CN103003698A - 免疫和氧系统测量以及药物筛选方法和装置 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于监测与免疫系统功能相关的健康以及用于测量毒素和其它应激的影响的方法和装置。本发明还涉及预筛选药物用于制药管线的方法。本发明还涉及使用免疫图谱作为研究工具的方法。本发明还涉及制备用于疾病治疗、疗法或治愈的化合物或药物的方法。

Description

免疫和氧系统测量以及药物筛选方法和装置
优先权要求
本申请要求2010年4月27日递交的美国临时申请号61/328,409的优先权利益，该临时申请以其全部内容引入本文。
背景技术
免疫和氧系统是动物和人对抗疾病的机体功能和防御机制的重要部分。事实上，包括植物和微生物在内的任何有生命的东西均利用内部系统抵抗应激和不利。该系统对疾病应答、供给组织能量、解除污染和药物对机体的毒性、进行神经肌肉信号传导等的能力在不同个体间以及同一个体的不同日是变化的。该系统在本文将简称为“免疫系统”。
例如，患有丙型肝炎、癌症、其它疾病或甚至是身体或心理应激的患者可能有超负荷的免疫系统。旨在提高或调节免疫系统的某些免疫治疗药物，例如用于丙型肝炎的干扰素或用于癌症的细胞因子和/或活化T细胞，有助于个体的免疫系统对抗特定疾病。例如，干扰素能够帮助个体对抗丙型肝炎。不过，不是所有的个体对免疫治疗具有相同程度的反应。
由新泽西医学和牙科大学的机构审查委员会(the Institutional Review Boardof the University of Medicine and Dentistry of New Jersey)批准的评价丙型肝炎患者对干扰素治疗的临床研究显示了对免疫治疗反应间的差异。在该研究的总结中，存在丙型肝炎患者对干扰素治疗的无反应者，这是众所周知的。得克萨斯大学西南医学院(the University of Texas Southwestern Medical School)的WilliamM.Lee博士提供了综述。Lee博士和在9个其他机构的同事从2002到2007年从事HALT-C研究工作。该研究指出对干扰素加利巴韦林治疗有50％-60％的无反应者。在施用干扰素的无反应者和未进行干扰素维持的无反应者之间在肝脏疾病进展速度方面没有显著差异，从这个意义上讲，这些无反应者进一步对长期干扰素维持策略无反应。从该工作提出的问题是：为什么在反应者和无反应者之间有差别？
Hinshaw，Sofer和合作者(Am.J.Physiol Heart Cir.Phys：H742-750(1980))在犬内毒素休克模型中研究体外血液再循环系统时发现体外泵循环系统产生的剪切应激导致自动抗凝作用。也就是说，受应激的血液在外部抗凝剂如肝素不存在下，甚至在剧烈搅动的血液循环系统中也不会凝固。他们进一步从受应激的血液分离了HLF-肝素样生长因子(请参考以下的bNOS)，证明其阻止产生凝血。Hinshaw和合作者(Circ.Shock 1979；6(3)261-9)还指出，犬中该受应激的血液使得犬“治愈”，该自动抗凝犬当用细菌内毒素注射时抗休克。
本发明的发明人Sofer作为新泽西州资助的生物技术研究教授继续从事这一问题，并发现了由受应激血液产生的从血液发出的MOP或分子氧峰(不是活性氧物质)(Comparative Haematology International(1999)9：68-71)。基于Sofer的NJIT生物技术组的成千上万次操作的其他发表的工作强化了许多其它类型的应激：化学、热、pH等产生的氧峰的存在。此处产生的问题是：鉴于MOP在零氧浓度时从血液产生的事实，此时血红蛋白平衡氧含量为零，那么MOP的氧从哪里来？为什么应激释放该氧？为什么应激增强免疫系统对抗细菌内毒素的攻击？这些问题没有被这些研究者所阐明。
虽然Sofer组承认他们用于氧测量的探针可能也读取一氧化氮或H2S或其它化合物的可能性，但是他们没有考虑氧与这些化合物的联合作用，也没有假定NO储存器(reservoir)或其它储存器的存在。
在NO文献的全面综述中，Pieper((Hypertension.1998；31：1047-1060.)GalenM.Pieper，Review of Alterations in Endothelial Nitric Oxide Production in Diabetes))没有教导氧或NO或其它物质在储存器中存在，他也没有提出它们的联合作用。此外，该综述没有考虑这些物质的浓度作为时间函数变化率，即与反应率相关的曲线斜率。他指出NO科学关于许多重大疾病尚无结论。
Maltepe和Sougstad(Maltepe，Emin；Saugstad，Ola Didrik，Oxygen in Healthand Disease：Regulation of Oxygen Homeostasis-Clinical Implications PediatricResearch：March 2009-Volume 65-Issue 3-pp 261-268)提供了在健康和疾病中氧的作用的详细综述。他们没有考虑氧或NO或其它储存器，或它们的联合作用。在背景技术中引用的前述任何参考文献以其全部内容引入本文作为参考。
因此，需要一种评价或量化个体免疫系统避开疾病和应答免疫系统增强药物如干扰素的能力的方法。
发明内容
为提供对本发明的一些方面的基本理解，下面给出本发明的简要概括。该概括不是对本发明的广泛概述。其不意欲确定本发明的关键或重要元素或描述本发明的范围，其唯一目的是以简化的形式提出本发明的概念作为随后提出的更详细说明的前序部分。
