CN102985066B - 藤构提取物及其制造方法以及含有该提取物的化妆品组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及藤构提取物的制造方法、通过该方法制造的藤构提取物及含有该提取物的化妆品组合物，更具体地，本发明涉及藤构提取物的制造方法，其中，包括使用超高压、超临界或油提取法提取藤构，从而增加有效成分，提高皮肤美白、抗老化、抗皱、保湿或弹力改善效果。本发明还涉及通过该方法制造的藤构提取物及含有该提取物的化妆品组合物。此外，本发明涉及藤构或其提取物的发酵方法、通过该方法制造的发酵提取物及含有该发酵提取物的化妆品组合物。更具体地，本发明涉及将藤构或其提取物进行发酵的方法，其中，包括将藤构或其提取物进行自然发酵，或添加发酵菌株或一定量的盐进行发酵，并利用溶剂提取发酵的藤构或其提取物，从而防止对人体有害的例如腐败菌、大肠杆菌和厌氧细菌等各种细菌的繁殖，去除恶臭，相比现有的提取物能够提高皮肤美白、抗老化、抗皱、保湿及弹力改善效果。本发明还涉及通过该方法制造的发酵提取物及含有该发酵提取物的化妆品组合物。

Description

藤构提取物及其制造方法以及含有该提取物的化妆品组合物
技术领域
本发明涉及藤构提取物的制造方法、由此制造的藤构提取物及含有该提取物的化妆品组合物。更具体地，涉及将藤构或其提取物通过超高压、超临界或油提取法提取而增加有效成分的提取物的制造方法。
此外，本发明涉及将藤构或其提取物通过自然发酵或添加发酵菌株或一定量的盐进行发酵后，用溶剂进行萃取而防止对人体有害的腐败菌、大肠杆菌及厌气性细菌等杂菌繁殖，除去恶臭的发酵方法。
本发明还涉及相比现有的提取物能够提高美白、抗老化、抗皱、保湿及弹力改善效果的藤构提取物的制造方法，通过此方法制造的藤构提取物及含该提取物的化妆品组合物，或藤构或其提取物的发酵方法、该方法得到的发酵提取物及含有该提取物的化妆品组合物。
背景技术
藤构的韧皮纤维用作造纸的原料，且已知具有多种药效而具有强壮、明目作用、阳痿、水肿、益气及利尿等效果，还具有祛风、清血，对视力减退也有效果。
超高压技术是人为地施加1GPa即约1万atm以上的压力的技术，用于钻石合成或金属加工等，近来也用于天然物提取。
超临界流体是指达到了超过一定高温和高压界限的状态而无法区分液体和气体的临界点的流体。分子的密度接近于液体，但是粘度低而接近气体的性质，扩散快、导热性高而有效用于化学反应。利用这种超临界流体的提取方法为超临界萃取。
另外，近来对传统发酵食品的关注提高，开发出了利用上述发酵工艺的多种提取物的制造方法。随之也开发出了利用发酵韩药材等相比现有的韩药材具有更优异的性能的韩药材提取物的功能食品、化妆品。
盐藏法(用盐腌制)作为传统的食品储藏法的一种，一直以来在动物性食品及植物性食品中都得到应用。盐藏法是在食品中添加盐而防止腐败及污染，帮助发酵的方法，通常用于咸菜、大酱及腌制海鲜类的制造。
发明内容
技术问题
本发明发明人研究提高藤构提取物中的有效成分的方案，结果发现使用超高压、超临界或油提取法提取藤构时，美白、抗老化、抗皱、保湿及弹力改善效果优异，从而完成了本发明。另外，还发现将藤构或其提取物进行自然发酵，或添加发酵菌株或一定量的盐发酵后，将发酵液用溶剂提取的藤构发酵提取物的美白、抗老化、抗皱、保湿及弹力改善效果也优异，由此完成了本发明。
因此，本发明的目的在于提供能够提高藤构提取物中的有效成分含量的藤构提取物的制造方法及含有通过上述方法制造的藤构提取物的化妆品组合物。
此外，本发明的另一目的是提供能够提高藤构提取物中的有效成分含量的藤构或其提取物的发酵方法及其发酵提取物。
技术方案
为了实现上述目的，本发明提供包括将选自藤构的根、茎、叶、花及果实组成的组中的至少一种用超高压、超临界或油提取法提取的步骤的藤构提取物的制造方法及含有通过上述方法制造的藤构提取物的化妆品组合物。
另外，本发明还提供将藤构或其提取物进行自然发酵、菌发酵或盐藏发酵的发酵方法及通过上述方法获得的藤构发酵提取物。
有益效果
本发明的方法提取的藤构提取物由于有效成分的增加而其美白、抗老化、抗皱、保湿及弹力改善效果优异。
此外，通过本发明的方法发酵的藤构发酵提取物也由于有效成分的增加，美白、抗老化、抗皱、保湿及弹力改善效果优异，盐藏发酵提取物能够防止对人体有害的大肠杆菌或厌气性细菌等引起的腐败及污染。
