CN102994513A - 以色列金蝎昆虫神经毒素多肽LqhIT2基因的新用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种以色列金蝎（Leiurusquinquestriatushebraeus）昆虫神经毒素LqhIT2基因的新用途，本发明将以色列金蝎昆虫神经毒素多肽LqhIT2用于提高植物的抗虫活性，有效地提高了植物抵御虫害的能力，可以广泛应用于农业领域。本发明还针对水稻提供了一种新的以色列金蝎昆虫神经毒素多肽LqhIT2核苷酸序列SEQIDNO.1，以及含有该基因的表达载体，将该基因转入水稻基因组，能够高效表达以色列金蝎昆虫神经毒素多肽LqhIT2，该高表达的以色列金蝎昆虫神经毒素多肽LqhIT2能诱导水稻产生一定水平的抗水稻稻纵卷叶螟、二化螟和三化螟的保护作用。

Description

以色列金蝎昆虫神经毒素多肽LqhIT2基因的新用途

 

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体地说，本发明涉及一种含以色列金蝎昆虫神经毒素多肽LqhIT2基因的转基因表达载体及其在防御鳞翅目害虫稻纵卷叶螟、二化螟和三化螟的应用。

背景技术

水稻是世界上最重要的粮食作物之一，而环境中的生物和非生物因素都会对水稻的产量和质量产生不利影响，尤其是虫害。稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocis medinalis Guenee)是一类杂食性鳞翅目害虫，主要以水稻叶片为食，造成水稻叶片全叶枯白，受稻纵卷叶螟危害的叶片不能正常的进行光合作用从而导致水稻产量严重下降。二化螟（Chilo suppressalis）是我国水稻上危害最为严重的常发性害虫之一，在分蘖期受害造成枯鞘、枯心苗，在穗期受害造成白穗，一般导致水稻产量减产3%～5%，严重时减产在3成以上。三化螟（Tryporyza incertulas）食性单一，专食水稻，以幼虫蛀茎为害，分蘖期形成枯心，孕穗至抽穗期，形成枯孕穗和白穗，以致颗粒无收。近年来，对于稻纵卷叶螟、二化螟和三化螟的防治和抗虫转基因水稻的研究受到了越来越多的关注。

转基因途径是控制和防治虫害的重要措施之一，目前转基因抗虫应用最多和最广泛的是苏云金芽孢杆菌（Kim EH, Suh SC, Park BS, et al. 2009. Chloroplast-targeted expression of synthetic cry1Ac in transgenic rice as an alternative strategy for increased pest protection. Planta 230:397-405； Weng LX, Deng HH, Xu JL, et al. 2010. Transgenic sugarcane plants expressing high levels of modified cry1Ac provide effective control against stem borers in field trials. Transgenic Res 10:1007-1020）。尽管目前Bt转基因作物能够有效的抵御虫害的取食，但由于广泛的使用，昆虫的不断繁殖和变异，已经导致部分昆虫对Bt蛋白具有抗性（Tang JD, Gilboa S, Roush RT, Shelton AM. 1997. Inheritance, stability and lack of fitness costs of field-selected resistance to Bacillus thuringiensis in diamondback moth (Lepidoptera: Putellidae) from Florida. J Econ Entomol 90:732-741.）。因此，寻找新型的抗虫候选基因仍是当今抗虫防治研究的重点之一和当务之急。

蝎广泛分布于除寒带以外的世界各地区，目前在我国已有记载的有15种。蝎捕食和防卫时靠蝎尾节末端毒腺分泌的蝎毒麻痹或毒死猎物。蝎毒是一组约含30～80 个氨基酸的蛋白质，它们具有神经毒性，是蝎子进行捕食和自卫的重要工具。迄今为止，已有上百种昆虫特异性的神经毒素被相继分离鉴定。根据它们的选择性毒性，可分为昆虫毒素、甲壳动物毒素和哺乳动物毒素。根据它们的大小和作用位点的不同，又分为短链毒素和长链毒素。蝎昆虫毒素对昆虫的高毒性、特异性已有文献报道（Trung NP, Fitches E, Gatehouse JA. 2006. A fusion protein containing a lepidopteran-specific toxin from the South Indian red scorpion (Mesobuthus tamulus) and snowdrop lectin shows oral toxicity to target insects. Omonrice 14:28-43； Wang CS, Leger SRJ. 2007. A scorpion neurotoxin increases the potency of a fungal insecticide. Nature Biotechnol 25:1455-1456；Weng LX, Deng HH, Xu JL. et al. 2010. Transgenic sugarcane plants expressing high levels of modified cry1Ac provide effective control against stem borers in field trials. Transgenic Res 10:1007-1020.）。

