CN103003427B - 具有佐剂活性的新型核酸及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种核酸，该核酸至少含有送达至树突状细胞的内体的单链DNA和具有TLR3活化能力的双链RNA，该核酸可到达内体上的TLR3，具有强的佐剂活性，但副作用少，因此作为免疫赋活剂、疫苗佐剂、癌症治疗药等的有效成分有用。

Description

具有佐剂活性的新型核酸及其应用
技术领域
本发明涉及一种含有佐剂活性的新型核酸以及含有该核酸的药物组合物、IFN-β表达促进剂、NK细胞活化剂、细胞阻断性T细胞诱导剂、免疫赋活剂、疫苗佐剂以及癌治疗药。
背景技术
作为一种癌症的治疗法有所谓的癌症免疫疗法，该方法提高对患者自身的癌细胞的免疫力，诱导癌的衰退。该癌症免疫疗法的主流是给予作为癌抗原的肽疫苗的方法，但作为提高有效率的方法提倡在给予癌抗原的同时给予活化树突状细胞的佐剂。
本发明人针对用于癌免疫疗法中的佐剂进行研究，发现来源于麻疹病毒的diRNA(defective interference RNA)具有佐剂的功能，并公开在专利文献1中。具体来说是，该diRNA针对人细胞，诱导IFN-β表达，增强NK细胞的NK活性，和癌抗原表位一起对已移植B16黑色素瘤细胞的患癌小鼠给与时，表现出显著的癌衰退效果。但是，因为细胞外的该diRNA不能到达内体上的TLR3(Toll样受体3，Toll-like受体3)，因此在细胞外给药时，发现佐剂活性不充分的问题。另一方面，作为TLR3的合成配体而周知的聚IC(聚肌胞)虽然即使在细胞外给药也具有很强的佐剂活性，但是担心有细胞因子过剩产生(细胞因子风暴)等副作用，存在不能应用于临床的问题。
另一方面，本发明人发现了寡核苷酸(Oligo DNA)，该寡核苷酸可阻断聚IC通过TLR3来诱导IFN-β表达，并报道了该寡核苷酸通过和聚IC共同的受体进入到细胞内，进入的寡核苷酸一部分局部存在于TLR3(非专利文献1)。但是，在非专利文献1中没有记载该寡核苷酸和其他核酸连接而送达到内体上的TLR3的启示，不能预测非专利文献1中所述的寡核苷酸与专利文献1中所述的具有茎环结构的diDNA连接而是否能够送达至内体上的TLR3。
专利文献1：国际公开第2008/065752号
非专利文献1：The Journal of Immunology,2008,181:5522-5529
发明内容
本发明的目的在于提供一种副作用少，可到达内体上的TLR3，且具有很强佐剂活性的核酸。
本发明为了解决上述课题，包含以下各发明。
[1]一种核酸，至少包括送达至树突状细胞的内体的单链DNA和具有TLR3活化能力的双链RNA。
[2]根据所述[1]中所述的核酸，所述单链DNA为以下(a)～(d)中的任意一个，
(a)具有TLR9配体活性的B型或C型CpG-DNA；
(b)在上述(a)中将CpG转换为GpC的DNA；
(c)在上述(b)中将GpC转换为TpC的DNA；
(d)在上述(b)中将GpC转换为CpC的DNA。
[3]根据所述[2]中所述的核酸，其特征在于，所述单链DNA包括序列号1～4、11～14中任意一种所示的碱基序列或该碱基序列的部分序列。
[4]根据所述[1]～[3]中任意一项所述的核酸，其特征在于，所述单链DNA具有15个碱基以上的长度。
[5]根据所述[1]～[4]中任意一项所述的核酸，其特征在于，构成所述单链核酸DNA的核苷酸的全部或一部分经硫代磷酸酯修饰。
[6]根据所述[1]～[5]中任意一项所述的核酸，其特征在于，所述具有TLR3活化能力的双链RNA具有来源于RNA病毒的RNA序列。
[7]根据所述[6]中所述的核酸，其特征在于，所述RNA病毒选自麻疹病毒、仙台病毒、RS病毒、丙肝病毒、脊髓灰质炎病毒以及轮状病毒。
[8]根据所述[7]中所述的核酸，其特征在于，所述具有TLR3活化能力的双链RNA为包括序列号5～7、15～20中的任意一个所示的碱基序列或其互补序列组成的RNA。
[9]根据所述[8]中任意一项所述的核酸，其特征在于，所述具有TLR3活化能力的双链RNA具有40～200个碱基对的长度。
[10]根据所述[9]中任意一项所述的核酸，其特征在于，所述单链DNA和所述双链RNA通过接头序列连接。
[11]根据所述[1]～[9]中任意一项所述的核酸，其特征在于，所述单链DNA和所述双链RNA直接连接。
[12]一种药物组合物，含有所述[1]～[11]中任意一项所述的核酸。
[13]一种IFN-β表达促进剂，含有所述[1]～[11]中任意一项所述的核酸作为有效成分。
[14]一种NK细胞活化剂，含有所述[1]～[11]中任意一项所述的核酸作为有效成分。
[15]一种细胞阻断性T细胞诱导剂，含有所述[1]～[11]中任意一项所述的核酸作为有效成分。
[16]一种免疫赋活剂，含有所述[1]～[11]中任意一项所述的核酸作为有效成分。
[17]一种疫苗佐剂，含有所述[1]～[11]中任意一项所述的核酸作为有效成分。
