CN103012419B - 一种罗丹明b衍生物的合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种罗丹明B衍生物的合成方法。通过对胱氨一端的氨基进行Boc保护，进而使用DCC/DMAP使单边保护的胱氨与罗丹明B的羧基酰胺化缩合，最后脱去Boc保护，得到存在独立活泼氨基的罗丹明B衍生物，为罗丹明B的进一步应用奠定了基础。本发明的合成方法产率较高，操作方便，纯化过程简单，易于实现大量生产。
Description
【技术领域】
本发明涉及有机合成领域，具体涉及一种罗丹明B衍生物的合成方法。
【背景技术】
罗丹明B是一种人工合成的荧光染料，在细胞染色、荧光探针等领域都有着广泛的应用价值。因此，对罗丹明B进行化学改性，以合成具有各种活性基团的罗丹明B衍生物具有重要意义。
胱氨是带有二硫键和两个氨基的较长链的链状化合物。将胱氨与罗丹明B进行缩合，以合成带有二硫键和一个活泼氨基的罗丹明B衍生物具有重要的意义。因为氨基与二硫键均为反应活性基团，这为罗丹明B的进一步应用提供了平台。
罗丹明B和一些短链类氨基化合物，如乙二胺、水合肼等反应时，较容易得到存在独立氨基的罗丹明B衍生物。
但对于胱氨这种含有多个反应活性基团的物质，在剧烈的反应条件下，这些活性基团很难被保留，不易得到目标产物。目前常用的制备酰胺化合物的方法包括直接用DCC/DMAP催化缩合，或者用EDC/NHS活化羧基后再进行酰氨化等。但对于胱氨而言，这些反应条件常会使另外一个氨基由于位阻较小，而和另一分子的罗丹明B的羧基或者酰胺键发生一些副反应，造成胱氨的两个氨基都参与反应或者是二硫键断裂。这使得罗丹明B的进一步应用成为泡影。
目前，已有人将7-二乙氨基-3-香豆素酸和胱氨的一个氨基成功地连接起来，并利用另外一个独立的氨基和卟啉进行反应，得到了一个利用荧光共振能量转移原理来检测体内巯基化合物的荧光探针。
但将胱氨与罗丹明B缩合，以合成具有一个独立活泼氨基的罗丹明B衍生物，目前还没有报道。
【发明内容】
本发明旨在提供一种将胱氨与罗丹明B缩合，以合成存在独立的活泼氨基的罗丹明类酰氨化合物的方法，从而为罗丹明B的进一步应用提供平台。
根据本发明，罗丹明B衍生物的合成方法包括以下步骤：
氨基保护：在胱氨二盐酸盐的甲醇溶液中，加入摩尔过量的三乙胺，冰浴下，缓慢滴加与胱氨二盐酸盐等摩尔量的二碳酸二叔丁酯的甲醇溶液，滴加完毕后，使反应液在室温下反应3-5小时，分离纯化后，得到单边保护的胱氨；
缩合：将罗丹明B、N，N-二环己基碳二亚胺、催化量的二甲氨基吡啶溶于二氯甲烷，先室温下反应0.5-1小时，再加入摩尔过量的单边保护的胱氨，回流反应6-14小时，分离纯化，得到缩合产物；
脱保护：冰浴温度至室温条件下，将缩合产物溶于二氯甲烷，添加三氟乙酸，反应1-2.5小时，分离纯化，得到下式的罗丹明B衍生物。
一些实施方案中，氨基保护步骤中，三乙胺的量可以为胱氨二盐酸盐摩尔量的3倍。
一些实施方案中，缩合步骤中，单边保护的胱氨的量为罗丹明B摩尔量的1-1.3倍，N，N-二环己基碳二亚胺的量为罗丹明B摩尔量的1.1倍，并且二甲氨基吡啶的量为罗丹明B摩尔量的0.1-0.2倍。
一些实施方案中，分离纯化的操作可以包括萃取、洗涤、柱层析等，或是它们的组合。
一些实施方案中，氨基保护步骤中的分离纯化操作可以是：去除溶剂，以pH为4.2的KH2PO4溶液溶解，然后用乙醚萃取以除去一些副产物，再以1M的NaOH溶液调节pH至不再出现沉淀，之后用乙酸乙酯萃取并收集有机层，去除溶剂，得到呈淡黄色油状的单边保护的胱氨。
一些实施方案中，缩合步骤中的分离纯化操作可以是：去除溶剂，用硅胶柱层析纯化，得到呈白色至浅红色粉末状的缩合产物。
一些实施方案中，脱保护步骤中的分离纯化操作可以是：去除溶剂后，用二氯甲烷溶解固体物质，然后用0.2M的NaOH溶液萃取以除去残留的三氟乙酸，再用水洗涤，收集有机相，除去溶剂后得到粗产品，之后进一步用硅胶柱层析纯化，得到呈白色粉末状的产品。
