CN102958530A - 通过ccr6阻断ccl18信号转导作为纤维化疾病和癌症的治疗选择 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及能够与CCL18和/或CCL20结合的分离的可溶性CCR6受体多肽，以及对来自对象的液体样品中可溶性CCR6受体多肽的浓度进行定量的方法。本发明还涉及通过确定来自对象的样品中可溶性CCR6受体多肽的水平来在所述对象中检测和/或预测间质性肺病或癌症的方法，还提供了用于治疗所述疾病的药物组合物，其包含能够抑制CCL18或CCL20的活性和/或表达的化合物。本发明还涉及能够结合趋化因子受体CCR6并抑制其活性的分离的多肽，以及鉴定其它的CCR6受体活性抑制剂的方法。本发明还涉及通过确定来自对象的样品中CCR6基因表达的水平来在所述对象中检测间质性肺病或癌症的方法，还提供了用于治疗所述疾病的药物组合物，其包含CCR6受体活性和/或表达的抑制剂。

Description

通过CCR6阻断CCL18信号转导作为纤维化疾病和癌症的治疗选择
发明领域
本发明涉及能够与CCL18和/或CCL20结合的分离的可溶性CCR6受体多肽，以及对来自对象的液体样品中可溶性CCR6受体多肽的浓度进行定量的方法。本发明还涉及通过确定来自对象的样品中可溶性CCR6受体多肽的水平来在所述对象中检测和/或预测间质性肺病或癌症的方法，还提供了用于治疗所述疾病的药物组合物，其包含能够抑制CCL18或CCL20的活性和/或表达的化合物。本发明还涉及能够结合趋化因子受体CCR6并抑制其活性的分离的多肽，以及鉴定其它的CCR6受体活性抑制剂的方法。本发明还涉及通过确定来自对象的样品中CCR6基因表达的水平来在所述对象中检测间质性肺病或癌症的方法，还提供了用于治疗所述疾病的药物组合物，其包含CCR6受体活性和/或表达的抑制剂。
发明背景
间质性肺病是一类异质性病症，伴随着导致肺实质损伤的不同程度的炎症和纤维化。近来，特发性间质性肺炎亚类被划分为七种不同的综合征。这些病症中最常见的是特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)、非特异性间质性肺炎(non-specific interstitial pneumonia，NSIP)和隐源性机化性肺炎(cryptogenic organizing pneumonia，COP)。所述疾病的病因仍然不明，并且引起它们发病的分子机制尚不清楚。但是，成纤维细胞增殖和细胞外基质释放的最终路径代表病因已知和未知的纤维性肺病的常见路径，所述纤维性肺病包括具有引起纤维化的肺部表现的胶原血管病(collagen-vascular)和系统性炎性疾病(例如，类风湿性关节炎、系统性硬化病、硬皮病、超敏感性肺炎、一些形式的药物诱导的肺泡炎)。
IPF是原因未知的特殊类型的慢性纤维性间质性肺炎。当检查IPF患者的肺组织时，其显示称作普通型间质性肺炎(UIP)的一组特征性组织/病理特征。相反，NSIP是指这样的间质性肺炎病例，其中可鉴定出不同于UIP的特别类型的更同质的炎症和纤维化。
IPF在男性中比在女性中稍更常见，并且通常发生于50岁以上的患者。
支气管肺泡灌洗流体(BAL)的细胞学检查是诊断和监测间质性肺病(例如，IPF)的常用方法。与来自健康对照的支气管肺泡灌洗流体相比，IPF患者的支气管肺泡灌洗流体的特征为显著更高的总细胞和巨噬细胞数，增加的淋巴细胞、嗜中性细胞和嗜酸性细胞的百分比。
IPF的另一些常见症状是呼吸短促(尤其是在身体活动过程中和之后)和干咳。所述症状通常直到疾病加重且已发生不可逆的肺损伤时才出现。
IPF的预后相当差，从诊断时开始平均存活时间为3年。
对于肺纤维化，目前没有可用的有效的治疗和治愈方法。治疗通常限于处理肺中发生的炎性应答。标准疗法包括抗炎性和细胞毒性药物如类固醇和环磷酰胺或硫唑嘌呤，但是，这些疗法仅在例如NSIP(与IPF相比，其还具有较佳的预后)或脱屑性间质性肺炎(DIP)中有一些价值。然而，对于这些治疗选择中的大多数而言，IPF都是难治病。使用IFNγ、Bosentan