根据其主要方面，简言之，本发明的一个实施方案包括一种方法，该方法包括以下步骤：提供至少一个传感器；提供样品，所述样品包含具有一定量的信号传导物质的一定量的体液或物质；确定所述量的信号传导物质的基线值；向所述样品中引入应激；通过所述传感器确定所述样品中的ROX值；和通过所述传感器确定所述样品中的BOX值。此外，本发明的方法包括确定ROX和BOX的浓度随时间变化的步骤。
本发明进一步包括一个装置。所述装置的一个实施方案包括：光学探针和膜探针，该光学探针和膜探针可操作地连接到处理器，所述处理器用于计算给定样品中的ROX值和BOX值。本发明的处理器进一步计算ROX和BOX浓度随时间的变化率。这些变化率由代表性的斜率表示。
本发明进一步包括用于控制ROX和BOX浓度的方法，该方法包括以下步骤：提供至少一个传感器；提供样品或有机体，其包含具有一定量的信号传导物质的一定量的机体物质；确定所述量的信号传导物质的基线值；向所述样品或有机体中引入应激；通过所述传感器确定所述样品或有机体中的ROX值；通过所述传感器确定所述样品或有机体中的BOX值；和向所述样品或有机体中引入控制或阻断物质，所述有机体可以是患者，其中所述控制物质能够改变所述样品或有机体中的所述ROX值或所述BOX值。
此外，本发明还包括预测对器官移植物或药物发生排斥的方法，该方法包括以下步骤：提供至少一个传感器；提供来自准备接受治疗的患者的样品，所述样品包含具有一定量的信号传导物质的一定量的机体物质；确定所述量的信号传导物质的基线值；向所述样品中引入应激，其中所述应激包括一定量的治疗物质且其中所述治疗物质是对所述治疗不可缺少的物质；通过所述传感器确定所述样品中的ROX值；和通过所述传感器确定所述样品中的BOX值。
通过仔细阅读以下附有附图的优选实施方案的详细描述，这些和其它特征及其优点对于评价健康和准备医疗领域的技术人员而言将是显而易见的。
附图说明
在附图中，
图1是根据本发明的一个实施方案的生物系统的示意性表示；
图2是阐明根据本发明的一个实施方案用于测量正被监测的患者的血液样品中的ROX和BOX浓度的方法的步骤的示意图；
图3是阐明根据本发明的一个实施方案用于预测给定药物或其它应激的毒性的方法的步骤的示意图。
图4阐明了通过根据本发明的一个实施方案的方法的步骤获得SOX事件的一种可能性。
图5是根据本发明的一个实施方案的免疫图谱TM的示意性表示；
图6是显示根据本发明的一个实施方案在测试装置上典型的一系列运行的图表；
图7是指示根据本发明的一个实施方案建立测试装置的重现性以及证明ACD(酸-柠檬酸盐-葡萄糖)抗凝剂毒性的另一系列运行的图表；
图8是显示根据本发明的一个实施方案的两次运行的图表，所述两次运行指示由测试装置测定的最大BOX率和转折点数据。
具体实施方式
本发明是用于确定看起来健康的个体的免疫系统抗攻击的状态的方法，用于确定患者对免疫调节剂或增强或改变免疫系统性能的物质的反应及反应能力的方法，所述免疫调节剂或增强或改变免疫系统性能的物质为抵抗疾病例如丙型肝炎中的免疫治疗的一部分的，以及调整免疫调节剂特别是较大剂量时可能有毒性的那些免疫调节剂的剂量的方法。进一步，本发明是用于确定一般健康信息包括个人耐受和克服内部和外部应激的潜能的方法。
本发明是用于量化个体免疫系统避开疾病以及在此方面被免疫增强或调节药物如干扰素所帮助的能力的方法和装置。本发明还可适用于人的神经系统、解毒系统、肌肉系统以及能量产生和传递系统。
当与内标一起使用时，该方法和装置还可用于量化未来潜在药物以及其它化学品的毒性和生理作用。如本文所用，“内标”可以包括可反映或表现被测试样品的特性或品质的任何合适的物质。例如，从牛血液获得的已知为MEDXTM的物质是用于本发明的目的的用于与患者的血液样品相比较的合适的内标。重要地，使用内标如MEDXTM有利于跟踪样品的历史和可靠性。例如，如果样品被破坏且相关的内标也被破坏，则可假定内标和样品均遭受类似的误操作或环境应激。
本发明的方法和装置还可以用于评估生物标志物的有效性。此外，该方法和装置还可以用于确定个体的整体健康状况，包括提供接收和克服应激、疾病和药物治疗的能力的个体强度的信息。
不希望被理论所束缚，认为在本文所有称为“信号传导物质”的氧或含有氧的分子例如一氧化氮和其它免疫系统或机体的信号传导分子例如硫化氢等是机体防御入侵的外源化学物质和有机体的重要且有力的工具。充足量的信号传导物质尤其是氧的储存和释放形成机体免疫系统的不可分割的一部分。
然而，信号传导物质如氧在血浆中例如以非常低的浓度是可溶的。因此，机体必须将信号传导物质以可移动、包装的形式运输到需要的位置如伤口(cut)、肿瘤以及需要大量能量的组织。该种包装形式的信号传导物质被称作氧储存器(ROX)。如本文所用，术语“ROX”指用于穿过血液有效递送的包装或捆绑形式的氧分子以及包括NO和H2S在内的其它信号传导物质。
术语“捆绑”和“包装”可以互换使用，且涉及任何装置例如电磁力或蛋白质包装，通过该装置血液中的细胞包括白细胞将信号传导物质例如氧和NO集中成在血液中可运输的形式，供体内的系统如免疫系统使用。ROX的测量是患者先天免疫活性以及患者将如何对给定治疗或药物立即应答的测量。当ROX受到应激，氧分子从捆绑形式释放。如本文所用，“应激”定义为可以是物理、化学、电磁或其它的任何因素，其改变血液的现有状态或平衡。此外，应激可以是单个全应激例如全治疗剂量的药物，部分应激例如部分治疗剂量，或随着时间给予多于一次的应激例如在一段时间内多次给予的全剂量的治疗药物。
血液或组织中的ROX是血液中可利用的信号传导物质储备的指示剂，并认为是人针对入侵的外源化学物质和有机体攻击提供氧气或其它重要机体物质的先天能力的测量。ROX因应激而释放入血液，除作为对该攻击应答的信号传导物质外，还向有需要的组织例如为了能量而提供信号传导物质。除仅是血红蛋白(通常指示动脉血中当前可利用的氧)的度量外，ROX还是氧、NO和H2S储存器以及存在于血液的所有组分包括血浆和红细胞中的其它信号传导物质的储存器的度量。此外，本发明可用于分析包含信号传导物质储存器的任何体液，包括脊髓液。