[18]一种癌症治疗药，含有所述[1]～[11]中任意一项所述的核酸作为有效成分。
[19]一种癌症治疗方法，对哺乳动物给予上述[1]～[11]中任意一项所述的核酸的有效量。
[20]所述[1]～[11]中任意一项所述的核酸在制备癌症治疗药中的应用。
[21]所述[1]～[11]中任意一项所述的核酸在治疗癌症中的应用。
根据本发明，可提供一种副作用小，可达到内体上的TLR3，具有强的佐剂活性的核酸。因为可促进IFN-β的表达、活化NK细胞、诱导细胞阻断性T细胞，所以本发明的核酸作为免疫赋活剂、疫苗佐剂的有用性高。另外，由于在单独给药时有好的肿瘤衰退效果，因此作为癌症治疗药有用。
附图说明
图1为表示使用不含FCS的培养基并评价本发明的核酸对IFN-β启动子活化的结果的图。
图2为表示使用含FCS的培养基并评价本发明的核酸对IFN-β启动子活化的结果的图。
图3为表示评价本发明的核酸对移植荷瘤的衰退效果的试验(第一次)结果的图，(a)为蒸馏水(DW)给药组的结果、(b)为聚IC给药组的结果、(c)为核酸2给药组的结果、(d)为核酸3给药组的结果。
图4为表示评价本发明的核酸对移植荷瘤的衰退效果的试验(第二次)结果的图，(a)为蒸馏水(DW)给药组的结果、(b)为聚IC给药组的结果、(c)为核酸1给药组的结果、(d)为核酸2给药组的结果、(e)为核酸1的内体转移序列(核酸10DN)给药组的结果。
图5为表示评价本发明核酸中双链RNA的长度对IFN-β启动子性能的影响的结果的图。
图6(A)为表示使用含FCS的培养基并评价本发明核酸中内体转移序列(单链DNA)的碱基序列对IFN-β启动子活化的影响的结果的图。
图6(B)为表示使用不含FCS的培养基并评价本发明核酸中内体转移序列(单链DNA)的碱基序列对IFN-β启动子活化的影响的结果的图。
图7为表示使用不含FCS的培养基并评价本发明核酸中内体转移序列(单链DNA)的长度对IFN-β启动子活化的影响的结果的图。
图8(A)为表示使用含FCS的培养基并评价本发明核酸经RIG-I/MDA5路径对IFN-β活化的结果的图。
图8(B)为表示使用含FCS的培养基并评价本发明核酸经RIG-I/MDA5路径对IFN-β活化的结果的图。
图9(A)为表示使用来源于野生型小鼠以及TICAM-1基因敲除小鼠的脾脏树突状细胞来体外评价本发明核酸对IL-6产生的结果的图。
图9(B)为使用来源于野生型小鼠以及TICAM-1基因敲除小鼠的脾脏树突状细胞来体外评价本发明核酸对TNF-α产生的结果的图。
图9(C)为表示使用来源于野生型小鼠以及TICAM-1基因敲除小鼠的脾脏树突状细胞来体外评价本发明核酸对IFN-β产生的结果的图。
图10(A)为表示使用来源于野生型小鼠以及TICAM-1基因敲除小鼠的骨髓树突状细胞来体外评价本发明核酸对IL-6产生的结果的图。
图10(B)为表示使用来源于野生型小鼠以及TICAM-1基因敲除小鼠的骨髓树突状细胞来体外评价本发明核酸对TNF-α产生的结果的图。
图11(A)为表示在本发明核酸对体内细胞因子产生的评价中，核酸2对TNF-α产生的结果的图。
图11(B)为表示在本发明核酸对体内细胞因子产生的评价中，核酸2对IL-6产生的结果的图。
图11(C)为表示在本发明核酸对体内细胞因子产生的评价中，核酸22、核酸23对TNF-α产生的结果的图。
图11(D)为表示在本发明核酸对体内细胞因子产生的评价中，核酸22、核酸23对IL-6产生的结果的图。
图11(E)为表示在本发明核酸对体内细胞因子产生的评价中，核酸22、核酸23对IL-10产生的结果的图。
图12为表示在本发明核酸对移植荷瘤的衰退效果评价中，对B16黑色素瘤荷瘤野生型小鼠的衰退效果的结果的图。
图13为表示在本发明核酸对移植荷瘤的衰退效果评价中，对EL4荷瘤野生型小鼠的衰退效果的结果的图。
图14(A)为表示在本发明核酸对移植荷瘤的衰退效果评价中，对B16黑色素瘤荷瘤野生型小鼠的衰退效果的结果的图。
图14(B)为表示在本发明核酸对移植荷瘤的衰退效果评价中，对B16黑色素瘤荷瘤TICAM-1基因敲除小鼠的衰退效果的结果的图。
图15为表示在本发明核酸对移植荷瘤的衰退效果评价中，对B16黑色素瘤荷瘤野生型小鼠，用体内转染试剂在肿瘤附近皮下给予本发明核酸时的衰退效果的结果的图。
具体实施方式
[本发明的核酸]
本发明的核酸只要为至少含有可送达至树突状细胞内体的单链DNA和具有TLR3活化能力的双链RNA的核酸即可。
不特别限定可送达至树突状细胞内体的单链DNA，只要可从树突状细胞外部进入到细胞内，并达到内体即可。优选的上述单链DNA可举出以下(a)～(d)。
(a)具有TLR9配体活性的B型或C型的CpG-DNA
(b)在上述(a)中将CpG转换为GpC的DNA
(c)在上述(b)中将GpC转换为TpC的DNA
(d)在上述(b)中将GpC转换为CpC的DNA
