CN102940624A - 原花青素在制备治疗糖尿病药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及中药肉桂水提物中的原花青素在制备治疗糖尿病药物中的应用。胰岛淀粉样多肽在体内发生聚集，这一聚集过程会破坏胰岛β细胞膜的结构，诱导β细胞凋亡，损伤β细胞的功能，被认为是2型糖尿病的重要致病原因之一。本发明发现中药肉桂水提物中的原花青素能够有效抑制2型糖尿病中胰岛淀粉样多肽的聚集，同时逆转其聚集过程中对β细胞产生的毒性，从而保护β细胞。本发明发现肉桂原花青素能够以抗胰岛淀粉样多肽聚集为靶点，在制备治疗2型糖尿病药物中具有极大的应用价值。

Description

原花青素在制备治疗糖尿病药物中的应用

 

技术领域

本发明属于生物药学领域，涉及中药肉桂水提物中的原花青素在制备治疗糖尿病药物中的应用。

背景技术

近年来中国已成为全球糖尿病发病率高速增长的地区之一，糖尿病患者总人数位居世界第一。根据国际糖尿病联盟估计，我国2007年糖尿病患病人数约为3980万，2025年时将达到5930万。糖尿病已经成为严重威胁我国国民健康和生活质量的重大慢性疾病。

糖尿病分为1型和2型，其中2型糖尿病（T2DM）人数占糖尿病患者总数的90%以上，2型糖尿病的病理特征之一为由胰岛β细胞分泌的胰岛淀粉样多肽（human islet amyloid polypeptide，hIAPP）的错误折叠和形成淀粉样聚集。这种淀粉样多肽聚集会破坏胰岛β细胞膜的结构（参见L. Haataja, T. Gurlo, C.J. Huang, and P.C. Butler, Islet amyloid in type 2 diabetes, and the toxic oligomer hypothesis. Endocr Rev 2008; 29 (3): 303-316.），诱导β细胞凋亡，损伤β细胞的功能，被认为是2型糖尿病的重要致病原因之一（参见Westermark P, Wernstedt C, O'Brien TD, Hayden DW, Johnson KH. Islet amyloid in type 2 human diabetes mellitus and adult diabetic cats contains a novel putative polypeptide hormone. Am J Pathol 1987; 127(3): 414-417.）。此外，在2型糖尿病中晚期患者中，hIAPP的聚合物还可能通过打断β细胞间的耦合、诱导β细胞的凋亡等机理，导致β细胞功能的损伤，加重糖尿病的病情。

肉桂作为一种传统中药，已列入中国药典。在抗菌抗炎、抗肿瘤和治疗糖尿病中有广泛应用。研究表明肉桂水提物可以抑制阿尔兹海默病中聚集蛋白A-beta的聚集。本发明研究了肉桂水提物对2型糖尿病中胰岛淀粉样多肽聚集性的影响，并且鉴定了其活性成分。

发明内容

肉桂作为一种传统中药在抗菌抗炎、抗肿瘤和治疗糖尿病中有广泛应用。本发明发现中药肉桂水提物能够有效抑制2型糖尿病中胰岛淀粉样多肽的聚集，降低其聚集过程中对β细胞产生的毒性，并且鉴定出其中的有效成分为原花青素。为肉桂或者肉桂原花青素在制备治疗2型糖尿病药物中奠定了基础。所以本发明提供了原花青素在制备治疗糖尿病药物中的应用。

同时本发明还提供了一种治疗糖尿病的药物，其中含有原花青素作为活性成分。该治疗糖尿病的药物可以按医药行业现有技术来制备，比如，取原花青素适量，以乳糖、淀粉和糊精为稀释剂，羧甲基淀粉钠（CMS-Na）为崩解剂，乙醇为润湿剂，硬脂酸镁为润滑剂经过筛，混匀，压片制成原花青素片剂。

附图说明

图1，实施例1用反相高效液相色谱鉴定肉桂水提物成分。

图2，实施例2 hIAPP和肉桂水提物、原花青素共浴的硫磺素荧光光谱实验。

图3，实施例2 hIAPP和肉桂酸、肉桂醛、香豆素共浴的硫磺素荧光光谱实验

图4，hIAPP和化合物共浴孵育12小时后在透射电镜下观察到的形态。

图5，光催化交联实验，用20%的Tricine-Urea凝胶电泳分离并用银染方法分析结果。

图6，各种肉桂水提物对羧基荧光素泄露的影响。

图7，肉桂水提物或原花青素对红细胞溶血率的影响。

图8，肉桂水提物或原花青素对细胞存活率的影响。

具体实施方式

下面结合具体实验，进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明保护的范围，下列实施例中未注明具体实验条件和方法，通常按照常规条件如：J.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，1992，分子克隆实验指南（第二版）；D.L.斯佩克特等，科学出版社，2001，细胞实验指南；吕鸿声，科学出版社，1982，或接照制造厂商所建议的条件。

