CN103006899B

CN103006899B - 一种枸杞子总黄酮的提取纯化工艺、检测方法及其应用

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Publication number: CN103006899B
Application number: CN201210518705.3A
Authority: CN
Inventors: 王宇; 高凯; 杜小英; 汤海峰
Original assignee: SHAANXI ARK PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: SHAANXI ARK PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date: 2012-12-02
Filing date: 2012-12-02
Publication date: 2015-02-18
Anticipated expiration: 2032-12-02
Also published as: CN103006899A

Abstract

本发明属于枸杞子总黄酮的提取纯化制备方法和检测方法及其应用。目前，制备枸杞黄酮的方法有回流提取法、超声波提取法、微波提取法，公开专利201010542616.3枸杞叶中黄酮的提取制备方法中，采用胶体磨合技术和高压匀质技术及膜分离联合应用技术，繁复，耗时长。本发明目的是研制一种枸杞子总黄酮的提取纯化工艺、检测方法及其应用。本发明技术方案：提取工艺是枸杞子烘干粉碎、加乙醇，提取合并滤液、浓缩、萃取、得到枸杞子黄酮粗提液；提取纯化工艺：采用大孔树脂D101，对粗提液进行纯化，采用聚酰胺对黄酮进一步的纯化。本发明效果：在获得多糖的同时提取总黄酮，更充分的提取了枸杞子的有效成分；为大规模工业化生产打下基础。

Description

一种枸杞子总黄酮的提取纯化工艺、检测方法及其应用

技术领域

本发明属于天然药物领域，涉及一种具有清除自由基的作用的枸杞子提取物，具体为枸杞子中总黄酮的提取纯化制备方法和检测方法以及其应用。

背景技术

枸杞子(Lycium Barbarum)为茄科植物宁夏枸杞的干燥成熟果实，是名贵的药材和滋补品，也是中国传统的、重要的药食两用同源植物之一。枸杞子其味甘、性平具有补肝益肾之功效，中医很早就有“枸杞养生”的说法。《本草纲目》记载：“枸杞，补肾生精，养肝……明目安神，令人长寿。”“久服坚筋骨，轻身不老，耐寒暑。”中医常用它来治疗肝肾阴亏、腰膝酸软。枸杞的产区主要集中在西北地区。枸杞在现代临床上广泛用于调节免疫功能、降血脂、降血糖、保肝、抗肿瘤及抗衰老等。枸杞之所以具有上述功能，一般认为与其所含枸杞多糖、类胡萝卜素和甜菜碱等活性成分有关，特别是与枸杞多糖密切相关，然而，随着黄酮类化合物研究开发的热潮，枸杞中黄酮类化合物的抗氧化活性也开始得到关注，目前制备枸杞黄酮的方法有回流提取法、超声波提取法、微波提取法等。但是，有关枸杞黄酮的研究多集中在粗提物水平。公开的专利201010542616.3中，提到枸杞叶中黄酮的提取制备方法，是采用了胶体磨合技术和高压匀质技术及膜分离联合应用技术；但是该方法是提取枸杞叶中黄酮的提取方法，并没有对枸杞子中总黄酮的提取方法做一介绍。

发明内容

本发明的目的是提供了一种枸杞子中总黄酮的提取纯化工艺、检测方法及其应用。在获得多糖的同时提取总黄酮，更充分、更简便、更有效率的提取了枸杞子的有效成分；对枸杞子总黄酮进行提取纯化的工艺，通过大孔树脂D101与聚酰胺的联用，取得良好的纯化效果，体外清除自由基试验表明：枸杞子总黄酮类对DPPH和ABTS自由基表现出显著的清除作用，而且D101与聚酰胺本身比较廉价，成本较低，今后有望进行工业化生产打下基础。