本发明通过首先使用(Boc)2O保护胱氨的一个氨基，然后在DCC/DMAP作用下与罗丹明B进行缩合反应，再脱保护，得到了具有一个独立的活泼氨基的罗丹明B胱氨衍生物。反应产率较高，纯化简单。
【具体实施方式】
为了将罗丹明B与胱氨缩合，并保留胱氨的一个独立活泼的氨基，本发明人首先用二碳酸二叔丁酯将胱氨的其中一个氨基保护，再利用N，N-二环己基碳二亚胺（DCC）和二甲氨基吡啶（DMAP）使单边保护的胱氨与罗丹明B的羧基发生酰胺化缩合反应，得到的中间体进一步脱保护后得到存在独立氨基的目标产物，即本发明的罗丹明B衍生物。
本发明的方法保证了一个独立氨基在反应后仍然存在，此氨基活泼性较高，很容易和其它物质反应，为罗丹明B的进一步应用奠定了基础。
具体的合成路径见下式：
首先使用二碳酸二叔丁酯将胱氨的一端氨基进行Boc保护，反应溶剂可以为甲醇。反应体系中可以加入三倍摩尔量的三乙胺，以使胱氨二盐酸盐被完全中和，并使反应体系呈碱性。二碳酸二叔丁酯可以通过恒压滴液漏斗缓慢滴加，例如滴加过程可以持续40-60分钟。滴加完成后，撤去冰浴，使反应体系升至室温，并在常温条件下继续反应3-5小时。
反应完成后，进行分离纯化处理：旋干溶剂，再用酸性KH2PO4溶液（pH为4.2）溶解残留物，然后用乙醚萃取以除去一些副产物，此时的目标产物是以盐的形式存在的，所以用1M的NaOH溶液调节pH，直至不再出现沉淀为止（此时pH一般在9.0-9.5之间）。然后再用乙酸乙酯萃取，收集有机层，旋干溶剂，得到的淡黄色油状物质即为单边保护的胱氨。
之后用DCC/DMAP使单边保护的胱氨与罗丹明B的羧基发生酰胺化缩合反应。
在烧瓶中依次加入罗丹明B、摩尔过量的DCC、催化量的DMAP，用二氯甲烷溶解，然后在室温下反应30-60分钟后，加入溶于二氯甲烷中的单边保护的胱氨（其摩尔量也可以略大于罗丹明B的摩尔量，以使反应完全），加热回流继续反应6-14小时。
缩合产物的分离纯化步骤可以为：旋干溶剂，用硅胶柱层析纯化，得到白色或略带红色的产品。
最后对缩合产物进行脱保护：在冰浴温度至室温条件下，用少量二氯甲烷溶解缩合产物，加入三氟乙酸反应1-2.5小时。
分离纯化：旋干溶剂，用二氯甲烷溶解，用0.2M的NaOH溶液萃取以除去残留的三氟乙酸，再用水洗两次，收集有机相，旋干得到粗产品，进一步用硅胶柱纯化，得到纯品呈白色粉末。
本发明的合成方法产率较高，操作方便，整个实验过程所用到的化学技术均是最常见的一些实验操作，如萃取、柱层析等，纯化过程简单，易实现大量生产。
实施例
原料：
胱氨二盐酸盐；三乙胺；二碳酸二叔丁酯（(Boc)2O）；罗丹明B；N，N-二环己基碳二亚胺（DCC）；二甲氨基吡啶（DMAP）；三氟乙酸，均购自Aldrich。
实施例1
1、氨基保护：将2.24g（0.01mol）胱氨二盐酸盐溶于25mL甲醇并加入4.18mL（0.03mol）三乙胺。冰浴条件下，用怛压滴液漏斗缓慢滴入溶于15mL甲醇中的2.18g（0.01mol）二碳酸二叔丁酯，滴加过程用时50min。滴加完毕后，撤去冰浴，使温度升至室温，反应5小时。
分离纯化：旋干溶剂，用pH为4.2的KH2PO4溶液溶解，之后用乙醚萃取以除去一些副产物。此时的目标产物是以盐的形式存在的，所以用1M的NaOH溶液调节pH，直至不再出现沉淀（pH一般在9.0~9.5之间）。然后再用乙酸乙酯萃取，收集有机相，旋干溶剂，得到淡黄色油状的单边保护的胱氨。收率50%。
2、缩合：在100mL圆底烧瓶中依次加入479mg（0.001mol）罗丹明B、226mg的DCC（0.0011mol）、24.4mg的DMAP（0.0002mol），用30mL二氯甲烷溶解，然后在室温下反应1小时后，继续加入用20mL二氯甲烷溶解的单边保护的胱氨252mg（0.001mol），加热回流继续反应6小时。
分离纯化：旋干溶剂，用硅胶柱层析纯化，得到白色或略带红色的粉末状缩合产物。收率90%。
