CN102971437A - 扩增靶基因内存在多种变异的基因区域的引物组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了用于扩增靶基因内存在多种变异的基因区域的引物组合物,其包括:第一引物组,其包括一个或多个特异于一个或多个模板的引物,所述模板包括靶基因内进行分析的基因变异碱基序列的基因型可分析序列;及第二引物组,其包括一个或多个引物,所述引物通过从第一引物组的引物中选择一个具有最多数目的共同碱基的引物而设计并使用所选的引物作为参照,第二引物组的一个或多个引物特异性结合模板或互补地结合模板,并允许与模板3'端附近的多达3个连续碱基或优选地1至2个碱基错配。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于扩增基因区域的引物组合物,所述基因区域在靶基因内存在多种变异,本发明还涉及使用所述引物组合物扩增靶基因的方法,包含所述引物组合物的PCR扩增试剂盒,以及对靶基因进行基因分型的方法,更特别地涉及能够简单并有效地扩增靶基因内存在多种变异的基因区域的引物组合物,以无缺失地完成基因区域的准确扩增,同时满足特异性和敏感性条件下精确地分析大量基因型,使用所述引物组合物扩增靶基因的方法,包含所述引物组合物的PCR扩增试剂盒,以及使用所述引物组合物对靶基因进行基因分型的方法。
另外,本发明涉及一种能够产生扩增产物的引物组合物,当扩增靶基因内存在多种变异的基因区域时,所述扩增产物的序列除了待分析的序列的“基因型可分析序列”之外的序列彼此相同,以减少基于限制性片段质量多态性(RFMP)分析的基因分型所示的峰的数目,并利于基因分型,使用所述引物组合物扩增靶基因的方法,包含所述引物组合物的PCR扩增试剂盒,以及使用所述引物组合物对靶基因进行基因分型的方法。
背景技术
有关风险程度的测量广泛使用活生物体的基因分型,进行初步体检或疾病诊断以提供适当的治疗方法。例如,通过分析受试者特定基因的变异及预测疾病的风险程度,基因分型可提前预防疾病。另外,可进行基因分型以分析生物体内任何传染性病原体(诸如病毒)导致的感染是否抗通过分析病毒的遗传变异的特定治疗药物,并预防传染性病原体对特定治疗药物的反应,例如,对药物的抗性反应,且因此开发为患者定制的治疗方法。
人类基因组的基因图谱完成后,允许基因分型广泛进行疾病风险程度的测量,初步体检或疾病诊断及药物反应的预测,并增加了医疗领域中基因分型的兴趣。然而,应注意的是应分析一些碱基序列信息,且应在同时满足特异性和敏感性条件下准确并有效地进行该分析以清楚地揭示包括人类的活生物体中的基因突变和疾病的关系。
尽管有几种分析核苷酸序列或碱基变异的方法,但基本上使用所述方法前应获得大量基因样品。目前,获得基因样品的最常用方法是使用聚合酶链反应(PCR)方法(下文中称为“PCR”),该方法使用DNA聚合酶。根据PRC方法,可通过设计能够结合模板的引物扩增基因的所需区域。从基因中选择需要扩增的区域并确定能够与所选区域的3’端序列互补结合的核苷酸序列以设计引物。
然而,很难设计用于靶基因内存在多种变异的基因区域的引物,所述靶基因选作用于基因分型。需要小心处理及足够的时间合成PCR引物。此外,存在由引物的非特异性杂交产生假阳性产物的问题。特别是,如果靶基因内有数十或数百种基因型,更难以精确地扩增靶基因内的所有基因区域,每个基因区域存在多种变异,并在同时满足特异性和敏感性的条件下分析其基因型。例如,已知人乳头瘤病毒(下文中称作“HPV”)具有80多株及大约120个亚型。
如上所述如果靶基因内存在至少几十种基因型,很难设计多个精确用于靶基因内存在多种变异的基因区域的引物。另外,由于未能扩增具有特异性变异的基因区域,它会引起假阴性问题以将目的基因型确定为阴性,或通过上述的引物非特异性杂交引起假阳性问题。随着使用的引物的种类数量增加,假阳性问题变得更加严重。靶基因内存在至少几十种基因型的情况下,根据敏感性和特异性之间的权衡比,很难设计并提供同时满足敏感性和特异性的多个引物以精确地扩增靶基因内存在多种变异的基因区域。
当扩增存在多种变异的基因区域时,普遍使用已知的含有至少一个混合碱基的引物设计方法或混合多个设计的引物的方法。
首先,如果假设A型和B型基因进行如下分析,以这样的方式制备含有至少一个混合碱基的引物,其中使用分别对应于腺嘌呤(A)或胞嘧啶(C),及鸟嘌呤(G)或腺嘌呤(A)的混合碱基设计第三和第十五碱基:
A型基因:5'-ggA ttc ggg ccc gaG tct-3';及
B型基因:5'-ggC ttc ggg ccc gaA tct-3'。
因此,可设计具有以下序列的引物用于A型和B型基因:
5'-ggM ttc ggg ccc gaR tct-3'(R=A/G,M=A/C)。
然而,如果使用很多混合碱基,引物的Tm值变得更高,且可合成不同于模板核苷酸序列的碱基以产生几种扩增产物,由于使用混合碱基所述产物的核苷酸序列不同于一个模板。因此,使用混合碱基的现有技术不能解决上述PCR产物的假阳性问题。
可选地,分别设计了特异于A型基因的引物A和特异于B型基因的引物B,并将其混合以通过引物A和引物B分别结合A型基因和B型基因产生PCR产物。如果靶基因内的基因区域具有少数变异这种方法可以起作用。然而,如果靶基因内的基因区域存在超过几十种变异,当扩增靶基因内存在多种变异的基因区域时其将引起假阳性问题。例如,在上述情况下通常期望的是,引物A和引物B分别结合A型基因和B型基因以产生各自的PCR产物。但是,有可能引物A和引物B的产物由一个模板共同扩增。在模板最初微量的浓度下,特异性引物只能与相应的模板结合,然而,在产物扩增达到一定浓度后,非特异性引物可与由模板扩增的产物结合。这将导致用于一个模板的几种引物混合并扩增几种产物,所述产物的核苷酸序列彼此不同。
因此,当通过PCR扩增存在多种变异的基因区域时,预先进行PCR以分析模板的核苷酸序列,如果使用采用混合碱基的引物或多种特异性引物以相同浓度混合,由于通过非特异性引物复制模板不可能准确地分析核苷酸序列。换言之,扩增存在多种变异的基因区域时,如果基于每种基因型一对一的对应关系简单地设计引物,很难提供同时满足敏感性和特异性的引物。另一方面,如果将使用的引物种类最小化,某种程度上可能解决假阳性问题,但不能扩增特异性变异,这将不可避免地出现敏感性降低的问题。
同时,如果由一个模板扩增的几种PCR产物的核苷酸序列彼此不同,在分析模板核苷酸序列时可能导致错误结果。例如,在PCR-SSCP中,扩增包括待分析的碱基的核苷酸序列,以使其分离为单链,并进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(Orita,M.等,Genomics,1989,5:8874-8879)。在PCR-SSCP中,由于一个核苷酸差异引起DNA链二级结构的差异,可能依据二级结构的差异导致的电泳迁移率或速度差鉴定是否存在碱基变异。按照PCR-SSCP方法,当待分析的碱基只由模板复制,且其余部分具有相同的碱基序列的情况下,就可能准确地识别碱基变异。因此,如果核苷酸序列彼此不同的几种产物被扩增,其可能导致错误结果。
另外,本发明人已研发了一种新的基因分型方法,称为“限制性片段质量多态性分析(RFMP分析)”,其已在韩国专利公开号10-0477766和10-0642829的专利申请中公开。在RFMP分析中,扩增包括待分析的碱基的核苷酸序列,通过限制性内切酶将其切除以产生片段,并通过测量片段的分子量分析其基因型。然而,如果核苷酸序列彼此不同的几种产物被扩增,将会出现由一个模板产生几种不同分子量的问题。另外,因为RFMP是通过测量由待分析的基因区域的扩增产物产生的片段的分子量分析基因型的方法,如果质谱图中存在许多分子量峰,其使得RFMP分析变得复杂并困难。因此,如果基于每种基因型一对一的对应关系制备多个引物,然后将其混合以扩增靶基因内存在多种变异的基因区域并通过“RFMP分析“分析基因区域的基因型,由于质谱峰增加,有很大可能性使其分析变得更加困难并导致错误结果。
为了解决上述问题,在本领域中需要提供根据权衡后同时满足敏感性和特异性的引物,从而精确地扩增靶基因内存在多种变异的基因区域。
发明内容
技术问题
本发明的目的是解决上述问题并提供能够简单且有效地扩增靶基因内存在多种变异的基因区域的引物组合物,以无缺失地完成基因区域的准确扩增,并同时满足特异性和敏感性条件下精确地分析大量基因型,本发明还提供了使用所述引物组合物扩增靶基因的方法,包括所述引物组合物的PCR扩增试剂盒,以及使用所述引物组合物对靶基因进行基因分型的方法。
更具体地,本发明的目的在于提供引物组合物,其包括待分析的序列附近碱基存在各种变异时,通过设计并混合每种特异性引物获得的引物,及能够扩增除序列的“基因型可分析序列”以外的所有其余部分以具有相同序列,通过PCR扩增存在多种遗传变异的序列并精确地分析其序列及变异,使用所述引物组合物扩增靶基因的方法,包括所述引物组合物的PCR扩增试剂盒,以及使用所述引物组合物对靶基因进行基因分型的方法。
此外,本发明的目的在于提供能够产生扩增产物的引物组合物,当扩增靶基因内存在多种变异的基因区域时,所述扩增产物的序列除了进行分析的序列的“基因型可分析序列”彼此相同,以减少基于限制性片段质量多态性(RFMP)检测的基因分型所示的峰的数目并利于基因分型,使用所述引物组合物扩增靶基因的方法,包括所述引物组合物的PCR扩增试剂盒,以及使用所述引物组合物对靶基因进行基因分型的方法。
技术方案
本发明的发明人继续研究与上述问题有关的改进的RFMP分析。结果,本发明的发明人发现扩增靶基因内存在多种变异的基因区域时,如果基于每种基因型一对一的对应关系简单地设计引物,很难提供同时满足敏感性和特异性的引物,且通过最大限度地减少使用的引物及扩增除“基因型分析序列”以外的具有相同序列的所有其余部分,才能准确地分析基因区域的核苷酸序列。
同时,能够扩增存在多种变异的基因区域的引物组合物并不限于在一个实施方案中所述的RFMP分析,其应解释为适用于使用PCR产物分析基因型的各种技术的技术平台,例如,诸如微矩阵芯片的基因分型技术等。
首先,将本发明说明书中使用的术语描述如下:
说明书中使用的限制性片段质量多态性分析(以下简称为"RFMP分析")是指一种通过PCR扩增待分析的基因的基因分型方法,使用限制性内切酶识别具有变异的限制性位点酶切PCR产物,以产生分子量不同的限制性片段,其分子量取决于碱基变异的存在,并通过测量限制性片段的分子量分析基因型(参见韩国专利公开号10-0477766和10-0642829)。
