CN102994626A

CN102994626A - 碱性艳兰bo在dna检测中的应用

Info

Publication number: CN102994626A
Application number: CN2011102821644A
Authority: CN
Inventors: 金利泰; 丛维涛
Original assignee: WENZHOU UNDERSUN BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: WENZHOU UNDERSUN BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority date: 2011-09-15
Filing date: 2011-09-15
Publication date: 2013-03-27
Anticipated expiration: 2031-09-15
Also published as: CN102994626B

Abstract

本发明涉及碱性艳兰BO(Victoria pure blue BO，VPBBO)在琼脂糖凝胶上对DNA染色的方法，其中染色液为pH为6-8的含碱性艳兰BO的溶液。另外，本发明还涉及基于上述方法的在琼脂糖凝胶上检测DNA的方法以及用于这些方法的试剂盒等。本发明具有灵敏度高、操作简单迅速、重现性好、染色背景低、线性范围广、可逆性强、使用安全、成本低廉等优点。

Description

碱性艳兰BO在DNA检测中的应用

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体而言，本发明涉及碱性艳兰BO(VPBBO)在琼脂糖凝胶上对DNA染色的方法，其成本低、步骤简单、操作时间短、灵敏度高而且染色后的背景颜色浅。另外，本发明还涉及检测DNA的方法以及用于这些方法的试剂盒等。

发明背景

在生命科学研究领域中，作为生物体内的重要大分子，DNA是研究生命现象与本质的物质基础，其主要功能是储存、传递和表达生物体的遗传信息，DNA与生命的异常现象的发生和遗传性疾病等紧密关联。近年来随着基因组学、功能基因组学和结构基因组学的快速发展，它的应用范围越来越广，几乎渗透到生命科学的各个领域。因此，如何进一步研究和发展高灵敏度、高选择性和简便快捷的DNA测定新体系与新方法，自然成为分析研究工作者关注的研究方向。目前，琼脂糖凝胶电泳是高效分离和分析DNA分子的一种常用方法，使得凝胶上DNA的检测技术对DNA的相关研究起着至关重要的作用。

测定DNA含量的方法有多种，目前用于琼脂糖上DNA研究和测定的方法有荧光染色法、染料染色法、负染法、银染法等。DNA荧光检测法因具有快速便捷、灵敏度高等优点而成为常用的DNA检测方法之一，其使用诸如溴化乙锭(EB)、SYBR green、SYBR gold等荧光染料，如紫外光线(UV)的照射下发出荧光，可用于检测琼脂糖凝胶上的DNA条带[1-4]。然而，这些荧光染料都具有一些不可克服的缺点，尤其是EB，由于其能嵌入DNA分子双螺旋结构中，可破坏DNA样品，从而具有较强的致畸致突变作用，对实验操作者具有潜在危险；此外EB检测的凝胶需要在紫外灯下进行检识，而紫外射线常常导致核酸杂交、聚合，对其结构产生影响。，同时荧光检测仪器设备成本也比较高[5-7]。

因此，肉眼可见、操作简单、无毒、低成本的可视有机染料成为替代荧光染料为DNA染色的选择之一。已经有一些报道公开了可视有机染料用于琼脂糖凝胶上DNA的染色方法，如亚甲蓝[8]、亮甲酚蓝[9]、结晶紫[10]、以及尼罗河蓝[11，12]等。但是，这些染料染色和脱色时间长，而且灵敏度较低，普遍不如荧光染料。

为此，本发明人经过长期实践研究，令人惊讶地在发现成本低的碱性艳兰BO(Victoria pureblue BO，VPBBO)可用于在琼脂糖凝胶上对DNA染色，其可以在10分钟的染色时间内检测出低至0.8-1.6ng级的DNA，灵敏度是尼罗蓝(NB)的四倍，近似EB等荧光染料的灵敏度。另外，本发明人还发明了基于上述染色法的检测DNA的方法以及用于这些方法的试剂盒等。

发明内容

本发明的目的在于提供VPBBO染色法，其能对在琼脂糖凝胶中的DNA染色，该方法安全、操作方便、成本低，而且灵敏度高。另外，本发明的目的还在于提供检测DNA的方法以及用于这些方法的试剂盒等。

VPBBO是一种无毒性的萘基二苯甲烷类染料，其结构式如图1所示。本发明人经研究发现，VPBBO的分子结构和DNA分子具有很强的亲和力，但是VPBBO分子结构和琼脂糖结合的能力则弱得多，从而能够使DNA(相对于琼脂糖凝胶基质)显出颜色。

