、乙酰化等）及生物修饰法（如基因工程修饰、酶法降解等）(王兆梅,李琳,郭祀远,胡松青. 多糖结构修饰研究进展.中国医药工业杂志,2012,33(12):616-620）。多糖的分子修饰可能极大程度提高多糖的生物学功能，因此多糖的分子修饰已成为多糖构效关系研究的重要手段，也是发现和研制多糖类生物制剂的重要途径。

羧甲基化多糖是指多糖大分子链中单糖分子上的某一个或几个羟基被羧甲基基团取代而形成的一类化学结构复杂、生物活性多样、构效鲜明的阴离子多糖衍生物。有研究表明，许多原本不具有或仅有微弱抗病毒、抗肿瘤或抗氧化活性的多糖经过羧甲基化修饰后其抗病毒、抗肿瘤或抗氧化活性得到了显著提高。因此，多糖的羧甲基化修饰已经成为多糖分子修饰的一个重要方向，已成为人们关注的焦点。2011年，仰榴青，赵婷等申请的专利“一种羧甲基化黑木耳多糖、粗多糖及其制备方法和应用”（申请号：201110219047.3），将水提醇沉所得黑木耳多糖与氯乙酸在碱溶液中反应得到羧甲基黑木耳多糖，并证明该多糖与未羧甲基化黑木耳多糖相比，对DPPH自由基、羟基自由基、ABTS+自由基的清除能力和溶解性得到显著的提高。2010年，吴广枫，李平兰等申请的专利“一种羧甲基化双歧杆菌胞外多糖及其制备方法”（申请号：201010248295.6），利用双歧杆菌胞外多糖制备得到羧甲基化双歧杆菌胞外多糖，并证明该多糖能显著提高小鼠脾细胞中IL-2、IFNγ细胞因子水平，免疫调节力得到明显提高。

但是有关阴沟肠杆菌胞外多糖羧甲基化衍生物的制备和抗氧化活性研究至今未见国内外报道，也未见相应专利公开。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种羧甲基化阴沟肠杆菌胞外多糖及其制备方法和用途。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种羧甲基化阴沟肠杆菌胞外多糖的制备方法，包括如下步骤：

1）、将500mg阴沟肠杆菌胞外多糖溶于20~30mL异丙醇中，搅拌20~40分钟后滴加质量浓度为18~22%（最佳为20%）的NaOH水溶液，继续搅拌0.8~1.2h（最佳1h）后，加入1.8~2.2g（最佳为2g）氯乙酸，然后于50℃~70℃恒温水浴中反应2~4h；

NaOH与氯乙酸（MCA）的摩尔比为2~3:1；

滴加时间一般为2~10分钟；

2）、将步骤1）所得的反应体系降温至室温，先用质量浓度为4~6%的稀盐酸调pH至6.9~7.1，然后加入为步骤1）所得的反应体系2.5~3.5体积倍的无水乙醇，离心收集沉淀，将沉淀溶于蒸馏水中然后装入透析袋内，透析袋先放入自来水中透析22~26h（较佳24 h），再放入蒸馏水中透析46~50h（较佳为48 h）；透析袋中的透析产物经冷冻干燥，得到羧甲基化多糖（即，羧甲基化阴沟肠杆菌胞外多糖）。

作为本发明的羧甲基化阴沟肠杆菌胞外多糖的制备方法的改进：阴沟肠杆菌胞外多糖是通过发酵阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae Z0206）CGMCC NO.2279而得。

作为本发明的羧甲基化阴沟肠杆菌胞外多糖的制备方法的进一步改进：透析袋的截留分子量为800-12000Da。

作为本发明的羧甲基化阴沟肠杆菌胞外多糖的制备方法的进一步改进：

步骤1）中：NaOH与氯乙酸（MCA）的摩尔比为2:1，反应时间为4h，反应温度为60℃。

本发明还同时提供了利用上述任一方法制备所得的羧甲基化阴沟肠杆菌胞外多糖：该羧甲基化阴沟肠杆菌胞外多糖取代度为0.68-0.86，得率为95.42%-117.7%，该多糖的红外光谱中在1602 cm^-1和1426 cm^-1处出现了COO-的对称和非对称伸缩振动特征吸收峰。