本发明说明书中使用的限制性内切酶识别序列是指执行上述RFMP分析时不同限制性内切酶同时或相近地识别的序列,且其可能与限制性内切酶切除的序列错配。在详细描述的本发明的实施方案中,作为示例使用的限制性内切酶FokI和BtsCI识别GGATG序列但从识别序列的3'端分别切除临近第9/第13位和第2/第0位的碱基。另外,所有的限制性内切酶可用作识别限制性内切酶识别序列的两种限制性内切酶。例如,可用于本发明目的的两种限制性内切酶可能包括彼此具有相同最适温度或不同最适温度的限制性内切酶,优选地,具有彼此不同的最适温度。例如,具有相对较低的最适温度的限制性内切酶可能包括FokI、BbvI、BsgI、BcgI、BpmI、BseRI MmelI、AvaII或BaeI等。例如,具有相对较高的最适温度的限制性内切酶可能包括BtsCI、BstF5I、TaqI、BsaBI、BtrI、BstAPI、FauI、BclI、PciI或ApoI等(参见韩国专利号10-0477766和10-0642829)。
另外,说明书中使用的术语“触发引物”(TP;也称为第一引物组)是指特异于包括基因型可分析序列的相应模板的引物,且该触发引物以低浓度混合于PCR反应混合物中以在最初PCR反应中完全耗尽。
此外,说明书中使用的术语“扩增引物”(AP;也称为第二引物组)是指通过比对靶基因内的序列确定基因型可分析序列并选择引物结合部分而制备的引物。扩增引物以如下方式设计,其可特异性结合特定的模板或互补地结合各种模板,并允许在模版的3'端附近的多达3个连续碱基或优选地1至2个碱基的错配。使用触发引物产生的最初PCR产物作为模板,扩增引物以高浓度混合于PCR反应混合物中以产生最终PCR产物。通常,引物组合物包括几种触发引物,其中每种触发引物特异于模板3'端附近的相应序列,所述模板包括多个靶基因内的基因型可分析序列,且通过选择一个触发引物中具有最多数目的共同碱基的引物以确定至少一个扩增引物而提供引物组合物。
此外,说明书中使用的术语“基因型可分析序列”是指能够从其它基因型特异性地区分目的靶基因的基因型的序列(核苷酸序列或氨基酸序列),且其存在于靶基因内待分析的具有多种变异的区域内。
本发明提供了用于扩增靶基因内存在多种变异的基因区域的引物组合物,其包括:
第一引物组,其包括至少一个特异于至少一个模板的引物,所述模板包括靶基因内待分析的基因变异碱基序列的基因型可分析序列;
及第二引物组,其包括至少一个引物,所述引物通过从第一引物组的引物中选择一个具有最多数目的共同碱基的引物而设计,并使用所选的引物作为参照,第二引物组的引物特异性结合模板或互补地结合模板,并允许其与模板3'端附近的多达3个连续碱基或优选地1至2个碱基错配。
在所述引物组合物的一个实施方案中,第一引物组以低浓度提供于第一扩增反应物中以在模板的初始扩增反应中完全耗尽,且第二引物组以高浓度提供于第二扩增反应物中以使用通过第一引物组扩增的初始扩增产物作为模板产生最终扩增产物。
优选地,提供于第一扩增反应物的第一引物组的浓度可以用这样一种方式调节至一定浓度,其中第一引物组的引物可在模板的初始扩增反应中与模板结合(例如,10至15个PCR扩增循环),并在将模板的扩增产物扩增至一定浓度后耗尽。例如,第一引物组的引物浓度可以优选为第二引物组的引物浓度的1/2至1/20,更优选为1/8至1/16。然而,本发明不限于此,且引物浓度可根据反应条件改变。
在所述引物组合物的一个实施方案中,第一引物组的引物数量没有限制,但第一引物组和第二引物组的引物的总浓度优选地在2μM范围内。
在所述引物组合物的一个实施方案中,第一引物组的引物的超过四个的碱基应与模板3'端部分的核苷酸序列互补。另外,如果该引物与其它部分的核苷酸序列超过3个连续碱基错配,则该引物很难与模板结合。
在所述引物组合物的一个实施方案中,优选地以这样一种方式设计第一引物组的每个引物,其具有碱基变异的核苷酸序列可与模板互补结合且其它序列部分作为共同序列与第二引物组的引物相同。此外,优选地将第一引物组的引物设计为与第二引物组的引物序列长度相同。
在所述引物组合物的一个实施方案中,将最终扩增产物扩增至除基因型可分析序列以外,其它序列彼此相同的核苷酸序列。
在所述引物组合物的一个实施方案中,当靶基因是HPV基因时,第一引物组的引物是至少一个选自序列号6及序列号8-10的引物,且第二引物组的引物是至少一个选自序列号5及序列号7的引物。
在所述引物组合物的一个实施方案中,当靶基因是HLA-DQB1基因时,第一引物组的引物是至少一个选自序列号25及序列号26的引物,且第二引物组的引物是至少一个选自序列号23及序列号24的引物。
在所述引物组合物的一个实施方案中,当靶基因是HBV基因时,第一引物组的引物是至少一个选自序列号42-48的引物,且第二引物组的引物是至少一个选自序列号40及序列号41的引物。
另外,不是必须将第一引物组提供为一对正向引物和反向引物。例如,如果第一引物组只有反向引物,那么反向引物将与第二引物组的正向引物配对以进行扩增反应。将第二引物组作为正向引物和反向引物的组合提供于扩增反应物。
本发明提供了PCR扩增试剂盒,其包括用于扩增靶基因内存在多种变异的基因区域的引物组合物,该试剂盒包括至少一个多核苷酸模板;第一引物组,其包括至少一个特异于至少一个模板的引物,所述模板包括靶基因内待分析的基因变异碱基序列的基因型可分析序列;第二引物组,其包括至少一个引物,所述引物通过从第一引物组的引物中选择一个具有最多数目的共同碱基的引物而设计并使用所选的引物作为参照,第二引物组的引物特异性结合模板或互补地结合模板,并允许与模板3'端附近的多达3个连续碱基或优选地1至2个碱基错配;DNA聚合酶;dNTPs及缓冲溶液。
在PCR扩增试剂盒的一个实施方案中,第一引物组以低浓度提供于第一扩增反应物中以在模板的初始扩增反应中完全耗尽,且第二引物组以高浓度提供于第二扩增反应物中以使用通过第一引物组扩增的初始扩增产物作为模板产生最终扩增产物。
在PCR扩增试剂盒的一个实施方案中,提供于第一扩增反应物的第一引物组的浓度可以用这样一种方式优选地调节至一定浓度,其中第一引物组的引物可在模板的初始扩增反应中与模板结合(例如,10至15个PCR扩增循环),并在将模板的扩增产物扩增至一定浓度后耗尽。例如,第一引物组的引物浓度可以优选为第二引物组的引物浓度的1/2至1/20,更优选为1/8至1/16。然而,本发明不限于此,且引物浓度可根据反应条件改变。
在PCR扩增试剂盒的一个实施方案中,第一引物组的引物数量没有限制,但第一引物组和第二引物组的引物的总浓度优选地在2μM范围内。
在PCR扩增试剂盒的一个实施方案中,将最终扩增产物扩增至除基因型可分析序列以外,其它序列具有彼此相同的核苷酸序列。
在PCR扩增试剂盒的一个实施方案中,当靶基因是HPV基因时,第一引物组的引物是至少一个选自序列号6及序列号8-10的引物,且第二引物组的引物是至少一个选自序列号5及序列号7的引物。
在PCR扩增试剂盒的一个实施方案中,当靶基因是HLA-DQB1基因时,第一引物组的引物是至少一个选自序列号25及序列号26的引物,且第二引物组的引物是至少一个选自序列号23及序列号24的引物。
在PCR扩增试剂盒的一个实施方案中,当靶基因是HBV基因时,第一引物组的引物是至少一个选自序列号42-48的引物,且第二引物组的引物是至少一个选自序列号40及序列号41的引物。
在PCR扩增试剂盒的一个实施方案中,以正向引物和反向引物的组合,将第二引物组提供于扩增反应物中。
本发明提供了使用扩增靶基因内存在多种变异的基因区域的引物组合物扩增靶基因的方法,其包括:
(a)制备第一引物组,其包括至少一个特异于至少一个模板的引物,所述模板包括靶基因内待分析的基因变异碱基序列的基因型可分析序列;
(b)制备第二引物组,其包括至少一个引物,所述引物通过从第一引物组的引物中选择一个具有最多数目的共同碱基的引物而设计并使用所选的引物作为参照,第二引物组的引物特异性结合模板或互补地结合模板,并允许其与模板3'端附近的多达3个连续碱基或优选地1至2个碱基错配;
(c)将至少一个第一引物组的引物和至少一个第二引物组的引物添加到扩增反应物中进行PCR扩增反应,所述扩增反应物包括至少一种多核苷酸模板、DNA聚合酶、dNTPs及缓冲溶液;
(d)将至少一个第一引物组的引物与模板互补结合,扩增模板并在最初PCR扩增反应中耗尽第一引物组;
(e)通过使用第二引物组至少一个的引物,并使用由第一引物组的至少一个引物扩增的扩增产物作为模板,进行进一步扩增反应;及
(f)获得具有基因型可分析序列的最终扩增产物,其扩增至除基因型可分析序列以外,其它序列具有相同的核苷酸序列。
在一个用于扩增靶基因的方法的实施方案中,在步骤(c)中,第一引物组以低浓度加入扩增反应物,第二引物组与第一引物组相比以高浓度加入扩增反应物。
在步骤(c)中,第一引物组的引物浓度可以优选为第二引物组的引物浓度的1/2至1/20,更优选为1/8至1/16。然而,本发明不限于此,且引物浓度可根据反应条件改变。
在一个用于扩增靶基因的方法的实施方案中,在步骤(c)中,第一引物组和第二引物组的引物的总浓度优选地在2μM范围内。
在一个用于扩增靶基因的方法的实施方案中,当靶基因是HPV基因时,第一引物组的引物是至少一个选自序列号6及序列号8-10的引物,且第二引物组的引物是至少一个选自序列号5及序列号7的引物。
在一个用于扩增靶基因的方法的实施方案中,当靶基因是HLA-DQB1基因时,第一引物组的引物是至少一个选自序列号25及序列号26的引物,且第二引物组的引物是至少一个选自序列号23及序列号24的引物。
在一个用于扩增靶基因的方法的实施方案中,当靶基因是HBV基因时,第一引物组的引物是至少一个选自序列号42-48的引物,且第二引物组的引物是至少一个选自序列号40及序列号41的引物。
在用于扩增靶基因的方法的一个实施方案中,以正向引物和反向引物的组合,将第二引物组提供于扩增反应物。
本发明提供了使用扩增靶基因内存在多种变异的基因区域的引物组合物对靶基因进行基因分型的方法,其包括:
(a)根据上述扩增靶基因的方法扩增靶基因;
(b)通过限制性内切酶酶切步骤(a)中扩增的多核苷酸,所述多核苷酸包括靶基因内待分析的基因变异碱基序列的基因型可分析序列,并且除所述基因型可分析序列以外,其它序列具有相同的核苷酸序列,通过限制性内切酶酶切所述多核苷酸以产生至少两种具有变异碱基的单链多核苷酸片段,所述片段的碱基数目在有限范围内;及