Figure BDA00002659247200021
(内皮素拮抗剂)、Aviptadil
Figure BDA00002659247200022
(血管活性肠肽，VIP)或酪氨酸激酶抑制剂Imatinib
Figure BDA00002659247200023
的实验性治疗研究也未显示这些药物的任何显著有益作用。
因此，开发治疗多种形式的肺纤维化(尤其是IPF)的新疗法仍然是必要任务。需要新的细胞靶标和可以有效影响这些靶标的治疗性分子。
趋化因子是免疫系统的稳态和活化必需的趋化、促炎性细胞因子家族。它们引导免疫细胞迁移到炎症和感染部位。趋化因子与属于七次跨膜结构域家族的特异性细胞表面受体G蛋白偶联受体结合。
CCL18也称为肺和活化调节的趋化因子(pulmonary andactivation-regulated chemokine，PARC)、替代性巨噬细胞活化相关CC趋化因子1(alternative macrophage activation-associated CC chemokine1，AMAC-1)、巨噬细胞炎性蛋白-4(MIP-4)和树突状细胞衍生趋化因子1(DCCK1)，CCL18是主要由多种单核细胞/巨噬细胞和树突状细胞表达的趋化因子。它在人肺中以高水平组成型表达。CCL18吸引T细胞、不成熟树突状细胞，并诱导成纤维细胞合成胶原。此外，有证据表明CCL18还可诱导B细胞的趋化性。
CCL18水平在多种疾病状态(例如，皮肤、肺和关节的炎性病症)中升高。还发现CCL18从肺纤维化患者的肺泡巨噬细胞中以提高的水平释放，并且该趋化因子的血清水平是纤维化疾病的预后标志物。
此外，可以证实，CCL18诱导成纤维细胞分化为肌成纤维细胞，并诱导胶原和α-平滑肌-肌动蛋白的表达。由于其已知的胶原诱导特性，高水平的CCL18可与肺纤维化中增加的基质沉积直接相关。
但是，由于其受体未知这一事实，对CCL18信号转导中信号转导事件和可行治疗干预的准确分析受到影响。
近来，可溶性受体作为新型疗法被引入临床医学。大多数可溶性受体与其膜结合对应物竞争其配体，从而以竞争性拮抗剂的形式发挥作用。可溶性受体的优点是它们高度特异，以高亲和力结合其靶标，并且诱导可削弱其作用的免疫应答的可能性较小。此外，它们具有在一定距离处起作用的潜力，使得它们可以在远离作用部位处施用。鉴于这些优点，可溶性受体在治疗应用方面有极大潜力。
癌症是其中一组细胞显示不受控生长、侵袭以及有时转移的一类疾病。癌症的这三种恶性特性使它们区别于良性肿瘤，良性肿瘤是自限的并且不侵袭或转移。
癌症是导致约13％的全世界所有死亡的重大健康问题。根据美国癌症协会，2007年世界范围内有760万人死于癌症。预计癌症引起的死亡将持续增加，估计2030年将有1200万人死于癌症。
因此，开发抗击癌症的新疗法仍是重要任务。
肺癌是癌症相关死亡的首要原因，并且由于其高患病率和增加的发病率而成为最重要的恶性肿瘤之一。接近80％的所有肺癌在组织学上定义为非小细胞肺癌(NSCLC)。尽管新技术中的优点和新药的开发有助于更早的诊断和更有效的治疗，但NSCLC仍然是威胁生命的疾病。NSCLC患者的5年总体存活时间仍然很低，并且即使在疾病的早期阶段，复发率也相对高。预后差是由于肿瘤的高度侵袭性行为，这由肿瘤的快速生长和早期转移证实。虽然NSCLC癌症发生和转移的准确机制仍然未知，但是肿瘤的微环境似乎在恶性疾病的发生和肿瘤细胞的散布中扮演着重要角色。
NSCLC是描述数种形式的肿瘤的术语。25％至40％的NSCLC是腺癌。该类肿瘤是从产生黏液的细胞产生的，并且主要位于肺的外周。肿瘤的第二常见组织学类型是从覆盖肺泡和细支气管表面的鳞状细胞发生的鳞细胞癌。