附图说明
图1是本发明使用的超高压机的照片。
图2是本发明使用的超高压机的截面图。
图3是为了确认盐对有害微生物生长的影响，在大肠杆菌(Escherichia coliATCC 8739)、绿脓菌(Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027)及黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC 6538)培养时，涂覆天日盐溶液后确认清除区的生成与否的结果。
具体实施方式
本发明涉及能够提高藤构提取物中的有效成分含量的藤构或其提取物的发酵方法。
下面详细说明本发明。
本发明涉及利用超高压、超临界或油提取法制造藤构提取物的方法，本发明的提取方法包括将选自藤构的根、茎、叶、花及果实中的至少一种，添加水或C1至C5的低级醇，在10-90℃下经4-24小时提取有效成分的步骤；及将上述提取物用超高压、超临界或油提取法加工的步骤，所述超高压、超临界或油提取法加工的步骤可与所述提取步骤同时或依次进行，利用低级醇的提取过程也可以省略。
根据本发明实施方式可以利用超高压技术制造藤构提取物。例如，将藤构的根、茎、叶、花或果实在20-50℃、50-300Mpa压力下进行10-20分钟的超高压处理而提取，优选在25-35℃、70-200Mpa压力下进行10-15分钟的超高压处理。
根据本发明的实施方式，使用了图1及图2中图示的结构的超高压机进行超高压处理，但并不限于此。图2中所述超高压机由气缸(cylinder)部位、在气缸部装载被加压物的工艺处理室(Processing Chamber)、加压活塞(Pressuring Piston)、调节气缸外部温度的水循环套(Water circulation jacket)及油泵等构成，在实验室规模(Lab scale)下HHP的最大压力(max.Pressure)为600Mpa，作用体积(Working volume)为0.6L左右，在产业上可常用的条件为中试规模(Pilot-scale)UHP设备(35L)为例，最大压力为2000Mpa、作用体积最大为35L。
根据本发明的实施方式，可以利用超临界技术制造藤构提取物。此时，超临界流体可以使用二氧化碳、氮、一氧化二氮、甲烷、乙烯、丙烷及丙烯等；优选使用超临界二氧化碳。这是因为在超临界流体中二氧化碳的临界压力为73.8bar，临界温度为31.1℃的低温，因为制造超临界条件，二氧化碳本身没有毒性、费用低。
所述超临界提取条件优选在20-40℃、70-200bar压力条件下，添加超临界流体进行提取。提取温度在20℃以上时提取效率增加；超过40℃时提取效率高，但是相反提取效率不会增加。此外，气压在70bar以上时提取效率增加；超过200bar时提取效率相比低气压时没有增加。
根据本发明的实施方式，可以通过油提取法制造藤构提取物。例如，可在藤构的根、茎、叶、花或果实中添加豆油、芝麻油等植物油，在40-70℃、2-10bar压力下，进行2-12小时的提取。
另外，本发明还涉及相对于组合物总重量，含有0.0001-90重量％的上述方法制造的藤构提取物，优选含有0.001-50重量％的上述方法制造的藤构提取物的化妆品组合物。此外，本发明的化妆品组合物的特征为用于美白、抗老化、抗皱、保湿或弹力改善。
另外，本发明还涉及能够提高藤构提取物中的有效成分含量的藤构或其提取物的发酵方法。
本发明中可以通过本领域公知的方法将藤构或其提取物进行发酵。此时，藤构提取物可通过本领域公知的水或乙醇进行提取制造。例如，在藤构的根、茎、叶、花或果实中添加水或乙醇，在10-90℃下经4-24小时提取制造，优选使用水，但并不限于此。
下面，进一步详细说明本发明。
本发明涉及将藤构或其提取物进行自然发酵的方法。根据本发明的实施方式，将所述藤构或其提取物与糖成分混合，置于瓮等容器中在没有人为操作的条件下进行自然发酵而制造。此时，可使用的糖成分不受特别的限制，例如，蔗糖、木糖醇、寡糖、膳食纤维、赤藓糖、葡萄糖或果糖等。优选上述糖成分相对于发酵物总重量混合1-10重量％，在阳光充足的四季的自然环境下发酵30天至6年，优选发酵6个月以上。
