CN102973926A - 胸腺肽α1在制备治疗肺纤维化药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药技术领域，涉及胸腺肽α1新的药用用途，具体涉及胸腺肽α1在制备治疗肺纤维化药物中的用途。本发明针对现有技术药物治疗特发性肺纤维化预后极差，无有效治疗手段，死亡率极高等缺陷，采用针对性地增加Th1型反应或抑制Th2型反应的策略，用胸腺肽α1作为免疫调节剂增加Th1型免疫反应及其他免疫调节作用，经动物实验，结果证实，所述胸腺肽α1可纠正肺纤维化机体的免疫失衡，明显减少感染发生率，降低死亡率，可进一步用于制备治疗肺纤维化的药物。本发明在肺纤维化疾病缺乏有效治疗药物的现状下，具有重要的临床应用价值，为临床广泛应用提供了可靠的实验依据。

Description

胸腺肽α1在制备治疗肺纤维化药物中的用途

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及胸腺肽α1新的药用用途，具体涉及胸腺肽α1(日达仙)在制备治疗肺纤维化药物中的用途。

背景技术

迄今，特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)原因不明，发病机制不清，预后差，5年生存率低于50％，确诊后的中位生存时间仅2-3年。2011年3月制定的特发性肺纤维化诊治指南公开了有关IPF发病率呈现明显的增长趋势，过去20年间死亡率明显增加，死亡率高于某些癌症，目前，临床实践中对特发性肺纤维化尚缺乏切实有效的治疗办法。

长期以来肾上腺糖皮质激素(简称：激素)一直是IPF治疗的主要手段。但目前已少有证据支持IPF患者激素治疗的有效性。2011年新指南强烈反对单独使用糖皮质激素以及糖皮质激素联合免疫抑制剂治疗IPF。其原因之一是：使用激素后，随着时间延长，激素副作用日渐突出，常因免疫功能严重受损而发生各种病原体感染，从而加重病情导致死亡，最终并未提高生存率，甚至比未用激素的患者生存期更短。更有研究发现IPF患者本身因存在免疫缺陷，比正常人更容易因各种病原体的感染而加重病情。由此，有关研究者设想寻找一种合适的免疫调节药物，用于正确合理地调节IPF患者的免疫功能，应能减少感染机会，提高IPF患者的生存质量和延长生存期。

胸腺肽α1(又称日达仙，简称Tα1)是由28种氨基酸组成的多肽。作为免疫调节剂，可以触发淋巴细胞成熟，增强T细胞的功能，并促进免疫缺陷的重组，目前常规用于治疗免疫缺陷或慢性肝炎或癌症患者，安全性得到证实。有研究显示，Tα1治疗的患者外周血有较高的CD4细胞水平并产生单个核细胞中γ-IFN。Tα1可激活病毒特异性辅助性T细胞，分泌内源性α-IFN，γ-IFN，白介素-2，肿瘤坏死因子，提高淋巴细胞的白细胞介素-2受体的表达，增加Th1型免疫反应；Tα1能刺激自然杀伤活性。

免疫功能失衡是影响和制约IPF最终疗效的重要因素之一。选择合适的免疫调节措施应能通过纠正IPF机体的免疫失衡而提高生活质量和延长生存期。有研究表明，IPF患者体内存在过度Th2型免疫反应(Th2型细胞因子有IL-4和IL-13等)，而Th1型免疫反应不足(Th1型细胞因子有IL-12和γ-IFN等)。

在目前肺纤维化疾病缺乏有效治疗药物的情况下，本发明拟提供胸腺肽α1(日达仙)用于治疗肺纤维化药物中的用途。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的缺陷，提供胸腺肽α1(日达仙)新的药用用途，具体涉及胸腺肽α1在制备治疗肺纤维化药物中的用途。