CpG-DNA是具有在细菌和病毒的遗传因子中特有的CpG基序的DNA。B型CpG-DNA具有强烈诱导B细胞的反应的作用，C型的TLR9配体同时具有B型的作用和A型的作用(强烈诱导NK细胞、浆细胞样树突状细胞的反应)。作为符合上述(a)的单链DNA，可举出ODN 2006、ODN M362、ODN 2395、ODN 1668、ODN 1826、ODN 2007(以上均为商品名、来自InvivGen公司制)。另外，本发明人确认了将上述(a)中CpG转换为GpC的DNA也可送达至树突状细胞内体。而且，本发明人进一步确认了将上述(b)中GpC转换为TpC或CpC的DNA也可送达至内体。
作为可送达至树突状细胞内体的单链DNA，优选举出包括表1中所述的序列号1～4所示的碱基序列的单链DNA。
[表1]
商品名 碱基序列 序列号
ODN M362 tcgtcgtcgttcgaacgacgttgat 1
ODN M362对照 Tgctgctgcttgcaagcagcttgat 2
ODN 2006 tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt 3
ODN 2006对照 tgctgcttttgtgcttttgtgctt 4
*InvivoGen公司制
进一步地，还可以优选使用在序列号2中将GpC转换为TpC的DNA(序列号11)、将GpC转换为CpC的DNA(序列号12)、在序列号4中将GpC转换为TpC的DNA(序列号13)、将GpC换为CpC的DNA(序列号14)等作为可送达至树突状细胞内体的单链DNA。
不特别限定可送达至树突状细胞内体的单链DNA的长度，但确认了若为5个碱基以上，则可达到目标效果。优选为约15个碱基以上。不特别限定上限，但当长度为约25个碱基左右时，认为可达到目标效果。但是，作为可送达至树突状细胞内体的单链DNA长度，优选约5～30个碱基，更优选约15～25个碱基。例如，适合使用包括序列号1～4、11～14中任意一个所示的碱基序列的一部分(部分序列)的DNA，且具有5个碱基以上、优选为15个碱基以上长度的单链DNA。
可送达至树突状细胞内体的单链DNA，优选经硫代磷酸酯修饰(统称为“S化修饰”)的。上述单链DNA可一部分经硫代磷酸酯修饰，也可全部经硫代磷酸酯修饰。更优选全部经硫代磷酸酯修饰。通过硫代磷酸酯修饰，在表现出核酸酶抗性的同时，提高向内体的送达性。
对于具有TLR3活化能力的双链RNA，只要具有TLR3活化能力则不做限定，优选具有来源于RNA病毒的RNA序列。不特别限定于RNA病毒，可为负链单链RNA病毒、正链单链RNA病毒、双链RNA病毒中的任意一个。具体可举出麻疹病毒、仙台病毒、RS病毒、丙肝病毒、脊髓灰质炎病毒、轮状病毒等，优选负链单链RNA病毒的麻疹病毒、仙台病毒和RS病毒，更优选麻疹病毒、仙台病毒和RS病毒的疫苗株。
具有TLR3活化能力的双链RNA的长度不做特别限定，优选约40个碱基对以上，更优选约60个碱基对以上，进一步优选约90个碱基对以上。上限也没有特别限定，但当长度为约150个碱基对左右时，认为可达到目标效果。因此，作为具有TLR3活化能力的双链RNA长度，优选约40～200个碱基对，更优选约60～180个碱基对，进一步优选约90～150个碱基对。
作为具有TLR3活化能力的双链RNA，优选例如包括序列号5～7、15～20所示的碱基序列及其互补序列的双链RNA。序列号5～7、15～20中所示的碱基序列具有来源于习惯性(馴化)麻疹病毒株Edmonston(ED)株的diRNA碱基序列(序列号8)的一部分。序列号5中所示的碱基序列是序列号8中第1017位～第1074位的碱基序列。序列号6中所示的碱基序列是在序列号8中的第1077位～第1152位的5’末端上添加的3个胞嘧啶的碱基序列。序列号7中所示的碱基序列是在序列号8中的第1017位～第1152位的5’末端上添加了3个胞嘧啶的碱基序列。序列号15中所示的碱基序列是在序列号8中的第1077位～第1152位的3’末端上添加3个胞嘧啶的碱基序列。序列号16中所示的碱基序列是在序列号8中的第1017位～第1152位的3’末端添加3个胞嘧啶的碱基序列。序列号17中所示的碱基序列是在序列号8中的第1057位～第1152位的3’末端上添加3个胞嘧啶的碱基序列。序列号18中所示的碱基序列是在序列号8中的第1046位～第1152位的3’末端添加3个胞嘧啶的碱基序列。序列号19中所示的碱基序列是在序列号8中的第1037位～第1152位的3’末端上添加3个胞嘧啶的碱基序列。序列号20中所示的碱基序列是序列号8中的第1017位～第1089位的碱基序列。
本发明的核酸不仅为由可送达至树突状细胞内体的单链DNA和具有TLR3活化能力的双链RNA构成的核酸，还可以含除此之外的核酸(以下称“其他核酸”)。单链DNA可与双链RNA中任意一条链连接。单链DNA与双链RNA可直接连接，也可通过其他核酸进行连接。另外，可以为DNA的3’端与RNA的5’端连接，也可以为DNA的5’端与RNA的3’端连接，但优选DNA的3’端与RNA的5’端连接。