另外认为，本文将称之为“BOX”的血液或其它细胞氧和信号传导物质也是免疫系统适应能力的指标。如本文所用，“BOX”是血液细胞氧化消耗能力的测量，即氧、NO或其它信号传导物质(包括被捆绑或包装的)被消耗的速率，其与ROX准备进入血液的速率有关。因此，BOX还是患者的适应性免疫系统强度或血细胞建立针对信号传导物质的容量以及增强信号传导物质递送用于被机体利用的能力的测量。通过监测BOX水平，可以跟踪在较长时间内患者对治疗的反应。BOX还给出触发免疫转换的剂量，并且可用于确定药物的适当剂量。
认为血液中ROX和BOX的正常浓度失衡(其是可测量的)的人和动物(请参见图6和7)更易感疾病并对免疫系统增强药物如干扰素不太有效反应。因此，精确测量ROX和BOX的浓度可能对其中免疫系统和一般健康状况被关注的动物和人的疾病具有临床和诊断价值。如本文所用，术语“失衡”是指BOX、ROX或一般信号传导物质的的水平高于或低于正常范围内，所述正常范围基于从无疾病、放松或没有应激和正常状态的个体或其它有机体获得的数据。认为没有经受内部或外部应激的健康有机体具有正常范围的BOX和ROX值。
进一步认为，机体还需要非常高的持续时间内极度高浓度的信号传导物质如氧。该现象被称为SOX，即超氧化事件。SOX可以由血细胞以及其它组织如胰岛产生。当特定体液中的信号传导物质水平急剧增加时，典型的SOX事件是可检测到的。例如，SOX事件可包括非常大的NO爆发以及O2间隔爆发，并伴有其它的免疫应答的强指示物如乳铁蛋白和髓过氧化物酶。该情况对于对抗癌症或艾滋病或在淋巴结战场中的病原体将是特别有效的。例如，如果SOX事件能被触发，则与信号传导物质捆绑有关的白细胞可返回到患者自己的血液、体液或机体物质用于实际对抗机体疾病或问题。
此外，本发明设想用于在液体或物质中引起或产生SOX事件的方法，该液体或物质不必是目标病人所具有的体液或机体物质。在患者的机体物质太弱或通常不能产生SOX事件的情况下，本发明的方法包括以下步骤：1)提供将被患者的免疫系统接受的合适的液体或物质；2)引起SOX事件；和3)为患者施用能够SOX的材料。基于人获得的体内产生SOX事件的能力，该方法将能使患者更好地抵抗和战胜疾病、药物治疗或其它应激。
另外，相比经受应激的血液的增加量，信号传导物质水平的测量提供关于血液克服应激的先天能力的信息。经受多个连续应激的人血液中该强度的证实在本文称为血液的“转折点”或“转身点”。
因此，本发明的方法和装置测量血液样品中ROX和BOX的浓度。当与表示具有正常ROX和BOX浓度的正常血液的内标化合物相比时，本发明的方法和装置还可测量药物、化学物质和其它应激的毒性以及对它们的生理反应。还可用作研究工具用于研究生物标志物或其它现象。例如，T-淋巴细胞可募集和使用ROX用于氧化攻击，正常细胞可募集和使用ROX用于葡萄糖氧化需求。ROX还有助于解释和提供II型糖尿病胰岛素抵抗的指示。
在本发明的方法中，从患者取血并与健康个体比较。该方法的步骤包括将来自测试个体或患者的一定量的新鲜抽取或冻存血加入测试装置的孔中，该测试装置具有与用于检测和测量ROX、BOX和SOX以及与这些事件有关的其它信息的传感器相连的读取器。适合用于该测量的测试装置的实例是免疫图谱分析仪TM(Immunogram AnalyzerTM，本文也称为“IA”)。免疫图谱分析仪TM产生免疫图谱TM，其提供在该装置上运行的测试数据汇总。免疫图谱TM可用于确定对免疫增强或调节药物(如干扰素)治疗非应答者。
免疫图谱分析仪TM目前在临床试验中。特别地，临床试验正在以丙型肝炎患者和健康患者对照组进行(University of Medicine & Dentistry of New JerseyIRB协议号0120090320)。临床试验的目的是确定ROX和BOX水平的量失衡的患者和在干扰素和利巴韦林补充剂治疗过程中检查他们的进展。预期ROX和BOX水平的测量将影响其它慢性疾病包括糖尿病和某些癌症的治疗。
测试装置的传感器检测样品中ROX和BOX的存在，并输出ROX和BOX的浓度，包括这些浓度随时间的变化。此后，这些输出的浓度与健康个体的那些相比较。
在定期体检期间还可以使用测试装置作为稳态和健康的“基线”指标。例如，可监测运动、沉思、药物、情绪和其它应激等的影响用于改善机体状况或警告可能的弱点。
进一步认为，用化学或其它应激作为封闭系统操作测试装置产生长达几个小时的SOX的实例。
通过使用免疫图谱TM进行的简单血液测试，获得对治疗做出知情建议所需的信息。在示例性测试中，所述步骤包括将约0.05-0.5ml患者血液样品加入孔或小室中。本发明设想合适的小室可以是任何结构的，包括人皮肤，则观察到的读数可通过皮肤被读取而不必取血液样品。ROX和BOX数可通过基于当量(equivalent)O2百分饱和度在零和100％校准的读取器/处理器计算并输出。向上和向下波动、反应速率的斜率和值的范围是可读取的且具有潜在价值。
ROX和BOX浓度失衡表明受抑的免疫系统和对利用免疫增强或免疫调节药物的治疗减少响应的免疫系统。然而，在某些疾病中，ROX和BOX可暂时地升高。对同一患者在一段时间内监测ROX和BOX水平还可以具有临床和诊断价值。因此，测量血液中ROX和BOX水平的本发明的方法可以是用于患者监测、药物筛选、生物标志物评价以及其它相关目的的工具。
通过自身使血液应激或同时测量ROX、BOX和SOX以及随后使用该血液或来自该血液的物质以实现治愈患者是该技术的最终应用。
使用该方法合成ROX、BOX、SOX和其它类似事件的特征用于提供药物、治疗、治愈或方案的目的是该技术的增加应用。