本发明的技术解决方案：一种枸杞子总黄酮的提取纯化工艺，其特征是：提取工艺：枸杞子于65℃烘干粉碎后，称取30kg于提取罐，加入300L的浓度为80％的乙醇，于温度为60℃～100℃提取2次，每次0.5h～2h，合并滤液，经浓缩过滤后定容到120L，加入3倍浓度为95％乙醇静置24h后抽滤并将溶液浓缩至120L，将浓缩得到的溶液与石油醚按比例为1∶2的进行萃取2-3次，弃去石油醚层，得到枸杞子总黄酮粗提液；

提取纯化工艺：

(1)采用大孔树脂D101，对粗提液进行纯化：

提前将大孔树脂用浓度为95％乙醇浸泡1d后，进行装柱，用蒸馏水洗至无醇味，将所得到的120L枸杞子总黄酮粗提液上样，上样流速为0.5～1.0ml/min，上样结束后用蒸馏水洗脱到无色，采用Molish反应进行清洗终点的判断，其判断方法为吸取1ml清洗液，加5％α-萘酚乙醇溶液3滴，摇匀，沿试管壁缓缓加入0.5ml浓硫酸，如在试液与浓硫酸的交界面处很快形成紫色环，表明还有糖类物质的存在，判断后，以Molish反应阴性作为清洗终点，再用浓度为50％乙醇进行洗脱，采用盐酸-镁粉反应进行洗脱终点的判断，判断方法是取洗脱液1ml，加少许镁粉振摇后，滴加5～6滴浓盐酸，1～2min内即可显橙红～紫红色，判断后以盐酸-镁粉反应阴性为洗脱终点，收集浓度为50％醇洗液，将其浓缩至第一步枸杞子总黄酮纯化液60L；

(2)采用聚酰胺对总黄酮进一步的纯化：

先进行聚酰胺的活化处理：将聚酰胺颗粒用95％乙醇浸泡24h，装柱，水洗至无醇味，然后用浓度为5％氢氧化钠3倍柱体积进行冲洗，然后用水洗至中性，在用浓度为5％柠檬酸3倍柱体积冲洗，然后用水洗至中性，待上样；

将大孔树脂所得的60L第一步枸杞子总黄酮纯化液进行上样，所用聚酰胺的柱体积应大于上样液体，使上样液可以充分分散在聚酰胺中24h，用蒸馏水进行冲洗除杂，以Molish反应进行清洗终点的判断，然后浓度为分别用20％、50％乙醇依次洗脱，20％乙醇洗脱液中主要为杂质，总黄酮损失量较少，再用50％乙醇洗脱至盐酸-镁粉反应为阴性，收集洗脱液，所得为具有清除自由基作用的枸杞子总黄酮80g。

所述的一种枸杞子总黄酮的提取纯化工艺，其特征是：在提取工艺中：枸杞子于65℃烘干粉碎后，称取30kg于提取罐，加入300L的浓度为80％的乙醇，于85℃提取2次，每次1h，合并滤液，经浓缩过滤后定容到120L，加入3倍浓度为95％乙醇静置24h后抽滤并将溶液浓缩至120L，将浓缩得到的溶液与石油醚按比例为1∶2的进行萃取2次，弃去石油醚层，得到枸杞子总黄酮粗提液。

所述的一种枸杞子总黄酮的检测方法，其特征是：检测方法：

(1)色谱条件：

流动相乙腈-水(70∶30)，检测波长为342nm，柱温为30℃，流速0.5ml/min，进样量为20ul，在此条件下芦丁与山奈酚能与其他成分达到较好的分离；

(2)对照品溶液的制备：

精密称取槲皮素对照品10.80mg，山奈酚对照品7.22mg置于同一100mL量瓶中，加浓度为80％甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得混合对照品储备液，储备液为槲皮素浓度为108.0mg·L^-1，山奈酚浓度为72.2mg·L^-1；

(3)标准曲线的绘制：

精密吸取混合对照品储备液0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0mL，分别用流动相乙腈-水(70∶30)稀释至10mL，摇匀，取20uL按照色谱条件进样测定峰面积，以峰面积(Y)与浓度(X)绘制标准曲线，槲皮素的回归方程为Y＝1.54×10⁵X+1.89×10⁴(r＝0.9999)，山奈酚的回归方程为Y＝1.65×10⁵X+3.65×10⁴(r＝0.9999)。结果槲皮素在5.04～50.4mg·L^-1线性关系良好，山奈酚在3.61～36.1mg·L^-1线性关系良好；