到目前为止，还没有出现关于含色列金蝎昆虫神经毒素多肽LqhIT2作为抗虫基因应用于植物害虫防治的研究报道。

发明内容

本发明的目的在于提供以色列金蝎昆虫神经毒素多肽LqhIT2及其编码基因的新用途。

本发明的第二个目的在于提供一种适合于水稻中表达的并具有抗虫活性的以色列金蝎昆虫神经毒素多肽LqhIT2编码基因。

本发明的第三个目的在于提供含有上述基因的表达载体及宿主细胞。

本发明的目的还在于提供含有上述抗虫基因的转基因水稻的制备方法。

本发明研究发现以色列金蝎昆虫神经毒素多肽LqhIT2能够在植物中表达，并能产生抗虫活性。据此，本发明首先提供以色列金蝎昆虫神经毒素多肽LqhIT2或其编码基因在提高植物抗虫性中的应用。所述植物包括但不限于水稻，所述虫为鳞翅目害虫。

为更适合在水稻中表达，本发明还进一步对编码LqhIT2的基因进行了优化，优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供含有上述基因的表达载体，优选该表达载体为植物双元表达载体；更优选的，所述表达载体的出发载体为植物双元表达载体pCAMBIA1301。

上述表达载体中的启动子优选为植物自身启动子，对于水稻而言，更优选的启动子是水稻绿色组织特异性启动子rbcS promoter。

本发明还包括含有上述表达载体的宿主细胞，包括但不限于大肠杆菌宿主细胞、农杆菌宿主细胞等等。

本发明还提供制备包含以色列金蝎昆虫神经毒素多肽LqhIT2基因的转基因水稻的方法，其包括以下步骤：

A、根据水稻密码子偏爱性，人工合成以色列金蝎昆虫神经毒素多肽LqhIT2基因核苷酸序列，通过PCR扩增得到序列为SEQ ID NO.1所示的全长序列；

B、酶切步骤A得到的序列和植物双元表达载体pCAMBIA1301，构建转基因植物双元表达载体；

C、将步骤B中得到的转基因植物双元表达载体转化入农杆菌宿主细胞；

D、培养包含转基因植物双元表达载体的农杆菌宿主细胞，并在合适条件下，侵染水稻愈伤；

E、筛选阳性愈伤并获得含有色列金蝎昆虫神经毒素多肽LqhIT2基因的转基因水稻植株。

本发明的优点和效果

本发明将以色列金蝎昆虫神经毒素多肽LqhIT2用于提高植物的抗虫活性，有效地提高了植物抵御虫害的能力，可以广泛应用于农业领域。

本发明针对水稻提供了一种新的以色列金蝎昆虫神经毒素多肽LqhIT2核苷酸序列，可用于转基因水稻植株在预防和抵御鳞翅目害虫中的应用。

本发明含以色列金蝎昆虫神经毒素多肽LqhIT2基因在水稻绿色组织特异性启动子的调控下，能够在转基因水稻中高效表达LqhIT2。在转基因水稻离体叶片法检测以色列金蝎昆虫神经毒素多肽LqhIT2对稻纵卷叶螟抗性实验中，使转基因水稻叶片的损害率仅为29.64%，与对照相比，叶片损害率降低了63.54%；在转基因水稻植株水平检测以色列金蝎昆虫神经毒素多肽LqhIT2对稻纵卷叶螟抗性实验中，转基因水稻叶片取食率仅为3.71%，而对照叶片取食率为35.33%。在转基因水稻植株水平检测以色列金蝎昆虫神经毒素多肽LqhIT2对二化螟抗性实验中，转基因水稻单株枯心率和总枯心率分别为36.64%和32.48%，而对照的单株枯心率和总枯心率则分别为97.18%和93.57%。在转基因水稻植株水平检测以色列金蝎昆虫神经毒素多肽LqhIT2对三化螟抗性实验中，转基因水稻单株枯心率为41.64%，与对照相比，单株枯心率降低了55.23%；同时转基因水稻的总枯心率为39.84%，而对照叶片取食率为97.98%。该蛋白可以作为抗稻纵卷叶螟、二化螟和三化螟农药应用；该蛋白的基因可以作为一种抗植物鳞翅目害虫的基因资源，在抗鳞翅目害虫植物育种中有很大的应用价值。