具体而言，本发明将参照其中示意性地表示生物系统的图1进行说明。在图1中，生物系统100包括基质102，其能够可逆地溶剂化信号传导物质108。运输物质104如白细胞，提取和/或捆绑基质中的信号传导物质108′，用于运输到不期望的成分106或用于处理不期望的成分106如感染、癌部位等，以用于清理它们。对于本发明的目的，在基质102中可用量的信号传导物质被称为ROX，通过捆绑能被提取的量的信号传导物质和/或用于在清理不期望的成分中所消耗的量的运输物质是BOX。如将认识到，ROX和BOX均期望在正常的范围内，因为这暗示足够量的信号传导物质和利用信号传导物质的足够能力。
本发明进一步包括用于测量ROX、BOX、SOX和与个体免疫系统或其它机体功能有关的其它成分的装置。特别地，本发明包括能够进行测试的测试装置，除本文所描述的具体应用外该装置还是有用的研究工具。
本发明还可适用于人的神经系统、解毒系统、肌肉系统或能量系统或任何体液，包括捆绑能力，例如白细胞，从而根据个体情况提供关于这些系统克服应激的强度和效力的信息。
在一个实施方案中，本发明的方法包括测量与正常相比血液样品中ROX和BOX浓度的步骤。认为血液中存在的ROX和BOX浓度是用于测量免疫系统提供氧以防御病原体，信号传导和协调免疫反应，以及维持内环境稳态水平的能力的指标。血液中ROX和BOX在人或动物机体所用的如根据施加于机体上的应激所需要的向组织递送大量氧的机制中发挥不可或缺的作用。
因此，本发明可用于与人和动物针对应激的免疫反应相关的许多目的。例如，本发明的方法可用于一般性地评估人和动物的健康，例如在例行身体检查中，以及评估患有癌症、糖尿病和自身免疫缺陷综合征(AIDS)的患者的免疫治疗方案的状态。本发明的方法还可以用于评估运动员在改善其状况中的表现，以及用于测试暴露于污染和其它外部应激的人。本发明的方法可用于研究目前还没有清楚确定的疾病，例如纤维肌痛、神经肌肉疾病和神经退行性疾病。
本发明的方法可用于更快速且廉价的针对毒性和免疫原性预先筛选新药，并监测参与临床试验的个体。因此也可测试其它化学物质、环境污染物或物理应激如温度和压力、情绪应激等。
医生或兽医可使用ROX和BOX作为内环境稳态的度量。其次，他或她可以使用ROX和BOX监测可能对某些药物和/或医疗方案敏感的患者。这至少可通过两种方式进行：通过当给予药物或治疗方案时取血进行实时ROX和BOX测量来监测患者，或通过测量已经暴露于药物或治疗方案(而患者实际上没有暴露于潜在危险的药物或治疗方案)的患者血液样品中的ROX和BOX。
本发明的另一个特征包括机体中的NO的直接测量。在本发明之前，并不能直接测量NO。本文证实了本发明可如何用于癌症预防、预后和治愈以及作为在阐明癌症研究方面的主要问题的研究工具。
发现一氧化氮在防御癌症中是非常关键的。机体为了制造一氧化氮，以下步骤必须发生：1)基因必须编码酶，一氧化氮合酶(NOS)；2)该密码必须被表达；3)酶NOS必须从NOS密码制备；4)该酶必须具有制备一氧化氮所需的所有底物和辅因子；5)该酶必须被激活；和与该发现相关的，6)NO必须以容易运输到并集中在使用部位的形式被捆绑。
NOS编码基因的形式的数目为数百个。这些形式的特征为：内皮型，eNOS；诱导型，iNOS；神经型，nNOS；和线粒体型，mNOS。本发明公开了来自血液的一种新型的NOS-bNOS。
这是最终产品NO，其是最关键的。因此，该讨论将使用简化术语“NOS”用于所有这些类别。
在题为“内皮型一氧化氮合酶在慢性炎症和癌症中的新兴作用”(Anemerging role for endothelial nitric oxide synthase in chronic inflammation andcancer，Cancer Res.2007Feb 15，67(4)：1407-10，L.Ying and L.J.Hofseth)的文献综述文章中，L.Ying和L.J.Hofseth总结NOS调节所有重要的癌症途径，包括细胞凋亡、血管生成、细胞周期、侵袭和转移。这些研究者指出NOS在人实体肿瘤中也失调，以及NOS还在慢性炎症中有一定作用。他们的建议是NOS可作为参数用于癌症预防和治疗中。
在M A Rahman等的题为“在肝细胞癌和周围肝脏中诱导型一氧化氮合酶和环氧合酶-2的共表达：COX-2可能参与丙型肝炎病毒阳性病例的血管生成”(Co-expres sion of inducible nitric oxide synthase and cyclooxygenase-2 inhepatocellular carcinoma and surrounding liver：possible involvement of COX-2 inthe angiogenesis of hepatitis C-virus positive cases Clin Cancer Res 2001 May；7(5)：1325-32)的来自100名患者的人肝脏组织切片研究中，Rahman和他的同事得出结论：尽管NOS单独表达不是预测丙型肝炎病毒阳性(HCV)肝细胞癌(HCC)患者死亡率的预测指标，但NOS和COX-2组合表达确实与HCV/HCC患者死亡率相关。
最近，S Fujita等在题为“内皮型一氧化氮基因的遗传多态性与以铂基双重化疗治疗的晚期非小细胞肺癌患者的总生存期相关”(Genetic polymorphisms in theendothelial nitric oxide gene correlate with overall survival in advancednon-small-cell lung cancer patients treated with platinum-based doubletchemotherapy，BMC Medical Genetics 2010，11：167)的文章中指出NOS有超过160个遗传多态性。他们已经发现了NOS基因的一个特殊的等位基因，该等位基因是非小细胞肺癌(NSCLC)患者生存的标记物。在108名NSCLC患者以及铂基治疗的研究中，该NOS基因是存活的标记物。