本发明的核酸由可送达至树突状细胞内体的单链DNA、具有TLR3活化能力的双链RNA以及除这些以外的核酸(以下称“其他核酸”)构成时，其他核酸可为单链或双链DNA，也可为单链或双链RNA，还可为DNA与RNA的杂交。优选为双链RNA、或DNA和RNA的杂交。当可送达至树突状细胞内体和单链DNA和具有TLR3活化能力的双链RNA直接连接时，其他核酸可以连接在任意一方的末端，也可以分别连接在两个末端，但是优选连接在DNA的3’端或RNA的3’端。另外，在不破坏本发明核酸的功能的前提下，其他核酸的长度(碱基数目)不做限定。
另外，可送达至树突状细胞内体的单链DNA和具有TLR3活化能力的双链RNA也可通过其他核酸进行连接。即，也可通过接头序列进行连接。接头序列可为单链或双链的DNA，也可为单链或双链的RNA，还可为DNA与RNA的杂交。优选双链RNA或者DNA与RNA的杂交。另外，在无损本发明核酸的功能的前提下，接头序列的长度(碱基数)不做限定。在除了接头序列外，在任意一方的末端或两末端可进一步与其他核酸连接。此时，优选在RNA的3’端连接其他核酸。
本发明的核酸的制备方法不做特别限定，可用公知的方法进行制备。例如，可优选使用一般的核酸的化学合成法。RNA链可优选公知的体外转录法。具体来说，分别合成DNA与RNA连接的链和RNA的互补链，然后在适当的条件下进行双链化，制备得到本发明的核酸。当本发明的核酸包含其他核酸时，也可同样地制备。
[本发明核酸用途]
由于本发明的核酸可送达至树突状细胞内体并活化TLR3，所以可增强各种免疫反应。具体来说，可促进IFN-β表达、活化NK细胞、诱导细胞阻断性T细胞。因此，本发明提供含有上述本发明的核酸作为有效成分的IFN-β表达促进剂、NK细胞活化剂、细胞阻断性T细胞诱导剂、免疫赋活剂、疫苗佐剂。另外，将本发明的核酸对移植癌细胞至皮下而形成肿瘤的小鼠单独给药时，可使肿瘤衰退，因此可知上述本发明的核酸也用于癌症治疗。因此，本发明提供含有上述本发明的核酸作为有效成分的癌症治疗药。
而且，以本发明的核酸为有效成分的上述各类药，由于副作用小而非常有用。虽然认为作为TLR3的合成配体的聚IC，为了活化TLR3之外的细胞内RNA效应器RIG/MDA5，从而引起细胞因子风暴，但本发明核酸中所含的具有TLR3活化能力的双链RNA与聚IC不同，由于选择性地活化介于TLR3下游的TICAM-1的信号传导系统，因此不存在引起细胞因子风暴的担忧。
本发明的药物组合物，可通过适量添加上述本发明的核酸以及药学上可接受的载体或添加剂来成为制剂。具体来说，可为片剂、包衣片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂、液体剂、悬浊剂、乳剂等口服剂，注射剂、输液剂、栓剂、软膏、贴剂等非口服剂。关于载体和添加剂的配合比例，可基于医药领域中通常采用的范围内进行适当设定。对可配合的载体或添加剂不做特别限定，例如可举出水、生理盐水、其他水性溶剂、水性或油性基质等各种载体，赋形剂、粘合剂、pH调节剂、崩解剂、吸收促进剂、润滑剂、着色剂、矫味剂、香料等各种添加剂。
作为可添加入片剂作为可混合到片剂、胶囊剂等的添加剂，例如可使用例如明胶、玉米淀粉、黄芪胶、阿拉伯胶等粘合剂，结晶性纤维素等赋形剂，玉米淀粉、明胶、褐藻酸等膨化剂，硬脂酸镁等润滑剂，蔗糖、乳糖或糖精等甜味剂，薄荷、赤物油(アカモノ油)、樱桃等香味剂等。当制剂形态为胶囊剂时，在上述类型的材料中还可进一步含有油脂等液体载体。用于注射的无菌组合物可根据溶解或悬浮注射用水等赋形剂中的活性物质、胡麻油、椰子油等天然产植物油等通常的制剂实施方法来进行配置。作为注射用的水性液体，例如可使用例如生理盐水、含有葡萄糖、或含有其他辅助药的等张溶液(例如，D-山梨糖醇、D-甘露醇、氯化钠等)等，也可与适当的助溶剂、例如醇(例如乙醇)、多元醇(例如丙二醇、聚乙二醇)、非离子型表面活性剂(例如，吐温-80TM、HCO-50)等并用。作为油性液体，可用蓖麻油、大豆油等，也可与作为助溶剂的苯甲酸苄酯、苯甲醇等并用。另外，也可与缓冲剂(例如，磷酸盐缓冲液、醋酸钠缓冲液)、镇痛剂(例如苯扎氯铵、烟酸普鲁卡因等)、稳定剂(例如人血清白蛋白、聚乙二醇等)、保存剂(例如苯甲醇、苯酚等)、防氧化剂等配合使用。
这样得到的制剂，可给予例如人、其他哺乳动物(例如大鼠、小鼠、兔、羊、猪、牛、猫、犬、猴等)。本发明的药物组合物作为疫苗佐剂给药时，需要和起疫苗作用的抗原一同给药。
本发明药物组合物的给药量、给药频率要考虑到给药目的、给药对象的年龄、体重、性别、病史和给药方法等可进行适当的设定。
实施例
以上通过实施例对本发明进行详细的说明，但本发明并不限定于此。
[实施例1：核酸的合成(1)]
