CN102961372A

CN102961372A - 丹酚酸b在抑制胰岛淀粉样多肽聚集和治疗糖尿病中的应用

Info

Publication number: CN102961372A
Application number: CN2012104471921A
Authority: CN
Inventors: 黄昆; 程彪; 龚皓; 李晓超; 孙粤; 张鑫; 陈红; 吴谦
Original assignee: Huazhong University of Science and Technology
Current assignee: Huazhong University of Science and Technology
Priority date: 2012-11-11
Filing date: 2012-11-11
Publication date: 2013-03-13

Abstract

本发明属于医药领域，披露了丹酚酸B具有抑制胰岛淀粉样多肽聚集和治疗糖尿病中作用。胰岛淀粉样多肽在体内进行聚集，能够破坏β细胞膜结构以及破坏线粒体正常形态功能，导致β细胞凋亡，损伤β细胞功能，这一过程被认为是2型糖尿病的重要致病原因。本发明揭示丹酚酸B能够抑制胰岛淀粉样多肽聚集，同时逆转聚集过程中β细胞膜结构以及线粒体正常形态功能的损坏这一过程，从而保护β细胞，从而能够用于预防和治疗糖尿病。

Description

丹酚酸B在抑制胰岛淀粉样多肽聚集和治疗糖尿病中的应用

技术领域

本发明属于医药领域，涉及治疗糖尿病的药物。

背景技术

糖尿病是由人体自身营养代谢障碍导致的内分泌疾病，以持续性高血糖为基本生化特征，目前已成为全球第五大死因，被认为是危害仅次于心脑血管病和恶性肿瘤的非传染性疾病。

糖尿病分为1型和2型，其中2型糖尿病(T2DM)人数占糖尿病患者总数的90％以上，2型糖尿病基本特征为：在胰岛素抵抗的基础上，β细胞功能的受损。有关2型糖尿病的发病机制目前尚未阐明。胰岛淀粉样多肽(islet amyloidpolypeptide，IAPP)是与胰岛素一同由胰岛β细胞共分泌，由37个氨基酸组成的多肽。生理状态下的IAPP可以协同胰岛素等血糖调节激素对人体血糖进行更精准的调节。人胰岛淀粉样多肽(human islet amyloid polypeptide，hIAPP)具有很强的错误折叠、形成淀粉样蛋白聚集的倾向，是目前已知的淀粉样聚集性最强的多肽之一。淀粉样蛋白沉积已被发现存在于多种病理状态中，如阿尔茨海默病中的淀粉样蛋白β(β-Amyloid，Aβ)，疯牛病中的阮蛋白(prion)等，这些淀粉样蛋白沉积被认为是导致相关病灶组织细胞死亡的主要原因。导致这些淀粉样蛋白沉积形成的主要原因就是体内这些蛋白质分子的错误折叠及随后的聚集沉淀。由hIAPP错误折叠所形成的淀粉样蛋白沉积具有破坏胰岛β细胞膜的结构(参见Engel MF.Membrane permeabilization by Islet AmyloidPolypeptide.Chem Phys Lipids 2009；160(1)：1-10.)，破坏正常线粒体功能(参见Li XL，Chen T，Wong YS，Xu G，Fan RR，Zhao HL，Chan JC.Involvementof mitochondrial dysfunction in human islet amyloid polypeptide-inducedapoptosis in INS-1E pancreatic beta cells：An effect attenuated byphycocyanin.Int J Biochem Cell Biol 2011；43(4)：525-534.)，诱导β细胞凋亡，损伤β细胞功能的作用，被认为是2型糖尿病的重要致病原因之一(参见Westermark P，Wernstedt C，0’Brien TD，Hayden DW，Johnson KH.Isletamyloid in type 2 human diabetes mellitus and adult diabetic cats containsa novel putative polypeptide hormone.Am J Pathol 1987；127(3)：414-417.)。此外，hIAPP的聚合物通过打断β细胞间的耦合、诱导β细胞的凋亡等机理，导致2型糖尿病中晚期患者的β细胞功能损伤，加重糖尿病的病情。

随着近年来我国人们生活水平的普遍提高，中国成为了全球糖尿病发病率高速增长的地区之一，糖尿病患者人数已位居世界第一。根据国家卫生部2008年印发的《防治糖尿病宣传知识要点》，我国糖尿病患病率在过去20年中上升了4倍，截至2002年为止，我国约有糖尿病患者2000多万。据国际糖尿病联盟估计，我国2007年糖尿病患病人数约为3980万，2025年时将达到5930万。糖尿病已成为严重地威胁我国国民的健康和生活质量的重大慢性疾病。国家和社会迫切需要研究和开发治疗和减缓糖尿病发展的新型药物。