针对现有技术药物治疗特发性肺纤维化预后极差，无有效治疗手段，死亡率极高等缺陷，本发明采用针对性地增加Th1型反应或抑制Th2型反应的策略，用胸腺肽α1作为免疫调节剂增加Th1型免疫反应及其他免疫调节作用，通过纠正实验动物肺纤维化机体的免疫功能失衡及其对实验动物存活率等方面的影响观察，结果证实，所述胸腺肽α1能纠正肺纤维化机体的免疫功能失衡，可明显减少感染发生率，降低死亡率，可进一步用于制备治疗肺纤维化的药物。本发明提供的胸腺肽α1(日达仙)新的药用用途，在肺纤维化疾病缺乏有效治疗药物的现状下，具有重要的临床应用价值，为临床广泛应用提供了可靠的实验依据。

本发明中，胸腺肽α1能纠正肺纤维化大鼠体内Th细胞不足，抑制Ts细胞的生成，提升γ-球蛋白值，或提升B细胞免疫水平；

本发明中，胸腺肽α1可降低造模大鼠的感染发生率，降低死亡率，提高生存率。

本发明采用胸腺肽α1作为免疫调节剂进行了肺纤维化实验动物实验，观察所述的胸腺肽α1纠正实验动物机体的免疫功能失衡及其对存活率等方面的影响，其包括：

将SD大鼠随机均分为空白对照组、模型对照组、地塞米松干预组、胸腺肽α1干预组、地塞米松+胸腺肽α1干预组五大组，再根据造模后不同时间(即D7、14、28、56)均分为不同亚组分批c常规处理大鼠，腹主动脉采血，分别进行细胞免疫项目、体液免疫项目检测，左肺行肺灌洗，留取肺泡灌洗液(BALF)进行细菌、真菌培养(采用平板划线接种法行肺泡灌洗液细菌、真菌培养)，留取肝、右肺叶行病理检查。

结果证实，所述的胸腺肽α1能纠正体内Th细胞不足，抑制Ts细胞的生成，提升γ-球蛋白值，或提升B细胞免疫水平，在一定时间内控制感染，造模14天，肺泡灌洗液培养未发现细菌；所述的胸腺肽α1能降低造模大鼠的感染发生率(仅为10％)，降低死亡率(仅为14％)，明显提高生存率(如表1，表2所示)。

表1  是模14天肺泡灌洗液细菌和真菌培养结果。

表2  是各组大鼠死亡率比较(％)。

表1

表2

(其中：去除不同处理时间对大鼠存活的影响后，根据大鼠的不同存活时间，采用卡方检验法，得出各组X²值、P值。)

实验结果表明，能起到部分纠正免疫失衡，减少感染发生率，提高生活质量，延长生存期的作用，可作为治疗肺纤维化疾病的药物，应用于临床治疗IPF患者。在目前肺纤维化疾病缺乏有效治疗药物的情况下，具有重要的理论意义及临床实用价值。

附图说明

图1是各组大鼠肺组织HE染色病理表现。

其中，

图1A-d7、A-d14、A-d28、A-d56分别是空白对照组造模7天、14天、28天、56天的大鼠肺组织病理(HE染色X400)，图中显示肺泡结构基本正常，随饲养时间的延长，呈现轻度肺泡隔炎症；

图1B-d7、B-d14、B-d28、B-d56分别是模型对照组造模7天、14天、28天、56天的大鼠肺组织病理(HE染色X400)；图中显示造模7d出现肺泡炎改变；14d出现纤维化改变，炎性细胞明显减少；28d形成严重纤维化；56d肺泡隔增厚、肺泡炎、纤维化改变、类似正常肺泡结构均存在，局部炎症细胞聚集。

图1C-d7、C-d14分别是地塞米松干预组造模7天、14天的大鼠肺组织病理(HE染色X400)；图中显示造模7d见肺泡腔、肺间质炎性细胞渗出，间质内成纤维细胞增多较明显，部分肺泡萎陷，部分肺气肿；14d肺泡间隔内炎性细胞增多，纤维化改变比较明显。