此外，本发明还涉及藤构或其提取物进行菌发酵的方法。根据本发明的实施方式，所述藤构或其提取物接种酵母菌、蘑菇菌、乳酸菌、曲菌或芽孢杆菌属(枯草菌)等本领域公知的有用发酵菌株，在10-60℃进行18小时至100日左右的发酵。此时，可以直接在藤构接种发酵菌株后再用水或乙醇等提取，或在已有的藤构提取物中接种发酵菌株得到发酵物。
本发明可使用的酵母菌可以是酵母属(Saccharomyces sp.)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces sp.)、球拟酵母属(Torulopsis sp.)、红酵母属(Rhodotorulasp.)或假丝酵母属(Candida sp.)等；蘑菇菌只要是可食用的蘑菇菌均可，优选，桦褐孔菌(Inonnotus-obliquus)、冬虫夏草菌(Cordyceps sinensis,Paecilomyces japonica)、松耳(Tricholomamatsutake)、桑黄(Phellinus linteus))或灵芝(Ganoderma lucidum)等。此外，乳酸菌可使用乳杆菌属(Lactobacillus sp.)、链球菌属(Streptococcus sp.)、明串珠菌属(Leuconostoc sp.)或双歧杆菌属(Bifidobacteria sp.)等；曲菌可以使用根霉(Rhyzopus)、宇佐美曲霉(Usami)及曲霉(Oryzae)，米曲霉(Aspergillusoryzae)或酱油曲霉(Aspergillus sojae)等；芽孢杆菌属(枯草菌)可以使用地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)F1017、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)F1232、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)F1267、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)F1268、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis))F1200、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)F1337、枯草芽孢杆菌(Bacillus sonorensis)F1005、枯草杆菌(Bacillussubtilis)F1236或枯草杆菌(Bacillus subtilis)F1279等，但并不限于此。
根据本发明的实施方式，使用酵母进行发酵时，在含有藤构或其提取物的基本培养基中接种一定浓度(约105至107细胞/mL)的酵母，在pH 5.5-6.5、温度25-50℃、通气量0.05-0.5VVM的条件培养后，将该发酵液进行离心分离除去高分子沉淀和酵母菌，从而获得藤构发酵提取物。培养时间优选为24-120小时。
此外，根据本发明的实施方式，使用蘑菇菌进行发酵时，在藤构或其提取物中接种蘑菇菌，维持温度18-25℃、湿度60-80％的条件培养后，使用水或碳原子数为1-4的无水或含水低级醇(例如，甲醇、乙醇、丙醇及丁醇等)、所述低级醇和水的混合溶液、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、1,3-丁二醇、己烷或二乙醚中的一种以上，在50-100℃下加热1-5小时减压浓缩，从而获得藤构提取物。培养时间优选为1日至100日。
此外，根据本发明的实施方式，使用乳酸菌进行发酵时，在含有藤构或其提取物的基本培养基中以一定浓度(约105至107细胞/mL)接种乳酸菌，维持pH 6.5-7.5、温度25-50℃、通气量1VVM条件进行培养，将该发酵液进行离心分离去除高分子沉淀物和乳酸菌后，获得藤构发酵提取物。培养时间优选为24-120小时。
此外，根据本发明的实施方式，使用曲菌进行发酵时，在藤构或其提取物中接种曲菌，维持温度15-45℃的条件培养后，将该发酵液进行离心分离去除高分子沉淀物和曲菌，获得藤构发酵提取物。培养时间优选为18-120小时。