(4)样品的含量测定：

精密吸取供试品溶液20uL进样，每份进样两次，结果，枸杞子中的总黄酮苷水解后的绝大部分成为槲皮素和山奈酚，根据测得的槲皮素和山奈酚峰面积计算槲皮素和山奈酚的含量，将″-O-乙酰基异槲皮苷分子量505.4和″-O-乙酰基黄芪苷相对分子质量490.4相加之和除2得平均分子质量为497.9的黄酮醇乙酸酯苷作为总的枸杞子黄酮的代表，根据苷元槲皮素分子量为302.23和山奈酚分子量286.23，计算出黄酮醇乙酸酯苷对槲皮素和山奈酚的转换因子分别为1.65和1.74，再根据下式计算枸杞子中总黄酮醇苷的含量；

枸杞子总黄酮含量＝槲皮素含量×1.65+山奈酚含量×1.74。

所述的一种枸杞子总黄酮的应用，其特征是：在制药中的应用；临床上枸杞子总黄酮的抗衰老作用主要表现在其对自由基的清除作用上：

(1)对DPPH自由基清除作用，或者是指枸杞子总黄酮清除自由基的作用

准确称取0.0099g DPPH标准品，用浓度为95％乙醇溶解并定容至250ml棕色容量瓶中，充分混匀，得浓度为1x10^-4mol/L的DPPH溶液，置于冰箱中温度为0℃～4℃避光保存；在试管中依次加入3.0ml DPPH溶液和0.5ml样品溶液，混匀，避光反应30min，在517nm下测吸光度值(A)，平行测定3次，测定度值记为As；在试管中加入3.0mlDPPH溶液和0.5ml样品稀释溶剂，混匀，测定吸光度值，记为Ao；在试管中，加入3.0mlDPPH溶液稀释溶剂和0.5rnl样品溶液，混匀，测定吸光度值，记为A，按照下列公式计算清除率，记为Y1：

Y1(％)＝[1-(As-Ar)/Ao)]x100

测得枸杞子总黄酮对DPPH自由基清除率为95.8％，其与Vc的清除能力相当；

(2)对ABTS+的清除活性

称取0.3721g ABTS+，0.0662g过硫酸钾，配制成2000mL的水溶液，摇匀，室温暗室下反应16h；取ABTS+溶液与去离子水各2mL，在734nm处，6min内每隔0.5min测吸光度值，记为A；取ABTS+溶液与样品溶液各2mL，在同等波长下测吸光度值，记为A1；每个样品重复3次试验，取平均值，并按下式计算枸杞子总黄酮的ABTS+清除率记为Y2；

Y2(％)＝(1-A₁/A₀)x100

测得枸杞子总黄酮对ABTS+的清除率为94.1％，与Vc的清除能力相当。

本发明的优点和效果：

1、本发明是枸杞子用乙醇提取后，通过大孔树脂D101与聚酰胺的联用技术，取得良好的纯化效果，提取纯度可达42.8％。

2、D101与聚酰胺本身比较廉价，成本较低，今后有望进行工业化生产，为大规模工业化生产打下基础。。

3、在获得多糖的同时提取总黄酮，更充分、更简便、更有效率的提取了枸杞子的有效成分；成本低廉，提取率高，所得枸杞子总黄酮性状稳定，含量高。

4、测得枸杞子总黄酮对DPPH自由基清除率为95.8％，其与Vc的清除能力相当；测得枸杞子总黄酮对ABTS+的清除率为94.1％，与Vc的清除能力相当；这些说明抗衰老能力强。