优选在本发明的第一方面中，所述染色液中碱性艳兰BO的浓度为0.001％至0.01％，优选为0.003％至0.008％，最优选为0.005％。本发明人经研究发现，VPBBO浓度过低，则染色后的颜色强度会有下降，而浓度过高，VPBBO会使背景也过多地染上色，从而降低图像的对比度，如图2。另外，在本文中如未特别指出，所述“溶液”均为水溶液，即溶剂为水，优选明示出其中所含的溶质为所述溶液中的全部溶质；也优选对于液体溶质来说，其百分比浓度指的是体积百分比浓度，而对于固体溶质来说，其百分比浓度指的是质量百分比浓度。

在现有的染色方法中，有机溶剂常用来作为染色的介质或固定剂，用以提高染色强度，从而提高灵敏度。本发明人经研究发现，加入有机溶剂乙醇能更好的溶解VPBBO并能有效提高琼脂糖凝上的DNA染色强度。所述染色液中乙醇浓度为5％至50％，优选5％至20％，最优为10％。优选所述有机溶剂选自甲醇、乙醇、甘油和丙二醇之一或多种。

在现有的染色方法中，无机盐常用来降低凝胶背景上染色的程度。本发明人经研究发现，加入无机盐NaHCO₃后可使凝胶背景上的染色强度达到最强。所述染色液中NaHCO₃浓度为0.01％至5％，优选0.05％至1％，最优为0.1％。优选所述无机盐选自NaHCO₃、NaCl、MgCl₂、ZnCl₂和(NH₄)₂SO₄之一或多种。最优选，本发明第一方面所述的方法中所述的染色液是VPBBO的溶液，其中溶质含VPBBO和NaHCO₃，溶剂为含10％乙醇的水溶液。

染色后，需将琼脂糖凝胶进行脱色，以洗去其表面残留的染色液，然后用于观察结果。优选在本发明的第一方面，所述方法包括在染色后洗涤的步骤。更优选本发明第一方面所述的方法由将琼脂糖凝胶浸入含碱性艳兰BO的染色液中染色的步骤和在染色后洗涤的步骤组成。在本文中，“洗涤”指的是用溶剂清洗琼脂糖凝胶，用以洗去上一步骤残留在琼脂糖凝胶上的试剂。其中，优选溶剂是醇、水、生理盐水或缓冲液，如Tris-HCl缓冲液、PBS缓冲液等。洗涤的时间为1至30分钟，优选是1分钟至10分钟。优选洗涤是先用醇洗然后用水洗。在本发明的具体实施方式中，先用40％乙醇溶液，1％冰醋酸水溶液冲洗2-3分钟，接着用去离子水清洗1分钟。

在本发明的第一方面中，染色的时间为至少5分钟。本发明人研究发现，染色的时间可以不必过长。因此出于节约操作时间的考量，优选在本发明的第一方面中，染色的时间优选为5至240分钟，更优选为10至45分钟，最优选为10分钟。

在第二方面，本发明的目的在于提供用于本发明第一方面所述方法的试剂盒，其包括分装的pH为6-8的含碱性艳兰BO的染色液。所述试剂盒还可以包括分装的醇，如40％乙醇，1％冰醋酸溶液。更优选所述试剂盒中染色液中各组分的含量如本发明第一方面所优选的那样。尽管不优选，但是所述试剂盒还可以包括分装的水，如去离子水。

在本文中，试剂盒具有本领域技术人员所能理解的含义，在本文中，其包括分开的容器，分别包装(即，分装)不同的溶液。这样，不同的溶液之间不会发生混合。其中，容器是任何能够保存其所储存的溶液的容器，如玻璃瓶、塑料罐等，优选是能够长期保存其所储存的溶液的容器。另外，优选本发明第二方面的试剂盒还包括记载有本发明第一方面所述方法的说明书。说明书可以是独立的，如纸质说明书，其被放入试剂盒中；说明书也可以是直接印刷在试剂盒上的，如可以印刷在试剂盒中的一个或多个容器上。

在第三方面，本发明的目的在于提供在琼脂糖凝胶上检测DNA的方法，其包括在琼脂糖凝胶上进行电泳，然后进行本发明第一方面所述的方法。琼脂糖凝胶电泳是本领域常规的技术，其方法步骤及使用的试剂、设备可参见《分子克隆实验指南》(科学出版社，2002)等书籍或实验手册，也有许多已经商品化了。