此外，根据本发明的实施方式，使用芽孢杆菌属进行发酵时，在含有藤构或其提取物的基本培养基中以一定浓度(约105至107细胞/mL)接种芽孢杆菌属，维持温度10-60℃进行培养后，将该发酵液进行离心分离并在pH5.5-8.5下，去除高分子沉淀物和芽孢杆菌，得到藤构发酵提取物。培养时间优选为24-96小时。
此外，本发明还涉及将藤构或其提取物进行盐藏发酵的方法。根据本发明的实施方式，所述盐藏发酵方法包括1)在藤构或其提取物中添加一定量的盐进行长期熟成发酵的步骤；及2)将上述盐藏发酵物用水或有机溶剂进行萃取获得发酵提取物的步骤。
所述步骤1)中，盐藏所使用的盐优选为精制的高纯度氯化钠、天日盐、岩盐及竹盐，相对于发酵物总量，盐的浓度优选为10-30重量％。盐含量不足10重量％，无法得到期待的效果；超过30重量％，效果的变化甚微。
本发明的发酵工艺在4-40℃下进行30日至1年左右，以便充分进行发酵，优选发酵6个月至1年。在4℃以下，有用微生物生长不良；超过40℃微生物生长过度而对藤构或其提取物的性能产生影响。
所述步骤2)中所使用的提取溶剂可以从纯化水、甲醇、乙醇、甘油、乙酸乙酯、丁二醇、丙二醇、二氯甲烷及己烷组成组中选择一种单独使用或两种以上混合使用。此时，提取温度优选10-80℃，提取6-24小时。超过上述提取温度及提取时间可降低提取效率或成分会发生变化。
在本发明中，在上述步骤2)之后可用本领域公知的通常的方法，在常温将获得的液状物进行冷浸、加热及过滤，或进一步进行溶剂蒸发、喷雾干燥或冷冻干燥，制造盐藏发酵提取物。
此外，本发明还涉及化妆品组合物，相对于组合物总重量，含有0.0001-90重量％，优选0.001-50重量％的通过上述方法制造的藤构发酵提取物。此外，本发明的化妆品组合物的特征为用于美白、抗老化、抗皱、保湿或弹力改善。
实施例
以下，通过实施例及实验例进一步详细说明本发明的内容。以下实施例仅是为了帮助理解本发明的内容而示出，本发明的范围并不由这些实施例限定，本领域技术人员可进行变形、置换及插入等，这些内容也包含在本发明的范围。
实施例1：超高压提取物的制造
将藤构茎及根1kg用干净的水进行洗涤、干燥，然后设置超高压机准备超高压处理，在工艺处理室添加水后，将上述准备的藤构用真空袋包装，利用超高压机在50Mpa以上的压力及50℃以下温度处理1分钟以上，在室温进行冷却，在干燥机中干燥，得到藤构提取物。
实施例2：超临界提取物的制造
将藤构茎及根1kg用干净的水进行洗涤、干燥，投入到超临界提取槽中，利用高压氧气泵向提取槽供给二氧化碳，压力达到75bar就中断二氧化碳供给。利用温度调节器通过包裹提取槽外部的热线将提取槽内部的温度以2℃/min的速度上升至40℃。利用提取槽出口附着的压力调节器将二氧化碳部分排出，将提取槽的温度及压力在34℃、74bar下维持30分钟。然后，重新启动高压氧气泵以2L/min的流量向提取槽连续供给二氧化碳。同时，利用出口处附着的压力调节器将提取物释放，将提取槽的温度和压力维持在34℃、74bar。压力调节器的温度维持在40℃，通过压力调节器释放提取物，压力及温度下降，二氧化碳转变为固体干冰。释放提取物到常压，将二氧化碳释放到大气中，藤构提取物用捕集器进行回收。上述过程进行4小时，得到藤构提取物。
实施例3：油提取物的制造
将藤构茎及根1kg用干净的水进行洗涤、干燥，然后加入豆油10L，在安装有冷凝器的提取器中，在50℃、2-4bar的压力下提取4小时后，用滤纸过滤。将该提取物在安装有冷凝器的蒸馏装置中，70℃下减压浓缩得到藤构油提取物。
比较例1：
将藤构茎及根1kg用干净的水进行洗涤、干燥，然后加入10L水，在安装有冷凝器的提取物器中煮沸5小时进行提取，提取物用300目的过滤布过滤，在5-15℃放置5天熟成，然后利用沃特曼2号滤纸进行过滤。在安装有冷凝器的蒸馏装置中，80℃下减压浓缩得到71.3g(干燥重量)提取物。
实施例4：
将比较例1得到的藤构提取物利用实施例1的相同的方法进行超高压处理。
实施例5：
将比较例1得到的藤构提取物利用实施例2的相同的方法进行超临界提取。
实施例6：
将比较例1得到的藤构提取物利用实施例3的相同的方法进行油提取。
实验例1：酪氨酸酶阻碍效果