本发明还同时提供了利用上述任一方法制备所得的羧甲基化阴沟肠杆菌胞外多糖的用途：作为抗氧化剂。

在本发明的步骤1）中，2处搅拌的速度均为速度为600～1200rpm（较佳为600～1000 rpm）。

在本发明中，室温一般是指10~25℃。

本发明所用的原料阴沟肠杆菌胞外多糖是按照申请号为200810121312.5的《一种阴沟肠杆菌及其多糖和多糖的应用》制备而得的阴沟肠杆菌Z0206多糖，该阴沟肠杆菌Z0206多糖是通过发酵一种阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae Z0206）CGMCC NO.2279而得到的。阴沟肠杆(Enterobacter cloacae Z0206)于2007年12月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC），保藏号为CGMCCNO.2279。该菌株已在申请号为200810121312.5的专利中公开。

羧甲基化阴沟肠杆菌胞外多糖中的羧甲基取代度的测定方法参见以下两个文献：

1）、李小飞，吴玉英，羧甲基壳聚糖的制备，精细与专用化学品，2006，14卷，24期，26-29；

2）、朱昌玲，史劲松，孙达峰，张和，威善龙，羧甲基壳聚糖的制备及其在保险中的应用，中国野生植物资源，2010，29卷，3期，41-45。

采用本发明方法制备而得的羧甲基化阴沟肠杆菌胞外多糖化学性质稳定，体外实验表明该胞外多糖具有较强的清除羟基自由基和超氧阴离子自由基的能力，且清除能力明显高于未改性的阴沟肠杆菌胞外多糖，显示出良好的抗氧化活性。本发明方法制备而得的羧甲基化阴沟肠杆菌胞外多糖的用法和用量可参照未改性的阴沟肠杆菌胞外多糖。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为阴沟肠杆菌胞外多糖对羟基自由基的清除作用图；

图2是实施例3所得的羧甲基化阴沟肠杆菌胞外多糖对羟基自由基的清除作用图；

图3是实施例8所得的羧甲基化阴沟肠杆菌胞外多糖对羟基自由基的清除作用图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不限制本发明。

实施例1、一种羧甲基化阴沟肠杆菌胞外多糖的制备方法，依次进行以下步骤：

1）、将500mg阴沟肠杆菌胞外多糖溶于25mL异丙醇中，室温下搅拌（转速为600～1000rpm）30min；然后滴加8mL 质量浓度为20%的NaOH水溶液（即为0.04mol的NaOH），约5分钟滴加完毕，室温下继续搅拌（转速为600～1000rpm）1h后，加入2g氯乙酸（即为0.02mol的氯乙酸），然后于50℃恒温水浴中反应2h；

2）、将步骤1）所得的反应体系降温至室温，先用质量浓度为5%的稀盐酸调pH至7，然后加入为步骤1）所得的反应体系3体积倍的无水乙醇，离心收集沉淀，将沉淀溶于15ml蒸馏水中然后装入透析袋中，透析袋先放入自来水中透析24 h，再放入蒸馏水中透析48 h；透析袋中的透析产物经冷冻干燥（于-80℃干燥至恒重），得0.4878g到羧甲基化多糖----羧甲基化阴沟肠杆菌胞外多糖。得率为97.56%。

备注说明：透析袋的截留分子量为8000-14000Da。

（3）羧甲基度的测定

采用酸碱滴定法（Muzzarelli et al., 1982）测定羧甲基化多糖的取代度。精确称取30mg羧甲基化多糖于三颈瓶中，精确移取15mL0.1mol／L盐酸标准溶液(含0.1mol／L氯化钠)于其中，振摇，使完全溶解，用0.1mol／L氢氧化钠标准溶液(含0.1mol／L氯化钠)滴定，同时用pH计测量pH值。

羧甲基取代度的计算公式如下：

DS=0.161A／(1-0.058A) A=(V₂-V₁) M／W

式中：A 为每克样品中羧甲基的物质的量，mmol；0.161为每个乙酰氨基葡萄糖残基的物质的量，mmol；0.058为每毫克当量的羧甲基质量；V₁ 为pH值为2.1时滴定所消耗的氢氧化钠标准溶液的体积；V₂ 为pH值为4.3时滴定所消耗的氢氧化钠标准溶液的体积；W 为样品净重；M为氢氧化钠标准溶液浓度。

所得结果如表2所示。

实施例2~实施例9、

以氢氧化钠与氯乙酸的比例、反应时间、反应温度为考察因素，每个因素拟定3个水平，以得率和羧甲基取代度（DS）为考察指标，选用L₉（3³）正交表（见表1）进行试验，试验水平及编码见表1。

