CN102993276B - 一种具有免疫活性的多肽衍生物及其内参抗体的制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有免疫活性的多肽衍生物及其内参抗体的制备方法和应用，所述多肽衍生物具有下列序列结构：R8(Kys)₄-(Lys)₂-Lys-Gly，其中，R表示多肽片段，其序列为：YDESGPSIVHRKCF-GSK。根据本发明实施例的具有免疫活性的多肽衍生物，一个赖氨酸支架上同时合成八个目的多肽，该目的多肽大大的增加了多肽抗原的分子量及抗原性，从而免去偶联载体蛋白，使抗原的特异性更好。

Description

一种具有免疫活性的多肽衍生物及其内参抗体的制备方法和应用

技术领域

本发明涉及化学合成技术领域，更具体地，本发明涉及一种具有免疫活性的多肽衍生物及其内参抗体的制备方法和应用。

背景技术

目前，常用的多肽化合物没有完整的免疫原性，免疫时需要偶联载体蛋白，并且特异性不强，灵敏度不高，制备方法复杂。更重要的是由于制备后的抗原含有载体蛋白，所以用此抗原制备的抗体会产生抗载体蛋白的抗体，有时会对后期的实验产生不良影响即非特异性反应。

发明内容

本发明旨在至少解决上述技术问题之一。

为此，本发明的一个目的在于提出一种具有完整免疫原性，且制备方法简单的具有免疫活性的多肽衍生物。

根据本发明实施例的具有免疫活性的多肽衍生物，具有下列序列结构：R₈(Kys)₄-(Lys)₂-Lys-Gly，其中，R表示多肽片段，其序列为：YDESGPSIVHRKCF-GSK。

根据本发明实施例的具有免疫活性的多肽衍生物，一个赖氨酸支架上同时合成八个目的多肽，该目的多肽大大的增加了多肽抗原的分子量及抗原性，从而免去偶联载体蛋白，使抗原的特异性更好。

本发明的另一个目的在于提出一种具有免疫活性的多肽衍生物及其内参抗体的制备方法，其具体操作步骤可以包括：

a）提供9-芴基甲氧羰酰基保护的氨基酸（Fmoc-AA）并使其活化，得到活化氨基酸；

b）将所述活化氨基酸与P-羟甲基苯氧甲基多聚乙烯树脂（HMP树脂）反应，得到连接有氨基酸的树脂；

c）脱除所述连接有氨基酸的树脂的Fmoc保护基；

d）将脱除Fmoc保护基的连接有氨基酸的树脂与过量的活化羧基组份偶联，并脱去偶联后活化氨基组份的氨基保护基；

e）重复步骤d）至脱去偶联后活化氨基组份的氨基保护基的数目为8，得到八分支活化氨基组份骨架；

f）将所述八分支活化氨基组份骨架同时连接8个相同的多肽，得到肽树脂，将所述肽树脂分离提纯，得到具有免疫活性的多肽衍生物。

根据本发明实施例的具有免疫活性的多肽衍生物及其内参抗体的制备方法，其合成过程在自动化的多肽合成仪上完成，制备工艺简便，结构准确，偶联率高，周期短，自动化程度高。

为了快速得到八分支活化氨基组份骨架，所述活化氨基组份优选为赖氨酸。当所述活化氨基组份为赖氨酸时，在脱去偶联后活化氨基组份的氨基保护基过程中便可脱去两个氨基保护基，再与过量的赖氨酸偶联时，就可以与两个赖氨酸同时偶联，再脱去偶联后活化氨基组份的氨基保护基时便可脱去四个氨基保护基。依此类推，第三次脱除过程便可脱去八个氨基保护基，得到八分支活化氨基组份骨架。

所述八个相同的多肽R优选为YDESGPSIVHRKCF-GSK，由此，便可得到具有免疫活性的多肽衍生物(YDESGPSIVHRKCF-GSK)₈(Kys)₄-(Lys)₂-Lys-Gly。

关于具有免疫活性的多肽衍生物的分离提纯，具体可以包括：

f-1）用三氟乙酸(TFA)结合清除剂与所述肽树脂反应，以将所述具有免疫活性的多肽衍生物从肽树脂上分离；

f-2）反应后去除清除剂，并用萃取液萃取，得到具有免疫活性的多肽衍生物粗品；

f-3）将具有免疫活性的多肽衍生物粗品进行纯化，得到具有免疫活性的多肽衍生物。

关于清除剂的选择，没有特殊限制，只要能将所述具有免疫活性的多肽衍生物从肽树脂上分离即可，优选地，所述清除剂为1，2-乙二硫醇（EDT）、硫代苯甲醚和水的混合溶液。为了保证反应的充分进行，反应时间优选3h。