附图说明

图1是本发明实施例1重组质粒pCAMBIA1301-rbcS promoter-以色列金蝎昆虫神经毒素多肽LqhIT2的PCR和双酶切鉴定图。在图1中，M：DNA标志物（DL2000）；1：重组质粒HindⅢ、XbaⅠ双酶切鉴定; 2：重组质粒XbaⅠ、KpnⅠ双酶切鉴定; 3：重组质粒PCR鉴定（rbcS promoter引物SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3）；4：重组质粒PCR鉴定（LqhIT2基因引物SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5）。从图1可以看出，在“1”、“3”泳道都有明显的1600bp大小的rbcS promoter条带，表明经PCR扩增出的rbcS promoter基因片段，成功地插入了植物双元表达载体pCAMBIA1301的多克隆酶切位点。在“2”、“4”泳道都有明显的189bp大小的LqhIT2条带，表明经PCR扩增出的LqhIT2基因片段，成功地插入了植物双元表达载体pCAMBIA1301的多克隆酶切位点。

图2是本发明实施例2以色列金蝎昆虫神经毒素多肽LqhIT2基因转基因水稻植株的PCR鉴定图。在图2中，M：DNA标志物（DL2000）；1：阴性对照无菌水为模板的PCR鉴定；2：野生型材料粤泰基因组DNA的PCR鉴定（LqhIT2基因引物SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5）；3-8：转基因材料pCAMBIA1301-rbcS promoter-以色列金蝎昆虫神经毒素多肽LqhIT2基因组DNA的PCR鉴定（LqhIT2基因引物SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5）。从图2可以看出，在“1”，“2”泳道无189bp大小的LqhIT2条带。在“3”-“8”泳道都有明显的189bp大小的LqhIT2条带，表明LqhIT2基因片段成功地转入到水稻基因组DNA。

具体实施方式

下面结合具体实施例阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规实验条件，《分子克隆实验手册》（第三版）【J.萨姆布鲁克等编著，2003，北京：科学出版社】中所述的条件进行，或按照制造厂商所建议的条件。

本发明利用重组DNA技术将以色列金蝎昆虫神经毒素多肽LqhIT2基因的编码序列克隆至植物双元表达载体，并使其成功的导入水稻和在转基因水稻中高效表达。转基因水稻可应用于鳞翅目害虫稻纵卷叶螟、二化螟和三化螟抗性实验，以评估其抗稻纵卷叶螟、二化螟和三化螟的保护效果，为抗稻纵卷叶螟、二化螟和三化螟水稻植株的筛选提供重要的参考价值。

实施例1  

以色列金蝎昆虫神经毒素多肽LqhIT2基因编码序列转基因植物双元表达载体的构建：本实施例中得到一新的基因核苷酸序列，是前人所未报道过的。

1.引物扩增

查找水稻绿色组织特异性启动子rbcS promoter基因在Genebank中的序列设计引物，根据这一部分序列设计引物如下：

Sense：5’-CCCAAGCTTTCGGGTCGAGGTGAACTTTA-3’ (SEQ ID NO.2)

Anti-sense：5’-GCTCTAGAAGATGCACTGCTCTGCACAC-3’ (SEQID NO.3)

根据水稻密码子的偏爱性人工合成以色列金蝎昆虫神经毒素多肽LqhIT2的核苷酸序列（SEQ ID NO.1），本实施例中的核苷酸序列是前人未报道过的。根据这一部分序列设计引物如下：

Sense: 5’-GCTCTAGAATGGACGGCTACATCAAG-3’ (SEQ ID NO.4)

Anti-sense: 5’-GGGGTACCTTAGCCGCAGGTGTTG-3’ (SEQ ID NO.5)

分别引入限制性内切酶Hind Ⅲ、XbaⅠ和KpnⅠ酶切位点（下划线部分）。rbcS promoter基因的扩增以PMD18T-rbcS保存质粒为模板进行PCR。LqhIT2开放阅读框的扩增以PMD18T- LqhIT2保存质粒为模板进行PCR。采用的植物双元表达载体pCAMBIA1301为卡那霉素和潮霉素抗性的高效表达载体，该载体设计有多克隆酶切位点，可以插入外源基因片段rbcS promoter基因编码序列和LqhIT2基因编码序列。将扩增rbcS promoter基因编码序列和LqhIT2基因编码序列的PCR产物经胶回收、双酶切后，与同样双酶切的质粒pCAMBIA1301于16℃连接过夜，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，均匀涂布于含卡那霉素（50μg/ml）的LB平板。随机挑取单一菌落扩大培养，提取质粒，进行PCR及双酶切鉴定，将初步鉴定正确的阳性克隆质粒进行测序。结果如图1所示。