即，相对于实施例1而言，改变步骤1）中氢氧化钠与氯乙酸的摩尔比（氯乙酸的用量保持不变---0.02mol的氯乙酸），还改变反应温度和反应时间；其余同实施例1，从而获得相应的实施例2~实施例9。

将实施例2~实施例9所得的羧甲基化多糖按照实施例1所述方法进行羧甲基度的测定，所得结果如表2所示。

表1、羧甲基化正交试验水平及其编码

表2、不同反应条件对羧甲基化阴沟肠杆菌胞外多糖得率及取代度的影响

综上所述：

本发明选用氢氧化钠-氯乙酸法，采用L₉（3³）正交试验，研究了反应时间、反应温度和氢氧化钠/氯乙酸对Z0206多糖羧甲基化反应的影响。结果表明，影响Z0206多糖羧甲基化取代度的因素主次顺序为：氢氧化钠/氯乙酸>反应时间>反应温度。以羧甲基化多糖得率和取代度为考察对象，羧甲基化反应的最佳条件为：反应时间为4h，反应温度为60℃，NaOH/MCA摩尔比为2:1。此时，取代度为0.86。

此外，羧甲基化阴沟肠杆菌胞外多糖的红外光谱分别在1602 cm^-1和1424 cm^-1处出现COO-的对称和非对称伸缩振动特征峰。

多糖及其羧甲基化衍生物红外光谱分析：

取1 mg左右经干燥的阴沟肠杆菌胞外多糖以及实施例3、实施例8所得的羧甲基化多糖，与100-200 mg干燥的KBr粉末在玛瑙研钵中轻轻研磨均匀，经压片机压片后，进行傅立叶变换红外光谱扫描分析，扫描范围为4000 cm-1-400 cm-1。如图1~图3所示。

结果表明，阴沟肠杆菌及其羧甲基化多糖均出现了多糖特征吸收峰，如3423.1cm-1 附近为OH的伸缩振动吸收峰；2925.2cm-1 附近为C-H的伸缩振动；1400-1200cm-1 的一组峰是C-H键的变角振动吸收，这些多糖的特征吸收峰表明三种物质均为多糖类化合物。

实施例3和实施例8除保留了多糖的母体特征吸收峰，还新增加了两个特征吸收峰：1601cm-1 附近出现了羧甲基基团中C=O非对称伸缩振动吸收峰，1424cm-1 附近出现了羧甲基基团中C=O对称伸缩振动吸收峰，并且这些吸收峰的强度随着羧甲基基团取代度的提高而增强。由此我们可以确定，多糖链上连接了羧甲基基团。

对比例1、

按照201110219047.3实施例3所述的方法，将实施例8的步骤1）改成以下内容：

将1.0g阴沟肠杆菌胞外多糖溶于40 mL异丙醇中，室温下剧烈搅拌15min；然后滴加7mL 质量浓度为20%的NaOH水溶液，室温在继续剧烈搅拌1h后，加入1.5g氯乙酸，然后于60℃恒温水浴中反应4h；此时，NaOH与氯乙酸的mol比为2.2：1。

步骤2）同实施例8。

具体结果如下：

多糖含量为33.64%，得率为103.84%，取代度为0.81。

对比例2、

按照201010248295.6所述的方法，将实施例1的步骤1）改成以下内容：

将2.0g阴沟肠杆菌胞外多糖溶于浓度为250mL、2.0mol/L的NaOH水溶液中，剧烈搅拌下加入氯乙酸10g，于60℃条件下继续剧烈搅拌反应3h。此时，NaOH与氯乙酸的mol比为5：1。

步骤2）同实施例8。

具体结果如下：

多糖含量为37.52%，得率98.21%，取代度0.79。

实验1、羧甲基化阴沟肠杆菌胞外多糖的体外抗氧化作用

（1）、羧甲基化阴沟肠杆菌胞外多糖对羟基自由基的清除作用

将样品用超纯水配制8mg/mL溶液，并稀释至0.125、0.25、0.5、1、2、4mg/mL。各取160ul上述样品于酶标板中，依次加入9.0mM FeSO4溶液40ul，0.03% （体积浓度）H₂O₂溶液40ul以及9.0mM水杨酸乙醇溶液（用体积浓度50%乙醇做溶剂） 20ul，混匀，37℃下孵育30min后于510nm处测定吸光度值。