一方面，当NOS和COX-2基因表达时，患有HCC的HCV患者不能生存。另一方面，当NOS基因表达时，表达NOS的NSCLC患者确实能生存。该明显的不一致应如何解释？
NOS的基因表达是复杂、昂贵且耗时的分析方法。更重要地，简单的NOS基因表达不足以确定NO确实形成。本发明提供了一种容易地分析可利用NO的工具，IA。此外，其可以使我们假设解释明显不一致的机制。例如，可预测生存的NSCLC患者具有ROXNO机制，而不生存的HVC/HCC患者没有足够的ROXNO，并且COX-2需要氧气，因此其对于ROX是额外的负担。
形成用于测试的解释性疾病模型的能力在寻求癌症治愈中是关键。如本文所用，解释性疾病模型由以下步骤形成：1)创建疾病模型；2)进行临床或研究以验证模型；3)如果模型是正确的，则基于其进行扩大；和4)如果模型是不正确的，则根据数据进行修改或改进。
如图2所示，本发明的一个实施方案包括以下装置和方法步骤。首先，提供具有带传感器或探针20的样品孔10或小室(cell)和读取器/处理器30的测试装置。值得注意的，小室10可以是任何类型的结构，包括人皮肤。将测试探针插入小室中，并校准测试装置，使得信号传导物质水平的读数为零。例如，可将化合物A例如不含信号传导物质的生理盐水溶液加入小室E中，得到无信号传导物质的仪器基线读数。或者，可将不含信号传导物质的气体鼓泡入小室中。
一旦建立显示对信号传导物质为零读数的基线，则将一定量的血液D添加到小室E中。该量的血液D可以是小量的，例如来自测试个体或患者的约0.02mL至约0.10mL之间的新鲜或冻存的血液。为方便起见，可将3.00mL抗凝血样品冻存用于以后分析。也可以分析非常少的血液样品，例如小于约0.02mL。
初始读数由在施加任何应激之前的样品中的信号传导物质的水平构成。然后将化合物A和血液D的混合物暴露于初始应激B。合适的应激将是由给药注射器和/或旋转磁力搅拌器产生的物理剪切应激。然后小室E中传感器确定信号传导物质浓度的下降，其推测由添加应激B所引起。一般地，该信号传导物质浓度的下降产生BOX值，其与系统吸收信号传导物质用于运输的能力相关。该下降之后，信号传导物质浓度的任何升高产生ROX值，其与系统提供信号传导物质储存器的能力相关。
所述测试装置的传感器优选包括两个或更多个传感器-一个可以是基于膜的氧电极22例如极谱克拉克(Clark)氧电极，其测量未结合且因此可以渗透通过膜的O2、NO、H2S和其它信号传导物质。在极谱传感器中，阴极和极化的阳极浸入电解液中，氧和其它信号传导物质渗透通过膜进入电解液。阳极/阴极对使得电流与进入系统的信号传导物质例如氧的量成正比地流动。因此，电流的大小与进入探针或传感器的信号传导物质的量直接相关。显然，由于消耗，基于膜的传感器必然耗尽正测试的物质样品，而由传感器消耗的物质水平在本文中认为具有对实际目的微不足道的量级。
其它传感器24或探针可以是荧光光学溶解氧分析仪例如海洋光学(OceanOptics)钌涂布的纤维光学发光二极管(LED)探针，并且还可以包括其它合适的基于光的设备，包括激光(下文统称为“光学传感器”)，其确定O2和捆绑的O2储存器(ROXO2)的值。其它传感器例如基于芯片的传感器也可以基于价格、方便性以及对新的信号传导和反应物质的敏感性使用。
本发明的测试装置可以包括计算机化系统，其中来自各个探针的数据线与计算机连接，该计算机包括处理器、显示器和操作软件以能够处理和组织通过探针得到的数据以及计算相关事件例如ROX、BOX或SOX事件的值。
如本文所用，“ROXO2”是可测定的O2储存器，而“ROXNO”是可测定的NO储存器。当由血液特别是由正在制备被机体使用的信号传导物质的白细胞捆绑时，ROXO2和ROXNO不能穿过膜传感器。然而，BOX事件发生后，如膜或光学传感器测定的样品中增加的信号传导物质水平(其往往相互关联)得到ROXO2和ROXNO的量。例如，如果膜传感器的读数变为零，这意味着所有未结合的O2已测量或已渗透通过膜，光学传感器随后的读数升高可认为是ROXO2量的另一种测定。类似地，一旦NO膜读数变为零，则意味着所有未结合的NO已测量或已渗透通过膜，该信号传导物质的膜传感器的随后读数升高得到ROXNO的量，假设任何氧由例如光学传感器单独解释。
因此，在这两个或更多个传感器之间，该测试提供O2、NO、ROXO2以及捆绑的储存器(ROXNO)中的NO的读数，如图6和图7所示。对于该实施方案，完整的ROX测量包括ROXO2+ROXNO。因此，膜探针和光学探针的读数一起提供暴露于物理应激B后的样品中的BOX和ROX(ROXO2+ROXNO)的总浓度。此外，图6和图7中曲线斜率获得关于这些组分的反应率而言有价值的信息。例如，信号传导物质水平的升高可以指示ROX事件及其时间，而信号传导物质水平的降低可以指示BOX事件及其计时间。
总之，当信号传导物质正被用于对应激的反应时，信号传导物质的水平将显示下降。不过，一旦发生这些下降，则信号传导物质水平任何随后的的升高都表明之前未检测到的捆绑信号传导物质或信号传导物质储存器的存在及量。
如图2中进一步阐述，接着将化合物A和血液D的混合物暴露于化学应激C。应激C可以是强大的化学物质例如6％含水酚或其它类型的足以基本上释放样品中任何剩余的ROX的应激。然后小室E中的传感器测量氧和NO的任何升高，其据推测是引入应激C的结果。施加该应激后氧和NO的这一升高产生溶液中剩余ROX的量。由测试装置的读取器/处理器30来追踪和记录样品内随时间的诸如这些的信号传导物质的水平。