实体肿瘤的微环境是细胞因子和非细胞因子的复杂混合物。尤其是位于肿瘤周围的免疫细胞和趋化因子交扰(chemokine-crosstalk)促进肿瘤细胞的生长和它们的扩散。肿瘤相关巨噬细胞(TAM)是肿瘤微环境中免疫细胞的最重要的亚类型之一，并且占肿瘤质量的多至50％。一些研究证实恶性疾病中TAM数和预后差之间的显著相关性。
发明目的和概述
本发明的一个目的是提供能够与CCL18和/或CCL20结合的分离的可溶性CCR6受体多肽。
本发明的另一目的是提供对来自对象的液体样品中可溶性CCR6受体多肽的浓度进行定量的方法，以及可用于在对象中检测和/或预测间质性肺病或癌症的体外诊断方法。
本发明的另一目的是提供CCR6受体活性的抑制剂。本发明的又一目的是提供鉴定CCR6受体活性抑制剂的方法。
本发明的另一目的是提供药物组合物，其包含适于治疗间质性肺病和/或癌症的化合物，其中所述间质性肺病优选为特发性肺纤维化(IPF)，其中所述癌症优选为腺癌，最优选为肺的腺癌。
从随后的描述和权利要求中显而易见的这些和其它目的通过独立权利要求的主题达到。一些优选的实施方案由从属权利要求限定。
在第一方面，本发明提供了分离的可溶性CCR6受体多肽，其包含选自以下的氨基酸序列或由其组成：
(a)与根据SEQ ID NO.：1的序列显示至少80％同一性的氨基酸序列；和
(b)根据(a)的氨基酸序列的片段；
其中所述分离的可溶性CCR6受体多肽能够与CCL18和/或CCL20结合。
在另一方面，本发明涉及对来自对象的液体样品中可溶性CCR6受体多肽的浓度进行定量的方法，其中所述方法包括以下步骤：
(a)在固体支持物上固定对可溶性CCR6受体特异的捕捉分子；
(b)添加来自所述对象的液体样品；
(c)任选地添加可溶性CCR6受体的配体，其中所述配体是多肽，所述多肽包含与根据SEQ ID NO.：18、SEQ ID NO.：19、SEQ ID NO.：20或SEQ ID NO.：21的序列显示至少80％同一性的氨基酸序列或者由其组成。
(d)添加对根据(c)的配体特异的检测剂，其中所述检测剂包含可检测标记；
(e)对来自根据(d)的检测剂的信号进行定量。
在又一方面，本发明涉及在对象中检测和/或预测间质性肺病或癌症的方法，其中所述方法包括确定来自所述对象的样品中可溶性CCR6受体多肽水平的步骤。
在又一方面，本发明提供了药物组合物，其包含能够抑制CCL18或CCL20的活性和/或表达的化合物。
在另一方面，本发明涉及本发明的分离的可溶性CCR6受体多肽用于治疗中。
在又一方面，本发明涉及本发明的分离的可溶性CCR6受体多肽或本发明的药物组合物用于治疗或预防间质性肺病和/或癌症。
在又一方面，本发明涉及对本发明的分离的可溶性CCR6受体多肽特异的检测剂用于在来自对象的样品中检测间质性肺病或癌症。
在又一方面，本发明提供了包含选自以下的氨基酸序列或者由其组成的分离的多肽：
(a)与根据SEQ ID NO.：9、22或23的序列显示至少80％同一性的氨基酸序列；和
(b)根据(a)的氨基酸序列的片段；
其中，所述分离的多肽能够与CCR6受体结合并抑制其活性。
在另一方面，本发明涉及编码本发明多肽的分离的多核苷酸。
在又一方面，本发明涉及鉴定能够抑制CCR6受体之活性的化合物的方法，其中所述方法包括以下步骤：
(a)使CCR6受体与测试化合物接触；
(b)添加CCR6受体激动剂，其中所述激动剂是多肽，所述多肽包含与根据SEQ ID NO.：5或SEQ ID NO.：18的序列显示至少80％同一性的氨基酸序列或者由其组成；
(c)确定所述CCR6受体的活性；和
(d)如果(c)中确定的CCR6受体活性比对照中确定的CCR6受体活性更低，则选择所述测试化合物作为能够抑制CCR6受体活性的化合物。
在又一方面，本发明涉及在对象中检测间质性肺病或癌症的方法，其包括确定来自所述对象的样品中CCR6基因表达水平的步骤。
在另一方面，本发明提供了药物组合物，其包含能够抑制CCR6受体的活性和/或表达的化合物。
在又一方面，本发明涉及本发明的药物组合物用于治疗或预防间质性肺病和/或癌症。