委托株式会社ジーンデザイン或筑波技术产业综合研究所合成表2中所示的10种核酸。即，RNA部分的化学合成中使用了tBDMS RNA amidite，DNA部分的化学合成使用了一般的DNA amidite，S化(硫代磷酸)部分使用PADS。合成方法以使用固相载体的亚磷酰胺法(Scaringe,S.A.et al,；J AM Chem 1998；120:11820-11821)为基本方法，使用最优化后的参数来实施。合成仪使用最适合用于长链合成的ns-8核酸合成仪(ジーンデサイン社制)。合成结束后，使用一般方法除去碱基部分和2’位中存在的保护基，经反向HPLC进行精制后脱盐，得到各单链。将各单链调整至最佳浓度，加入最终浓度为4.1mM的Tris-HCl(pH8.0)和8.3mM的NaCl作为双链化溶液，在最佳的温度条件下加热后，利用-1℃/min的温度梯度慢慢冷却至30℃，完成双链化，冷冻干燥后得到目标核酸。双链化可用12％的非变性凝胶电泳，从单链RNA的泳动位置和双链标记的泳动位置进行相对评价。另外，表2中所示的10种核酸中的一部分是使用利用T7转录试剂盒(EPICENTRE)来合成的体外转录的RNA而制备出双链RNA。
[表2]
a：单链DNA/接头和双链RNA间有缺口
b：全部都经硫代磷酸酯修饰
c：删除序列号9的第1位A的互补碱基
[实施例2：IPN-β启动子活化的评价]
将HEK293细胞(2×105cells/孔)接种于24孔的培养板。用FuGENE HD(Roche Diagnostics)，将人类TLR3表达载体(100ng/孔)与报告质粒P-125(100ng/孔)和作为内部对照载体的phRL-TK(5ng/孔、Promega)一同转染到HeK293细胞。报告质粒p-125含有人类IFN-β启动子(-125～+19)，从东京大学的谷口博士那里得到。另外，同时也制备不表达人TLR3的对照细胞。通过添加空白载体使用于转染的总DNA量均为500ng/孔。培养基使用含加热灭活的10％牛胎儿血清(FCS)和抗生素的低葡萄糖达尔伯克改良伊格尔培养基(Invitrogen)。
从转染起24小时后，交换到不含FCS的培养基或含FCS的培养基中，以达到10μg/mL的方式添加核酸后再培养6小时。作为被测核酸，使用表2中所述的核酸8、核酸10和FITC标示的核酸8、核酸8的内体转移序列、核酸10的内体转移序列、核酸8及10的双链RNA部分。阳性对照中使用聚IC。细胞清洗后，用裂解缓冲液(Promega)裂解细胞，用双荧光素酶报告检测试剂盒(Promega)对萤火虫荧光素酶活性和海肾荧光素酶活性进行定量。用海肾荧光素酶活性对萤火虫荧光素酶活性进行标准化，以相对诱导强度来表示。并且，所有化验都进行了三重测定。
图1中示出使用不含FCS的培养基进行的结果。图1中可清楚得知，对TLR3表达细胞添加核酸8、核酸10时，与添加聚IC的情况相比表现出较强的诱导强度。另外，FITC标记不影响诱导强度。另一方面，添加核酸8的内体转移序列(图中核酸8ODN)、核酸10的内体转移序列)(图中核酸10ODN)、核酸8和10的双链RNA部分(图中双链RNA)时，不显示效果。从该结果可清楚得知，本发明的核酸(核酸8、核酸10)可通过TLR3活化IFN-β启动子。
图2示出使用含FCS的培养基进行的结果。由于在FCS中混入了RNase，因此担心活性降低，但虽然承认多少有降低的趋势，但与图1所示的结果相同地，酸8和核酸10活化了TLR表达细胞的IFN-β启动子。
[实施例3：移植荷瘤的衰退效果(1)]
在C57BL/6J小鼠的侧腹部皮下移植6×105cells/200μL的B16黑色素瘤细胞(B16D8)，随时间测定肿瘤的大小(纵×横×0.4)。细胞移植后第12天向腹腔内给予被测物质或对照物质，评价肿瘤的衰退效果。并且，由于B16黑色素瘤细胞不能表达MHC class I分子，不能诱导杀伤性T-细胞的活化，仅通过介于树突状细胞TLR3的信号增强来活化NK细胞，从而B16黑色素瘤肿瘤衰退。
试验进行2次。第一次试验中，使用表2中所示的核酸2和核酸3作为被测物质。第二次试验中，使用表2中所示的核酸1、核酸4、以及核酸1的内体转移序列(同核酸4的内体送达序列)作为被测物质。两个试验中阴性对照组给予了蒸馏水(DW)，阳性对照组给予了聚IC。核酸的给药量为150μg/只。
第一次的试验结果如图3的(a)～(d)所示。(a)为蒸馏水(DW)给药组(3只)、(b)为聚IC给药组(2只)、(c)为核酸2给药组(3只)、(d)为核酸2给药组(3只)的结果。图的3(a)～(d)中明确可知，本发明的核酸(核酸2、核酸3)显示出与聚IC给药组相同的肿瘤衰退效果。
第二次的试验结果如图4的(a)～(e)所示。(a)为蒸馏水(DW)给药组(2只)、(b)为聚IC给药组(3只)、(c)为核酸1给药组(3只)、(d)为核酸2给药组(3只)、(e)为核酸1的内体转移序列(核酸1ODN)给药组(3只)的结果。图4的(a)～(e)中明确可知，本发明中的核酸(核酸1、核酸4)虽然稍逊于聚IC给药组，但和蒸馏水给药组相比有显著的肿瘤衰退效果。另一方面，(e)只给予核酸1的内体转移序列时，没有肿瘤衰退效果。
[实施例4：核酸的合成(2)]
表3和表4中所示的21种核酸均为委托ジーンデザイン株式会社或筑波技术产业综合研究所合成。合成方法同实施例1。
[表3]
a：单链DNA/接头和双链RNA间有缺口
b：全部都经硫代磷酸酯修饰