(c)测定所述片段的分子量。
在一种对靶基因进行基因分型的方法的实施方案中,所述片段具有变异碱基,且所述片段的碱基数目的范围在2个至32个之间。
在对靶基因进行基因分型的方法的一个实施方案中,当步骤(a)中扩增的靶基因是HPV基因时,第一引物组的引物是至少一个选自序列号6及序列号8-10的引物,且第二引物组的引物是至少一个选自序列号5及序列号7的引物。
在对靶基因进行基因分型的方法的一个实施方案中,当步骤(a)中扩增的靶基因是HLA-DQB1基因时,第一引物组的引物是至少一个选自序列号25及序列号26的引物,且第二引物组的引物是至少一个选自序列号23及序列号24的引物。
在对靶基因进行基因分型的方法的一个实施方案中,当步骤(a)中扩增的靶基因是HBV基因时,第一引物组的引物是至少一个选自序列号42-48的引物,且第二引物组的引物是至少一个选自序列号40及序列号41的引物。
在对靶基因进行基因分型的方法的一个实施方案中,用于步骤(a)中扩增的靶基因的第二引物组作为正向引物和反向引物的组合提供。
技术效果
本发明可简单并有效地扩增靶基因内存在多种变异的基因区域,以无缺失地完成基因区域的准确扩增并同时满足特异性和敏感性的条件下精确地分析大量基因型。更具体地,当扩增靶基因内存在多种变异的基因区域时,本发明在PCR反应中采用触发引物和扩增引物可以产生扩增产物,所述扩增产物的序列除了待分析的序列的“基因型可分析序列”以外,其它序列彼此相同,以使存在多种基因变异的序列能够通过PCR扩增并使其序列和变异得到精确分析。
此外,根据本发明,可能产生除“基因型可分析序列”以外的其它序列彼此相同的扩增产物以减少基于限制性片段质量多态性(RFMP)分析的基因分型所示的峰的数目,并利于基因分型。
因此,本发明可用于各种领域,例如,需要分析碱基变异的生物技术领域、医学领域和制药领域。
附图说明
本领域的技术人员将从以下详细描述并结合附图更清楚地理解本发明的上述和其它目的、特征及其它优势。
图1表示简单并有效地无缺失地扩增各种变异基因的方法,并由此通过使用本发明的触发引物和扩增引物进行PCR反应分析大量基因型的示意图。
图2表示通过使用本发明的触发引物和扩增引物进行PCR扩增后执行RFMP分析而获得的HPV59基因型的MALDI-TOF质谱分析图。
图3表示通过使用本发明的触发引物和扩增引物进行PCR扩增后执行RFMP分析而获得的HPV16基因型的MALDI-TOF质谱分析图。
图4表示通过使用本发明的触发引物和扩增引物进行PCR扩增后执行RFMP分析而获得的HPV51基因型的MALDI-TOF质谱分析图。
图5表示通过使用本发明的触发引物和扩增引物进行PCR扩增后执行RFMP分析而获得的HPV68基因型的MALDI-TOF质谱分析图。
图6表示通过使用本发明的触发引物和扩增引物进行PCR扩增后执行RFMP分析而获得的HLA-DQB 1人类异基因型(0201/0501)的MALDI-TOF质谱分析图。
图7表示通过使用本发明的触发引物和扩增引物进行PCR扩增后执行RFMP分析而获得的HLA-DQB 1人类异基因型(0301/0401)的MALDI-TOF质谱分析图。
图8表示通过使用本发明的触发引物和扩增引物进行PCR扩增后执行RFMP分析而获得的野生型HBV基因型的MALDI-TOF质谱分析图,由碱基变异HBV聚合酶诱导阿德福韦耐药性,野生型HBV基因型中第236位密码子是编码氨基酸天冬酰胺(Asn)的AAC。
图9表示通过使用本发明的触发引物和扩增引物进行PCR扩增后执行RFMP分析而获得的突变型HBV基因型的MALDI-TOF质谱分析图,由碱基变异HBV聚合酶诱导阿德福韦耐药性,突变型HBV基因型中第236位密码子是编码氨基酸苏氨酸(Thr)的ACT。
具体实施方式
在以下实施例中将更加清楚的示出本发明实践中和优选的实施方案。然而,应当理解的是本领域技术人员,在考虑了本文公开的内容后,可以在本发明的精神和范围内做出修改和改进。说明书中的参考文献都已引入的方式纳入本发明中。
实施例
实施例1.HPV(人乳头瘤病毒)基因分型
使用上述限制性片段质量多态性分析(以下,称为“RFMP分析”)得知人乳头瘤病毒(以下,称为“HPV”)的基因型引起人类宫颈癌。在该实施例中,对HPV DNA进行分析。
HPV是属于乳多泡病毒病毒家族的DNA病毒,其由72个外单元(壳粒)形成二十面体,并包括由7,900个核苷酸构成的双链环形DNA。取决于核苷酸序列的相似度,HPV可分为120种不同的亚型。已知这120种亚型中的30种亚型感染下生殖道。根据导致宫颈上皮内瘤变和宫颈癌的危险程度,将其分成高风险型HPV-16、HPV-18、HPV-26、HPV-30、HPV-31、HPV-33、HPV-35、HPV-39、HPV-45、HPV-51、HPV-52、HPV-53、HPV-56、HPV-57、HPV-58、HPV-59、HPV-67、HPV-68、HPV-73、HPV-74;以及低风险型HPV-2a、HPV-3、HPV-6、HPV-10、HPV-11、HPV-32、HPV-34、HPV-40、HPV-42、HPV-43、HPV-44.HPV-54、HPV-55、HPV-61、HPV-69、HPV-70(Munoz N等,N Engl J Med,2003,348(6):518-27)。对HPV进行基因分型和测试,发现很难扩增几十个HPV DNA从而分析其各种变异,并且特别是同时满足测试风险类型中的特异性和敏感性。
同时,HPV的基因组结构大体上分为早期转录区E(早期基因区)和晚期转录区L(晚期基因区),以及并不表达的LCR区(长的控制区)。HPV的基因组结构主要影响疾病的发病类型、危险程度、以及疾病的预后。尤其是,已知早期转录区的E6基因和E7基因在致癌作用中,通过插入到受感染细胞的基因组中并留在该基因组中表达而发挥最重要的作用。例如,属于高危险型的HPV的E6基因和E7基因,分别与p53肿瘤抑制基因和rb(成视网膜细胞瘤)基因表达的蛋白结合,使其失活。结果是,抑制细胞周期和细胞死亡(凋亡)的调控机制从而使宫颈内的正常细胞转化成癌细胞。另一方面,属于低危险型的HPV,例如HPV-6和HPV-11,已知使肿瘤抑制基因表达的蛋白失活的能力降低,并且属于低危险型的HPV很难引起宫颈癌(Barbosa M.S.等,In vitro biologicalactivities of the E6and E7gene vary among HPVs of different oncogenicpotential.J.Virol.,65:292-298,1991)。
因此,如果检测靶基因中的遗传变异(例如E6基因和E7基因)以分析HPV的基因型,那么就可以验证高危险型HPV感染并由此预先监控宫颈癌的发生。以下将根据由本发明人开发的RFMP分析,并采用以下实施例中的上述触发引物和扩增引物对HPV的基因分型方法进行详述。
1.PCR扩增
通过比对大约80种HPV品种的序列确定“基因型可分析序列”,并选择引物结合部分,从而制备一对扩增引物(AP)。以如下方式设计扩增引物:所述扩增引物可以与各种HPV DNA模版互补结合,并允许与模版3'端附近的多达3个连续碱基或优选地1至2个碱基错配。例如,通过制备几种触发引物(TP)确定扩增引物,每种触发引物对各种HPVDNA模版的3'端附近的序列是特异的,并通过在触发引物中选择一个具有最多数目的共同碱基的引物。使用混合物进行PCR,该混合物包括高浓度的上述扩增引物(AP)和低浓度的上述触发引物(TP)。
通过引物在高危险型HPV基因中扩增的模版DNA序列(5'→3')如下所示:
HPV 59
GCTCAGGGTTTAAACAATGGtatatgttggcacaatcaattgtTTTTAACAGT TGTAGATACTACTCGCAGCACCAATCTT(序列号1);
HPV 16
GCACAGGGCCACAATAATGGcatttgttggggtaaccaactaTTTGTTACTG TTGTTGATACTACACGCAGTACAAATATG(序列号2);
HPV 51
GCGCAGGGTCACAATAATGGcatttgctggaacaatcagcttTTTATTACCT GTGTTGATACTACCAGAAGTACAAATTTA(序列号3);以及
HPV 68
GCACAGGGACACAACAATGGtatttgttggcataatcaattaTTTCTTACTGT TGTGGATACCACTCGCAGTACCAATTTT(序列号4)。
HPV DNA模版序列的具有下划线的序列是与如下所示的引物1-6结合的部分。在每个HPV DNA模版的前面的具有下划线的序列是正向引物的结合部分。在每个HPV DNA模版的后面的具有下划线的序列是反向引物的结合部分。小写字母表示的序列是基因型可分析序列。
*正向引物
*反向引物
基于HPV 16DNA模版,正向引物的引物1是扩增引物(AP)并且正向引物的引物2是触发引物(TP)。另外,反向引物的引物3是扩增引物(AP)并且反向引物的引物4-6是触发引物(TP)。正向引物以如下方式设计:其3'端序列的5个碱基与HPV DNA模版互补。反向引物以如下方式设计:其3'端序列的7个碱基与HPV DNA模版互补。小写字母表示的序列是FokI和BtsCI的限制性内切酶的识别序列。在该实施例中,插入限制性内切酶的识别序列以进行RFMP分析。
例如,正向扩增引物(AP)的引物1以如下方式设计:3'端序列的5个碱基几乎与所有的HPV基因型完全匹配。引物2是正向触发引物(TP),其特异地设计为对HPV 59DNA具有特异性。因为HPV 59DNA模版在至少4个连续的碱基中(由粗体字母表示)与正向扩增引物(AP)的引物1并不是互补的并且是错配的。
反向扩增引物(AP)的引物3以如下方式设计:3’端序列的7个碱基与HPV 16DNA模版完全匹配,并且与所有的HPV基因型互补结合,其允许多达3个连续碱基或1至2个碱基的错配。反向触发引物(TP)的引物4,其与HPV 34、HPV 59和HPV 73互补,特异地设计成在第4位的碱基(A)和第6位的碱基(T)上与引物3的3’端序列有所不同(由粗体字母表示)。反向触发引物(TP)的引物5,其与HPV 51、HPV 70和HPV 82互补,特异的设计成在第4位的碱基(T)上与引物3的3’端序列有所不同(由粗体字母表示)。反向触发引物(TP)的引物6,其与HPV 39和HPV68互补,特异的设计成在第4位的碱基(G)上与引物3的3’端序列有所不同(由粗体字母表示)。