图1D-d7、D-d14、D-d28、D-d56分别是胸腺肽α1干预组造模7天、14天、28天、56天的大鼠肺组织病理(HE染色X400)；图中显示造模7d见炎性细胞渗出，较模型对照组稍减轻；14d、28d肺泡炎表现与模型对照组相似，肺纤维化较模型对照组比有减轻；56d肺泡炎、纤维化、类似正常肺泡结构均存在，局部炎症细胞聚集有所改善。

图1E-d7、E-d14、E-d28分别是地塞米松+胸腺肽α1干预组造模7天、14天、28天的大鼠肺组织病理(HE染色X400)；图中显示造模7d肺泡腔、肺间质炎性细胞渗出，与模型对照组7d表现相似；14d组肺泡间隔内炎性细胞增多，纤维化改变明显，与地塞米松干预组14d表现类似；28d组肺泡隔增厚，炎性细胞聚集，纤维化改变仍存在，与模型对照组28d比，病变似有减轻。

图2造模14天各组大鼠肺组织Masson染色表现，

其中，

图2-A空白对照组大鼠肺组织(Masson染色，X400)，图中显示肺泡间隔的狭长区域内见到少量染成蓝绿色的胶原；

图2-B模型对照组大鼠肺组织(Masson染色，X400)，图中显示大量成片的胶原，尤以肺纤维化较重的区域更为明显；

图2-C地塞米松干预组大鼠肺组织(Masson染色，X400)，图中显示大量成片的胶原，尤以肺纤维化较重的区域更为明显；

图2-D胸腺肽α1干预组大鼠肺组织(Masson染色，X400)图中显示肺泡间隔区域内见到胶原分布明显少于模型对照组。

图2-E地塞米松+胸腺肽α1干预组大鼠肺组织(Masson染色，X400)，图中显示大量成片的胶原，胶原沉积多于胸腺肽α1干预组。

图3是各组大鼠血CD45RA％比较。

图4是各组大鼠血γ-球蛋白水平(Unit：g/L)。

图5各组大鼠血IgM水平(unit：mg/ml)。

图6.造模14天各组大鼠感染发生率比较。

图7.各组大鼠存活率-时间变化曲线，

其中，Group A：空白对照组，

Group B：模型对照组，

Group C：DXM干预组，

Group D：Tα1干预组，

Group E：DXM+Tα1干预组。

具体实施方式

实施例1

1.动物模型的建立、分组及标本处理：

所有大鼠随机均分为五大组：

(1)空白对照组(NS组，气管内注入生理盐水0.3ml，腹腔每日注射生理盐水0.16ml)；

(2)模型对照组(BLM组，气管内注入5mg/kg博莱霉素制作肺纤维化大鼠模型，腹腔每日注射生理盐水0.16ml)；

(3)地塞米松干预组(BLM+DXM组，制作肺纤维化模型后腹腔每日注射地塞米松3mg/kg)；

(4)胸腺肽α1干预组(BLM+Tα1组，制作肺纤维化模型后腹腔每日注射生理盐水0.16ml，每周二次皮下注射胸腺肽α1 0.18mg/kg)；

(5)地塞米松+胸腺肽α1干预组(BLM+DXM+Tα1组，制作肺纤维化模型后腹腔每日注射地塞米松3mg/kg，每周二次皮下注射Tα1 0.18mg/kg)。

各组再根据造模后不同时间(即D7、14、28、56)均分为不同亚组分批处理大鼠，每亚组数据完整者最终进入实验统计。按常规方式处理大鼠获得腹主动脉血，分别进行流式细胞检测，并制备血清用于蛋白电泳、酶联免疫吸附法(ELISA)检测；左肺行肺灌洗，留取肺泡灌洗液(BALF)进行细菌、真菌培养(采用平板划线接种法行肺泡灌洗液细菌、真菌培养)；留取肝、右肺叶行病理检查。