c：删除序列号9的第1位A的互补碱基
[表4]
a：单链DNA/接头和双链RNA间有缺口
b：全部都经硫代磷酸酯修饰
c：删除序列号9的第1位A的互补碱基
[实施例5：IFN-β启动子的活化]
使用转染报告质粒p-125且表达人类TLR3的HEK293细胞以及转染报告质粒p-125且不表达人类TLR3的HEK293细胞进行以下实验(参照实施例2)。
(1)基于双链RNA长度的IFN-β启动子活化能力的研究
与实施例2同样地，从各个载体的转染起24小时后交换至不含FCS的培养基中，添加被测核酸至10μg/mL进一步再培养6小时。细胞清洗后，用裂解缓冲液(Promega)裂解细胞，用双荧光素酶报告检测试剂盒(Promega)与实施例2同样地对荧光素酶活性进行定量。作为被测核酸，使用表3和表4中所示的核酸11(双链RNA：79个碱基对)、核酸12(双链RNA：99个碱基对)、核酸13(双链RNA：110个碱基对)、核酸14(双链RNA：119个碱基对)、核酸19(双链RNA：99个碱基对)、核酸20(双链RNA：110个碱基对)、核酸21(双链RNA：119个碱基对)和核酸22(双链RNA：139个碱基对)。阳性对照中使用聚IC。
结果如图5所示。图5中可明确可知，在体外的TLR3依赖性IFN-β启动子的活化中需要约90个碱基对以上长度的双链RNA。
(2)基于内体转移序列的碱基序列的IFN-β启动子活化能力的研究
与实施例2同样地，从各个载体的转染起24小时后交换至不含FCS的培养基或含FCS的培养基中，添加被测核酸至10μg/mL后进一步再培养6个小时。细胞清洗后，用裂解缓冲液(Promega)裂解细胞，用双荧光素酶报告检测试剂盒(Promega)与实施例2同样地对荧光素酶活性进行定量。作为被测核酸，使用表3和表4中所示的核酸16(单链DNA的碱基序列：序列号4)、核酸22(单链DNA的碱基序列：序列号2)、核酸26(单链DNA的碱基序列：序列号11)和核酸27(单链DNA的碱基序列：序列号14)。阳性对照中使用聚IC。另外，还使用了仅内体转移序列(序列号4的单链DNA(图中DNA4)、序列号11的单链DNA(图中DNA11)、序列号14的单链DNA(图中DNA14))。
结果如图6的(A)、(B)所示。(A)为使用含FCS的培养基的结构、和(B)为使用不含FCS的培养基的结果。无论在哪一个培养基中，具有将序列号2的GpC转换为TpC的单链DNA(序列号11)的核酸26、具有将序列号4的GpC换为CpC的单链DNA(序列号14)的核酸27显示出具有TLR依赖性IFN-β启动子活化能力。仅以内体转移序列(单链DNA)不能活化IFN-β启动子。
(3)基于内体转移序列长度的IFN-β启动子活化能力的研究
与实施例2同样地，从各个载体的转染起24小时后交换至不含FCS的培养基中，添加被测核酸至10μg/mL进一步再培养6小时。细胞清洗后，用裂解缓冲液(Promega)裂解细胞，用双荧光素酶报告检测试剂盒(Promega)对荧光素酶活性进行定量。作为被测核酸，使用表4中所示的核酸28(单链DNA的长度：5个碱基)、核酸29(单链DNA的长度：10个碱基)、核酸30(单链DNA的长度：15个碱基)、核酸31(单链DNA的长度：20个碱基)和核酸22(单链DNA的长度：25个碱基)。阳性对照中使用聚IC。
结果如图7所示。图7中可明确可知，即使内体转移序列(单链DNA)的长度即使为5个碱基，也具有体外的TLR3依赖性IFN-β启动子的活化能力，但优选内体转移序列(单链DNA)长度为15个碱基以上，更优选20个碱基以上。
(4)基于RIG-I/MDA5路径的IFN-β启动子活化能力的研究
向转染报告质粒p-125且在不表达人类TLR3的HEK293细胞(24孔板)中用Lipofectamine(Invitrogen)导入被测核酸至1μg/mL，在含FCS的培养基中培养24小时。细胞清洗后，用裂解缓冲液(Promega)裂解细胞，用双荧光素酶报告检测试剂盒(Promega)与实施例2同样地对荧光素酶活性进行定量。实验进行了2次。第一次实验中，作为被测核酸，使用表2和表3中所示的核酸1、核酸2、核酸3、核酸7、核酸11、核酸15、核酸16和核酸17以及序列号3的单链DNA(DNA3)、序列号5与其互补链组成的双链RNA(图中dsRNA5)和序列号16与其互补链组成的双链RNA(图中dsRNA16)。阳性对照中使用聚IC。在第二次实验中，作为被测核酸，使用表4中所示的核酸28(单链DNA的长度：5个碱基)、核酸29(单链DNA的长度：10个碱基)、核酸30(单链DNA的长度：15个碱基)、核酸31(单链DNA的长度：20个碱基)和核酸22(单链DNA的长度：25个碱基)以及序列号16与其互补链组成的双链RNA(图中dsRNA16)。阳性对照中使用聚IC。
结果如图8的(A)、(B)中所示。(A)为第一次实验结果、(B)为第二次实验结果。图8的(A)(B)中可明确可知，双链RNA活化RIG-I/MDA5路径，但连接5个碱基以上的内体转移序列(单链DNA)的双链RNA不活化RIG-I/MDA5路径。