将待分析的PCR缓冲液(1x)、2mM MgSO4、200mM dNTP、0.5U铂Taq聚合酶(Invitrogen,10966-026)、0.4μM引物1、0.4μM引物3、0.05μM引物2、0.05μM引物4、0.025μM引物5、0.025μM引物6和100ng HPV DNA加入到设置成25μL的总反应体积中。按照如下条件进行PCR反应(参见图1步骤(A))。
94℃5分钟;
94℃15秒,45℃15秒,72℃15秒(45个循环);以及
72℃5分钟。
触发引物(TP)与每个HPV模版互补结合,从而进行PCR反应并且在最初的PCR反应中产生PCR扩增产物(参见图1步骤(A))。与此同时,引物2和4与HPV 59DNA模版结合,引物1和5与HPV 51DNA模版结合,并且引物1和6与HPV 68DNA模版结合以产生以下扩增产物。从最初的反应开始,扩增引物(AP)的引物1和3与HPV 16DNA模版结合从而产生以下扩增产物。通过最初的PCR反应(10-15个循环)由每个HPV DNA模版制备的HPV DNA片段(5'→3')的序列如下所示:
HPV 59
GCACAGGGTTTAAAggatgAATGG[tatatgttggcacaatcaattgt]TTTTTA AcatccGTTGTTGATACTAC(序列号11);
HPV 16
GCACAGGGCCACAAggatgAATGG[catttgttggggtaaccaacta]TTTGTT AcatccGTTGTTGATACTAC(序列号12);
HPV 51
GCACAGGGCCACAAggatgAATGG[catttgctggaacaatcagctt]TTTATT AcatccGTTGTTGATACTAC(序列号13);以及
HPV 68
GCACAGGGCCACAAggatgAATGG[tatttgttggcataatcaatta]TTTCTTAcatccGTTGTTGATACTAC (序列号14)。
同时,特异性触发引物(TP)结合于每个HPV DNA模版以扩增模版(在HPV 16DNA模版的情况下,扩增引物(AP)作为触发引物(TP)与HPV16DNA模版结合)。在PCR扩增过程中,在最初的阶段,以低浓度加入的触发引物(TP)完全消耗后,在一定浓度下扩增每个HPV DNA片段,在每个HPV DNA片段的引物结合序列部分,与触发引物(TP)不同的扩增引物(AP)结合于每个HPV DNA片段,从而进行扩增(参见图1步骤(B))。该步骤是可行的,因为反向扩增引物(AP)的引物3最初以如下方式设计:3’端序列的7个碱基与所有的HPV基因型互补结合,并其允许多达3个连续碱基或1至2个碱基的错配,并且在PCR扩增中以高于触发引物(TP)的浓度添加。
根据本实施方案,仅从各种HPV DNA模版中复制了“基因型可分析序列”,除了基因型可分析序列之外,从扩增引物(AP)复制的其它序列(除了以下序列中方括号([])中所示出的序列)彼此具有相同的核苷酸序列(参见图1步骤(C))。最终扩增产物由扩增引物(AP)扩增的多数产物和由触发引物(TP)扩增的少数产物组成,该少数产物并不影响分析结果。由每个HPV DNA模版制备的最终的HPV DNA片段(5'→3')序列如下所示:
HPV 59
GCACAGGGCCACAAggatgAATGG[tatatgttggcacaatcaattgt]TTTGTT AcatccGTTGTTGATACTAC(序列号15);
HPV 16
GCACAGGGCCACAAggatgAATGG[catttgttggggtaaccaacta]TTTGTT AcatccGTTGTTGATACTAC(序列号16);
HPV 51
GCACAGGGCCACAAggatgAATGG[catttgctggaacaatcagctt]TTTGTT AcatccGTTGTTGATACTAC(序列号17);和
HPV 68
GCACAGGGCCACAAggatgAATGG[tatttgttggcataatcaatta]TTTGTTAcatccGTTGTTGATACTAC(序列号18)。
在PCR反应制备的序列中,用小写字母表示的序列是限制性内切酶的识别序列,划线的序列是由限制性内切酶酶切而产生的片段序列,由方括号([])表示的序列是基因型可分析序列。
在本实施方案中,使用触发引物(TP)和扩增引物(AP),仅针对HPV59、HPV 16、HPV 51和HPV 68进行PCR扩增。然而,本领域技术人员容易理解的是使用触发引物(TP)和扩增引物(AP)进行的PCR扩增能够应用于上述高风险HPV型和/或低风险HPV型的其它类型。
2.限制性内切酶的酶切、纯化及脱盐
将1U FokI(NEB R109L)、1U BtsCI(NEB R0647S)、50mM醋酸钾、20mM Tris-醋酸盐、10mM醋酸镁和1mM DTT(在25℃下,pH 7.9)加入到通过PCR反应扩增的产物中,并在37℃下反应1小时。
优选的是从用限制性内切酶处理的溶液中分离切割后的DNA片段,然后测量分离的DNA片段的分子量。例如,可以使用Oasis(Waters)C18离子交换树脂柱层析(C18反相柱层析法)分离由限制性内切酶酶切的DNA片段。首先,将70μL的0.15M的三乙基醋酸铵(TEAA,pH 7.6)加入到溶液中,并保持混合的溶液一分钟。通过使100%乙腈(ACN;Sigma,USA)和1mL的0.1M TEAA过柱以活化树脂。用限制性内切酶处理的溶液和0.15M TEAA溶液的100μL的混合物,2mL的0.1M TEAA和1mL的三级蒸馏水按顺序通过。将柱至于收集板上,并使100μL的70%ACN通过。在收集板中收集洗脱液,收集板在120℃下干燥60分钟。
3.MALDI-TOF质谱分析
4μL的MALDI矩阵(22.8mg的柠檬酸铵,148.5mg的羟基吡啶甲酸,1.12mL的乙腈,7.8mL的H2O)预先被分布于MALDI-TOF质谱分析仪(Biflex IV,Bruker)的锚芯片板上,并在37℃下干燥30分钟。将10μL的三级蒸馏水加入到通过纯化并脱盐获得的样品中,从而样品溶出。2μL溶解的溶液逐滴到干燥的MALDI矩阵上,在37℃下再次干燥MALDI矩阵30分钟,从而进行MALDI-TOF质谱分析。根据MALDI-TOF质谱分析手册进行分析。
基于MALDI-TOF质谱分析,由反应制备的片段的分子量的分析结果如图2-5所示。下表1总结了对各种HPV进行的分析结果,由分子量表示。基于表1的结果可以确定HPV的基因型。
表1示出了基于通过扩增引物(AP)扩增的产物计算的片段的分子量。它们不同于基于通过触发引物(TP)扩增的产物计算的片段的分子量。根据本发明的实施方案,证实了当每个触发引物(TP)以超过至少反应浓度混合时,同时出现来自扩增引物(AP)的片段的分子量和来自触发引物(TP)的片段的分子量。另一方面,当每个触发引物(TP)以低于反应浓度混合时,不能够进行HPV的基因型分析。
对HPV 59、HPV 16、HPV 51和HPV 68进行的MALDI-TOF质谱分析如图2~5所示,根据本发明的扩增产物中仅证实了来自扩增引物(AP)的片段的分子量。因此,如果在PCR之后使用本发明的触发引物(TP)和扩增引物(AP)进行RFMP分析,那么就可能毫无缺失地简单并有效地扩增多个变异基因,并在同时满足特异性和敏感性的条件下精确地分析多种基因型。
表1
实施例2.HLA(人白细胞抗原)-DQB1基因分型
进一步的证实是否使用本发明触发引物(TP)和扩增引物(AP)能够用于分析各种基因型。例如,对人免疫反应有关的HLA(人白细胞抗原)-DQB 1等位基因的进行基因分型,在PCR扩增后,使用了触发引物(TP)和扩增引物(AP)进行了RFMP分析。实施例2用人基因组DNA进行试验。
1.PCR扩增
通过比对大约100个HLA-DQB1序列确定“基因型可分析序列”,并选择引物的结合部分,从而制备一对扩增引物(AP)。另外,触发引物对(TP)制备成与HLA-DQB1*0201DNA模版的在HLA-DQB1*0201型的3’和5’端的特异性序列互补结合。使用混合物进行PCR,混合物包括上述设计的高浓度的扩增引物(AP)和低浓度的触发引物(TP)。
在待分析的HLA-DQB1等位基因中的通过引物扩增的模板DNA序列(5'→3')如下所示:
HLA-DQB1*0501
TGTGCTACTTCACCAACGGGACGGAGCgcgtgcggggtgtgaccagacAC ATCTATAACCGAGAGGAGTACGTGCGCTTCGAC(序列号19);
HLA-DQB1*0201
TGTGCTACTTCACCAACGGGACAGAGCgcgtgcgtcttgtgagcagaaGC ATCTATAACCGAGAAGAGATCGTGCGCTTCGAC (序列号20);
HLA-DQB1*0401
TGTGCTACTTCACCAACGGGACCGAGCtcgtgcggggtgtgaccagatAC ATCTATAACCGAGAGGAGTACGCGCGCTTCGAC(序列号21);以及
HLA-DQB1*0301
TGTGCTACTTCACCAACGGGACGGAGCgcgtgcgttatgtgaccagatACA TCTATAACCGAGAGGAGTACGCACGCTTCGAC (序列号22)。
HLA-DQB1等位基因的模板DNA序列的具有下划线的序列是下列引物7~10的结合部分。在每个HLA-DQB1等位基因的模板DNA序列前面的序列是正向引物结合的部分。在每个HLA-DQB1等位基因的模板DNA序列后面的具有下划线的序列是反向引物结合的部分。小写字母表示的序列是基因型可分析序列。
引物7:5'-TGTGCTACTTCACCAACggatgGACGGAGC-3'(30mer)(序列号23);
引物8:5'-GCGTGCGTACTCCTCTCGGTggatgATAGATGT-3'(33mer)(序列号24);
引物9:5'-TGTGCTACTTCACCAACggatgGACAGAGC-3'(30mer)(序列号25);以及
引物10:5'-GCGCACGATCTCTTCTCGGTggatgATAGATGC-3'(33mer)(序列号26).