所述萃取液的选择也没有特殊限制，考虑到成本问题，所述萃取液优选为乙醚。

关于具有免疫活性的多肽衍生物的纯化，采用高效液相色谱分离纯化，其具体操作条件为：

由此，可制得纯度为98%以上的具有免疫活性的多肽衍生物。

本发明还提出了一种具有免疫活性的多肽衍生物在制备抗体中的应用。

基于所述具有免疫活性的多肽衍生物具有完整的免疫原性，则根据该具有免疫活性的多肽衍生物制备而成的抗体具有特异性强，灵敏度高，稳定性好的特点，为广大科研人员提供了高质量的抗体，同时为开发其它多肽抗体开辟了一条新思路。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1是根据本发明实施例的具有免疫活性的多肽衍生物高效液相色谱分析示意图。

具体实施方式

以下通过具体实施例来进一步描述本发明，下列实施例用于说明目的，而非用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，可按照常见的分子克隆手册所述的条件进行操作。下列实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买所得。

实施例1具有免疫活性的多肽衍生物的制备

一、试验材料

HMP resin（P-羟甲基苯氧甲基多聚乙烯树脂，Wang树脂）购于Merck公司

Fmoc-AA(9-芴基甲氧羰酰基保护的氨基酸)购于Merck公司

NMP氮甲基吡咯烷酮  购于Merck公司

DCM二氯甲烷  购于Merck公司

MeOH甲醇  购于Merck公司

Piperidine哌啶  购于Merck公司

DMAP二甲基氨基吡啶  购于Sigma公司

HOBT羟基苯并三唑  购于Sigma公司

DCC二环已基碳二亚胺  购于Sigma公司

TFA三氟乙酸  购于Sigma公司

EDT 1，2-乙二硫醇  购于Sigma公司

硫代苯甲醚  购于Sigma公司

结晶苯酚  购于北京化学试剂公司公司

乙腈  购于Merck公司

二、试验仪器

多肽自动合成仪：美国CSBio 336型多通道多肽自动合成仪

旋转蒸发仪：日本YAMATO CE50型旋转蒸发仪

高效液相色谱仪：Waters 600E型

冷冻干燥机：美国Virtis

真空循环水泵：郑州长城科贸公司SH-B型

离心机：美国SIGMA公司

三、试验步骤

1、活化Fmoc-AA。

所述Fmoc-AA的结构式如下所示：

也可表示为：

所述Fmoc-AA通过与二环己基碳二亚胺（DCC）和羟基苯并三唑（HOBT）反应活化，其反应式如下所示：

DCC   HOBt    Fmoc-AA    活化氨基酸    DCU

2、将活化氨基酸连接到树脂上。

将所述活化氨基酸与P-羟甲基苯氧甲基多聚乙烯树脂（HMP树脂）在DMAP条件下反应，得到连接有氨基酸的树脂，其反应式为：

3、脱除连接有氨基酸的树脂的Fmoc保护基。

在Piperidine哌啶作用下，脱除连接有氨基酸的树脂的Fmoc保护基，具体反应式如下所示：

4、将步骤3所得树脂与过量的活化羧基组份偶联，并脱去偶联后活化氨基组份的氨基保护基。

5、重复上述步骤，至脱去的氨基保护基数目为8，得到八分支活化氨基组份骨架。

6、将八分支活化氨基组份骨架同时连接8个YDESGPSIVHRKCF-GSK多肽，得到肽树脂，将肽树脂分离纯化，得到具有免疫活性的多肽衍生物。

关于肽树脂的分离纯化，具体可以包括以下步骤：

6-1）用三氟乙酸(TFA)结合1，2-乙二硫醇（EDT）、硫代苯甲醚和水混合而成的清除剂与所述肽树脂反应，以将所述具有免疫活性的多肽衍生物从肽树脂上分离，反应时间为3h；

6-2）反应后去除清除剂，并用乙醚进行萃取，得到具有免疫活性的多肽衍生物粗品；

6-3）将具有免疫活性的多肽衍生物粗品进行纯化，得到具有免疫活性的多肽衍生物。

其中，所述纯化采用高效液相色谱分离纯化，其具体操作条件为：

四、试验结果

将得到的具有免疫活性的多肽衍生物进行HPLC（高效液相色谱）分析，分析条件为：

色谱柱：C₁₈ 4.6×150mm

流动相:A-0.1%TFA（三氟乙酸）H₂O

       B-0.1%TFA（三氟乙酸）于乙腈

检测波长：214nm

流速：1ml/min

洗脱梯度：0-60%

洗脱时间30分钟

分析结果如图1所示，结果表明，具有免疫活性的多肽衍生物纯度约为98%。

实施例2具有免疫活性的多肽衍生物的抗体制备及检测

一、试验材料

根据实施例1制备所得具有免疫活性的多肽衍生物；

实验用新西兰兔。

二、试验步骤

将实验用新西兰兔经过基础免疫（完全佐剂+多肽抗原充分乳化）和多次加强免疫（不完全佐剂+多肽抗原充分乳化）背部多点免疫后，在血清中抗体IgG浓度达到高峰时行耳静脉取血，分离血清，得到具有免疫活性的多肽衍生物的抗体。