3、脱保护：冰浴下，用4mL二氯甲烷溶解缩合产物，加入3mL三氟乙酸，冰浴下反应1小时后，撤去冰浴，继续室温反应1.5小时。
分离纯化：旋干溶剂，用30mL二氯甲烷溶解，用0.2M的NaOH溶液萃取以除去残留的三氟乙酸，再用水洗涤两次，收集有机相，旋干得到粗产品。进一步用硅胶柱纯化，得到白色粉末状产品。收率87%。
实施例2
1、氨基保护：将3.36g（0.015mol）胱氨二盐酸盐溶于35mL甲醇并加入6.27mL（0.045mol）三乙胺。冰浴条件下，用怛压滴液漏斗缓慢滴入溶于25mL甲醇中的3.27g（0.015mol）二碳酸二叔丁酯，滴加过程用时50min。滴加完毕后，撤去冰浴，使温度升至室温，反应5小时。
分离纯化：旋干溶剂，用pH为4.2的KH2PO4溶液溶解，之后用乙醚萃取以除去一些副产物。此时的目标产物是以盐的形式存在的，所以用1M的NaOH溶液调节pH，直至不再出现沉淀（pH一般在9.0~9.5之间）。然后再用乙酸乙酯萃取，收集有机相，旋干溶剂，得到的淡黄色油状的单边保护的胱氨。收率50%。
2、缩合：在100mL圆底烧瓶中依次加入479mg（0.001mol）罗丹明B、226mg的DCC（0.0011mol）、12.2mg的DMAP（0.0001mol），用30mL二氯甲烷溶解，然后在室温下反应0.5小时后，继续加入用20mL二氯甲烷溶解的单边保护的胱氨252mg（0.001mol），加热回流继续反应6.5小时。
分离纯化：旋干溶剂，用硅胶柱层析纯化，得到白色或略带红色的粉末状缩合产物。收率90%。
3、脱保护：冰浴下，用4mL二氯甲烷溶解缩合产物，加入3mL三氟乙酸，反应1小时后，撤去冰浴，继续室温反应1.5小时。
分离纯化：旋干溶剂，用30mL二氯甲烷溶解，用0.2M的NaOH溶液萃取以除去残留的三氟乙酸，再用水洗涤两次，收集有机相，旋干得到粗产品。进一步用硅胶柱纯化，得到白色粉末状产品。收率87%。
实施例3
1、氨基保护：将3.36g（0.015mol）胱氨二盐酸盐溶于35mL甲醇并加入6.27mL（0.045mol）三乙胺。冰浴条件下，用怛压滴液漏斗缓慢滴入溶于25mL甲醇中的3.27g（0.015mol）二碳酸二叔丁酯，滴加过程用时50min。滴加完毕后，撤去冰浴，使温度升至室温，反应5小时。
分离纯化：旋转蒸发旋干溶剂，用pH为4.2的KH2PO4溶液溶解，之后用乙醚萃取以除去一些副产物。此时的目标产物是以盐的形式存在的，所以用1M的NaOH溶液调节pH，直至不再出现沉淀（pH一般在9.0~9.5之间）。然后再用乙酸乙酯萃取，收集有机相，旋干溶剂，得到的淡黄色油状的单边保护的胱氨。收率48%。
2、缩合：在100mL圆底烧瓶中依次加入479mg（0.001mol）罗丹明B、226mg的DCC（0.0011mol）、12.2mg的DMAP（0.0001mol），用30mL二氯甲烷溶解，然后在室温下反应0.5小时后，继续加入用20mL二氯甲烷溶解的单边保护的胱氨323mg（0.0013mol），加热回流继续反应6.5小时。
分离纯化：旋干溶剂，用硅胶柱层析纯化，得到白色或略带红色的粉末状缩合产物。收率81%。
3、脱保护：室温下，用4mL二氯甲烷溶解缩合产物，加入3mL三氟乙酸，反应1小时。
分离纯化：旋干溶剂，用30mL二氯甲烷溶解，用0.2M的NaOH溶液萃取以除去残留的三氟乙酸，再用水洗涤两次，收集有机相，旋干得到粗产品。进一步用硅胶柱纯化，得到白色粉末状产品。收率91%。
实施例4
1、氨基保护：将1.12g（0.005mol）胱氨二盐酸盐溶于12.5mL甲醇并加入2.09mL（0.015mol）三乙胺。冰浴条件下，用怛压滴液漏斗缓慢滴入溶于7.5mL甲醇中的1.09g（0.01mol）二碳酸二叔丁酯，滴加过程用时40min。滴加完毕后，撤去冰浴，使温度升至室温，反应3小时。