更重要地，体液的BOX和ROX看起来彼此影响。例如，如果体液具有异常低的ROX，则该相同体液的BOX也将趋向于是低的，因为有较少可用的信号传导物质用于捆绑。同样地，如果体液的BOX是异常低的，因为该体液具有较少的捆绑能力，则ROX也将趋向于是低的，因为将有较少的捆绑的信号传导物质。此外，体液的先天强度可根据随着时间的该体液中可检测的ROX和BOX事件来测定。在比正常强的体液中，与比正常弱的体液相比，添加更多的应激和/或更强的应激将产生在正常范围内的BOX值和/或ROX值，而该比正常弱的体液，如果遭受相同的应激其将产生在正常范围之外的BOX值和/或ROX值。
ROX和BOX浓度的变化可以进一步指示人对应激的反应是急性的还是慢性的。例如，实质上减弱的BOX可以是比较急性与慢性反应的预测指标。应激性事件后如果患者的BOX是异常低的，则患者的反应可能是慢性反应，而应激后如果BOX水平是正常的并且更高，则这可能是急性反应的指示。
本发明还包括用于测量给定药物或其它应激的毒性的方法。该方法不同于图2中的方法，因为可使用内标(或患者的血液)与给定药物或毒素联合用于确定相对于标准的该药物的毒性或个体患者对该药物或毒素的敏感性。如图3所示，提供具有带有传感器20的样品孔10或小室，和读取器/处理器30的测试装置。将化合物A引入测试装置的小室E中。接着将替代血液样品如牛抗凝血的化合物D加入小室E中。然后将化合物A和化合物D的混合物暴露于第一化学应激B。小室E的传感器测量信号传导物质的任何下降，其产生样品中BOX的量。接着，将第二化学应激C加入到小室E中的混合物中。由传感器检测的测量的信号传导物质的升高得到样品中ROX的量。因此，可以测试给定药物的毒性，用于一般药物筛选，或用于为给定患者监测药物毒性。
本发明还包括用于获得SOX事件和用于测量经受该事件的患者的ROX和BOX的方法。如图4所示，将化合物A加入到具有一个或多个传感器的小室E中。将血液样品S加入到小室中。加入物理或化学应激B。由小室测得的信号传导物质的下降得到BOX。可以加入物理或化学应激C等以加强免疫反应的“点火”，并将小室与外部环境封闭。随着时间发生SOX事件并记录。SOX代表血细胞的实际“点火”。因此，当返回到患者时，例如在癌症和AIDS的治疗和/或治愈中，含有该物质的混合物可以最大限度的使用。
为具有临床和诊断价值，将ROX和BOX的浓度读数与健康个体或与同一个体的正常健康状态期间的ROX和BOX浓度读数相比。一般地，如果测试个体或患者的ROX和BOX浓度与健康个体(或在健康期间的同一患者)的ROX和BOX浓度相比在正常范围之外，则测试个体或患者存在失衡，因此可能具有比一般人低的响应疾病攻击的能力或对反应免疫调节剂降低的响应。如果测试个体或患者的ROX或BOX浓度与健康个体的ROX或BOX浓度相比在正常范围内，则预期测试个体对疾病正常响应并且患者对免疫调节具有良好的响应。
如在此可理解，如果使用基于膜的传感器和光学传感器两者均提供与分子氧相关的测量，不过基于膜的传感器检测其它物质如NO。在优选的实施方案中，测量的相关性提供允许间接测定附加组分的分析工具，从而大大扩展诊断和生物信息。
图5提供示意性免疫图谱TM。在免疫图谱中，光学测量的结果表示为时间(T)的函数，其由实线表示，而基于膜的传感器的结果由虚线表示。向上移动的信号表示测量物质的增加，而向下移动的信号表示测量物质的减少。
参考图5，建立基线200，其代表基质中测量的信号传导物质的总量。通常，这两个信号是相似的，除了由基于膜的传感器测量的高水平的NO或其它物质。在特定的时间T1，向系统施加应激从而通过白细胞从基质提取信号传导物质例如用于运输。测得的信号传导物质202的降低与从基质中去除的用于运输的信号传导物质(其在本文称为BOX)相关。在时间T2，增加应激，该添加的应激引起信号传导物质释放到基质中。信号传导物质204的总量是ROX。通过基于膜的传感器208测得的信号传导物质和由光学传感器206测得的信号传导物质(本文称为ROXNO 212)之间的差异，光学传感器206测得的氧量使得可以确定不是氧的信号传导物质，例如一氧化二氮(nitrous oxide)。特别地，在ROX形成后，由膜传感器测定的ROX比由光学传感器测定的ROX大，差异是NO的量。表示为210的ROXO2是ROX的总和减去表示为212的ROXNO。
从本发明的测试装置产生的数据的实例显示在图6中。该图中显示六个运行。从图的左侧开始，第一和第三个运行是用生理盐水重复的。第二个运行是零校准，其中使用氦气泡(或任何其它方法)标记“零”点，20.9％的大气氧平衡用于确定基线。接着的两个运行是用生理盐水/硼酸盐混合物的重复注射，证明在通常用于眼清洗的硼酸盐存下BOX和ROX的增加。最后的运行证明阿司匹林的作用，表明了如从阿司匹林的血管舒张和血液稀释性能所预期的NO的非常快速的释放。该运行还证明了血液中阿司匹林活性机制的新途径：该途径直接且即刻影响血液。该新途径还可有助于发现其它药物的途径和作用。
如进一步显示的，测量O2和NO的具有膜的克拉克型传感器的输出由空心正方形加短虚线表示。光学传感器(带有菱形的实线所示)仅测量O2。为方便起见，显示两个传感器之间的差异(空心圆加长虚线)。两个传感器的下降是由于血液的添加。膜传感器线的下降定义为BOX，由6图中的较小箭头表示。光学传感器曲线下降没有膜传感器那么多。差异空心圆表示不能穿过膜但可光学读取的氧。这是ROXO2。添加应激C的点表示读数大的增加。图6中较大的箭头表示升高，其定义为ROX。要注意膜读数高于光学读数。这意味着已新释放NO(及可能的其它化合物如H2S)。这是由于ROXNO的破裂加上任何即刻产生的NO。本发明提供用于直接确定流体或材料中存在的NO的唯一已知方法。此外，如果被测试的材料最初显示NO零浓度，且此后检测到NO，则在这样的测试运行中进一步显示bNOS的发现。还可以单独或组合使用有或没有膜的其它传感器。