2.克隆测序

重组质粒DNA经测序得知,重组质粒中插入片段rbcS promoter的序列与Genebank中公布的日本晴rbcS promoter完整编码区完全一致，达到100%的吻合度；重组质粒中插入片段LqhIT2序列与 SEQ ID NO.1完全一致，达到100%的吻合度，可以证明本发明成功将rbcS promoter-LqhIT2的编码序列插入了植物双元表达载体，且插入方向正确。

实施例2

以色列金蝎昆虫神经毒素多肽LqhIT2基因转基因水稻植株的培养：本实施例中可以得到大量含以色列金蝎昆虫神经毒素多肽LqhIT2基因的转基因水稻。

1、将测序正确的阳性克隆的质粒pCAMBIA1301-rbcS promoter-LqhIT2转化至农杆菌EH105A感受态细胞中，涂布于含有卡那霉素和利福平的LB平板上，挑取单一菌落，鉴定正确后接种于含有卡那霉素和利福平的液体LB培养基中，30℃预培养两天；

2、将水稻（Oryza sativa）愈伤转移至含OD₆₀₀=0.4-0.6农杆菌悬浮液的无菌三角瓶中浸泡30分钟，再转移至无菌滤纸上吸干水分，放置共培养基上19-20℃培养3天；

3、含800mg/L头孢霉素的无菌水洗涤愈伤8-10次至看不见农杆菌，将愈伤转移至无菌滤纸上吸干水分，再转移至含40mg/L潮霉素选择培养基上选择培养6-8周；

4、将抗性愈伤转移至分化培养基光照培养2周至愈伤成苗；

5、将幼苗转移至生根培养基光照培养2-3周，至苗子长出根系后炼苗一周，再转入大田培养。

按照上述的转基因方法，共得到59株转基因植株，PCR鉴定其中50株为阳性植株，阳性率约为84.74%。结果如图2所示。

实施例3

以色列金蝎昆虫神经毒素多肽LqhIT2的抗鳞翅目虫害稻纵卷叶螟作用：本实施例中以色列金蝎昆虫神经毒素多肽LqhIT2对鳞翅目害虫稻纵卷叶螟有很好的防御作用，可以作为一种抗虫基因被利用，其编码序列可作为抗植物虫害基因资源应用于抗植物虫害作物品种的选育。

1、用离体叶片法检测LqhIT2对稻纵卷叶螟取食水稻叶片的防御作用：取粗细相似的粤泰和粤泰转LqhIT2基因系（实施例2制得）叶片，基端用湿棉花球保湿，呈对称型排列于玻璃培养皿内，将试虫引入到培养皿中心，任其自由选食，72小时后计数粤泰和粤泰转LqhIT2基因系叶片的取食面积，计算叶片损害率：叶片损害率%=叶片损害面积/叶片总面积×100%。表1结果表明以色列金蝎昆虫神经毒素多肽LqhIT2对稻纵卷叶螟具有很好的防御作用。

表1  LqhIT2对稻纵卷叶螟取食水稻叶片的防御作用

水稻品系	叶片取食率（%）
		粤泰（对照）	93.18%
粤泰转LqhIT2基因系	29.64%

2、植株水平上检测LqhIT2对稻纵卷叶螟取食水稻叶片的防御作用：将野生型水稻粤泰和粤泰转LqhIT2基因系材料分别栽入塑料桶中，分蘖盛期分别向粤泰和粤泰转LqhIT2基因系接种稻纵卷叶螟幼虫5-10头，并加网罩。接虫后7天考察稻株叶片取食面积，计算叶片取食率。计算叶片取食率：叶片取食率%=损害叶片数/总叶片数×100%，实验结果如表2所示。LqhIT2转基因系在植株水平对稻纵卷叶螟具有很好的防御作用

表2  LqhIT2转基因水稻植株水平对稻纵卷叶螟取食水稻叶片的防御作用

水稻品系	叶片取食率（%）
		粤泰（对照）	35.33%
粤泰转LqhIT2基因系	3.71%

实施例4

以色列金蝎昆虫神经毒素多肽LqhIT2的抗鳞翅目虫害水稻二化螟作用：本实施例中以色列金蝎昆虫神经毒素多肽LqhIT2对鳞翅目害虫水稻二化螟有很好的防御作用，可以作为一种抗虫基因被利用，其编码序列可作为抗植物虫害基因资源应用于抗植物虫害作物品种的选育。

植株水平上检测LqhIT2对二化螟取食水稻的防御作用：将野生型水稻粤泰和粤泰转LqhIT2基因系（实施例2制得）分别栽入塑料桶中，孕蘖期分别向粤泰和粤泰转LqhIT2基因系接种二化螟幼虫5-10头，并加网罩。接虫后一个月考查各稻株中有无枯心，计算枯心率。计算枯心率：植株单株枯心率%=单株植株枯心茎杆数/单株植株总茎杆数×100%；植株总枯心率%=测试植株总枯心茎杆数/测试植株总茎杆数×100%，实验结果如表3所示。LqhIT2转基因系对二化螟具有很好的防御作用。