本发明所用的肉桂酸（C₉H₈O₂）、肉桂醛（C₉H₈O）、香豆素（C₉H₆O₂）和原花青素（C₃₀H₂₆O₁₂）均订购于阿拉丁试剂有限公司 (中国)；胰岛淀粉样多肽订购于金丝瑞公司 (美国)，其它本发明所涉及到试剂均订购于奥德里奇-西格玛公司(美国)。

实施例1.反相高效液相色谱(reverse phase high performance liquid chromatography)鉴定肉桂水提物。

具体操作：采用 Apollo C18 色谱柱(250×4.6 mm, 5 μm)，柱温为40℃。流动相为60%乙腈，等梯度洗脱，流速为1ml/min。检测波长为280 nm。

结果如图1所示，原花青素，肉桂酸，香豆素，肉桂醛标准品的保留时间分别为2.09 min， 3.87 min， 4.56 min和5.77 min（见图1A，1B，1C和1D）,通过和肉桂水提物的各个峰的半保留时间对比得知，肉桂水提物中的主要成分为原花青素、肉桂酸、肉桂醛和香豆素（见图1E）。

实施例2.硫磺素荧光光谱实验（Thioflavin-T fluorescence assay）

具体操作：将胰岛淀粉样多肽（hIAPP）溶解于六氟异丙醇（HFIP）并超声2分钟，用25 mM PBS （50 mM NaCl，pH7.4）将其溶解稀释为含1% HFIP终浓度为13 μM的溶液。在25℃下分别与肉桂水提物、原花青素、肉桂酸、肉桂醛和香豆素共水浴，每两小时取点，用日立2700荧光分析仪进行分析，检测体系包含25 mM PBS（50 mM NaCl, pH 7.4） 和26 μM 硫磺素（Thioflavin-T），激发和发射波长分别为450 nm和482 nm，波长扫描60 s，记录数据分析。

结果如图2、图3所示，hIAPP随着孵育的时间增加逐渐开始聚集，同时荧光信号强度随着hIAPP的聚集而增强。当加入肉桂水提物后，荧光信号强度随着肉桂水提物浓度的上升而下降（见图2）。相同地，加入原花青素后，荧光信号强度随着原花青素的浓度升高而降低，当原花青素与hIAPP的摩尔浓度达到2:1时，荧光信号强度几乎完全被抑制（见图2）。然而当加入近饱和浓度的肉桂酸、肉桂醛和香豆素时，荧光信号强度与只有hIAPP时相似（见图3）。该实验说明肉桂水提物和原花青素均能有效地抑制hIAPP的聚集，而肉桂酸、肉桂醛和香豆素不能抑制hIAPP的聚集。

实施例3.透射电镜实验（Transmission electronic microscopy）

具体操作：取实施例2中孵育12小时的样品在透射电镜下观察其形态。

结果如图4所示，hIAPP单独孵育12小时后呈现细长的纤维状形态（见图4A）。当hIAPP分别和0.26 μg/ml的肉桂水提物、1.3μM的原花青素共同孵育12小时后呈现短小的纤维状形态（见图4B，4D），当hIAPP和分别和26 μg/ml的肉桂水提物、26 μM的原花青素共同孵育12小时后没有观察到典型的纤维状形态（见图4C，4E）。说明肉桂水提物和原花青素对hIAPP的聚集有抑制作用，且呈现剂量依赖性。当hIAPP分别和近饱和浓度的肉桂酸、肉桂醛、香豆素共同孵育时，仍可以观察到大量的细长的纤维状形态（见图4F-H），说明肉桂酸、肉桂醛和香豆素不能抑制hIAPP的聚集。

 

实施例4.未修饰蛋白的光催化交联实验(Photo-induced cross-linking of unmodified proteins assay)

具体操作：将hIAPP溶解于HFIP并超声2分钟，用25 mM PBS（50 mM NaCl， pH7.4）将其溶解稀释为含1% HFIP终浓度为41 μM的溶液，分别和肉桂水提物、原花青素在交联剂的作用下在暗箱中用白炽光照射5 s促进交联，加入上样缓冲液97℃变性10分钟，用20%的Tricine-Urea凝胶电泳分离并用银染方法分析结果。

结果如图5所示，hIAPP在光处理5 s后形成了较多的多聚体（见图5第2条带）。在加入了肉桂水提物多聚物呈现剂量依赖性地减少（见图5第3、4、5条带，肉桂水提物浓度分别为0.82 μg/ml、8.2 μg/ml和82 μg/ml）；同样地，在加入原花青素后多聚物也呈现剂量依赖性地减少（见图5第6、7、8条带，原花青素的浓度分别为4.1 μM、41 μM和82 μM）。该实验说明肉桂水提物和原花青素对hIAPP的毒性聚集有抑制作用。