附图说明

图1是槲皮素的标准曲线示意图；图2是山奈酚的标准曲线示意图；图3是槲皮素对照和山奈酚对照曲线示意图；图4是样品溶液测定示意图。

具体实施方式

实施例1：

枸杞子于50℃烘干粉碎后，称取50g于磨口圆底烧瓶中，加入500ml80％乙醇，置于85℃恒温水浴锅中提取2次，每次1h，合并滤液，经浓缩过滤后定容到200ml，加入3倍95％乙醇静置24h抽滤并将溶液浓缩至200ml，将浓缩得到的溶液与石油醚按比例为1∶2的进行萃取2-3次，弃去石油醚层，得到枸杞子黄酮粗提液。

纯化工艺：

1.采用大孔树脂D101对粗提液进行纯化

提前将大孔树脂用95％乙醇浸泡1d后，进行装柱，用蒸馏水洗至无醇味，将所得到的200ml粗提液上样，上样流速为0.5-1.0ml/min，上样结束后用蒸馏水洗脱到无色，采用Molish反应进行清洗终点的判断(吸取1ml清洗液，加5％α-萘酚乙醇溶液3滴，摇匀。沿试管壁缓缓加入0.5ml浓硫酸，如在试液与硫酸的交界面处很快形成紫色环，表明还有糖类物质的存在)以Molish反应阴性作为清洗终点。再用50％乙醇进行洗脱，采用盐酸-镁粉反应进行洗脱终点的判断(取洗脱液1ml，加少许镁粉振摇后，滴加5～6滴浓盐酸，1～2min内即可显橙红～紫红色)，以盐酸-镁粉反应阴性为洗脱终点，收集50％醇洗液，将其浓缩至100ml。

2.采用聚酰胺对总黄酮进一步的纯化：

先进行聚酰胺的活化处理：将聚酰胺颗粒用95％乙醇浸泡24h，装柱，水洗至无醇味，然后用5％氢氧化钠3倍柱体积进行冲洗，然后用水洗至中性，在用5％柠檬酸3倍柱体积冲洗，然后用水洗至中性，待上样。

将大孔树脂所得的100ml纯化液进行上样，所用聚酰胺的柱体积应大于上样液体，使上样液可以充分分散在聚酰胺中，24小时后用蒸馏水进行冲洗除杂，以Molish反应进行清洗终点的判断，然后分别用20％、50％乙醇依次洗脱，20％乙醇洗脱液中主要为杂质，总黄酮损失量较少，再用50％乙醇洗脱至盐酸-镁粉反应为阴性，收集洗脱液，所得为纯化后的枸杞子总黄酮130mg；经紫外测定总黄酮的含量为41.5％。

实施例2

枸杞子于50℃烘干粉碎后，称取100g于磨口圆底烧瓶中，加入1000ml80％乙醇，置于85℃恒温水浴锅中提取2次，每次1h，合并滤液，经浓缩过滤后定容到200ml，加入3倍95％乙醇静置24h抽滤并将溶液浓缩至400ml，将浓缩得到的溶液与石油醚按比例为1∶2的进行萃取2-3次，弃去石油醚层，得到枸杞子总黄酮粗提液。

纯化工艺：

1.采用大孔树脂D101对粗提液进行纯化

提前将大孔树脂用95％乙醇浸泡1d后，进行装柱，用蒸馏水洗至无醇味，将所得到的400ml粗提液上样，上样流速为0.5-1.0ml/min，上样结束后用蒸馏水洗脱到无色，采用Molish反应进行清洗终点的判断(吸取1ml清洗液，加5％α-萘酚乙醇溶液3滴，摇匀。沿试管壁缓缓加入0.5ml浓硫酸，如在试液与硫酸的交界面处很快形成紫色环，表明还有糖类物质的存在)以Molish反应阴性作为清洗终点。再用50％乙醇进行洗脱，采用盐酸-镁粉反应进行洗脱终点的判断(取洗脱液1ml，加少许镁粉振摇后，滴加5～6滴浓盐酸，1～2min内即可显橙红～紫红色)，以盐酸-镁粉反应阴性为洗脱终点，收集50％醇洗液，将其浓缩至200ml。