在第四方面，本发明的目的在于提供用于本发明第三方面所述方法的试剂盒，其包括分装的琼脂糖凝胶电泳试剂和pH为6-8的含碱性艳兰BO的染色液。琼脂糖凝胶电泳试剂是本领域技术人员所熟知的，其可以通过商业渠道容易地购买。所述试剂盒还可以包括分装的醇，如40％乙醇，1％冰醋酸溶液。更优选所述试剂盒中染色液中各组分的含量如本发明第一方面所优选的那样。尽管不优选，但是所述试剂盒还可以包括分装的水，如去离子水。另外，优选本发明第四方面的试剂盒还包括记载有本发明第三方面所述方法的说明书。说明书可以是独立的，如纸质说明书，其被放入试剂盒中；说明书也可以是直接印刷在试剂盒上的，如可以印刷在试剂盒中的一个或多个容器上。

在第五方面，本发明的目的在于提供碱性艳兰BO在制备用于在琼脂糖凝胶上对DNA染色的染色液中的应用。本发明人经研究发现，VPBBO的分子结构和DNA分子具有很强的亲和力，但是VPBBO分子结构和琼脂糖结合的能力则弱得多，从而能够使DNA(相对于琼脂糖凝胶基质)显出颜色。因此，VPBBO作为对琼脂糖凝胶中DNA染色的有效成分可以配制入染色液中，从而制备形成用于在琼脂糖凝胶上对DNA染色的染色液。

为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例和附图仅是为了说明，尤其是权利要求书和说明书中位于括号内的附图标记仅仅是为了方便阅读时的理解，并不构成对本发明范围的限制。显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。另外，本发明引用了公开文献，这些文献也是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本发明进行参考，就好像它们的全文已经在本发明说明书中重复叙述过一样。

附图说明

图1显示了VPBBO的化学结构式。

图2显示了本发明的VPBBO染色法中以不同VPBBO浓度的效果变化曲线，以不同的VPBBO浓度染色得到的强度变化.

图3显示了本发明的VPBBO染色法与其他2种比较例的方法的染色照片，其中，(A)本发明的VPBBO染色法，(B)现有的EB染色法，(C)现有的NB染色法。泳道从左至右上样的λDNA/HindIII分子量标记的量分别为：(1)100，(2)50，(3)25，(4)12.5，(5)6.4，(6)3.2，(7)1.6，(8)0.8ng。

图4显示了本发明的VPBBO染色法与与其他2种比较例的方法在自提的CKGF质粒中的比较图，其中，(A)本发明的VPBBO染色法，(B)现有的EB染色法，(C)现有的NB染色法。泳道最左边是50ngλDNA/HindIII，依次从左往右是进行倍倍稀释的自提的CKGF质粒。

具体实施方式

以下通过具体的实施例进行说明，其中未特别详细说明的材料、步骤均为本领域技术人员所熟知的，如可参见《分子克隆实验指南》(科学出版社，2002)等书籍或实验手册。

1，实验材料

碱性艳兰BO(VPBBO)、溴化乙锭(EB)、尼罗蓝(NB)、EDTA、Tris和冰醋酸购自Sigma-Aldrich Chemical Co.(St.Louis，MO，美国)。λDNA/HindIII购自碧云天生物技术有限公司(上海，中国)。其他化学产物均通过市售渠道购买。

2，电泳和图像分析

根据常规的琼脂糖电泳法进行，简要过程如下：用TAE缓冲液(1mM EDTA，40mMTris-acetate，pH 8.0))溶解琼脂糖并聚合成0.8％琼脂糖凝胶(60mm×60mm×3mm)。分子量标记用Tris-EDTA(TE)缓冲液(10mM EDTA，100mM Tris-Cl，pH 8.0)稀释成各个浓度并上样到凝胶的各个泳道上：对于上样的是λDNA/HindIII分子量标记来说，使得每个泳道的λDNA/HindIII分子量标记的上样量分别为100，50，25，12.8，6.4，3.2，1.6和0.8ng；溴酚蓝和二甲苯胺FF(xylene cyanol FF)作为电泳过程中指示前沿的标记。用Miniprotean III dual slab cells(BioRad，Hercules，CA，美国)和PAC 300(BioRad)进行电泳，电泳直至溴酚蓝到达凝胶底部边缘，一般需要30分钟。