正向引物的引物7是扩增引物(AP),且正向引物的引物9是触发引物(TP)。另外,反向引物的引物8是扩增引物(AP),且反向引物的引物10是触发引物(TP)。正向引物以如下方式设计:其3’端序列的4个碱基与HLA-DQB1DNA模版互补。反向引物以如下方式设计:其3’端序列的7个碱基与HLA-DQB1DNA模版互补。小写字母表示的序列是FokI和BtsCI的限制性内切酶的识别序列。在该实施例中,插入限制性内切酶的识别序列以进行RFMP分析。
例如,正向扩增引物(AP)的引物7以如下方式设计:其3'端序列的4个碱基几乎与所有的HLA-DQB1基因型完全匹配。引物9是正向触发引物(TP),其特异地设计为对HLA-DQB1*0201具有特异性,因为HLA-DQB1*0201DNA模版和正向扩增引物(AP)的引物7并不是互补的并且在1个核苷酸中是错配的(A:由粗体字母表示)。
反向扩增引物(AP)的引物8以如下方式设计:其3’端序列的7个碱基与所有的HLA-DQB1基因型完全匹配,除了HLA-DQB1*0201。引物10是反向触发引物(TP),其与HLA-DQB 1*0201互补,并设计成在其3’端序列的一个核苷酸和在其5’端序列的五个核苷酸与HLA-DQB1*0201的模板特异性匹配。
将PCR缓冲液(1x)、2mM MgSO4、200mM dNTP、0.5U铂Taq聚合酶(Invitrogen,10966-026)、0.4μM引物7、0.4μM引物8、0.025μM引物9、0.025μM引物10和100ng人DNA加入到设置成25μL的总反应体积中。按照如下条件进行PCR反应(参见图1步骤(A))。
94℃5分钟;
94℃15秒,45℃15秒,72℃15秒(45个循环);以及
72℃5分钟。
触发引物(TP)与每个HLA-DQB1模版互补结合,从而进行PCR反应,并且在最初的PCR反应中产生PCR扩增产物(参见图1步骤(A))。例如,引物9和10与HLA-DQB1*0201DNA模版结合从而产生以下扩增产物。从HLA-DQB 1*0201DNA模版通过最初的PCR反应(10-15个循环)制备的HLA-DQB1*0201DNA片段(5'→3')的序列如下所示:
HLA-DQB1*0201
TGTGCTACTTCACCAACggatgGACAGAGC[gcgtgcgtcttgtgagcagaa] GCATCTATcatccACCGAGAAGAGATCGTGCGC(序列号27)。
同时,特异性触发引物(TP)与HLA-DQB1*0201DNA模版结合以扩增模版。在PCR扩增过程中,在最初的阶段,以低浓度加入的触发引物(TP)完全消耗后,在一定浓度下扩增每个HLA-DQB1DNA片段,在每个HLA-DQB 1DNA片段的引物结合序列部分,与触发引物(TP)不同的扩增引物(AP)结合于每个HLA-DQB1 DNA片段,从而进行扩增(参见图1步骤(B))。该步骤是可行的,因为扩增引物(AP)的引物8最初以如下方式设计:其3’端序列的7个碱基与所有的HLA-DQB1基因型互补结合,并允许多达3个连续碱基或1至2个碱基的错配,并且在PCR扩增中以高于触发引物(TP)的浓度添加。
根据本实施方案,仅从各种HLA-DQB 1DNA模版中复制了“基因型可分析序列”,除了基因型可分析序列之外,由扩增引物(AP)复制的其它序列(除了以下序列中方括号([])中所示出的序列)彼此具有相同的核苷酸序列(参见图1步骤(C))。最终扩增产物由扩增引物(AP)扩增的多数产物和由触发引物(TP)扩增的少数产物组成,该少数产物并不影响分析结果。由每个HLA-DQB1DNA模版制备的最终的HLA-DQB1DNA片段(5'→3')的序列如下所示:
HLA-DQB1*0501
TGTGCTACTTCACCAACggatgGACGGAGC[gcgtgcggggtgtgaccagac] ACATCTATcatccACCGAGAGGAGTACGCACGC(序列号28);
HLA-DQB1*0201
TGTGCTACTTCACCAACggatgGACGGAGC[gcgtgcgtcttgtgagcagaa] ACATCTATcatccACCGAGAAGAGATCGCACGC(序列号29);
HLA-DQB1*0401
TGTGCTACTTCACCAACggatgGACGGAGC[tcgtgcggggtgtgaccagat] ACATCTATcatccACCGAGAGGAGTACGCACGC(序列号30);以及
HLA-DQB1*0301
TGTGCTACTTCACCAACggatgGACGGAGC[gcgtgcgttatgtgaccagat] ACATCTATcatccACCGAGAGGAGTACGCACGC(序列号31)。
在PCR反应制备的序列中,用小写字母表示的序列是限制性内切酶的识别序列,划线的序列是由限制性内切酶酶切而产生的片段序列,并且由方括号([])表示的序列是基因型可分析序列。扩增产物的制备原理与实施例1相同。
在本实施方案中,使用触发引物(TP)和扩增引物(AP),仅针对HLA-DQB1*0501、HLA-DQB1*0201、HLA-DQB1*0401、HLA-DQB1*0301进行PCR扩增。然而,本领域技术人员容易理解的是使用触发引物(TP)和扩增引物(AP)进行的PCR扩增能够应用于上述HLA-DQB1型的其它等位基因类型。
2.限制性内切酶的酶切、纯化及脱盐
过程与实施例1中所进行的过程相同。
3.MALDI-TOF质谱分析
与实施例1中相同的方式进行该过程。
根据MALDI-TOF质谱手册进行分析。基于MALDI-TOF质谱分析,由反应制备的片段的分子量的分析结果如图6-7所示。下表2总结了对各种HLA-DQB1等位基因进行的分析结果,由分子量表示。基于表2的结果可以确定HLA-DQB1等位基因的基因型。
表2示出了基于通过扩增引物(AP)扩增的产物计算的片段的分子量。它们不同于基于通过触发引物(TP)扩增的产物计算的片段的分子量。根据本发明的实施方案,证实了当触发引物(TP)以超过0.025μM的浓度混合时,同时出现来自扩增引物(AP)的片段的分子量和来自触发引物(TP)的片段的分子量。另一方面,当触发引物(TP)以低于0.025μM的浓度混合时,不能进行HLA-DQB1等位基因的基因型分析。
图6~7分别示出了对人异质基因型HLA-DQB1(0201/0501)的MALDI-TOF质谱分析图以及对人异质基因型HLA-DQB1(0301/0401)的MALDI-TOF质谱分析图。从图6~7中可以看出,根据本发明的实施方案的扩增产物中仅证实了来自扩增引物(AP)的片段的分子量。因此,如果在PCR之后使用本发明的触发引物(TP)和扩增引物(AP)进行RFMP分析,那么就可能无缺失地简单并有效地扩增多个变异基因数量,并在同时满足特异性和敏感性的条件下精确地分析多个基因型的数量。
表2
实施例3.与阿德福韦抗性有关的乙型肝炎病毒的碱基变异的分析
在乙型肝炎肝病毒的DNA聚合酶基因中偶然出现的碱基变异诱发了人类的乙型肝炎。通过碱基的一些变异,出现了对于治疗乙型肝炎的药物阿德福伟的抗性。据报道,A181V/T和N236T的氨基酸突变引起了对阿德福韦的抗性。进一步的证实了是否使用本发明触发引物(TP)和扩增引物(AP)进行的PCR扩增能够用于分析各种基因型。换句话说,在使用触发引物(TP)和扩增引物(AP)进行PCR扩增后,通过RFMP分析对具有阿德福伟抗性的乙型肝炎病毒的基因型进行了分析。实施例3针对HBV DNA进行。
1.PCR扩增
为了分析乙型肝炎病毒中的DNA聚合酶基因的第236位氨基酸的核苷酸制备了扩增引物对(AP)。另外,制备了几种在第237位和第238位的氨基酸的核苷酸序列上具有多态性的触发引物(TP),其中每种触发引物特异于各种HBV DNA模版。使用混合物进行PCR,所述混合物包括上述高浓度的扩增引物(AP)和上述低浓度的触发引物(TP)。
通过引物在待分析的HBV基因中扩增的模版DNA序列(5'→3')如下所示:
HBV#1(通用型)
TACCAATTTTCTTTTTGTCTTTGGGTATACATTTaaacCCTAATAA AACCAAACGTTGGG (序列号32);
HBV#2
TACCAATTTTCTTTTTGTCTTTGGGTATACATTTaaacCCTACTAA AACCAAACGTTGGG (序列号33);
HBV#3
TACCAATTTTCTTTTTGTCTTTGGGTATACATTTaaacCCTGATAA AACCAAACGTTGGG (序列号34);
HBV#4
TACCAATTTTCTTTTTGTCTTTGGGTATACATTTaaacCCTCATAA AACCAAACGTTGGG (序列号35);
HBV#5
TACCAATTTTCTTTTTGTCTTTGGGTATACATTTaaacCATAATAA AACCAAACGTTGGG (序列号36);
HBV#6
TACCAATTTTCTTTTTGTCTTTGGGTATACATTTaaacCATACTAA AACCAAACGTTGGG (序列号37);
HBV#7
TACCAATTTTCTTTTTGTCTTTGGGTATACATTTaaacCATGATAA AACCAAACGTTGGG (序列号38);以及
HBV#8
TACCAATTTTCTTTTTGTCTTTGGGTATACATTTaaacCATCATAA AACCAAACGTTGGG (序列号39)。
HBV DNA模板序列的具有下划线的序列是下列引物11~19的结合部分。在每个HBV DNA模板序列前面具有下划线的序列是正向引物结合的部分。在每个HBV DNA模板序列后面的具有下划线的序列是反向引物结合的部分。小写字母表示的序列是基因型可分析序列。
*正向引物
引物11:
5'-TACCAATTTTCTTTTggatgTGTCTTTGGGTATACATTT-3'(39mer)(序列号40)
*反向引物
引物12:5'-CCCAACGTTTggatgGGTTTTATTAGG-3'(27mer)(序列号41)
引物13:5'-CCCAACGTTTggatgGGTTTTAGTAGG-3'(27mer)(序列号42)
引物14:5'-CCCAACGTTTggatgGGTTTTATCAGG-3'(27mer)(序列号43)
引物15:5'-CCCAACGTTTggatgGGTTTTATGAGG-3'(27mer)(序列号44)
引物16:5'-CCCAACGTTTggatgGGTTTTATTATG-3'(27mer)(序列号45)
引物17:5'-CCCAACGTTTggatgGGTTTTAGTATG-3'(27mer)(序列号46)
引物18:5'-CCCAACGTTTggatgGGTTTTATCATG-3'(27mer)(序列号47)
引物19:5'-CCCAACGTTTggatgGGTTTTATGATG-3'(27mer)(序列号48)
基于HBV#1DNA模版,正向引物的引物11是扩增引物(AP),反向引物的引物12是触发引物(TP),并且反向引物的引物13~19是触发引物(TP)。正向引物以如下方式设计:其3’端序列的19个碱基与HBV DNA模版互补。反向引物以如下方式设计:其3’端序列的12个碱基与HBVDNA模版互补。小写字母表示的序列是FokI的限制性内切酶的识别序列。在该实施例中,插入限制性内切酶的识别序列以进行RFMP分析。
例如,正向扩增引物(AP)的引物11以如下方式设计:其3'端序列的19个碱基与所有的HBV基因型匹配。反向触发引物(TP)的引物12以如下方式设计:其3'端序列的12个碱基与HBV#1DNA模版完全匹配,并且与所有的HBV基因型的模板互补结合,允许多达3个连续碱基或1至2个碱基的错配。
关于触发引物的设计,考虑了变体HBV,该变体与通用型HBV在HBV DNA的3’端核苷酸序列不同。制备了针对HBV DNA的第237位和第238位的氨基酸的核苷酸序列具有多态性的引物13~19,其中每个引物特异于HBV DNA模版的变体。引物13是反向触发引物(TP),其与HBV#2互补,特异地设计为与引物12不同,变化为3’端序列的第5个碱基为(G)(由粗体字母表示)。引物14是反向触发引物(TP),其与HBV#3互补,特异地设计为与引物12不同,变化为3’端序列的第4个碱基为(C)(由粗体字母表示)。引物15是反向触发引物(TP),其与HBV#4互补,特异地设计为与引物12不同,变化为3’端序列的第4个碱基为(G)(由粗体字母表示)。引物16是反向触发引物(TP),其与HBV#5互补,特异地设计为与引物12不同,变化为3’端序列的第2个碱基为(T)(由粗体字母表示)。引物17是反向触发引物(TP),其与HBV#6互补,特异地设计为与引物12不同,变化为3’端序列的第2个碱基为(T)和第5个碱基为(G)(由粗体字母表示)。引物18是反向触发引物(TP),其与HBV#7互补,特异地设计为与引物12不同,变化为3’端序列的第2个碱基为(T)和第4个碱基为(C)(由粗体字母表示)。最后,引物19是反向触发引物(TP),其与HBV#8互补,特异地设计为与引物12不同,变化为3’端序列的第2个碱基为(T)和第4个碱基为(G)(由粗体字母表示)。