表3  LqhIT2转基因系对二化螟取食植株的防御作用

水稻品系	单株枯心率（%）	总枯心率（%）
			粤泰（对照）	97.18%	93.57%
粤泰转LqhIT2基因系	36.64%	32.48%

实施例5

以色列金蝎昆虫神经毒素多肽LqhIT2的抗鳞翅目虫害三化螟作用：本实施例中以色列金蝎昆虫神经毒素多肽LqhIT2对鳞翅目害虫三化螟有很好的防御作用，可以作为一种抗虫基因被利用，其编码序列可作为抗植物虫害基因资源应用于抗植物虫害作物品种的选育。

植株水平上检测LqhIT2对三化螟取食水稻的防御作用：将野生型水稻粤泰和粤泰转LqhIT2基因系（实施例2制得）分别栽入塑料桶中，孕蘖期分别向粤泰和粤泰转LqhIT2基因系接种三化螟幼虫5-10头，并加网罩。接虫后一个月考查各稻株中有无枯心，计算枯心率。计算枯心率：植株单株枯心率%=单株植株枯心茎杆数/单株植株总茎杆数×100%；植株枯心率%=测试植株总枯心茎杆数/测试植株总茎杆数×100%，实验结果如表4所示。LqhIT2转基因系对三化螟具有很好的防御作用。

表4  LqhIT2对三化螟取食植株的防御作用

水稻品系	单株枯心率（%）	总枯心率（%）
			粤泰（对照）	96.87%	97.98%
粤泰转LqhIT2基因系	41.64%	39.84%

以上所述实施例仅表达了本发明部分具体实施方式，其描述较为详细，但并不能理解为对本发明范围的限制。此外应理解，在阅读了本发明上述内容后，本领域技术人员在不脱离本发明构思的前提下，可以对本发明作出若干修改和润饰，这些形式同样属于本发明的保护范围。

序列表

 

<110>  武汉大学

 

<120>  以色列金蝎昆虫神经毒素多肽LqhIT2基因的新用途

 

<130> 

 

<160>  5    

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  183

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  1

gacggctaca tcaagcgccg cgacggctgc aaggtggcct gcctcatcgg caacgagggc       60

 

tgcgacaagg agtgcaaggc ctacggcggc tcctacggct actgctggac ctggggcctc      120

 

gcctgctggt gcgagggcct cccggacgac aagacctgga agtccgagac caacacctgc      180

 

ggc                                                                    183

 

 

<210>  2

<211>  29

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

cccaagcttt cgggtcgagg tgaacttta                                         29

 

 

<210>  3

<211>  28

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  3

gctctagaag atgcactgct ctgcacac                                          28

 

 

<210>  4

<211>  26

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  4

gctctagaat ggacggctac atcaag                                            26

 

 

<210>  5

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  5

ggggtacctt agccgcaggt gttg                                              24

Claims (10)

1.以色列金蝎昆虫神经毒素多肽LqhIT2或其编码基因在提高植物抗虫性中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述植物为水稻。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述虫为鳞翅目害虫。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

5.编码以色列金蝎昆虫神经毒素多肽LqhIT2的基因，其核苷酸编码序列为SEQ ID NO.1所示。

6.含有权利要求5所述基因的表达载体。

7.根据权利要求6所述的表达载体，其特征在于，其出发载体为pCAMBIA1301。

8.根据权利要求6或7所述的表达载体，其特征在于，启动所述基因表达的启动子为水稻绿色组织特异性启动子rbcS promoter。

9.含有权利要求6~8任一项表达载体的宿主细胞。

10.制备包含以色列金蝎昆虫神经毒素多肽LqhIT2基因的转基因水稻的方法，其特征在于，包括以下步骤：

A、根据水稻密码子偏爱性，人工合成以色列金蝎昆虫神经毒素多肽LqhIT2基因核苷酸序列，通过PCR扩增得到序列为SEQ ID NO.1所示的全长序列；

B、酶切步骤A得到的序列和植物双元表达载体pCAMBIA1301，构建转基因植物双元表达载体；

C、将步骤B中得到的转基因植物双元表达载体转化入农杆菌宿主细胞；

D、培养包含转基因植物双元表达载体的农杆菌宿主细胞，并在合适条件下，侵染水稻愈伤；

E、筛选阳性愈伤并获得含有色列金蝎昆虫神经毒素多肽LqhIT2基因的转基因水稻植株。

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