如下所示，表I总结来自图6的数据，表明本发明用于确定药物对血液的毒性和其它作用的用途。当与针对患者血液的生理盐水运行相比，硼酸盐洗眼液和阿司匹林两者都影响ROX和BOX。阿司匹林对同一患者的作用指示对该患者的抗凝血结果。在表中未显示的源于ROXNO以及随后NO合成的NO形成的快速升高在例如血液中阿司匹林的分析方面是有价值的。在图6中，在标记之间的间隔(间隔2秒钟)形成大量的NO。
Figure BDA00002664806300171
通过测试装置可以从典型的测试运行收集大量的附加信息：由检测到的信号传导物 质的下降所指示的BOX可产生几个点的斜率和浓度，从中可以推导出Michaelis-Menten动力学(作为反应速率函数的氧曲线)以及用于分析反应动力学的更复杂的技术。随后缓慢的升高给出氧和NO升高率，该ROX部分给出NO和O2递送率。此外，如果理解血液样品中存在血红蛋白，则由于O2消耗率，该样品中50％饱和水平处的BOX曲线应显示斜率的大幅下降。BOX斜率显示血液和O2消耗机制超出了O2简单扩散出血红蛋白。电磁力也在起作用。特别地，白细胞通过使用电磁力也攫取或使用信号传导物质，其当处于捆绑形式时本质上大概是顺磁性的。因为低于50％饱和度的血红蛋白开始向溶液中释放额外的O2。如果O2消耗是恒定的，则斜率看起来将较浅，因为将添加新的氧。
图7是显示用测试装置进行的12个运行的曲线图。进行这些运行以测试装置的重现性，血液替代标准的处理，以及操作人员在测量血液标准中的技能。从左边开始，前3个运行由实验者1进行。其余的运行由实验者2进行。还测试了ACD抗凝剂的浓度。结果表明，冷冻血液标准轻微降低了BOX和ROX，而较高浓度的ACD加上冷冻最大地降低了ROX和BOX最大，表明标准血液的苛刻处理。
图7的测试结果总结在下面的表II中。这些一系列的运行表明如何确定测试装置的最佳运行浓度和条件，以及如何使用装置训练装置的操作人员。
Figure BDA00002664806300172
对于临床研究，优选地，通过从没有正在服用处方药和描述自己没有病的大量个体取样，获得用于与测试样品相比的ROX和BOX的正常浓度。将从该群体产生ROX和BOX浓度的分布。均值将定义为基线，设定为标准数如100。
以下表III和IV显示从私人诊所收集的数据，其相关于同感染丙型肝炎的个体相比，“正常”个体(在测试时没有疾病的个体)的血液样品的响应。如表III中所例示，建立中等应激标准，并进行一系列的运行以通过膜传感器和光学传感器来测量样品中的氧水平。基于这些测量，在应激状态的血液中，膜传感器检测到大于约20％的氧百分比，而光学传感器检测到大于约11.5％的氧百分比。
表III：私人诊所-中等应激响应
“正常”中等应激
M＜20L＜11.5
表IV显示从来自同一个体的血液样品检测到的ROX、BOX和NO水平。基于ROX、BOX和NO的测量，正常血液显示出约40至约110的ROX，约40至约160的BOX，以及小于约200的NO。该表的目的是显示测定正常ROX和BOX数值范围的方法，用以确定关于BOX和ROX的失衡。与确定BOX和ROX范围在取样个体中是正常的这一事实相比，得到的实际数字是不重要的。例如对于丙型肝炎患者的情况，随着获得更多的临床数据，可以随后调整正常范围。
表IV：私人诊所-ROX、BOX、NO
运行 描述 ROX BOX NO
1 MedX应激标准 82.7 200 206
2 丙型肝炎 110.6 187 237
3 正常 108.3 155 162
4 丙型肝炎 113.9 173 205
5 正常 101.1 101 93
6 正常 91.1 44 45
“正常”ROX：40＜ROX＜110
“正常”BOX：40＜BOX＜160
“正常”NO：NO＜200
以下表V提供与本发明相关的血液转折点有关的信息。随毒素逐渐增加对血液水平的增加进行测试。在应激1BOX读数后，分批而不是一次性加入化学应激。通常，将一定量的毒素，如0.2ml 6％苯酚针对应激2、3和4依次加入三次。在低水平的血液，ROX开始形成，O2和NO水平升高。血液被毒素战胜，O2和NO释放。
在高水平的血液，血液足够强大以克服应激2，O2和NO水平不升高，相反更多的氧被消耗。该水平是转折点，标志着血液克服该应激。
对于上述光学探针，转折点在0.10ml的血液开始。对于膜探针，转折点在0.20ml的血液开始。具有较强血液的人达到转折点将需要较少的血液。这样，可以监测每个个体的免疫系统强度特征(profile)。从而，通过观察作为习惯、运动、药物和毒素暴露等函数的两个单独的特征(光学和膜特征)，每个人都可以优化他们的健康状况。
Figure BDA00002664806300201
图8是显示两个测试的曲线图。这些测试的结果详述于表VI中。显示的数字是百分比饱和度(100％＝水中当量氧的量，用在大气压和25℃下的空气平衡)。0.20和0.05ml血液的运行显示在图8中。最大BOX率来自仅有剪切应激。NO的形成在加入化学应激后并完成运行。
这些数据可以以许多方式使用以评估免疫系统的整体强度。例如，可以对患者针对给定药物观察两个探针的最大BOX率特征，并与之前没有药物的运行比较以评价患者对药物的反应。这还可以用来评估运动员对锻炼方案的反应等。
“转身”点可以从所述运行定位，用于校准受试者的一般免疫强度，很像血液的滴定，如图8所示。
最终NO浓度以及总的NO生成表明血液稀释对于心脏病患者，NO可利用性和ROXNO剂量对于神经肌肉退形性变患者尤其是杜氏肌营养不良患者而言的非常重要的方面，已知神经肌肉退形性变患者尤其是杜氏肌营养不良患者具有NO失衡。