A₀ 为空白对照组的平均吸光度值，A₁为测试样品的平均吸光度值。

具体结果见表3。

表3、羧甲基化阴沟肠杆菌胞外多糖对羟基自由基的清除作用（%）

对比例1所得的羧甲基化阴沟肠杆菌胞外多糖在8mg/mL时，羟自由基清除率为78.85%。

对比例2所得的羧甲基化阴沟肠杆菌胞外多糖在8mg/mL时，羟自由基清除率为69.56%

（2）羧甲基化阴沟肠杆菌胞外多糖对超氧阴离子的清除作用

取不同浓度的羧甲基样品50ul于酶标板，依次加入100ul NBT (150uM),混匀， 100ul NADH (470uM) ，混匀，再加入20ul PMS (60uM), 混匀，室温放置5min后在560 nm出测定其吸光度A。空白组以超纯水代替多糖溶液，以VC作为阳性对照。

具体结果见表4。

表4、羧甲基化阴沟肠杆菌胞外多糖对超氧阴离子的清除作用

对比例1所得的羧甲基化阴沟肠杆菌胞外多糖在8mg/mL时，超氧阴离子清除率为71.02%。

对比例1所得的羧甲基化阴沟肠杆菌胞外多糖在8mg/mL时，超氧阴离子清除率为58.93%。

表3为羧甲基化阴沟肠杆菌胞外多糖对羟基自由基的清除作用，可以看到未经修饰的多糖清除羟基自由基的清除能力较弱，各羧甲基化阴沟肠杆菌胞外多糖清除羟自由基的能力较未修饰前有较大的提高，其中取代度最高的8号羧甲基化多糖（即实施例8所得）在浓度大于2mg/mL时，清除率可以达到78.53%以上。表4为羧甲基化阴沟肠杆菌胞外多糖对超氧阴离子的清除作用，可以看到阴沟肠杆菌胞外多糖在羧甲基化修饰以前对超氧阴离子的清除能力较低，而经过修饰的多糖的抗氧化活性皆优于修饰前的多糖。在浓度大于2mg/mL时，实施例8对应的羧甲基化多糖的清除率在87%以上，十分接近阳性对照抗坏血酸的清除能力。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims

1.羧甲基化阴沟肠杆菌胞外多糖的制备方法，其特征是包括如下步骤：

1）、将500mg阴沟肠杆菌胞外多糖溶于20~30mL异丙醇中，搅拌20~40分钟后滴加质量浓度为18~22%的NaOH水溶液，继续搅拌0.8~1.2h后，加入1.8~2.2g氯乙酸，然后于50℃~70℃恒温水浴中反应2~4h；

所述NaOH与氯乙酸的摩尔比为2~3:1；

2）、将步骤1）所得的反应体系降温至室温，先用质量浓度为4~6%的稀盐酸调pH至6.9~7.1，然后加入为步骤1）所得的反应体系2.5~3.5体积倍的无水乙醇，离心收集沉淀，将沉淀溶于蒸馏水中然后装入透析袋内，透析袋先放入自来水中透析22~26h，再放入蒸馏水中透析46~50h；透析袋中的透析产物经冷冻干燥，得到羧甲基化多糖。

2.根据权利要求1所述的羧甲基化阴沟肠杆菌胞外多糖的制备方法，其特征是：所述阴沟肠杆菌胞外多糖是通过发酵阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae Z0206）CGMCC NO.2279而得。

3.根据权利要求2所述的羧甲基化阴沟肠杆菌胞外多糖的制备方法，其特征是：所述透析袋的截留分子量为8000-14000Da。

4.根据权利要求3所述的羧甲基化阴沟肠杆菌胞外多糖的制备方法，其特征是：

所述步骤1）中：NaOH与氯乙酸的摩尔比为2:1，反应时间为4h，反应温度为60℃。

5.利用权利要求1~4任一方法制备所得的羧甲基化阴沟肠杆菌胞外多糖，其特征是：该羧甲基化阴沟肠杆菌胞外多糖取代度为0.68-0.86，该多糖的红外光谱中在1602 cm^-1和1426 cm^-1处出现了COO-的对称和非对称伸缩振动特征吸收峰。

6.利用权利要求1~4任一方法制备所得的羧甲基化阴沟肠杆菌胞外多糖的用途：作为抗氧化剂。