在又一方面，本发明还涉及能够抑制CCR6受体的活性和/或表达的化合物或本发明的药物组合物在制备用于治疗或预防间质性肺病和/或癌症的药物中的用途。
附图说明
图1来自鳞癌(n＝3)、NSIP(n＝2)和UIP(n＝3)患者的不同成纤维细胞系中CCR6mRNA的表达。采用管家基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPdH)对CCR6表达进行归一化。
图2来自UIP(上图，左和中)、NSIP(上图，右)和鳞癌(SQ CA；下图)患者的不同成纤维细胞系中CCR6表达的分析。
图3CCR6在对照肺(A)中不表达，但是，在纤维化肺中，在肺泡上皮细胞的顶部表面(B和C，箭头)和成纤维细胞上(C，箭头)可见CCR6的表达(放大倍数：A：×100，B：×200，C：×400)。
图4与来自未纤维化肺(浅灰色，“对照”，n＝6)的成纤维细胞相比，来自纤维化肺(灰色，n＝6(UIP n＝3，结节病n＝1，NSIP n＝1，不确定n＝1))的成纤维细胞中未刺激的(unst.)FGF2释放增加。CCL18诱导来自纤维化肺的成纤维细胞中FGF2释放的显著上调，但是在来自未纤维化肺的成纤维细胞中仅为少量。使用阻断抗体阻断CCR6抑制CCL18诱导的FGF2释放上调。同样，该作用仅见于来自纤维化肺的成纤维细胞中。
图5CCL18诱导所研究的四种中三种的胶原I mRNA表达(上图)和所有人肺成纤维细胞系中α-平滑肌肌动蛋白(αSMA)mRNA的表达(下图)(纵坐标显示细胞系名称)。胶原I mRNA表达和α-平滑肌肌动蛋白(αSMA)mRNA表达被抗-CCR6阻断(rE＝相对表达)。
图6用TGFβ或CCL18刺激之后，转化的大鼠肺泡上皮细胞系RLE-6TN经历上皮间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)。箭头指示成纤维细胞样细胞。培养阶段＝6天。
图7在未刺激或存在TGFβ、TGFβ+TNFα、CCL18或CCL18+TNFα的条件下培养6天的波形蛋白(vimentin)和αSMA表达的Western印迹分析。
图8在第6天通过免疫荧光测定αSMA的免疫反应性。RLE-6TN细胞未受刺激(A)或用(B)TGFβ+TNFα、(C)CCL18(D)或CCL18+TNFα刺激。用DAPI染核。αSMA仅在图B中可见，显示成纤维细胞的典型形状(箭头)。相反，在图C和图D中只有核是明显的。
图9在第6天通过免疫荧光测定CD90的免疫反应性。RLE-6TN细胞未受刺激(A)或用TGFβ+TNFα(B)、CCL18(C)刺激。用ToPro3染核。未受刺激细胞不表达CD90，并且只有核可见。相反，如由显示细胞形状所证实的，TGFβ+TNFα和CCL18二者刺激的细胞都表达CD90。
图10CCL18诱导的αSMA表达见于CCR6转染的RLE-6TN中，而非模拟转染的细胞中。相反，TGFβ在两种细胞系中均诱导αSMA表达。
图11在不存在或存在TNFα的条件下，用TGFβ+TNFα或CCL18刺激人原代AECII 12天。通过10％SDS-PAGE来分离总细胞裂解物，通过Western印迹进行分析。未受刺激的细胞仅少量表达α-平滑肌肌动蛋白(αSMA)而不表达波形蛋白。用TGFβ+TNFα和CCL18单独或组合刺激强烈地上调两种分子。有趣的是，细胞角蛋白被TGFβ+TNFα下调，但被单独的CCL18或CCL18与TNFα的组合保持。
图12在存在或不存在植物血球凝集素(PHA；5μg/ml)的条件下培养7天之后，外周血单核细胞中CCR6的表达。根据它们的初始CCR6表达，将细胞制备物分为“高”或“低”CCR6表达制备物。培养阶段之后，未受刺激的制备物未改变CCR6的表达模式。相反，用PHA刺激降低高表达组中CCR6的表达但增加了低表达组中的表达。