酪氨酸酶是从蘑菇类(Mushroom)中提取的，使用了SIGMA公司生产的酪氨酸酶。首先将基质酪氨酸溶解在蒸馏水中制成0.3mg/ml的溶液，将该溶液分别以1.0ml加入到试管中，在这里添加了磷酸钾缓冲液(浓度为0.1mol、pH 6.8)1.0ml及蒸馏水0.7ml。
将实施例1-6及比较例1的提取物与乙醇溶液以适当浓度混合制备的各个提取物试料0.2ml加入到反应液中，然后在37℃的恒温槽中反应10分钟。此时，准备了不含提取物的溶剂0.2ml作为对照组，使用了抗坏血酸作为阳性对照组。在该反应液中分别添加2500单位/ml的酪氨酸酶溶液0.1ml，在37℃恒温槽中反应10分钟。将含有该反应液的试管放入冰水中进行骤冷终止反应，利用光电分光光度计在475nm波长下测定吸光度，并将其结果在下表1中示出。各个提取物的酪氨酸酶阻碍效果用下列数学式1进行计算。
数学式1
酪氨酸酶阻碍率(％)＝100-(各提取物的反应吸光度/对照组的反应吸光度×100)
表1
从上述表1的结果可以确认，通过超高压、超临界及油提取法制造的实施例1-6的藤构提取物的酪氨酸酶抑制率高，因此美白效果优异。
实验例2：利用B16/F10黑瘤细胞评价黑色素生成的抑制能力
将分别含有实施例1-6、比较例1及曲酸0.001重量％的试料作为实验物质，以一定浓度分别添加到B16/F10黑瘤细胞(韩国细胞株银行)的培养液中培养3天后，去除培养液，用PBS洗涤，用1N NaOH溶解细胞，在405nm处测定吸光度。没有添加实验物质的细胞作为对照组，与对照组的黑色素含量进行比较，测定各个实验物质的黑色素生成阻碍程度。根据数学式2计算出黑色素生成抑制率，并将其结果在表2中示出。
数学式2：
黑色素生成抑制率(％)＝100-(各实验物质的吸光度/对照组的吸光度×100)
表2
实验物质 黑色素生成阻碍率(％)
对照组(无添加) 0
曲酸 53
实施例1 56
实施例2 52
实施例3 58
实施例4 67
实施例5 69
实施例6 54
比较例1 41
从上表2的结果，可以确认通过超高压、超临界及油提取法制造的实施例1-6的藤构提取物的黑色素抑制率高、因此美白效果优异。
实施例7：藤构自然发酵提取物的制造
将洗涤的藤构茎及根1kg与寡糖50g混合后装入瓮，填满瓮后在不施压的自然状态下盖上盖，进行6个月的自然发酵。发酵完成后，将发酵的原料用布料过滤去除残渣，得到藤构自然发酵提取物。
实施例8：利用酵母的藤构发酵提取物
将上述比较例1的藤构提取物粉末在1.5L的纯化水中以5重量％添加，以碳源、氮源、磷酸盐、无机盐类及微量营养成分作为基本组成，利用氢氧化钠调节pH 5.5-6.5。在含有上述藤构提取粉末的培养基中以106细胞/ml接种酵母属(Saccharomyces sp.)，维持pH5.5-6.5、温度25-35℃、通气量0.5VVM的条件，培养72小时。
将上述发酵液以1.000×g离心分离30分钟，去除高分子沉淀物和酵母菌菌体，最终获得藤构发酵提取物。
实施例9：利用蘑菇菌的藤构发酵提取物
在上述比较例1的藤构提取粉末中以5重量％添加冬虫夏草菌(Paecilomycesjaponica)，在18-25℃、湿度60-70％下发酵60天后干燥，将此粉碎得到的粉碎物100g加入到80％甲醇3L中，在安装有冷凝器的回流提取器中煮沸3小时提取。然后利用100目过滤布进行过滤后，残渣用相同方法再次提取1次。将各个提取物收集，在常温下用沃特曼2号滤纸过滤，去除不溶性物质，然后在安装有冷凝器的整流装置中60℃下减压浓缩，然后进行冷冻干燥，最终获得藤构发酵提取物。
实施例10：利用乳酸菌的藤构发酵提取物
将上述比较例1的藤构提取物粉末在1.5L的纯化水中以5重量％添加，以碳源、氮源、磷酸盐、无机盐类及微量营养成分作为基本组成，利用氢氧化钠调节pH 5.5-6.5。在含有上述藤构提取粉末的培养基中以106细胞/ml接种乳酸杆菌(Lactobacillus sp.)，维持pH 6.5-7.5、温度35-38℃、通气量1VVM的条件，培养72小时。
将上述发酵液以1.000×g离心分离30分钟，去除高分子沉淀物和乳酸杆菌菌体，最终获得藤构发酵提取物。
实施例11：利用曲美的藤构发酵提取物