2.病理比较：

2.1病理标本HE染色和Masson染色：组织标本经10％中性富尔马林液固定至少24小时后，按常规制作蜡块、切片，分别进行HE染色和Masson染色。造模14天各组大鼠Masson染色均使用Olympus BX51光学显微镜系统获取图像信息(放大倍数*400，图像采用jpg格式，2776*2074像素)。

2.2各组肺组织HE染色病理表现(如图1所示)，

(1)空白对照组(A组)：肺泡结构基本正常，随饲养时间的延长，呈现轻度肺泡隔炎症。

(2)模型对照组(B组)：造模7d出现肺泡炎改变；14d出现纤维化改变，炎性细胞明显减少；28d形成严重纤维化；56d肺泡隔增厚、肺泡炎、纤维化改变、类似正常肺泡结构均存在，局部炎症细胞聚集。

(3)地塞米松干预组(C组)：造模7d见肺泡腔、肺间质炎性细胞渗出，间质内成纤维细胞增多较明显，部分肺泡萎陷，部分肺气肿；14d肺泡间隔内炎性细胞增多，纤维化改变比较明显。

(4)胸腺肽α1干预组(D组)：造模7d见炎性细胞渗出，较模型对照组稍减轻；14d、28d肺泡炎表现与模型对照组相似，肺纤维化较模型对照组比有减轻；56d肺泡炎、纤维化、类似正常肺泡结构均存在，局部炎症细胞聚集有所改善。与地塞米松干预组比较，该组7d肺泡腔内及肺间质炎性细胞渗出相似，该组14d肺纤维化有减轻。

(5)地塞米松+胸腺肽α1干预组(E组)：造模7d肺泡腔、肺间质炎性细胞渗出，与模型对照组7d表现相似；14d组肺泡间隔内炎性细胞增多，纤维化改变明显，与地塞米松干预组14d表现类似；28d组肺泡隔增厚，炎性细胞聚集，纤维化改变仍存在，与模型对照组28d比，病变有减轻。

2.3肺组织标本Masson染色病理表现(如图2所示)

造模14天，空白对照组大鼠肺组织Masson染色仅在肺泡间隔的狭长区域内见到少量染成蓝绿色的胶原；模型对照组的大鼠肺组织则可见到大量成片的胶原，尤以肺纤维化较重的区域更为明显；Tα1干预组的胶原分布明显少于模型对照组；而DXM干预组、DXM+Tα1干预组的胶原沉积均多于Tα1干预组。

3.细胞免疫指标：

3.1测定方法：

细胞免疫项目包括T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞，T淋巴细胞又分为CD3细胞(代表总T淋巴细胞)、CD4细胞(代表辅助性T淋巴细胞水平，Th)、CD8细胞(代表抑制性T淋巴细胞水平，Ts)等多个亚群，CD45RA是大鼠全B细胞最常用标记，目前仅表达于B细胞，故本实施例采用血CD45RA％值来反映大鼠B细胞免疫情况，NKR-PIA是大鼠自然杀伤细胞(NK细胞)特异性标记，故本实施例采用血KR-PIA％来代表大鼠的NK细胞免疫情况。

3.1.1T细胞免疫指标测定方法：清洁空试管标号内放CD3+单抗4ul、CD4+单抗、CD8+单抗均2ul。再放入抗凝血100ul，混匀，电热恒温水槽29℃放置20min。裂解液预热，放入试管0.5ml，晃匀，放置15min。试管晃匀，加PBS缓冲液0.5ml，水槽里静置15min。2000转×10分钟离心后，倒掉试管内的血，试管内加PBS 0.5ml。流式细胞仪上检测。