将待分析的PCR缓冲液(1x)、2mM MgSO4、200mM dNTP、0.5U铂Taq聚合酶(Invitrogen,10966-026)、0.4μM引物11、0.4μM引物12、0.07μM引物13、0.07μM引物14、0.04μM引物15、0.04μM引物16、0.05μM引物17、0.05μM引物18、0.05μM引物19和100ng HBV DNA加入到设置成25μL的总反应体积中。按照如下条件进行PCR反应(参见图1步骤(A))。
94℃5分钟;
94℃15秒,45℃15秒,72℃15秒(45个循环);以及
72℃5分钟。
触发引物(TP)与每个HBV模版互补结合,从而进行PCR反应并且在最初的PCR反应中产生PCR扩增产物(参见图1步骤(A))。与此同时,引物11和13与HBV#2DNA模版结合,引物11和14与HBV#3DNA模版结合,引物11和15与HBV#4DNA模版结合,引物11和16与HBV#5DNA模版结合,引物11和17与HBV#6DNA模版结合,引物11和18与HBV#7DNA模版结合,以及引物11和19与HBV#8DNA模版结合,从而产生以下扩增产物。通过最初的反应,扩增引物(AP)的引物11和12与HBV#1DNA模版结合,从而产生以下扩增产物。通过最初的PCR反应(10-15个循环)由每个HBV DNA模版制备的HBVDNA片段的序列(5'→3')如下所示。
HBV#1(通用型)
TACCAATTTTCTTTTggatgTGTCTTTGGGTATACATTT[aaac]CCTAATAAAACCcatccAAACGTTGGG(序列号49);
HBV#2
TACCAATTTTCTTTTggatgTGTCTTTGGGTATACATTT[aaac]CCTACTAAAACCcatccAAACGTTGGG(序列号50);
HBV#3
TACCAATTTTCTTTTggatgTGTCTTTGGGTATACATTT[aaac]CCTGATAAAACCcatccAAACGTTGGG(序列号51);
HBV#4
TACCAATTTTCTTTTggatgTGTCTTTGGGTATACATTT[aaac]CCTCATAAAACCcatccAAACGTTGGG(序列号52);
HBV#5
TACCAATTTTCTTTTggatgTGTCTTTGGGTATACATTT[aaac]CATAATAAAACCcatccAAACGTTGGG(序列号53);
HBV#6
TACCAATTTTCTTTTggatgTGTCTTTGGGTATACATTT[aaac]CATACTAAAACCcatccAAACGTTGGG(序列号54);
HBV#7
TACCAATTTTCTTTTggatgTGTCTTTGGGTATACATTT[aaac]CATGATAAAACCcatccAAACGTTGGG(序列号55);以及
HBV#8
TACCAATTTTCTTTTggatgTGTCTTTGGGTATACATTT[aaac]CATCATAAAACCcatccAAACGTTGGG(序列号56)。
同时,特异性的触发引物(TP)与每个HBV DNA模版结合从而扩增模板(在HBV#1DNA模版中,扩增引物(AP)作为触发引物(TP)与HBV#1DNA模版结合)。在PCR扩增过程中,在最初的阶段,以低浓度加入的触发引物(TP)完全消耗后,在一定浓度下扩增每个HBV DNA片段,在每个HBV DNA片段的引物结合序列部分,与触发引物(TP)不同的扩增引物(AP)结合于每个HBV DNA片段,从而进行扩增(参见图1步骤(B))。该步骤是可行的,因为反向扩增引物(AP)的引物12最初以如下方式设计:其3’端序列的12个碱基与所有的HBV基因型的模板互补结合,并允许与模版多达3个连续碱基或1至2个碱基错配,并且在PCR扩增中以高于触发引物(TP)的浓度添加。
根据本实施方案,仅从各种HBV DNA模版中复制了“基因型可分析序列”,除了基因型可分析序列之外,从扩增引物(AP)复制的其它序列(除了以下序列中方括号([])中所示出的序列)彼此具有相同的核苷酸序列(参见图1步骤(C))。最终扩增产物由扩增引物(AP)扩增的多数产物和由触发引物(TP)扩增的少数产物组成,该少数产物并不影响分析结果。由每个HBV DNA模版制备的最终的HBV DNA片段序列(5'→3')如下所示。
HBV#1(通用型)
TACCAATTTTCTTTTggatgTGTCTTTGGGTATACATTT[aaac]CCTAATAAAACCcatccAAACGTTGGG(序列号57);
HBV#2
TACCAATTTTCTTTTggatgTGTCTTTGGGTATACATTT[aaac]CCTAATAAAACCcatccAAACGTTGGG (序列号58);
HBV#3
TACCAATTTTCTTTTggatgTGTCTTTGGGTATACATTT[aaac]CCTAATAAAACCcatccAAACGTTGGG(序列号59);
HBV#4
TACCAATTTTCTTTTggatgTGTCTTTGGGTATACATTT[aaac]CCTAATAAAACCcatccAAACGTTGGG(序列号60);
HBV#5
TACCAATTTTCTTTTggatgTGTCTTTGGGTATACATTT[aaac]CCTAATAAAACCcatccAAACGTTGGG(序列号61);
HBV#6
TACCAATTTTCTTTTggatgTGTCTTTGGGTATACATTT[aaac]CCTAATAAAACCcatccAAACGTTGGG(序列号62);
HBV#7
TACCAATTTTCTTTTggatgTGTCTTTGGGTATACATTT[aaac]CCTAATAAAACCcatccAAACGTTGGG(序列号63);以及
HBV#8
TACCAATTTTCTTTTggatgTGTCTTTGGGTATACATTT[aaac]CCTAATAAAACCcatccAAACGTTGGG(序列号64)。
在PCR反应制备的序列中,用小写字母表示的序列是限制性内切酶的识别序列,划线的序列是由限制性内切酶酶切而产生的片段序列,由方括号([])表示的序列是基因型可分析序列。扩增产物的制备原理与实施例1中相同。
在本实施方案中,使用触发引物(TP)和扩增引物(AP),仅针对HBV#1至HBV#8进行PCR扩增。然而,本领域技术人员容易理解的是使用触发引物(TP)和扩增引物(AP)进行的PCR扩增能够应用于上述HBV型变体的其它类型。
2.限制性内切酶的内切、纯化及脱盐
过程与实施例1中所进行的过程相同。
3.MALDI-TOF质谱分析
与实施例1中相同的方式进行该过程。
基于MALDI-TOF质谱分析,由反应制备的片段的分子量的分析结果如图8-9所示。下表3总结了对各种HBV进行的分析结果,由分子量表示。基于表3的结果可以确定HBV的基因型。
表3示出了基于通过扩增引物(AP)扩增的产物计算的片段的分子量。它们不同于基于通过触发引物(TP)扩增的产物计算的片段的分子量。根据本发明的实施方案,证实了当每个触发引物(TP)以超过反应浓度混合时,同时出现来自扩增引物(AP)的片段的分子量和来自触发引物(TP)的片段的分子量。另一方面,当每个触发引物(TP)以低于反应浓度混合时,可以进行HBV的基因型分析。
关于这点,在图8中示出了如果通过碱基变异诱导了阿德福韦的抗性的HBV聚合酶的第236个密码子是AAC,且其为用于编码天冬酰胺(Asn)的野生型HBV基因型的情况下的MALDI-TOF质谱分析图。另外,在图9中示出了MALDI-TOF质谱分析图,如果通过碱基变异诱导了阿德福韦的抗性的HBV聚合酶示出了突变型HBV基因型,其中第236个密码子是ACT,其用于编码苏氨酸(Thr)。对MALDI-TOF质谱分析图的分析如图8~9所示,根据本发明的实施方案的扩增产物中仅证实了来自扩增引物(AP)的片段。因此,如果在PCR之后使用本发明的触发引物(TP)和扩增引物(AP)进行RFMP分析,那么就可能无缺失地简单并有效地扩增变异基因的数量,并在同时满足特异性和敏感性的条件下精确地分析基因型的数量。
表3
尽管本发明已经参照本发明的示意性实施方案进行了说明和描述,但是应当理解的是除了本发明以外可以做出各种改变、修改,而不脱离本发明的范围。
序列表
<110> 基因矩阵公司
<120> 扩增靶基因内存在多种变异的基因区域的引物组合物
<130> FP12KR1750
<140> PCT/KR2011/002805
<141> 2011-04-20
<150> KR 10-2010-0043166
<151> 2010-05-07
<160> 64
<170> PatentIn version 3.2
<210> 1
<211> 81
<212> DNA
<213> 人乳头瘤病毒 59
<400> 1
gctcagggtt taaacaatgg tatatgttgg cacaatcaat tgtttttaac agttgtagat 60
actactcgca gcaccaatct t 81
<210> 2
<211> 81
<212> DNA
<213> 人乳头瘤病毒 16
<400> 2
gcacagggcc acaataatgg catttgttgg ggtaaccaac tatttgttac tgttgttgat 60
actacacgca gtacaaatat g 81
<210> 3
<211> 81
<212> DNA
<213> 人乳头瘤病毒 51
<400> 3
gcgcagggtc acaataatgg catttgctgg aacaatcagc tttttattac ctgtgttgat 60
actaccagaa gtacaaattt a 81
<210> 4
<211> 81
<212> DNA
<213> 人乳头瘤病毒 68
<400> 4
gcacagggac acaacaatgg tatttgttgg cataatcaat tatttcttac tgttgtggat 60
accactcgca gtaccaattt t 81
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> HPV 引物 1
<400> 5
gcacagggcc acaaggatga atgg 24
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> HPV 引物 2
<400> 6
gcacagggtt taaaggatga atgg 24
<210> 7
<211> 26
<212> DNA
<213> HPV 引物 3
<400> 7
gtagtatcaa caacggatgt aacaaa 26
<210> 8
<211> 26
<212> DNA
<213> HPV 引物 4
<400> 8
gtagtatcaa caacggatgt taaaaa 26
<210> 9
<211> 26
<212> DNA
<213> HPV 引物 5
<400> 9
gtagtatcaa caacggatgt aataaa 26
<210> 10
<211> 26
<212> DNA
<213> HPV 引物 6
<400> 10
gtagtatcaa caacggatgt aagaaa 26
<210> 11
<211> 73
<212> DNA
<213> HPV 59 扩增的 DNA 片段
<400> 11
gcacagggtt taaaggatga atggtatatg ttggcacaat caattgtttt ttaacatccg 60
ttgttgatac tac 73
<210> 12
<211> 72
<212> DNA
<213> HPV 16 扩增的 DNA 片段
<400> 12
gcacagggcc acaaggatga atggcatttg ttggggtaac caactatttg ttacatccgt 60
tgttgatact ac 72
<210> 13
<211> 72
<212> DNA