在上述比较例1的藤构提取粉末中以5重量％添加米曲霉(Aspergillus oryzae)，在25℃下发酵48小时然后干燥，将此粉碎得到的粉碎物100g加入到80％甲醇3L中，在安装有冷凝器的回流提取器中煮沸3小时提取。然后利用100目过滤布进行过滤后，残渣用相同方法再次提取1次。将各个提取物收集在常温下用沃特曼2号滤纸过滤，去除不溶性物质，然后在安装有冷凝器的整流装置中60℃下减压浓缩，然后进行冷冻干燥，最终获得藤构发酵提取物。
实施例12：利用芽孢杆菌的藤构发酵提取物
将上述比较例1的藤构提取物粉末在1.5L的纯化水中以5重量％添加，以碳源、氮源、磷酸盐、无机盐类及微量营养成分作为基本组成，利用氢氧化钠调节pH 5.5-6.5。在含有上述藤构提取粉末的培养基中接种枯草杆菌(Bacillus subtilis)F1279，在45℃下培养72小时。
将上述发酵液以1.000×g离心分离30分钟，去除高分子沉淀物和枯草杆菌菌体，最终获得藤构发酵提取物。
实施例13：藤构盐藏发酵提取物的制造
将藤构茎及根1kg用干净的水洗净，与10重量％浓度的盐溶液混合后装入瓮，在4℃下发酵30天后，在此加入80％乙醇水溶液5L，进行3次回流提取，在15℃下沉淀1天。然后，通过过滤布过滤和离心分离分离残渣和滤液，分离的滤液进行加压浓缩得到的提取物混悬到水中用乙醚1L进行5次萃取，去除色素，水层再用1-丁醇500ml萃取3次。由此得到的总1-丁醇层减压浓缩得到1-丁醇提取物，将此在少量的甲醇中溶解，添加大量的乙酸乙酯生成的沉淀物进行干燥，获得了藤构盐藏发酵提取物50.3g。
实验例3：酪氨酸酶阻碍效果
酪氨酸酶是从蘑菇类(Mushroom)中提取的，使用了SIGMA公司产的。首先将基质酪氨酸溶解在蒸馏水中制成0.3mg/ml的溶液，将该溶液分别以1.0ml加入到试管中，在这里添加了磷酸钾缓冲液(浓度为0.1mol、pH 6.8)1.0ml及蒸馏水0.7ml。
将实施例7-13及比较例1的提取物与乙醇溶液以适当浓度混合制备的各个提取物试料0.2ml加入到反应液，然后在37℃的恒温槽中反应10分钟。此时，作为对照组准备了不含提取物的溶剂0.2ml，作为阳性对照组使用了抗坏血酸。在该反应液中分别添加2500单位/ml的酪氨酸酶溶液0.1ml，在37℃恒温槽中反应10分钟。将含有该反应液的试管放入冰水中进行骤冷终止反应，利用光电分光光度计在475nm波长下测定吸光度，并将其结果在下表3中示出。各个提取物的酪氨酸酶阻碍效果用上述化学式1进行计算。
表3
从上述表3的结果，可以确认本发明实施例7-13的藤构发酵提取物的酪氨酸酶抑制率高，因此美白效果优异。
实验例4：利用B16/F10黑瘤细胞评价黑色素生成的抑制能力
将分别含有实施例7-13、比较例1及曲酸0.001重量％的试料作为实验物质，以一定浓度分别添加到B16/F10黑瘤细胞(韩国细胞株银行)的培养液中培养3天后，去除培养液，用PBS洗涤，用1N NaOH溶解细胞，在405nm处测定吸光度。没有添加实验物质的细胞作为对照组，与对照组的黑色素含量进行比较，测定各个实验物质的黑色素生成阻碍程度。根据数学式2计算出黑色素生成抑制率，并将其结果在表4中示出。
表4
实验物质 黑色素生成阻碍率(％)
对照组(无添加) 0
曲酸 44
实施例7 50
实施例8 61
实施例9 57
实施例10 47
实施例11 49
实施例12 39
实施例13 47
比较例1 35
从上表4的结果，可以确认本发明实施例7-13的藤构发酵提取物的黑色素生成抑制率高，美白效果优异。
实验例5：阻碍有害细菌生成实验
将培养基(Letheen Agar)1次倒入培养皿中固化后，将预培养的大肠杆菌(Escherichia coli ATCC 8739)、绿脓菌(Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027)及黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC 6538)进行预培养，将这些实验菌在调节为40℃的培养基(Letheen Agar)中以最终为105个/g的菌量进行稀释，倒入在1次培养基上进行固化。在灭菌的纸盘(paper disk)中注入0.02ml左右的10％、20％及30％的天日盐溶液，盖在涂覆菌的培养基上，在常温下经24小时使溶液充分扩散，然后在32℃下培养最佳时间，然后确认培养皿中是否出现清除区，并将结果在图3中示出。