3.1.2B细胞免疫指标测定方法：清洁空试管标号内放CD45RA单抗2ul，再放入抗凝血100ul，以后过程按上述程序操作。

3.1.3NK细胞免疫指标测定方法：清洁空试管标号内放CD161(即NKR)单抗2ul，再放入抗凝血100ul，以后过程按上述程序操作。

3.2测定结果：

3.2.1T细胞免疫指标变化：(1)造模大鼠较正常对照大鼠的CD3细胞％，CD4细胞％水平下降，CD8细胞％值升高，CD4细胞％/CD8细胞％下降；(2)DXM干预后，CD3细胞％，CD4细胞％，CD8细胞％较模型对照组比较进一步下降，P均＜0.001；(3)Tα1干预后，CD3细胞％，CD4细胞％值较模型对照组比升高，P＜0.001。造模D7-D28内，Tα1干预降低造模大鼠的CD8细胞％值；与DXM干预组比较，CD3细胞％、CD4细胞％明显升高，P均＜0.001。

3.2.2B细胞免疫指标变化：各组大鼠血CD45RA％值比较(如图3所示)，

结果显示，(1)BLM造模后，早期(7天)大鼠的B细胞免疫水平降低，以后逐渐升高；(2)DXM干预后，大鼠的B细胞免疫水平降低，CD45RA％明显下降，与模型对照组相比P＜0.001；(3)Tα1干预后大鼠B细胞免疫水平在D14天时稍有下降，但总体处于上升趋势并保持较高水平，其CD45RA％明显高于地塞米松干预组，P＜0.001。

3.2.3NK细胞免疫指标变化：(1)造模大鼠血NKR-PIA％值从D28开始降低，差异具有统计学意义；(2)DXM干预后，早期(D7)大鼠NK细胞水平升高，与模型对照组相比P＜0.05，表明激素处理有助于提升实验大鼠肺纤维化早期体内的NK细胞水平；(3)Tα1干预后，与模型对照组相比，NKR-PIA％值变化不明显，与DXM干预组相比，早期(D7)大鼠NK细胞水平较之低，P＜0.05。

4.体液免疫指标：

4.1测定方法：体液免疫项目主要检测血浆中的免疫球蛋白(Ig)，大多存在于丙种球蛋白(γ-球蛋白)中，分为IgG，IgA，IgM，IgD，IgE五类，本实施例检测前三种Ig。

4.1.1γ-球蛋白定量：装有200ul血清的Enppendorf管按序排列、室温解冻，

全自动毛细管电泳分析仪自动稀释分离血清蛋白，200nm波长检测出各种蛋白质的百分比浓度(检测顺序依次为γ球蛋白、β2球蛋白、β1球蛋白、α2球蛋白、α1球蛋白等)，总蛋白值与γ-球蛋白百分比浓度相乘，即为γ-球蛋白定量值。

4.1.2血清IgG、IgM、IgA含量：按各试剂盒说明书，依次进行检测程序，Ascent软件处理下，以各标准品之OD值作图，画出标准曲线，根据样品OD值得出相应大鼠IgG、IgM、IgA含量。

4.2测定结果：

4.2.1γ-球蛋白定量变化(如图4所示)：(1)DXM干预组大鼠γ-球蛋白值下降；(2)Tα1干预组造模7、14天大鼠γ-球蛋白水平上升，与模型对照组相比P＜0.001，但14天后变化不明显，胸腺肽α1干预组的γ-球蛋白值明显高于地塞米松干预组，P＜0.001；(3)血CD45RA％值(代表B细胞免疫水平)与血γ-球蛋白值(代表免疫球蛋白水平)相关性分析：Pearson相关系数(r)＝0.472，P＜0.01，表明血B细胞免疫水平与免疫球蛋白水平呈正相关关系。

4.2.2IgG、IgM、IgA含量变化(如图5所示)，血清IgG、IgM、IgA含量变化特点：(1)模型对照组造模7天IgM量升高(与空白对照组相比P＜0.001)，BLM造模对大鼠IgG和IgA量无明显影响；(2)造模7天，DXM干预降低造模大鼠的IgM值，P＜0.001；(3)造模14天，Tα1干预升高造模大鼠的IgM、IgG、IgA值，P均＜0.001；胸腺肽α1干预组的IgM量、IgA量明显高于地塞米松干预组，P均＜0.001。