2.采用聚酰胺对总黄酮进一步的纯化

将大孔树脂所得的200ml纯化液进行上样，所用聚酰胺的柱体积应大于上样液体，使上样液可以充分分散在聚酰胺中，24小时后用蒸馏水进行冲洗除杂，以Molish反应进行清洗终点的判断，然后分别用20％、50％乙醇依次洗脱，20％乙醇洗脱液中主要为杂质，总黄酮损失量较少，再用50％乙醇洗脱至盐酸-镁粉反应为阴性，收集洗脱液，所得为纯化后的枸杞子总黄酮262mg；经紫外测定总黄酮的含量为42.5％。

实施例3

枸杞子于65℃烘干粉碎后，称取200g于磨口圆底烧瓶中，加入2000ml80％乙醇，置于85℃恒温水浴锅中提取2次，每次1h，合并滤液，经浓缩过滤后定容到800ml，加入3倍95％乙醇静置24h抽滤并将溶液浓缩至800ml，将浓缩得到的溶液与石油醚按比例为1∶2的进行萃取2-3次，弃去石油醚层，得到枸杞子总黄酮粗提液。

纯化工艺：

1.采用大孔树脂D101对粗提液进行纯化

提前将大孔树脂用95％乙醇浸泡1d后，进行装柱，用蒸馏水洗至无醇味，将所得到的800ml粗提液上样，上样流速为0.5-1.0ml/min，上样结束后用蒸馏水洗脱到无色，采用Molish反应进行清洗终点的判断(吸取1ml清洗液，加5％α-萘酚乙醇溶液3滴，摇匀。沿试管壁缓缓加入0.5ml浓硫酸，如在试液与硫酸的交界面处很快形成紫色环，表明还有糖类物质的存在。以Molish反应阴性作为清洗终点。再用50％乙醇进行洗脱，采用盐酸-镁粉反应进行洗脱终点的判断(取洗脱液1ml，加少许镁粉振摇后，滴加5～6滴浓盐酸，1～2min内即可显橙红～紫红色)，以盐酸-镁粉反应阴性为洗脱终点，收集50％醇洗液，将其浓缩至400ml。

2.采用聚酰胺对总黄酮进一步的纯化

将大孔树脂所得的400ml纯化液进行上样，所用聚酰胺的柱体积应大于上样液体，使上样液可以充分分散在聚酰胺中，24小时后用蒸馏水进行冲洗除杂，以Molish反应进行清洗终点的判断，然后分别用20％、50％乙醇依次洗脱，20％乙醇洗脱液中主要为杂质，总黄酮损失量较少，再用50％乙醇洗脱至盐酸-镁粉反应为阴性，收集洗脱液，所得为纯化后的枸杞子总黄酮530mg。经紫外测定总黄酮的含量为42.8％。

实施例4

枸杞子于65℃烘干粉碎后，称取300g于磨口圆底烧瓶中，加入3000ml80％乙醇，置于85℃恒温水浴锅中提取2次，每次1h，合并滤液，经浓缩过滤后定容到1200ml，加入3倍95％乙醇静置24h抽滤并将溶液浓缩至1200ml，将浓缩得到的溶液与石油醚按比例为1∶2的进行萃取2-3次，弃去石油醚层，得到枸杞子总黄酮粗提液。

纯化工艺：1.采用大孔树脂D101对粗提液进行纯化

提前将大孔树脂用95％乙醇浸泡1d后，进行装柱，用蒸馏水洗至无醇味，将所得到的1200ml粗提液上样，上样流速为0.5-1.0ml/min，上样结束后用蒸馏水洗脱到无色，采用Molish反应进行清洗终点的判断(吸取1ml清洗液，加5％α-萘酚乙醇溶液3滴，摇匀。沿试管壁缓缓加入0.5ml浓硫酸，如在试液与硫酸的交界面处很快形成紫色环，表明还有糖类物质的存在)以Molish反应阴性作为清洗终点。再用50％乙醇进行洗脱，采用盐酸-镁粉反应进行洗脱终点的判断(取洗脱液1ml，加少许镁粉振摇后，滴加5～6滴浓盐酸，1～2min内即可显橙红～紫红色)，以盐酸-镁粉反应阴性为洗脱终点，收集50％醇洗液，将其浓缩至600ml。