从图3的结果可以确认盐有利于阻碍有害微生物的生长。
剂型例1-13及比较剂型例1-2
按照下表5至7的组成通过通常的方法制造了剂型例1-13及比较剂型例1-2的营养霜(单位：重量％)
表5
表6
表7
实验例6：通过本发明的超高压、超临界及油提取法制造的藤构提取物的皮肤保湿效果
为了测定本发明的藤构提取物对皮肤保湿力的增加产生的影响，将出现皮肤干燥症的40-50岁左右的成人男性和女性160名分为8个组，每个组每天2次持续4周在面部分别涂覆剂型例1-6及比较剂型例1-2。涂覆开始之前、涂覆后第1周、第2周、第4周及涂覆终止后的第2周(经过总6周)，在恒温、恒湿条件(24℃、相对湿度40％)下，用测角仪测定水分含量，并将其结果在下表8中示出。测角仪是通过测定表皮的导电值来测定皮肤中存在的水分含量的测定仪。实验结果以实验开始前测定的测定值为基准的处理一定期间后测定值的增加量的百分比表示。
表8
从上表8中的结果可以确认，含有通过本发明的超高压、超临界及油提取法制造的实施例1-6的藤构提取物的剂型例1-6的皮肤水分增加率优异。此外，剂型例1-6的营养霜终止涂覆之后测定的皮肤水分含量与涂覆开始后的第1周相似，即使不涂覆实施例经过一段时间后皮肤水分可持续维持。
实验例7：通过本发明的超高压、超临界及油提取法制造的藤构提取物的皮肤皱纹改善效果
为了测定本发明的藤构提取物对皮肤皱纹改善效果产生的影响，以30-50岁的面部有皱纹的实验对象160名为对象评价了皮肤皱纹改善效果。
首先测定使用霜之前的面部两侧皮肤状态，各实验对象持续3个月分别使用剂型例1-6及比较剂型例1-2的霜，然后再次测定同一部位，测定皮肤皱纹的变化量，并将其结果在下表9中示出。在24℃、相对湿度40％的恒温恒湿室中，用复制品(replica)复制眼尾部位的皱纹，并用能见度仪器系统(Visiometer system；C+K公司)测定皮肤皱纹。皮肤皱纹的变化量通过下列数学式3计算。
数学式3：
变化量(△％)＝(Tdi-Tdo)/Tdo×100
上述数学式3中，“Tdi”是D90的测定部位的值，“Tdo”是D0的测定部位的值。
表9
实验物质 皮肤皱纹变化量(％)
剂型例1 19
剂型例2 17
剂型例3 16
剂型例4 22
剂型例5 20
剂型例6 18
比较剂型例1 2
比较剂型例2 12
从上述表9的结果可以看出，含有通过本发明的超高压、超临界及油提取法制造的实施例1-6的藤构提取物的剂型例1-6的皮肤皱纹改善效果优异。
实验例8：通过本发明的超高压、超临界及油提取法制造的藤构提取物的皮肤弹力提高效果的确认
为了确认皮肤弹力提高效果，将30-40岁女性160名以20名为一组分为8组，分别使用剂型例1-6及比较剂型例1-2的霜，从而进行测定。试验方法如下。
各组分别分得剂型例1-6及比较剂型例1-2的霜，每日1次持续12周涂覆于面部，利用皮肤弹力测定仪(Cutometer SEM 575,C+K Electronic Co.,Germany)测定皮肤弹力。并将其结果在表10中示出。表10中的结果以Cutometer SEM 575的ΔR8(R8(左)-R8(右))值进行记载，R8值表示皮肤粘弹性(viscoelasticity)的性质。
表10
从上表10的结果可以确认，含有通过本发明的提取过程制造的实施例1-6的藤构提取物的剂型例1-6的皮肤弹力改善效果优异。
由此确认含有本发明的藤构提取物的化妆品组合物的皮肤弹力提高效果非常有效。
实验例9：本发明的藤构发酵提取物的皮肤保湿效果
为了测定本发明的藤构提取物对皮肤保湿力的增加产生的影响，将出现皮肤干燥症的40-50岁左右的成人男性和女性180名分为9个组，每个组每天2次持续4周在面部分别涂覆剂型例7-13及比较剂型例1-2。涂覆开始之前、涂覆后第1周、第2周、第4周及涂覆终止后的第2周(经过总6周)，在恒温、恒湿条件(24℃、相对湿度40％)下，用测角仪测定水分含量，并将其结果在下表11中示出。测角仪是通过测定表皮的导电值来测定皮肤中存在的水分含量的测定仪。实验结果以实验开始前测定的测定值为基准的处理一定期间后测定值的增加量的百分比表示。
表11
从上表11中的结果可以确认，含有通过本发明的发酵制造的实施例7-13的藤构提取物的剂型例7-13的皮肤水分增加率优异。此外，终止剂型例7-13的营养霜涂覆之后测定的皮肤水分含量与涂覆开始后的第1周相似，即使不涂覆实施例经过一段时间后皮肤水分可持续维持。