[实施例6：TICAM-1依赖性细胞因子的产生]
(1)从脾脏分离出的树突状细胞(脾脏DC)中的细胞因子的产生
从C57BL/6J小鼠(野生型：WT)和TICAM-1基因敲除小鼠(TICAM-1 KO，发明人制备)分别摘取脾脏，进行胶原酶处理。通过过滤器并溶血后，在培养基中清洗，在使用含抗CDllc微珠的MACS系统(miltenyi biotech)下分离CDllc阳性细胞，作为脾脏DC。
将脾脏DC以5×105个/500μL培养基/孔的方式分别注入到24孔板，添加被测核酸(50μg/ml)后培养24小时。培养基使用含有10％FCS、抗生素、10mMHEPES和55μM 2-ME的RPMI 1640。24小时后，回收培养上清液，用BD CBA试剂盒测定IL-6、TNF-α和IFN-β的产生量。作为被测核酸，使用表4中所示的核酸23和核酸25。阳性对照中使用聚IC。
结果如图9的(A)、(B)、(C)所示。(A)为IL-6的结果、(B)TNF-α的结果、(C)为IFN-β的结果。经核酸23和核酸25处理过的来源于野生型小鼠的脾脏DC，哪一种细胞因子都产生，但经核酸23和核酸25处理过的来源于TICAM0-1 KO小鼠的脾脏DC哪一种细胞因子都几乎不产生。从该结果可知，本发明的核酸通过介于TICAM-1的信号转导发挥效果。
(2)骨髓中分理出的树突状细胞(BMDC)中的细胞因子的产生
从C57BL/6J小鼠(野生型：WT)和TICAM-1基因敲除小鼠(TICAM-1 KO)的大腿骨中采集骨髓液，溶血后悬浮于添加有重组细胞鼠GM-CSF(终浓度10ng/ml，Peprotech社)的培养液(RPMI 1640/10％FCS/2-ME/HEPES)中，以1×106个/ml/孔的方式注射入24孔板，在37℃培养。每隔两天用含rmGM-CSF(10ng/ml)的新鲜培养液进行培养基交换，第六天回收浮游细胞作为BMDC。
将得到的BMDC以1×105个/200μl的AIM无血清培养基(GIBCO社)/孔的方式注入到96孔圆底板，添加被测核酸(10μg/ml)并培养24小时。24小时后回收培养上清液，用BD CBA试剂盒测定IL-6和TNF-α的产生量。作为被测核酸，使用表2中所示的核酸1和核酸2。阳性对照使用聚IC。
结果如图10的(A)(B)所示。(A)为IL-6的结果、(B)为TNF-α的结果。相比于来源于野生型小鼠的BMDC的细胞因子产生量，来源于TICAM-1 KO小鼠的BMDC的细胞因子产生量得到显著抑制。从该结果可知，本发明的核酸通过介于TICAM-1的信号转导发挥效果。
[实施例7：NK活性增强效果]
取出C57BL/6J小鼠的脾脏，用筛粉碎，回收到15ml试管中。溶血后，用培养液清洗，用使用含抗CD49b(DX5)微珠的MACS系统(miltenyi biotech)分离DX5阳性NK细胞。
将在实施例6(2)中分离得到的BMDC(分离后第6天的细胞)以1×105个/200μl的AIM无血清培养基(GIBCO社)/孔的方式播种于96孔圆底板，添加被测核酸(10μg/ml)后预刺激4小时。之后，将分离得到的上述NK细胞(DX5阳性细胞)调整至2×105个/孔，在37℃下共培养24小时。24小时后回收培养上清液，用ELISA(eBiosciense)测定IFN-γ的产生量。
结果如表5所示。本发明的核酸被送达至BMDC的内体，通过活化TLR3，活化NK细胞，促进IFN-γ的产生。
[表5]
核酸 IFN-γ(pg)
核酸1 1150
核酸2 3000
核酸3 795
核酸17 1300
核酸19 980
核酸20 930
核酸21 765
核酸22 520
聚IC 1250
dsRNA-1* 660
dsRNA-2** 314
*：序列号16和其互补链
**：序列号5和其互补链
[实施例8：体内细胞因子的产生]
对C57BL/6J小鼠(8～12周龄，雌性)，以腹腔内给药方式给予被测核酸(50μg)。给药1、3、6小时后麻醉下采血，用BD CBA试剂盒测定血清中的TNF-α、IL-6、IL-10。作为被测核酸，使用表2中所示的核酸2、表4中所示的核酸22、核酸23。作为对照核酸仅使用内体转移序列(序列号1的单链DNA(图中DNA1))。阳性对照中使用聚IC(200μg)。
结果如图11的(A)～(E)所示。(A)为核酸2的TNF-α结果、(B)为核酸2的IL-6结果、(C)为核酸22、核酸23的TNF-α结果、(D)为核酸22、核酸23的IL-6结果、(E)核酸22、核酸23的IL-10的结果。本发明的核酸与阳性对照的聚IC相比，可显著减少体内细胞因子的产生量。从该结果可知，本发明的核酸在给予生物体时没有细胞因子风暴等副作用的担心，认为安全性高。
[实施例9：移植荷瘤的衰退效果(2)]
(1)针对B16黑色素瘤荷瘤野生型小鼠的效果