分离纯化：旋干溶剂，用pH为4.2的KH2PO4溶液溶解，之后用乙醚萃取以除去一些副产物。此时的目标产物是以盐的形式存在的，所以用1M的NaOH溶液调节pH，直至不再出现沉淀（pH一般在9.0~9.5之间）。然后再用乙酸乙酯萃取，收集有机相，旋干溶剂，得到的淡黄色油状的单边保护的胱氨。收率50%。
2、缩合：在100mL圆底烧瓶中依次加入479mg（0.001mol）罗丹明B、226mg的DCC（0.0011mol）、24.4mg的DMAP（0.0002mol），用30mL二氯甲烷溶解，然后在室温下反应1小时后，继续加入用20mL二氯甲烷溶解的单边保护的胱氨252mg（0.001mol），加热回流继续反应14小时。
分离纯化：旋干溶剂，用硅胶柱层析纯化，得到白色或略带红色的粉末状缩合产物。收率90%。
3、脱保护：冰浴下，用4mL二氯甲烷溶解缩合产物，加入3mL三氟乙酸，反应1小时；撤去冰浴，继续反应1.5小时。
分离纯化：旋干溶剂，用30mL二氯甲烷溶解，用0.2M的NaOH溶液萃取以除去残留的三氟乙酸，再用水洗涤两次，收集有机相，旋干得到粗产品。进一步用硅胶柱纯化，得到白色粉末状产品。收率87%。
产物表征：
化学式C32H40N4O2S2，高分辨质谱[M+H]+为577.2654。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ1.17(t,J=7.05Hz,12H,CH3CH2),2.42(t,J=8Hz,2H,CH2CH2S-),2.67(t,J=6.05Hz,2H,-SCH2CH2),2.94(t,J=6.05Hz,,2H,-SCH2CH2),3.34(q,J=7.05Hz，8H,CH3CH2),3.45(t,J=8Hz,,2H,CH2CH2S-),6.28(dd,J=8.9Hz,2.5Hz,2H,Xanthene-H),6.39(d,J=2.5Hz,2H,Xanthene-H),6.43(d,J=8.85Hz,2H,Xanthene-H),7.07-7.10(m,1H,Ar-H),7.41-7.47(m,2H,Ar-H),7.88-7.91(m,1H,Ar-H).
以上所述本发明的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本发明的技术构思所作出的各种其他相应的改变与变形，均应包含在本发明权利要求的保护范围内。
Claims (1)
1.一种罗丹明B衍生物的合成方法，包括以下步骤：
氨基保护：在胱氨二盐酸盐的甲醇溶液中，加入为胱氨二盐酸盐摩尔量的3倍的三乙胺，冰浴下，缓慢滴加与胱氨二盐酸盐等摩尔量的二碳酸二叔丁酯的甲醇溶液，滴加完毕后，使反应液在室温下反应3-5小时，分离纯化后，得到单边保护的胱氨，所述分离纯化操作为：去除溶剂，以pH为4.2的KH2PO4溶液溶解，然后用乙醚萃取以除去一些副产物，再以1M的NaOH溶液调节pH至不再出现沉淀，之后用乙酸乙酯萃取并收集有机层，去除溶剂，得到呈淡黄色油状的单边保护的胱氨；
缩合：将罗丹明B、N，N-二环己基碳二亚胺、二甲氨基吡啶溶于二氯甲烷，先室温下反应0.5-1小时，再加入为罗丹明B摩尔量的1-1.3倍的单边保护的胱氨，回流反应6-14小时，分离纯化，得到缩合产物，其中N，N-二环己基碳二亚胺的量为罗丹明B摩尔量的1.1倍，并且二甲氨基吡啶的量为罗丹明B摩尔量的0.1-0.2倍，其中分离纯化操作为：去除溶剂，用硅胶柱层析纯化，得到呈白色至浅红色粉末状的缩合产物；
脱保护：冰浴温度至室温条件下，将缩合产物溶于二氯甲烷，添加三氟乙酸，反应1-2.5小时，分离纯化，得到下式的罗丹明B衍生物：
其中分离纯化操作为：去除溶剂后，用二氯甲烷溶解固体物质，然后用0.2M的NaOH溶液萃取以除去残留的三氟乙酸，再用水洗涤，收集有机相，除去溶剂后得到粗产品，之后进一步用硅胶柱层析纯化，得到呈白色粉末状的产品。
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