Figure BDA00002664806300211
本发明进一步考虑，ROX和BOX的确定可用于提高活有机体对抗疾病，接受治疗包括器官移植，以及全面改善健康的能力的许多应用。
因此，本发明进一步包括用于控制ROX和BOX浓度的方法，该方法包括以下步骤：1)提供传感器；2)提供包含一定量的机体物质的样品或有机体，所述有机体物质带有一定量的信号传导物质；3)通过传感器确定所述量的信号传导物质的基线值；4)向所述样品或有机体引入应激；5)通过所述传感器确定所述样品或有机体中的ROX值；6)通过所述传感器确定所述样品或有机体中的BOX值；和向所述样品或有机体中引入控制或阻断物质，其中所述控制材料能够改变所述样品或有机体中的所述ROX值或所述BOX值。基于该方法，可以确定成功的控制或阻断物质，并以有效量的控制或阻断物质施用给活的机体，以调整ROX和BOX任何失衡，产生SOX事件或使有机体为即时应激做准备。
本发明进一步包括用于预测对器官移植物或药物发生排斥的方法，该方法包括以下步骤：1)提供传感器；2)提供来自准备接受治疗的患者的样品，所述样品包含带有一定量的信号传导物质的一定量的机体物质；3)通过传感器确定所述量的信号传导物质的基线值；4)向所述样品中引入应激，其中所述应激包括一定量的治疗材料且其中所述治疗材料是对所述治疗即器官移植不可缺少的材料；5)通过所述传感器确定所述样品中的ROX值；和6)通过所述传感器确定所述样品中的BOX值。基于进行该将要治疗取样的患者的ROX和BOX值，可以确定患者接受新器官的能力或对现有移植物的排斥。
那些熟悉生命科学研究的人将理解，在不偏离由权利要求书所定义的本发明实质和范围的前提下，可以对本发明的前述优选实施方案进行许多修改和替换。

Claims (22)

1.用于测定ROX和BOX的方法，该方法包括以下步骤：
提供至少一个传感器；
提供包含一定量的机体物质的样品，所述机体物质含有一定量的信号传导物质；
测定所述量的信号传导物质的基线值；
向所述样品中引入应激；和
通过所述传感器测定所述样品中的ROX值；和
通过所述传感器测定所述样品中的BOX值。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述传感器选自光学探针和膜探针。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述传感器包括光学探针和膜探针。
4.如权利要求1所述的方法，进一步包括提供小室和向所述小室中引入所述样品的步骤。
5.如权利要求2所述的方法，其中所述信号传导物质包括一定量的O2、一定量的NO、一定量的ROXO2和一定量的ROXNO。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述光学探针能够检测所述量的O2和所述量的ROXO2。
7.如权利要求5所述的方法，其中所述膜探针能够检测所述量的O2、所述量的NO和所述量的ROXNO。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述ROX值指示所述样品中捆绑的信号传导物质的量。
9.如权利要求5所述的方法，其中所述ROX值是所述信号传导物质中存在的ROXO2值和ROXNO值的总和。
10.如权利要求1所述的方法，其中所述BOX值等于所述基线值的下降。
11.如权利要求1所述的方法，进一步包括测定所述样品中SOX值的步骤。
12.如权利要求1所述的方法，进一步包括测定所述样品中所述量的机体物质的转折点的步骤。
13.如权利要求1所述的方法，其中所述ROX值和所述BOX值由所述传感器通过人或动物的皮肤测定。
14.用于测量ROX和BOX的装置，其包括：
光学探针和膜探针，该光学探针和膜探针可操作地连接到处理器，所述处理器用于计算给定样品中的ROX值和BOX值。
15.如权利要求14所述的装置，其中所述膜探针是极谱氧电极，其测定所述给定样品中存在的O2、NO、ROXNO或其它信号传导物质的量。
16.如权利要求14所述的装置，其中所述光学探针是钌涂布的纤维光学发光二极管探针，其测定O2和ROXO2的量。
17.如权利要求14所述的装置，进一步包括应激源。
18.如权利要求17所述的装置，其中所述应激源包括至少一个全应激、至少一个部分应激或者在一段时间内多于一次施加的至少一个应激。
19.如权利要求17所述的装置，其中所述应激源是物理应激。
20.如权利要求17所述的装置，其中所述应激源是化学应激。
21.用于控制ROX和BOX浓度的方法，该方法包括以下步骤：
提供至少一个传感器；
提供包含一定量的机体物质的样品或有机体，所述机体物质含有一定量的信号传导物质；
测定所述量的信号传导物质的基线值；
向所述样品或有机体中引入应激；
通过所述传感器测定所述样品或机体中的ROX值；
通过所述传感器测定所述样品或有机体中的BOX值；和
向所述样品或有机体中引入控制或阻断物质，其中所述控制物质能够改变所述样品或有机体中的所述ROX值或所述BOX值。
22.预测对器官移植物或药物发生排斥的方法，该方法包括以下步骤：
提供至少一种传感器；
提供来自准备接受治疗的患者的样品，所述样品包含一定量的机体物质，所述机体物质含有一定量的信号传导物质；
测定所述量的信号传导物质的基线值；
向所述样品中引入应激，其中所述应激包括一定量的治疗物质且其中所述治疗物质是对所述治疗不可缺少的物质；
通过所述传感器测定所述样品中的ROX值；和
通过所述传感器测定所述样品中的BOX值。
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