电泳完成后的凝胶分别用以下染色法进行染色并观察显色结果。用VPBBO、NB染色的凝胶利用扫描仪(Epson Perfection V700 Photo，美国)以600dpi的分辨率扫描成图像；用EB染色的凝胶在302nm波长的紫外灯照射下用Molecular Imager Gel Doc XR成像系统(BioRad)拍成照片(图像)，然后用计算机定量分析DNA条带的显色结果，其中图像定量分析软件为MultiGauge software of Science Lab 2006(FUJIFILM Corporation，日本)。

3，本发明的VPBBO染色法的实施例

VPBBO溶解于50％乙醇溶液中配成0.5％的VPBBO溶液。然后，用去离子水将VPBBO溶液稀释成不同浓度的VPBBO溶液，最终溶液中VPBBO的浓度分别为0.0005％至0.01％；同时，将VPBBO溶液通过加入甲醇、乙醇、甘油、丙二醇来调节成含不同有机溶剂种类和浓度的VPBBO溶液，使最终溶液中的有机溶剂的含量分别为0(最初溶解VPBBO的50％乙醇溶液可以忽略不计)或5％至40％；同时，将VPBBO溶液通过加入NaHCO₃、NaCl、MgCl₂、ZnCl₂、(NH₄)₂SO₄来调节成含不同无机盐种类和浓度的VPBBO溶液，使最终溶液中的无机盐浓度分别为0％(调节pH时加入的酸或碱可以忽略不计)至10％。此外，我们还对脱色液进行优化，在脱色液中加入醇、水、生理盐水或缓冲液，如Tris-HCl缓冲液、PBS缓冲液等来调节成含不同有机溶剂种类和浓度的脱色液，使最终溶液中的有机溶剂的含量分别为0或5％至100％。同时加入柠檬酸，苹果酸，冰醋酸，草酸，酒石酸等不同的酸调节成含不同酸种类和浓度的脱色液溶液，使最终溶液中的酸浓度分别为O％至10％。

这一系列实验的结果比较如下：

(1)VPBBO的浓度对染色的影响

溶液中以0.0005％-0.01％VPBBO的浓度分别进行染色，其结果如图2所示，综合DNA条带的检测灵敏度以及DNA和背景之间的图像对比度，发现0.005％的VPBBO浓度是最佳的。尽管浓度低至0.004％，VPBBO仍旧能对凝胶上的DNA进行染色，但是染色后的颜色强度会有下降，而高于0.006％的VPBBO浓度会使背景也过多地染上色，从而降低图像的对比度。

(2)溶液中的有机溶剂对染色的影响

在染色中，甲醇、乙醇、甘油、丙二醇等有机溶剂常用来作为染色的介质或固定剂，用以提高染色强度，从而提高灵敏度。经过实验，发现加入10％乙醇溶液更能有效溶解VPBBO并能有效提高琼脂糖凝上DNA的染色强度。

(3)溶液中的无机盐对染色的影响

在染色中，NaHCO₃、NaCl、MgCl₂、ZnCl₂、(NH₄)₂SO₄等无机盐常用来降低凝胶背景上染色的程度。经过实验，发现加入0.1％NaHCO₃后DNA条带的染色强度最好，但是当无机盐浓度过高或过低时，对其染色强度影响不大或使其降低，故在染色液选用重量体积比为0.1％NaHCO₃。

(4)染色时间对染色的影响

用含0.005％VPBBO，10％乙醇，0.1％NaHCO₃的溶液对不同凝胶分别染色5、10、20、60、120、和240分钟，发现染色时间超过10分钟并不会显著增强DNA条带相对于背景的染色强度，超过10分钟后灵敏度基本保持平稳，而低于10分钟则会时间长度依赖性地降低染色强度。

(5)脱色液中的有机溶剂对染色的影响

在脱色时，优选脱色液溶剂是醇、水、生理盐水或缓冲液，如Tris-HCl缓冲液、PBS缓冲液等。经过实验发现，用40％-60％乙醇溶液洗涤能使DNA在琼脂糖凝胶上的脱色效果达到最好，为了节约成本，我们选用40％乙醇。

(6)脱色液中酸对染色的影响

在脱色时，加入不同的酸进行优化，优选柠檬酸，苹果酸，冰醋酸，草酸，酒石酸等。经过实验发现，在脱色液中加入1％冰醋酸能使DNA在琼脂糖凝胶上的脱色效果达到最好。

(7)脱色时间对染色的影响

用含40％乙醇，1％冰醋酸的洗涤液对不同凝胶分别洗涤0.5，1，3，5，8，10和15分钟，发现脱色时间过长超过3分钟则DNA条带相对于背景的染色强度大幅度降低，而低于3分钟则染色液不能被洗脱，使得染色背景太深，也会降低染色强度。