通过ELISA方法检测抗体的灵敏度，即效价；通过Western blot方法检测抗体的特异性；通过免疫组织化学法检测此抗体在细胞中的表达部位。

三、试验结果

通过ELISA方法检测抗体的灵敏度：检测结果显示具有免疫活性的多肽衍生物的抗体效价达1:128000。

通过Western blot方法检测抗体的特异性：Actin beta蛋白的分子量是42kDa,根据本发明实施例1制备的抗体做Western blot实验，结果显示分子量是42kDa，与理论分子量完全相同，且无杂带，证明根据本发明实施例的抗体的特异性极好。

通过免疫组织化学法检测此抗体在细胞中的表达部位：用根据本发明实施例的抗体检测小鼠的心肌细胞，其表达部位在细胞浆，表达部位准确，证明根据本发明实施例的抗体在小鼠的心肌细胞表达部位准确。

根据本发明上述实施例可以说明，本发明的具有免疫活性的多肽衍生物大大的增加了多肽抗原的分子量及抗原性，免去了偶联载体蛋白，使抗原的特异性更好，并且根据该多肽衍生物成功地制备出特异性强，灵敏度高，稳定性好的兔抗多种属的抗体，为广大科研人员提供了高质量的抗体，同时为开发其它多肽抗体开辟了一条新思路。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (8)

1.一种具有免疫活性的多肽衍生物，所述多肽衍生物的序列结构为：R₈(Lys)₄-(Lys)₂-Lys-Gly，其中，R表示多肽片段，其序列为：YDESGPSIVHRKCF-GSK。

2.一种根据权利要求1所述的具有免疫活性的多肽衍生物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

a)提供9-芴基甲氧羰酰基保护的氨基酸(Fmoc-AA)并使其活化，得到活化氨基酸；

b)将所述活化氨基酸与P-羟甲基苯氧甲基多聚乙烯树脂(HMP树脂)反应，得到连接有氨基酸的树脂；

c)脱除所述连接有氨基酸的树脂的Fmoc保护基；

d)将脱除Fmoc保护基的连接有氨基酸的树脂与过量的活化羧基组份偶联，并脱去偶联后活化氨基组份的氨基保护基；

e)重复步骤d)至脱去偶联后活化氨基组份的氨基保护基的数目为8，得到八分支活化氨基组份骨架；

f)将所述八分支活化氨基组份骨架同时连接8个相同的多肽，得到肽树脂，将所述肽树脂分离提纯，得到具有免疫活性的多肽衍生物，所述多肽为YDESGPSIVHRKCF-GSK。

3.根据权利要求2所述的具有免疫活性的多肽衍生物的制备方法，其特征在于，在步骤a)中，所述Fmoc-AA通过与二环己基碳二亚胺(DCC)和羟基苯并三唑(HOBT)反应活化。

4.根据权利要求2所述的具有免疫活性的多肽衍生物的制备方法，其特征在于，所述活化氨基组份为赖氨酸。

5.根据权利要求2所述的具有免疫活性的多肽衍生物的制备方法，其特征在于，步骤f)包括：

f-1)用三氟乙酸(TFA)结合清除剂与所述肽树脂反应，以将所述具有免疫活性的多肽衍生物从肽树脂上分离；

f-2)反应后去除清除剂，并用萃取液萃取，得到具有免疫活性的多肽衍生物粗品；

f-3)将具有免疫活性的多肽衍生物粗品进行纯化，得到具有免疫活性的多肽衍生物。

6.根据权利要求5所述的具有免疫活性的多肽衍生物的制备方法，其特征在于，所述清除剂为1，2-乙二硫醇(EDT)、硫代苯甲醚和水的混合溶液，步骤f-1)的反应时间为3h。

7.根据权利要求5所述的具有免疫活性的多肽衍生物的制备方法，其特征在于，所述萃取液为乙醚。

8.根据权利要求5所述的具有免疫活性的多肽衍生物的制备方法，其特征在于，所述步骤f-3)的纯化采用高效液相色谱分离纯化。