<213> HPV 51 扩增的 DNA 片段
<400> 13
gcacagggcc acaaggatga atggcatttg ctggaacaat cagcttttta ttacatccgt 60
tgttgatact ac 72
<210> 14
<211> 72
<212> DNA
<213> HPV 68 扩增的 DNA 片段
<400> 14
gcacagggcc acaaggatga atggtatttg ttggcataat caattatttc ttacatccgt 60
tgttgatact ac 72
<210> 15
<211> 73
<212> DNA
<213> HPV 59 扩增的 DNA 片段
<400> 15
gcacagggcc acaaggatga atggtatatg ttggcacaat caattgtttt gttacatccg 60
ttgttgatac tac 73
<210> 16
<211> 72
<212> DNA
<213> HPV 16 扩增的 DNA 片段
<400> 16
gcacagggcc acaaggatga atggcatttg ttggggtaac caactatttg ttacatccgt 60
tgttgatact ac 72
<210> 17
<211> 72
<212> DNA
<213> HPV 51 扩增的 DNA 片段
<400> 17
gcacagggcc acaaggatga atggcatttg ctggaacaat cagctttttg ttacatccgt 60
tgttgatact ac 72
<210> 18
<211> 72
<212> DNA
<213> HPV 68 扩增的 DNA 片段
<400> 18
gcacagggcc acaaggatga atggtatttg ttggcataat caattatttg ttacatccgt 60
tgttgatact ac 72
<210> 19
<211> 83
<212> DNA
<213> 人 HLA-DQB1 *0501
<400> 19
tgtgctactt caccaacggg acggagcgcg tgcggggtgt gaccagacac atctataacc 60
gagaggagta cgtgcgcttc gac 83
<210> 20
<211> 83
<212> DNA
<213> 人 HLA-DQB1 *0201
<400> 20
tgtgctactt caccaacggg acagagcgcg tgcgtcttgt gagcagaagc atctataacc 60
gagaagagat cgtgcgcttc gac 83
<210> 21
<211> 83
<212> DNA
<213> 人 HLA-DQB1 *0401
<400> 21
tgtgctactt caccaacggg accgagctcg tgcggggtgt gaccagatac atctataacc 60
gagaggagta cgcgcgcttc gac 83
<210> 22
<211> 83
<212> DNA
<213> 人 HLA-DQB1 *0301
<400> 22
tgtgctactt caccaacggg acggagcgcg tgcgttatgt gaccagatac atctataacc 60
gagaggagta cgcacgcttc gac 83
<210> 23
<211> 30
<212> DNA
<213> HLA-DQB1 引物 7
<400> 23
tgtgctactt caccaacgga tggacggagc 30
<210> 24
<211> 33
<212> DNA
<213> HLA-DQB1 引物 8
<400> 24
gcgtgcgtac tcctctcggt ggatgataga tgt 33
<210> 25
<211> 30
<212> DNA
<213> HLA-DQB1 引物 9
<400> 25
tgtgctactt caccaacgga tggacagagc 30
<210> 26
<211> 33
<212> DNA
<213> HLA-DQB1 引物 10
<400> 26
gcgcacgatc tcttctcggt ggatgataga tgc 33
<210> 27
<211> 84
<212> DNA
<213> HLA-DQB1 *0201 扩增的 DNA 片段
<400> 27
tgtgctactt caccaacgga tggacagagc gcgtgcgtct tgtgagcaga agcatctatc 60
atccaccgag aagagatcgt gcgc 84
<210> 28
<211> 84
<212> DNA
<213> HLA-DQB1 *0501 扩增的 DNA 片段
<400> 28
tgtgctactt caccaacgga tggacggagc gcgtgcgggg tgtgaccaga cacatctatc 60
atccaccgag aggagtacgc acgc 84
<210> 29
<211> 84
<212> DNA
<213> HLA-DQB1 *0201 扩增的 DNA 片段
<400> 29
tgtgctactt caccaacgga tggacggagc gcgtgcgtct tgtgagcaga aacatctatc 60
atccaccgag aagagatcgc acgc 84
<210> 30
<211> 84
<212> DNA
<213> HLA-DQB1 *0401 扩增的 DNA 片段
<400> 30
tgtgctactt caccaacgga tggacggagc tcgtgcgggg tgtgaccaga tacatctatc 60
atccaccgag aggagtacgc acgc 84
<210> 31
<211> 84
<212> DNA
<213> HLA-DQB1 *0301 扩增的 DNA 片段
<400> 31
tgtgctactt caccaacgga tggacggagc gcgtgcgtta tgtgaccaga tacatctatc 60
atccaccgag aggagtacgc acgc 84
<210> 32
<211> 60
<212> DNA
<213> HBV # 1
<400> 32
taccaatttt ctttttgtct ttgggtatac atttaaaccc taataaaacc aaacgttggg 60
<210> 33
<211> 60
<212> DNA
<213> HBV # 2
<400> 33
taccaatttt ctttttgtct ttgggtatac atttaaaccc tactaaaacc aaacgttggg 60
<210> 34
<211> 60
<212> DNA
<213> HBV # 3
<400> 34
taccaatttt ctttttgtct ttgggtatac atttaaaccc tgataaaacc aaacgttggg 60
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<211> 60
<212> DNA
<213> HBV # 4
<400> 35
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<211> 60
<212> DNA
<213> HBV # 5
<400> 36
taccaatttt ctttttgtct ttgggtatac atttaaacca taataaaacc aaacgttggg 60
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<212> DNA
<213> HBV # 6
<400> 37
taccaatttt ctttttgtct ttgggtatac atttaaacca tactaaaacc aaacgttggg 60
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<211> 60
<212> DNA
<213> HBV # 7
<400> 38
taccaatttt ctttttgtct ttgggtatac atttaaacca tgataaaacc aaacgttggg 60
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<211> 60
<212> DNA
<213> HBV # 8
<400> 39
taccaatttt ctttttgtct ttgggtatac atttaaacca tcataaaacc aaacgttggg 60
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<211> 39
<212> DNA
<213> HBV 引物 11
<400> 40
taccaatttt cttttggatg tgtctttggg tatacattt 39
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<212> DNA
<213> HBV 引物 12
<400> 41
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<211> 27
<212> DNA
<213> HBV 引物 13
<400> 42
cccaacgttt ggatgggttt tagtagg 27
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<211> 27
<212> DNA
<213> HBV 引物 14
<400> 43
cccaacgttt ggatgggttt tatcagg 27
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<212> DNA
<213> HBV 引物 15
<400> 44
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<210> 45
<211> 27
<212> DNA
<213> HBV 引物 16
<400> 45
cccaacgttt ggatgggttt tattatg 27
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<212> DNA
<213> HBV 引物 17
<400> 46
cccaacgttt ggatgggttt tagtatg 27
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<211> 27
<212> DNA
<213> HBV 引物 18
<400> 47
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<212> DNA
<213> HBV 引物 19
<400> 48
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<211> 70
<212> DNA
<213> HBV # 1 扩增的 DNA 片段
<400> 49
taccaatttt cttttggatg tgtctttggg tatacattta aaccctaata aaacccatcc 60
aaacgttggg 70
<210> 50
<211> 70
<212> DNA
<213> HBV # 2 扩增的 DNA 片段
<400> 50
taccaatttt cttttggatg tgtctttggg tatacattta aaccctacta aaacccatcc 60
aaacgttggg 70
<210> 51
<211> 70
<212> DNA
<213> HBV # 3 扩增的 DNA 片段
<400> 51
taccaatttt cttttggatg tgtctttggg tatacattta aaccctgata aaacccatcc 60
aaacgttggg 70
<210> 52
<211> 70
<212> DNA
<213> HBV # 4 扩增的 DNA 片段
<400> 52
taccaatttt cttttggatg tgtctttggg tatacattta aaccctcata aaacccatcc 60