4，比较例1：现有的EB染色法

根据Sambrook J等[13]的手册进行染色。基本过程如下：电泳后，琼脂糖凝胶浸在0.5μg/mL的EB溶液中染色15分钟。

5，比较例2：现有的NB染色法

根据Yong-II Yang等[12]的论文进行染色。基本过程如下：NB溶解于甲醇配成0.1％的NB溶液，然后用去离子水将其稀释成0.0015％NB溶液。电泳后，琼脂糖凝胶浸在100mL0.0015％NB溶液中染色40分钟，并用50％乙醇洗脱。整个染色过程均在摇床上操作。

6，结果比较

本发明的用VPBBO对在琼脂糖凝胶中的DNA染色的方法能以约20分钟完成，其可以检测到低至0.8ng的λDNA/HindIII分子量标记，接近于现有的EB染色法的0.5ng的检测效果，超过现有的NB染色法的检测极限(参见图3)。

参考文献

[1]Sharp，R.A.，Sugden，B.，Sambrook，J.，Biochemistry 1973，12，3055-3062.

[2]Ohta，T.，Tokishita，S.I.，Yamagata，H.，Mutat.Res.2001，492，91-97.

[3]Suenaga，E.，Nakamura，H.，Anal.Sci.2005，21，619-623.

[4]Tuma，R.S.，Beaudet，M.P.，Jin，X.，Jones，L.et al.，Anal.Biochem.1999，268，278-288.

[5]Brunk CF，Simpson L.Anal.Biochem，1977，82(2)：455-462.

[6]Hardy E，Pupo E，Casalvilla R，Sosa AE，Trujillo LE，Lopez E，Castellanos-Serra L.Electrophoresis，1996，17(10)：1537-1541.

[7]Marks，R.，Cancer 1995，75，607-612.

[8]Daru，Y.S.，Ramesh，K.，Methods Cell.Mol.Biol.1989，1，183-187.

[9]Torres，J.S.，Noyala，P.，Tech.Tips 1993，9，40.

[10]Yang，Y.I.，Jung，D.W.，Bai，D.G.，Yoo，G.S.，Choi，J.K.，Electrophoresis 2001，22，855-859.

[11]Adkins，S.，Burmeister，M.，Anal.Biochem.1996，240，17-23.

[12]Yang，Y.I.，Hong，H.Y.，Lee，I.S.，Bai，D.G.et al.，Anal.Biochem.2000，280，322-324.

[13]Sinden，R.R.，DNA Structure and Function，Academic Press，San Diego，CA 1994，pp.109-110.

Claims

1.在琼脂糖凝胶上对DNA染色的方法，其特征在于，所述方法包括将琼脂糖凝胶浸入pH为6-8的含碱性艳兰BO的染色液中染色。

2.权利要求1所述的方法，其包括染色及在染色后洗涤的步骤。

3.权利要求1或2所述的方法，其中所述染色液中碱性艳兰BO的浓度为0.001％至0.01％，优选为0.003％至0.008％，最优选为0.005％。

4.权利要求1或2所述的方法，其中所述染色液含有10％乙醇，优选所述有机溶剂选自甲醇、乙醇、甘油和丙二醇之一或多种。

5.权利要求1或2所述的方法，其中所述染色液含0.1％NaHCO₃，优选所述无机盐选自NaHCO₃、NaCl、MgCl₂、ZnCl₂和(NH₄)₂SO₄等之一或多种。

6.权利要求1或2所述的方法，其中染色的时间为至少5分钟，优选为5至240分钟，更优选为10至45分钟，最优选为10分钟。

7.用于权利要求1-6之任一所述方法的试剂盒，其包括分装的pH为6-8的含碱性艳兰BO的染色液。

8.碱性艳兰BO在制备用于在琼脂糖凝胶上对DNA染色液中的应用。

9.在琼脂糖凝胶上检测DNA的方法，其包括在琼脂糖凝胶上进行电泳，然后进行权利要求1-6之任一所述方法。

10.用于权利要求9所述方法的试剂盒，其包括分装的琼脂糖凝胶电泳试剂和pH为6-8的含碱性艳兰BO的染色液。