2.采用聚酰胺对总黄酮进一步的纯化

将大孔树脂所得的600ml纯化液进行上样，所用聚酰胺的柱体积应大于上样液体，使上样液可以充分分散在聚酰胺中，24小时后用蒸馏水进行冲洗除杂，以Molish反应进行清洗终点的判断，然后分别用20％、50％乙醇依次洗脱，20％乙醇洗脱液中主要为杂质，总黄酮损失量较少，再用50％乙醇洗脱至盐酸-镁粉反应为阴性，收集洗脱液，所得为纯化后的枸杞子总黄酮800mg。经紫外测定总黄酮的含量为42.3％。

实施例5检测方法

1.色谱条件：流动相乙腈-水(70∶30)，检测波长为342nm，柱温为30℃，流速0.5ml/min，进样量为20ul，在此条件下芦丁与山奈酚能与其他成分达到较好的分离。

2.对照品溶液的制备：精密称取槲皮素对照品10.80mg，山奈酚对照品7.22mg置于同一100mL量瓶中，加80％甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得混合对照品储备液(槲皮素浓度为108.0mg·L^-1，山奈酚浓度为72.2mg·L^-1。

3.标准曲线的绘制：精密吸取混合对照品储备液0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0mL，分别用流动相乙腈-水(70∶30)稀释至10mL，摇匀，取20uL按照色谱条件进样测定峰面积，以峰面积(Y)与浓度(X)绘制标准曲线，槲皮素的回归方程为Y＝1.54×10⁵X+1.89×10⁴(r＝0.9999)，山奈酚的回归方程为Y＝1.65×10⁵X+3.65×10⁴(r＝0.9999)。结果槲皮素在5.04～50.4mg·L-1线性关系良好，山奈酚在3.61～36.1mg·L^-1线性关系良好，参看图1和图2所示。

4.样品的含量测定：精密吸取供试品溶液20uL进样，每份进样两次。结果，枸杞子中的黄酮苷水解后的绝大部分成为槲皮素和山奈酚。根据测得的槲皮素和山奈酚峰面积计算槲皮素和山奈酚的含量。将6″-O一乙酰基异槲皮苷分子量505.4和6″-O一乙酰基黄芪苷相对分子质量490.4相加之和除2得平均分子质量为497.9的黄酮醇乙酸酯苷作为总的枸杞子黄酮的代表，根据苷元槲皮素分子量为302.23和山奈酚分子量286.23，计算出黄酮醇乙酸酯苷对槲皮素和山奈酚的转换因子分别为1.65和1.74，再根据下式计算枸杞子中总黄酮醇苷的含量，参照图3和图4。

枸杞子中总黄酮含量＝槲皮素含量×1.65+山奈酚含量×1.74

实施例5 在制药中的应用：具体是指枸杞子黄酮清除自由基的作用

1)对DPPH自由基清除作用

准确称取0.0099g DPPH标准品，用95％乙醇溶解并定容至250ml棕色容量瓶中，充分混匀，得DPPH溶液(浓度为1x10^-4mol/L)，置于冰箱中(0～4℃)避光保存。在试管中依次加入3.0ml DPPH溶液和0.5ml样品溶液，混匀，避光反应30min，在517nm下测吸光度值(A)，平行测定3次，测定度值记为As；在试管中加入3.0mlDPPH溶液和0.5ml样品稀释溶剂，混匀，测定吸光度值，记为Ao；在试管中，加入3.0mlDPPH溶液稀释溶剂和0.5rnl样品溶液，混匀，测定吸光度值，记为A，。按照下列公式计算清除率(Y1)：