5肺组织感染情况：

5.1肺泡灌洗液细菌和真菌培养结果(如表1所示)：

BLM造模14天，BALF细菌培养、真菌培养结果显示，空白对照组、Tα1干预组均未见细菌生长，其余三组均有革兰氏阳性球菌生长，模型对照组平均见1个菌落，地塞米松干预组平均见11个菌落，地塞米松+胸腺肽α1干预组平均见5个菌落。BALF真菌培养结果：五组均为阴性。实验结果表明，造模大鼠容易发生肺部感染，相比之下，同时加激素处理的两组比相同造模时间的其它组感染更严；造模14天，模型组BALF培养发现细菌，Tα1干预组未发现细菌，说明Tα1在一定时间内明显有助于调节肺纤维化大鼠的免疫状态，并控制感染。

5.2造模14天大鼠肺部感染发生率比较(如图6所示)，

造模14天实验大鼠的肺组织、肝组织标本HE染色出现感染的以下病理表现之一：如炎性细胞明显聚集、脓肿形成，或造模14天，BALF细菌培养结果发现细菌生长，均可视为大鼠感染发生，各组感染大鼠/各组处死大鼠总数即计算出各组大鼠感染发生率；结果表明，BLM造模14天，大鼠出现感染，感染发生率为30％，加激素组(DXM干预组、DXM+Tα1干预组)较其它三组更易出现感染，感染发生率分别为90％和70％，而胸腺肽α1干预组，感染发生率仅10％，较造模组低，表明单用胸腺肽α1在一定时间内有利于控制大鼠感染发生。

6.肺外组织感染情况：

6.1肝组织：DXM干预组、DXM+Tα1干预组造模14天处死大鼠，肝脏表面肉眼可见部分凹凸不平，肝组织标本HE染色光镜下见肝有水样变性、脉管区小灶状坏死、脂肪变性、灶性脓肿的表现，而空白对照组、模型对照组、Tα1干预组呈现正常的肝组织病理表现，提示激素干预确会引起大鼠肝脏感染等不良反应。

6.2其他组织：造模14天常规处理的各组实验大鼠的心、脑、肾组织HE染色病理基本正常。

7死亡率与存活时间比较

7.1生存率观察：

比较各组大鼠的死亡率及存活率-时间变化曲线。分别统计各组造模7天内、造模8-14天、造模15-28天、造模29-56天死亡大鼠数，各组各时间段死亡率＝各组各时间段死亡大鼠数/各组造模大鼠总数，各时间段死亡率相加即得各组死亡率。造模7、14、28、56天根据实验需要处死大鼠者不计入死亡大鼠。存活率＝1-死亡率，根据不同时间点不同存活率，制作存活率-时间变化曲线。

7.2各组大鼠死亡率比较及存活率-时间变化曲线(如图7、表2所示)，

(1)模型对照组观察56天仍有大鼠存活，死亡率为34.8％；

(2)地塞米松干预组造模23天后大鼠全部死亡，死亡率为100％；

(3)胸腺肽α1干预组观察56天仍有大鼠存活，死亡率为14％，低于模型对照组(P＜0.01)；

(4)地塞米松+胸腺肽α1干预组造模52天后全部死亡，死亡率为100％，远远高于模型对照组(P＜0.01)。

各组各时间段死亡大鼠进行主要脏器解剖，结果显示，模型对照组、Tα1干预组感染脏器主要集中在肺脏，而激素处理的两组肺脏、肝脏，包括腹腔网膜均有严重感染。

Claims (5)

1.胸腺肽α1在制备治疗肺纤维化药物中的用途。

2.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的胸腺肽α1纠正肺纤维化机体的免疫功能失衡。

3.按权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的胸腺肽α1增加Th1型反应或抑制Th2型反应.

4.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的胸腺肽α1减少感染发生率，降低死亡率。

5.按权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的胸腺肽α1纠正Th细胞不足，抑制Ts细胞的生成，提升γ-球蛋白值或提升B细胞免疫水平。

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