实验例10：本发明的藤构发酵提取物的皮肤皱纹改善效果
为了测定本发明的藤构发酵提取物对皮肤皱纹改善效果产生的影响，以30-50岁的面部有皱纹的实验对象90名为对象评价了皮肤皱纹改善效果。
首先测定使用霜之前的面部两侧皮肤状态，各实验对象持续3个月分别使用剂型例7-13及比较剂型例1-2的霜，然后再次测定同一部位，测定皮肤皱纹的变化量，并将其结果在下表12中示出。在24℃、相对湿度40％的恒温恒湿室中，用复制品(replica)复制眼尾部位的皱纹，并用能见度仪器系统(Visiometer system；C+K公司)测定皮肤皱纹。皮肤皱纹的变化量通过上述数学式3计算。
表12
从上述表12的结果可以看出，含有通过本发明发酵方法制造的实施例7-13的藤构提取物的剂型例7-13的皮肤皱纹改善效果优异。
实验例11：皮肤弹力提高效果确认
为了确认皮肤弹力提高效果，将30-40岁女性180名以20名为一组分为9组，分别使用剂型例7-13及比较剂型例1-2的霜，从而进行测定。试验方法如下。
各组分别分得剂型例7-13及比较剂型例1-2的霜，每日1次持续12周涂覆于面部，利用皮肤弹力测定仪(Cutometer SEM 575,C+K Electronic Co.,Germany)测定皮肤弹力。并将其结果在表13中示出。表13中的结果以Cutometer SEM 575的ΔR8(R8(左)-R8(右))值进行记载，R8值表示皮肤粘弹性(viscoelasticity)的性质。
表13
实验物质 皮肤弹力效果
剂型例7 0.42
剂型例8 0.14
剂型例9 0.37
剂型例10 0.37
剂型例11 0.40
剂型例12 0.35
剂型例13 0.36
比较剂型例1 0.12
比较剂型例2 0.32
从上表13的结果可以确认，含有通过本发明的发酵过程制造的实施例7-13的藤构发酵提取物的剂型例7-13的皮肤弹力改善效果优异。
由此，确认含有本发明的藤构发酵提取物的化妆品组合物的皮肤弹力提高效果非常有效。

Claims (5)

1.将藤构根和茎的混合物的提取物进行菌发酵的发酵方法，该方法包括：将藤构根和茎的混合物的提取物进行菌发酵，所述提取物的制备方法包括：在藤构的根和茎的混合物中添加水或乙醇，在10-90℃下经4-24小时提取制造；
其中，所述菌发酵通过接种发酵菌株到提取物中，然后在10-60℃发酵18小时至100天而实施，所述发酵菌株选自由蘑菇菌、乳酸菌和芽孢杆菌属所组成的组；
使用蘑菇菌进行发酵时，在提取物中接种蘑菇菌，维持温度18-25℃、湿度60-80%的条件培养后，使用水或碳原子数为1-4的无水或含水低级醇、所述低级醇和水的混合溶液、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、1,3-丁二醇、己烷或二乙醚中的一种以上，在50-100℃下加热1-5小时，然后减压浓缩，从而获得藤构发酵提取物，培养时间为1日至100日，所述蘑菇菌为冬虫夏草菌；
使用乳酸菌进行发酵时，在含有提取物的基本培养基中以浓度105 至107 细胞/mL接种乳酸菌，维持pH 6.5-7.5、温度25-50℃、通气量1VVM条件进行培养，将该发酵液进行离心分离去除高分子沉淀物和乳酸菌后，获得藤构发酵提取物，培养时间为24-120小时；
使用芽孢杆菌属进行发酵时，在含有提取物的基本培养基中以浓度105 至107 细胞/mL接种芽孢杆菌属，维持温度10-60℃进行培养后，将该发酵液进行离心分离并在pH 5.5-8.5下，去除高分子沉淀物和芽孢杆菌，得到藤构发酵提取物，培养时间为24-96小时，所述芽孢杆菌属为枯草杆菌F1236或者枯草杆菌F1279。
2.根据权利要求1所述的发酵方法制造的藤构发酵提取物。
3.含有权利要求2所述的藤构发酵提取物的化妆品组合物。
4.根据权利要求3所述的化妆品组合物，其中，所述化妆品组合物用于美白、抗老化、保湿或弹力改善。
5.根据权利要求3所述的化妆品组合物，其中，所述化妆品组合物用于抗皱改善。
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