Y1(％)＝[1一(As-Ar)/Ao)]x100

测得枸杞子中总黄酮对DPPH自由基清除率为95.8％，其与Vc的清除能力相当

2)对ABTS+的清除活性

称取0.3721gABTS+，0.0662g过硫酸钾，配制成2000mL的水溶液，摇匀，室温暗室下反应16h。取ABTS+溶液与去离子水各2mL，在734nm处，6min内每隔0.5min测吸光度值，记为A。；取ABTS+溶液与样品溶液各2mL，在同等波长下测吸光度值，记为A1。每个样品重复3次试验，取平均值，并按下式计算枸杞子总黄酮的ABTS+清除率(Y2)。

Y2(％)＝(1-A₁/A₀)x100

测得枸杞子中总黄酮对ABTS+的清除率为94.1％，与Vc的清除能力相当。

需要说明的是：

1、没有作出特殊说明，其工艺或者工序中的温度、压力均为常温常压。

2、浓硫酸、浓盐酸浓度为行业上泛指的或者是公知的浓度，一般指浓度为36％和37.5％。

3.枸杞子就是传统意义上的枸杞，为了与枸杞其他药用部位区别，本文用枸杞子表示。

Claims

1.一种枸杞子总黄酮的提取纯化工艺，其特征是：提取工艺：枸杞子于65℃烘干粉碎后，称取30kg于提取罐，加入300L浓度为80％的乙醇，于温度为60℃～100℃提取2次，每次0.5h～2h，合并滤液，经浓缩过滤后定容到120L，加入3倍浓度为95％乙醇静置24小时后抽滤并将溶液浓缩至120L，将浓缩得到的溶液与石油醚按比例为1∶2的进行萃取2-3次，弃去石油醚层，得到枸杞子总黄酮粗提液；

提取纯化工艺：

(1)采用大孔树脂D101，对粗提液进行纯化：

提前将大孔树脂用浓度为95％乙醇浸泡1d后，进行装柱，用蒸馏水洗至无醇味，将所得到的120L枸杞子总黄酮粗提液上样，上样流速为0.5～1.0ml/min，上样结束后用蒸馏水洗脱到无色，采用Molish反应进行清洗终点的判断，其判断方法为吸取1ml清洗液，加5％α-萘酚乙醇溶液3滴，摇匀，沿试管壁缓缓加入0.5ml浓硫酸，如在试液与浓硫酸的交界面处很快形成紫色环，表明还有糖类物质的存在，判断后，以Molish反应阴性作为清洗终点，再用浓度为50％乙醇进行洗脱，采用盐酸-镁粉反应进行洗脱终点的判断，判断方法是取洗脱液1ml，加少许镁粉振摇后，滴加5～6滴浓盐酸，1～2min内即可显橙红～紫红色，判断后以盐酸-镁粉反应阴性为洗脱终点，收集浓度为50％醇洗液，将其浓缩至第一步枸杞子黄酮纯化液60L；

(2)采用聚酰胺对黄酮进一步的纯化：

将大孔树脂所得的60L第一步枸杞子总黄酮纯化液进行上样，所用聚酰胺的柱体积应大于上样液体，使上样液可以充分分散在聚酰胺中，24小时后，用蒸馏水进行冲洗除杂，以Molish反应进行清洗终点的判断，然后浓度为分别用20％、50％乙醇依次洗脱，20％乙醇洗脱液中主要为杂质，黄酮损失量较少，再用50％乙醇洗脱至盐酸-镁粉反应为阴性，收集洗脱液，所得为具有清除自由基作用的枸杞子总黄酮80g。

2.根据权利要求1所述的一种枸杞子总黄酮的提取纯化工艺，其特征是：在提取工艺中：枸杞子于65℃烘干粉碎后，称取30kg于提取罐，加入300L的浓度为80％的乙醇，于85℃提取2次，每次1h，合并滤液，经浓缩过滤后定容到120L，加入3倍浓度为95％乙醇静置24小时后抽滤并将溶液浓缩至120L，将浓缩得到的溶液按比例为1∶2的溶液与石油醚进行萃取2-3次，弃去石油醚层，得到枸杞子总黄酮粗提液。