发明内容

本发明的任务是提供一种用于抑制胰岛淀粉样多肽聚集的药物和/或用于预防和治疗糖尿病的药物。

实现本发明的技术方案是：

本发明提供的这种用于抑制胰岛淀粉样多肽聚集的药物和/或用于预防和治疗糖尿病的药物是丹酚酸B。

丹酚酸B的结构式如下：

丹酚酸B可以从唇形科植物丹参Salvia Miltiorrhiza Bge.的根及根茎提取而得。丹参是一种中国传统中草药，已经被正式列入中国药典。广泛用于治疗冠状动脉疾病和糖尿病并发症。丹酚酸B占丹参活性成分的10-12％，具有一个典型的多酚结构。本发明发现丹酚酸B能够高效抑制胰岛淀粉样多肽聚集，同时抑制胰岛淀粉样多肽聚集所诱导的β细胞正常功能损害，在预防及治疗2型糖尿病方面具有药物应用价值，即丹酚酸B能够用于制备预防和治疗2型糖尿病的药物和/或抑制胰岛淀粉样多肽聚集的药物。

研究表明，胰岛淀粉样多肽在体内的聚集能够损伤β细胞正常功能，导致β细胞凋亡，而这一现象与2型糖尿病并发症有着密切联系。胰岛淀粉样多肽主要通过两个途径导致β细胞凋亡，一方面是通过对β细胞膜的破坏(参见EngelMF.Membrane permeabilization by Islet Amyloid Polypeptide.Chem PhysLipids 2009；160(1)：1-10.)，另一方面是通过对线粒体正常形态功能的损害(参见Li XL，Chen T，Wong YS，Xu G，Fan RR，Zhao HL，Chan JC.Involvementof mitochondrial dysfunction in human islet amyloid polypeptide-inducedapoptosis in INS-1E pancreatic beta cells：An effect attenuated byphycocyanin.Int J Biochem Cell Biol 2011；43(4)：525-534.)。胰岛淀粉样多肽在体内进行聚集，能够破坏β细胞膜结构以及破坏线粒体正常形态功能，导致β细胞凋亡，损伤β细胞功能，这一过程被认为是2型糖尿病的重要致病原因。本发明发现目前用于治疗冠状动脉疾病和糖尿病并发症的丹参片中主要成分丹酚酸B能够高效的抑制胰岛淀粉样多肽聚集，同时逆转聚集过程中β细胞膜结构以及线粒体正常形态功能的损坏这一过程，从而保护β细胞。本发明发现丹酚酸B能够以抗胰岛淀粉样多肽聚集为靶点，在制备治疗2型糖尿病药物中具有极大地应用价值。

本发明实施例1、2和3通过实验发现丹酚酸B能有效的抑制胰岛淀粉样多肽的聚集，同时本发明实施例4，5，6，7的实验发现丹酚酸B能够从保护β细胞膜以及保护线粒体正常形态功能两方面阻止胰岛淀粉样多肽聚集所诱导的β细胞正常功能损害。证明以抗胰岛淀粉样多肽聚集为靶点，丹酚酸B能够用于治疗糖尿病，即丹酚酸B能够用于制备预防和治疗糖尿病药物。人体内的胰岛淀粉样多肽的浓度一般维持在pM级别(参见Young A.Tissue expression andsecretion of amylin.Adv Pharmacol 2005；52：19-45.)，而丹参在人体内代谢后，丹酚酸B的浓度能够达到M级别(参见Gao DY，Han LM，Zhang LH，FangXL，Wang JX.Bioavailability of salvianolic acid B and effect on bloodviscosities after oral administration of salvianolic acids in beagle dogs.Arch Pharm Res 2009；32(5)：773-779.)。通过本发明实验发现，丹酚酸B在5倍剂量下，已经能体现出完全的抑制效果。因此，将以丹酚酸B为抗糖尿病药物的活性成分，在体内仅仅需要pM级别就能达到很好的治疗效果。