将B16黑色素瘤细胞(B16D8)以6×105细胞/200μL移植至C57BL/6J小鼠的侧腹部皮下，随时间测定肿瘤的大小(纵×横×0.4)。细胞移植后第12天腹腔内给予被测物质或对照物质，评价肿瘤的衰退效果。使用表4中所示的核酸22作为被测物质。阴性对照组中给予蒸馏水(DW)，阳性对照组中给予聚IC。核酸的给药量为150μg/只。并且，由于B16黑色素瘤细胞不表达MHC class I分子,因此不能诱导伤害性-T细胞的活化，仅通过由介于树突状细胞TLR3的信号而被增强的NK细胞的活性，黑色素瘤肿瘤衰退。
结果如图12所示。图12中明确可知，核酸22示出了与聚IC相同的肿瘤衰退效果。
(2)针对EL4荷瘤野生型小鼠的效果
将EL4细胞(小鼠淋巴肿瘤细胞)以1×106细胞/200μL移植至C57BL/6J小鼠的侧腹部皮下，随时间测定肿瘤的大小(纵×横×0.4)。细胞移植后第7天和第11天腹腔内给予被测物质或对照物质，评价肿瘤的衰退效果。使用表4中所示的核酸24和核酸25作为被测物质。阴性对照组中给予蒸馏水(DW)，阳性对照组中使用聚IC。核酸的给药量为200μg/只。而且，EL4荷瘤小鼠是评价CTL依赖性抗肿瘤效果的体系。
结果如图13所示。图13中可明确得知，核酸24和核酸25虽然均比聚IC差，但与给予蒸馏水(DW)时相比，表现出显著的肿瘤衰退效果。
(3)针对B16黑色素瘤荷瘤TICAM-1 KO小鼠的效果
分别将B16黑色素瘤细胞(B16D8)以6×105细胞/200μL移植至C57BL/6J小鼠(野生型：WT)和TICAM-1基因敲除小鼠(TICAM-1 KO)的侧腹部皮下，随时间测定肿瘤的大小(纵×横×0.4)。细胞移植后第11天腹腔内给予被测物质或对照物质，评价肿瘤的衰退效果。使用表4中所示的核酸25作为被测物质。给予蒸馏水(DW)作为对照物质。核酸的给药量为250μg/只。
结果如图14的(A)(B)所示。(A)为野生型小鼠的结果、(B)为TICAM-1KO小鼠的结果。核酸25在野生型小鼠中与给予蒸馏水(DW)时相比，显示出显著的肿瘤衰退效果，但TICAM-1 KO小鼠中没有显示肿瘤衰退效果。从该结果可知，本发明的核酸显示出通过介于TICAM-1的信号转导发挥效果。
(4)基于使用in vivo jet PEI的核酸给药的移植荷瘤的衰退效果
in vivo jet PEI(フナコシ公司)为内体用转染试剂。用该试剂在肿瘤附近皮下给予本发明的核酸，评价移植荷瘤衰退效果。
分别将B16黑色素瘤细胞(B16D8)以6×105细胞/200μL移植至C57BL/6J的侧腹部皮下，随时间测定肿瘤的大小(纵×横×0.4)。细胞移植后第12天腹腔内给予被测物质或对照物质，评价肿瘤的衰退效果。使用表4中所示的核酸25作为被测物质。阴性对照组中给予蒸馏水(DW)，阳性对照组中给予聚IC。核酸的给药量为50μg/只。按照以下方法配制核酸给药用溶液。分别配制A液(10％葡萄糖：50μl，核酸(50μg)、加DW(DNase，Rnase-free，Ambion)至100μl)和B液(10％葡萄糖：50μl、DW(DNase，Rnase-free，Ambion)：43μl、in vivo jet PEI：7μl)，将A液和B液混合缓慢搅拌后，室温下孵化15分钟。将得到的核酸溶液在肿瘤附近的两处分别皮下给予100μl。
结果如图15所示。图15中可明确得知，核酸25与聚IC相比差，但与蒸馏水(DW)给药时相比，显示出显著的肿瘤衰退效果。
而且，本发明不限于上述的各实施方式和实施例，在权利要求所示的范围内可以进行各种变更，适当组合在不同的实施方式中分别公开的技术手段来得到的实施方式也包含在本发明的技术范围内。另外，本说明书中所述的学术文献和专利文献全部作为参考在本说明书中引用。

Claims (8)

1.一种核酸，其至少包括送达至树突状细胞的内体的单链DNA和具有TLR3活化能力的双链RNA，其中，所述核酸为如下表所示的核酸1、核酸2、核酸3、核酸4、核酸8、核酸10、核酸12、核酸13、核酸14、核酸16、核酸17、核酸19、核酸20、核酸21、核酸22、核酸24、核酸25、核酸26、核酸27、核酸28、核酸29、核酸30和核酸31中的任一种核酸，
在所述核酸中，所述单链DNA和所述双链RNA通过接头序列连接，或者所述单链DNA和所述双链RNA直接连接，
在上表中，a表示单链DNA/接头和双链RNA间有缺口，b表示全部都经硫代磷酸酯修饰，c表示删除序列号9的第1位A的互补碱基。
2.一种药物组合物，含有权利要求1所述的核酸。
3.一种IFN-β表达促进剂，含有权利要求1所述的核酸作为有效成分。
4.一种NK细胞活化剂，含有权利要求1所述的核酸作为有效成分。
5.一种细胞阻断性T细胞诱导剂，含有权利要求1所述的核酸作为有效成分。
6.一种免疫赋活剂，含有权利要求1所述的核酸作为有效成分。
7.一种疫苗佐剂，含有权利要求1所述的核酸作为有效成分。
8.一种癌症治疗药，含有权利要求1所述的核酸作为有效成分。
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