图13用CCL18(10ng/ml)孵育20分钟之后，CCR6受体的下调。用CCL18孵育导致CCR6表面表达的显著下调。该作用由配体-受体相互作用后的受体内化引起。
图14CCL18诱导的人淋巴细胞中CCR6的表达下调及其被抑制剂PS-AU-1015(根据SEQ ID NO：.9的多肽)抑制的FACS分析。可观察到表达趋化因子受体CCR6的新鲜分离的人淋巴细胞亚群为主峰(阳性对照)右手边的较低峰。用CCL18(10ng/ml)孵育20分钟显著地降低该峰(仅CCL18)。在抑制剂PS-AU-1015(SEQ ID NO：9；100ng/ml)的存在下用CCL18(10ng/ml)孵育细胞，未发生该下调(CCL18+抑制剂)。仅有抑制剂没有显示作用。
图15来自对照肺(A)和两个腺癌肺(B、C)的肺切片中的CCR6染色。在对照肺中没有可见的染色，而肿瘤细胞是CCR6阳性的(红色，箭头)。
图16肺腺癌细胞(上图)和胸膜间皮瘤细胞(下图)表面上CCR6的表达。左峰表示同型对照，右峰表示CCR6表达。三种腺癌细胞系中的两种和全部胸膜间皮瘤细胞系表现出显著的CCR6表达。
图17用于PCR的引物列表。
图18来自作为对照的健康志愿者(n＝3；泳道1-3)和纤维化(UIP)患者(n＝3；泳道4-6)的血清的Western印迹分析(A)。分子大小在图侧给出(C＝对照；M＝蛋白质标记物)。Western印迹的密度分析(B)。
图19来自健康志愿者(n＝9)的对照血清和纤维化患者(UIP，n＝19)的分析。
图20使用CCR6配体CCL18和CCL20(各100ng/ml)1小时阻断通过ELISA对可溶性CCR6(sCCR6)的检测。低浓度和中浓度被完全阻断，而高浓度降低了三分之一。血清1、2和3是来自健康志愿者的血清。
图21来自sCCR6阳性和sCCR6阴性的对照和(UIP)患者的BAL中淋巴细胞的百分比。在血清sCCR6阳性患者中，淋巴细胞的百分比显著增加。在对照组中，该作用不那么明显(不显著)。
图22来自sCCR6阳性和sCCR6阴性(UIP)患者的BAL中CD3+和HLA-DR+淋巴细胞、NK细胞以及CD1a+树突状细胞的百分比。
图23与对照相比，所有患者组均显示显著增加的CCL18血清水平。
图24与对照相比，所有T阶段的平均CCL18水平显著增加(p＜0.0002)。此外，具有最低T阶段的患者组相比于两个最高T阶段的患者组有显著差异。
图25使用受试者/工作曲线(receiver/operator curve)(ROC，左)和图相比于标准值(右)确定截断点。ROC分析给出83ng/ml的截断点以区分对照患者与肿瘤患者。标准图(criterion plot)给出以在观察期内死亡为标准的截断点160ng/ml。
图26NSCLC患者的存活时间与CCL18血清水平的关系的Kaplan-Meier分析。
图27腺癌患者的存活时间与CCL18血清水平的关系的Kaplan-Meier-分析。
图28与具有正常血清CCL18水平的亚组相比，在腺癌患者亚组中，具有最高血清CCL18水平的组中平均N-阶段显著较高。
图29CCL18在腺癌细胞(A549)中诱导FSP1表达上调。使用2ng/ml的TGFb。培养72小时之后，通过qPCR测定表达。(C＝未受刺激的细胞)。
图30CCL18在腺癌细胞(A549)中诱导snail表达。使用2ng/ml的TGFb。培养72小时之后，通过Western印迹测定表达。(C＝未受刺激的细胞)。
图31CCL18在腺癌细胞(A549)中诱导E-钙粘蛋白表达下调。使用2ng/ml的TGFb。培养72小时之后，通过qPCR测定表达。(C＝未受刺激的细胞)。
图32来自不同肿瘤患者肺的成纤维细胞系中CCR6阳性成纤维细胞的百分比。
图33序列表SEQ ID NO：1至9和SEQ ID NO：18至27。
发明详述