附图说明

图1：丹酚酸B化学结构式。

图2：为实施例1中硫磺素荧光光谱实验结果，显示IAPP随着孵育的时间增加逐渐开始聚集，同时荧光信号强度随着IAPP的聚集而增强。然后，加入丹酚酸B后，IAPP的荧光信号强度显著性下降，同时呈现出稳定的剂量依赖性。这说明丹酚酸B对IAPP的聚集有显著性抑制作用，并呈现剂量依赖性。

图3：为实施例2中扫描电镜实验结果，显示单独孵育24h后的IAPP在扫描电镜下呈现出典型的纤维状形态(见图3A)。与丹酚酸B共同孵育后，在电镜下观察，纤维状形态逐渐减少，呈剂量依赖性(见图3B-D)这说明丹酚酸B对IAPP的聚集具有明显抑制作用。

图4：为实施例3中光交联实验结果，显示单独反应的IAPP在照射5秒后，形成了较多多聚体(第2条带)；而加入不同剂量丹酚酸B进行反应的IAPP在照射5秒后，多聚体呈剂量依赖性减少(第3-5条带)。该实验说明丹酚酸B对IAPP的毒性多聚体的形成具有抑制作用。

图5：为实施例4中染料泄露实验结果，显示单独反应的IAPP在1M浓度下，能够显著地破坏分子膜，导致荧光染料泄露；加入丹酚酸B后，分子膜的破坏得到抑制，并且呈现出剂量依赖性。

图6：为实施例5中红细胞溶血实验结果，显示单独孵育8h后的IAPP能够明显破坏红细胞膜，导致红细胞溶血现象；加入丹酚酸B后，红细胞膜的破坏呈剂量依赖性抑制，并在5倍摩尔浓度时，溶血现象消失。

图7：为实施例6中细胞毒性试验结果结果，显示IAPP具有较强的细胞毒性，15 M IAPP条件下细胞存活率仅有有20％；加入丹酚酸B共同孵育后，细胞存活率得到显著性提升，在高剂量(5倍摩尔比)下，细胞存活率提高到67％。

图8：为实施例7中线粒体转染形态实验结果，，显示INS-1细胞在正常生理状态下，线粒体形态呈典型细长线条状(见图8A)；而INS-1细胞在单独孵育的IAPP后，线粒体形态发生了明显变化，由正常的细长形态变成片段状(见图8B)，这表明IAPP对线粒体的正常形态造成了损害，影响了线粒体正常功能。加入丹酚酸B后，IAPP对线粒体的正常形态的损害得到逆转。

具体实施方式

下面结合具体实验的实施例，对本发明作进一步说明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围，下列实施例中未注明具体实验条件和方法，通常按照常规条件如：J.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，1992，分子克隆实验指南(第二版)；D.L.斯佩克特等，科学出版社，2001，细胞实验指南；吕鸿声，科学出版社，1982，或接照制造厂商所建议的条件。

本发明所用丹酚酸B(C₃₆H₃₀O₁₆)为中药标准品，纯度为99.8％，购于阿拉丁试剂有限公司(中国)；胰岛淀粉样多肽订购于金丝瑞公司(美国)，纯度大于95％；其它本发明所涉及到试剂均订购于奥德里奇-西格玛公司(美国)。

实施例1 硫磺素荧光光谱实验(Thioflavin-T(ThT)fluorescenceassays)

具体操作：将IAPP溶解于HFIP中并超声2分，之后溶于25mM PBS(50mMNaCl)，pH7.4将其稀释为含1％HFIP，终浓度为15μM的IAPP溶液。在25℃下分别与1、2、5倍摩尔比(化合物/IAPP)的丹酚酸B共同水浴，用日立2700荧光分析仪进行分析，检测体系包含25mM PBS，50mM NaCl，pH 7.4和20μMthioflavin-T，激发和发射波长为450nm和482nm。

结果如图2所示，IAPP随着孵育的时间增加逐渐开始聚集，同时荧光信号强度随着IAPP的聚集而增强。然后，加入丹酚酸B后，IAPP的荧光信号强度显著性下降，同时呈现出稳定的剂量依赖性。这说明丹酚酸B对IAPP的聚集有显著性抑制作用，并呈现剂量依赖性(见图2)。

实施例2 电镜实验Transmission electronic microscopy(TEM)

具体操作：将实施例1中孵育24h后的样品，利用扫描电镜，从形态学角度观察IAPP聚集后纤维的形态。

结果如图3所示，单独孵育24h后的IAPP在扫描电镜下呈现出典型的纤维状形态(见图3A)。与丹酚酸B共同孵育后，在电镜下观察，纤维状形态逐渐减少，呈剂量依赖性(见图3B-D)这说明丹酚酸B对IAPP的聚集具有明显抑制作用。