实施例5.羧基荧光素泄露实验（dye leakage assay）

具体操作：利用2-Oleoyl-1-palmitoyl-sn-glycerol-3-phospho-rac (1-glycerol) sodium salt （POPG）制作包裹有羧基荧光素的POPG脂质膜（模拟生物膜），加入hIAPP和肉桂水提物或原花青素以检测其对hIAPP毒性的影响。

结果如图6所示，0.5 μM的hIAPP能够显著地破坏模拟生物膜，造成了95%的POPG脂质膜荧光泄露，当肉桂水提物或原花青素存在时，破膜率显著性地降低。

实施例6. 红细胞溶血实验（Hemolysis assay）

具体操作：hIAPP和肉桂水提物或原花青素与人红细胞共同在37℃下孵育5小时，上清在540 nm下测吸光度值，计算溶血率，通过比较溶血率得出肉桂水提物和原花青素对hIAPP毒性的影响。

结果如图7所示，单独15 μM的hIAPP存在时红细胞溶血率达到94%，加入肉桂水提物或原花青素后，红细胞溶血率呈现剂量依赖性地降低。

实施例7.细胞毒性实验（MTT assay）

具体操作：将大鼠胰腺肿瘤β-细胞（INS-1细胞）以5×10⁵ cells/ml的密度平铺在培养皿上，37℃和5% CO₂的培养箱中孵育24小时，换含15 μM 的hIAPP和肉桂水提物或原花青素的培养基，再孵育24小时。加入塞唑蓝（MTT）进一步孵育4 h后在570nm下的吸光度。

结果如图8所示，加入15 μM 的hIAPP后细胞存活率与对照组相比显著降低。加入肉桂水提物或原花青素后，细胞存活率呈现剂量依赖性地上升。

前期研究表明，胰岛淀粉样多肽在体内的聚集与2型糖尿病的发生和发展有密切关系。这一聚集过程会破坏胰岛β细胞膜的结构（参见L. Haataja, T. Gurlo, C.J. Huang, and P.C. Butler, Islet amyloid in type 2 diabetes, and the toxic oligomer hypothesis. Endocr Rev 2008; 29 (3): 303-316.），诱导β细胞凋亡，损伤β细胞的功能。本发明通过以上实验发现肉桂水提物可以有效抑制hIAPP的聚集，其四种主要成分为：原花青素、肉桂酸、肉桂醛和香豆素，其中原花青素可以有效抑制hIAPP的聚集。认为肉桂水提物中抑制hIAPP聚集的有效活性成分为原花青素。hIAPP的毒性实验证实肉桂水提物和原花青素可以有效地降低hIAPP在聚集过程中产生的毒性，并有效提高大鼠胰腺肿瘤β-细胞（INS-1细胞）在hIAPP存在条件下的存活率。这些结果表明肉桂水提物中的原花青素以抑制胰岛淀粉样多肽聚集为靶点，在制备治疗2型糖尿病药物中具有极大地应用价值。

人体内的胰岛淀粉样多肽的浓度在pM级别（参见Young A. Tissue expression and secretion of amylin. Adv Pharmacol 2005; 52:19-45.），原花青素在体内的浓度可以达到μM级别（R.R. Holt, S.A. Lazarus, M.C. Sullards, Q.Y. Zhu, D.D. Schramm, J.F. Hammerstone, C.G. Fraga, H.H. Schmitz, and C.L. Keen, Procyanidin dimer B2 [epicatechin-(4beta-8)-epicatechin] in human plasma after the consumption of a flavanol-rich cocoa. Am J Clin Nutr 2002; 76 (4): 798-804. ；R. Rajbhandari, N. Peng, R. Moore, A. Arabshahi, J.M. Wyss, S. Barnes, and J.K. Prasain, Determination of cranberry phenolic metabolites in rats by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J Agric Food Chem 2011; 59 (12): 6682-6688），在实验中原花青素和胰岛淀粉样多肽的摩尔浓度达到2:1时可以抑制该多肽的聚集。因此，以原花青素为抗糖尿病药物的主要成分，在体内仅仅需要pM级别就能达到很好的治疗效果。

所以本发明不仅提供了原花青素在制备治疗糖尿病药物中的应用，同时还提供了一种治疗糖尿病的药物，其中以原花青素作为活性成分，药学上可接受的辅料作为载体，比如以乳糖、淀粉和糊精为稀释剂，羧甲基淀粉钠（CMS-Na）为崩解剂，乙醇为润湿剂，硬脂酸镁为润滑剂。

Claims (3)

1.原花青素在制备治疗糖尿病药物中的应用。

2.一种用于治疗糖尿病的药物，其中含有原花青素。

3.根据权利要求2所述的药物，其中还含有乳糖、淀粉和糊精为稀释剂，羧甲基淀粉钠为崩解剂，乙醇为润湿剂，硬脂酸镁为润滑剂。

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