aaacgttggg 70
<210> 53
<211> 70
<212> DNA
<213> HBV # 5 扩增的 DNA 片段
<400> 53
taccaatttt cttttggatg tgtctttggg tatacattta aaccataata aaacccatcc 60
aaacgttggg 70
<210> 54
<211> 70
<212> DNA
<213> HBV # 6 扩增的 DNA 片段
<400> 54
taccaatttt cttttggatg tgtctttggg tatacattta aaccatacta aaacccatcc 60
aaacgttggg 70
<210> 55
<211> 70
<212> DNA
<213> HBV # 7 扩增的 DNA 片段
<400> 55
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<210> 56
<211> 70
<212> DNA
<213> HBV # 8 扩增的 DNA 片段
<400> 56
taccaatttt cttttggatg tgtctttggg tatacattta aaccatcata aaacccatcc 60
aaacgttggg 70
<210> 57
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<212> DNA
<213> HBV # 1 扩增的 DNA 片段
<400> 57
taccaatttt cttttggatg tgtctttggg tatacattta aaccctaata aaacccatcc 60
aaacgttggg 70
<210> 58
<211> 70
<212> DNA
<213> HBV # 2 扩增的 DNA 片段
<400> 58
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aaacgttggg 70
<210> 59
<211> 70
<212> DNA
<213> HBV # 3 扩增的 DNA 片段
<400> 59
taccaatttt cttttggatg tgtctttggg tatacattta aaccctaata aaacccatcc 60
aaacgttggg 70
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<211> 70
<212> DNA
<213> HBV # 4 扩增的 DNA 片段
<400> 60
taccaatttt cttttggatg tgtctttggg tatacattta aaccctaata aaacccatcc 60
aaacgttggg 70
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<213> HBV # 5 扩增的 DNA 片段
<400> 61
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aaacgttggg 70
<210> 62
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<212> DNA
<213> HBV # 6 扩增的 DNA 片段
<400> 62
taccaatttt cttttggatg tgtctttggg tatacattta aaccctaata aaacccatcc 60
aaacgttggg 70
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<211> 70
<212> DNA
<213> HBV # 7 扩增的 DNA 片段
<400> 63
taccaatttt cttttggatg tgtctttggg tatacattta aaccctaata aaacccatcc 60
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<211> 70
<212> DNA
<213> HBV # 8 扩增的 DNA 片段
<400> 64
taccaatttt cttttggatg tgtctttggg tatacattta aaccctaata aaacccatcc 60
aaacgttggg 70
Claims (28)
1.用于扩增靶基因内存在多种变异的基因区域的引物组合物,其包括:
第一引物组,其包括至少一个特异于至少一个模板的引物,所述模板包括靶基因内待分析的基因变异碱基序列的基因型可分析序列;及
第二引物组,其包括至少一个引物,其通过从第一引物组的引物中选择一个具有最多数目的共同碱基的引物而设计,并使用所选的引物作为参照,第二引物组的引物特异性结合模板或与模板互补结合,并允许与模版3'端附近的多达3个连续碱基或优选地1至2个碱基错配。
2.根据权利要求1所述的引物组合物,其中所述第一引物组以低浓度提供于第一扩增反应物以在模板的初始扩增反应中完全耗尽,且所述二引物组以高浓度提供于第二扩增反应物以使用通过第一引物组扩增的初始扩增产物作为模板产生最终扩增产物。
3.根据权利要求2所述的引物组合物,其中将所述扩增的最终扩增产物除基因型可分析序列以外的其余序列具有彼此相同的核苷酸序列。
4.根据权利要求1所述的引物组合物,其中当所述靶基因是 HPV基因时,所述第一引物组的引物是至少一个选自序列号6 及序列号8-10 的引物,且所述第二引物组的引物是至少一个选自序列号5及序列号7的引物。
5.根据权利要求1所述的引物组合物,其中当所述靶基因是HLA-DQB1基因时,所述第一引物组的引物是至少一个选自序列号25及序列号26的引物,且所述第二引物组的引物是至少一个选自序列号23及序列号24 的引物。
6.根据权利要求1所述的引物组合物,其中当所述靶基因是HBV基因时,所述第一引物组的引物是至少一个选自序列号42-48的引物,且个第二引物组的引物是至少一个选自序列号40及序列号41的引物。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的引物组合物,其中将所述第二引物组作为正向引物和反向引物的组合提供于扩增反应物。
8.一种包括用于扩增靶基因内存在多种变异的基因区域的引物组合物的PCR 扩增试剂盒,其包括:
至少一个多核苷酸模板;
第一引物组,其包括至少一个特异于至少一个模板的引物,所述模板包括靶基因内待分析的基因变异碱基序列的基因型可分析序列;
第二引物组,其包括至少一个引物,其通过从第一引物组的引物中选择一个具有最多数目的共同碱基的引物而设计并使用所选的引物作为参照,第二引物组的引物特异性结合模板或与模板互补结合,并允许与模板3'端附近的多达3个连续碱基或优选地1至2个碱基错配;
DNA聚合酶;
dNTPs;及
缓冲溶液。
9.根据权利要求8所述的PCR 扩增试剂盒,其中所述第一引物组以低浓度提供于第一扩增反应物以在模板的初始扩增反应中完全耗尽,且所述第二引物组以高浓度提供于第二扩增反应物以使用通过第一引物组扩增的初始扩增产物作为模板产生最终扩增产物。
10. 根据权利要求9所述的PCR 扩增试剂盒,其中将所述最终扩增产物扩增至除基因型可分析序列以外的其余部分具有彼此相同的核苷酸序列。
11. 根据权利要求8所述的PCR 扩增试剂盒,其中当所述靶基因是 HPV基因时,所述第一引物组的引物是至少一个选自序列号6 及序列号8-10的引物,且所述第二引物组的引物是至少一个选自序列号5及序列号7的引物。
12. 根据权利要求8所述的PCR 扩增试剂盒,其中当所述靶基因是HLA-DQB1基因时,所述第一引物组的引物是至少一个选自序列号25及序列号26的引物,且所述第二引物组的引物是至少一个选自序列号23及序列号24 的引物。
13. 根据权利要求8所述的PCR 扩增试剂盒,其中当所述靶基因是HBV基因时,所述第一引物组的引物是至少一个选自序列号42-48的引物,且所述第二引物组的引物是至少一个选自序列号40及序列号41的引物。
14. 根据权利要求8至13中任一项所述的PCR 扩增试剂盒,其中将所述第二引物组作为正向引物和反向引物的组合提供于扩增反应物。
15. 一种使用扩增靶基因内存在多种变异的基因区域的引物组合物扩增靶基因的方法,其包括:
(a) 制备第一引物组,其包括至少一个特异于至少一个模板的引物,所述模板包括靶基因内进行分析的基因变异碱基序列的基因型可分析序列;
(b) 制备第二引物组,其包括至少一个引物,其通过从第一引物组的引物中选择一个具有最多数目的共同碱基的引物而设计并使用所选的引物作为参照,第二引物组的引物特异性结合模板或互补地结合模板,并允许与模版3'端附近的多达3个连续碱基或优选地1至2个碱基错配;
(c) 将至少一个第一引物组的引物和至少一个第二引物组的引物添加到扩增反应物中进行PCR扩增反应,所述扩增反应物包括至少一种多核苷酸模板、DNA 聚合酶、dNTPs及缓冲溶液;
(d) 将至少一个第一引物组的引物与模板互补结合,扩增模板并在最初的PCR扩增反应中耗尽第一引物组;
(e) 通过使用第二引物组的至少一个的引物,并使用由第一引物组的至少一个引物扩增的扩增产物作为模板,进行进一步扩增反应;及
(f) 获得具有基因型可分析序列的最终扩增产物,其扩增至除基因型可分析序列以外,其它序列具有相同的核苷酸序列。
16. 根据权利要求15所述的方法,其中在所述步骤(c)中第一引物组以低浓度加入扩增反应物,所述第二引物组与所述第一引物组相比以高浓度加入到扩增反应物中。
17. 根据权利要求16所述的方法,其中在所述步骤(c)中的所述第一引物组的引物浓度为所述第二引物组的引物浓度的1/2至1/20。
18. 根据权利要求17所述的方法,其中在所述步骤(c)中的所述第一引物组的引物浓度为所述第二引物组的引物浓度的1/8至1/16。
19. 根据权利要求15所述的方法,其中当所述靶基因是 HPV基因时, 所述第一引物组的引物是至少一个选自序列号6 及序列号8-10 的引物,且所述第二引物组的引物是至少一个选自序列号5及序列号7的引物。
20. 根据权利要求15所述的方法,其中当所述靶基因是HLA-DQB1基因时,所述第一引物组的引物是至少一个选自序列号25及序列号26的引物,且所述第二引物组的引物是至少一个选自序列号23及序列号24的引物。
21. 根据权利要求15所述的方法,其中当所述靶基因是HBV基因时,所述第一引物组的引物是至少一个选自序列号42-48的引物,且所述第二引物组的引物是至少一种选自序列号40及序列号41的引物。
22. 根据权利要求15至21中任一项所述的方法,其中将所述第二引物组作为正向引物和反向引物的组合提供于扩增反应物。
23. 一种使用扩增靶基因内存在多种变异的基因区域的引物组合物基因分型靶基因的方法,其包括:
(a) 根据权利要求15至21中任一项所述的方法扩增靶基因;
(b) 通过限制性内切酶切除步骤(a)中扩增的多核苷酸,所述多核苷酸包括靶基因内进行分析的基因变异碱基序列的基因型可分析序列,并且除所述基因型可分析序列以外,其它序列具有相同的核苷酸序列,通过限制性内切酶的酶切所述多核苷酸以产生至少两种具有变异碱基的单链多核苷酸片段,所述片段的碱基数目在有限范围内;及
(c) 测定所述片段的分子量。
24. 根据权利要求23所述的方法,其中所述片段具有变异碱基,且所述片段的碱基数目的范围在2个至32个之间。
25. 根据权利要求23所述的方法,其中当所述步骤(a)中扩增的靶基因是 HPV基因时,所述第一引物组的引物是至少一个选自序列号6 及序列号8-10 的引物,且所述第二引物组的引物是至少一个选自序列号5及序列号7的引物。
26. 根据权利要求23所述的方法,其中当所述步骤(a)中扩增的靶基因是HLA-DQB1基因时,所述第一引物组的引物是至少一个选自序列号25及序列号26的引物,且所述第二引物组的引物是至少一个选自序列号23及序列号24的引物。
27. 根据权利要求23所述的方法,其中当所述步骤(a)中扩增的靶基因是HBV基因时,所述第一引物组的引物是至少一个选自序列号42-48的引物,且所述第二引物组的引物是至少一个选自序列号40及序列号41的引物。
28. 根据权利要求23所述的方法,其中用于所述步骤(a)中扩增的靶基因的第二引物组作为正向引物和反向引物的组合提供。
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