实施例3 未修饰蛋白的光催化交联实验(Photo-induced Cross-Linkingof Unmodified Proteins(PICUP)assay)

具体操作：将IAPP溶解于HFIP并超声2分钟，用10mM PBS(pH7.4)将其溶解并稀释为含1％HFIP终浓度，为82μM的IAPP溶液，分别与1、5倍摩尔比(化合物/hIAPP)的丹酚酸B在交联剂的作用下于暗箱中用白炽光照射5s。然后，向反应溶液加入7.5μl上样缓冲液，97℃下变性10分钟，之后用20％的Tricine-Urea凝胶电泳，并用可视化银染色法进行染色(Beyotime快速银染试剂盒)。

结果如图4所至，单独反应的IAPP在照射5秒后，形成了较多多聚体(第2条带)；而加入不同剂量丹酚酸B进行反应的IAPP在照射5秒后，多聚体呈剂量依赖性减少(第3-5条带)。该实验说明丹酚酸B对IAPP的毒性多聚体的形成具有抑制作用(见图4)。

实施例4 染料泄露实验(Dye leaked assay)

具体操作：将IAPP用100％DMSO溶解后，终浓度为1M，迅速加入到已经裹好的荧光染料的POPG脂质膜中(模拟分子膜)，用日立2700荧光分析仪进行检测，检测时间为60s，激发和发射波长分别设定为493和518nM。结果如图5所示，单独反应的IAPP在1M浓度下，能够显著地破坏分子膜，导致荧光染料泄露；加入丹酚酸B后，分子膜的破坏得到抑制，并且呈现出剂量依赖性(见图5)。

实施例5 红细胞溶血实验(Hemolysis assay)

具体操作：将含有1％红细胞的细胞悬浊液(等渗溶液)与IAPP共同孵育8h，终浓度为7.5M，孵育结束后，离线取上清，在540nM下进行检测。

结果如图6所示，单独孵育8h后的IAPP能够明显破坏红细胞膜，导致红细胞溶血现象；加入丹酚酸B后，红细胞膜的破坏呈剂量依赖性抑制，并在5倍摩尔浓度时，溶血现象消失(见图6)。

实施例6 细胞毒性试验(MTT assay)

具体操作：将终浓度为5*10⁵/ml INS-1细胞首先孵育24h，24h后，去掉旧培养基，同时加入含有15 M IAPP及丹酚酸B的新鲜培养基，在进行孵育24h后，用MTT细胞毒性检测法进行检测。

结果如图7所示，IAPP具有较强的细胞毒性，15 M IAPP条件下细胞存活率仅有有20％；加入丹酚酸B共同孵育后，细胞存活率得到显著性提升，在高剂量(5倍摩尔比)下，细胞存活率提高到67％(见图7)。

实施例7 线粒体转染形态实验(Morphological visualization ofmitochondria)

具体操作：将已成功转染pDsRed2-Mito质粒的INS-1细胞与10mM IAPP与5倍摩尔量丹酚酸B共同孵育24h，孵育结束后，用共振荧光显微镜观察线粒体形态。

结果如图8所示：INS-1细胞在正常生理状态下，线粒体形态呈典型细长线条状(见图8A)；而INS-1细胞在单独孵育的IAPP后，线粒体形态发生了明显变化，由正常的细长形态变成片段状(见图8B)，这表明IAPP对线粒体的正常形态造成了损害，影响了线粒体正常功能。加入丹酚酸B后，IAPP对线粒体的正常形态的损害得到逆转(见图8C)。

实施例8 丹酚酸B片剂的制备

取丹酚酸B 5g、淀粉30g、蔗糖20g、17％淀粉浆适量、滑石粉15g、轻质液状石蜡0.25g，按常规制备片剂的方法制备丹酚酸B片1000。

Claims

1.丹酚酸B在制备用于治疗糖尿病的药物中的应用。

2.一种用于治疗糖尿病的药物，含有作为活性成分的丹酚酸B。

3.一种用于治疗糖尿病的药物制剂，由作为活性成分的丹酚酸B和药学上可接受的载体组成。

4.丹酚酸B在制备用于抑制胰岛淀粉样多肽聚集的药物中的应用。