在对本发明进行以下详述之前，应理解，本发明不限于本文所述的特定方法、方案和试剂，因为它们可以改变。还应理解，本文所使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，并且不旨在限制本发明的范围，本发明的范围将仅由所附权利要求限制。除非另有限定，否则本文所使用的全部技术和科学术语的含义与本领域普通技术人员通常理解的含义相同。
虽然在本说明书全文中引用了数个文献(其通过整体引用并入本文)，但是本文中的任何内容均不应理解为承认无权凭借在先发明先于这些公开内容。
引入了下述定义。如在本说明书中和权利要求书中所使用的，除非上下文中清楚地指明，否则未指出数量时还包括各自的复数形式。
应当理解，术语“包含”以及变体如“包括”不是限制性的。为了本发明目的，认为术语“由…组成”是术语“包含”的一个优选实施方案。
如果在下文中，一个组被定义为包含至少一定数目的实施方案，则这意指还涵盖优选地仅由这些实施方案组成的组。
在本发明的上下文中，术语“约”是指本领域技术人员将理解的仍确保所讨论特征的技术效果的精确度间隔。该术语通常涵盖与所示数值偏离±10％，优选±5％。
两个序列之间的同一性百分数的确定优选地使用Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci USA 90：5873-5877的数学算法完成。这样的算法整合入例如可得自NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi)的BLASTn程序和BLASTp程序(Altschul等(1990)J.MoI.Biol.215：403-410)。
同一性百分数的确定优选地使用BLASTn程序和BLASTp程序的标准参数进行。
BLAST多核苷酸搜索优选地使用BLASTn程序进行。
对于一般参数，“最大靶序列(Max Target Sequences)”框可以设置为100，可以点选“短查询(Short queries)”框，“期望阈值(Expectthreshold)”框可以设置为10，“字大小(Word Size)”框可以设置为28。对于得分参数，“匹配/错配得分(Match/mismatch Scores)”可以设置为1、-2，“空格扣分(Gap Costs)”框可以设置为线性(linear)。对于过滤和掩蔽(masking)参数，可以不点选“低复杂度区(Low complexity regions)”框，可以不点选“种属特异重复”框，可以点选“仅掩蔽查找表(Mask forlookup table only)”框，可以不点选“掩蔽小写字母(Mask lower caseletters)”框。
BLAST蛋白质搜索优选使用BLASTp程序进行。
对于一般参数，“最大靶序列”框可以设置为100，可以点选“短查询”框，“期望阈值”框可以设置为10，“字大小”框可以设置为3。对于得分参数，“矩阵”框可以设置为“BLOSUM62”，“空格扣分”框可以设置为“存在：11延伸：1(Existence：11 Extension：1)”。“组成调节(Compositionaladjustments)”框可以设置为“条件性组成分数矩阵调节(Conditionalcompositional score matrix adjustment)”。对于过滤和掩蔽参数，可以不点选“低复杂度区”框，可以不点选“仅掩蔽查找表”框，可以不点选“掩蔽小写字母”框。
通过各参照序列的全长(即根据各自上下文中所述的SEQ ID NO序列的全长)确定同一性百分数。例如，与根据SEQ ID NO.：1的序列显示至少80％同一性的氨基酸序列在SEQ ID NO.：1全长上与SEQ ID NO.：1显示至少80％的同一性。在另一实例中，与根据SEQ ID NO.：8的序列显示至少80％同一性的序列在SEQ ID NO.：8的全长上与SEQ ID NO.：8显示至少80％的同一性。
本文所使用的术语“对象”是指人或动物，优选哺乳动物如非人灵长类、小鼠、大鼠、兔、豚鼠、狗、猫、牛、马、绵羊、猪、山羊等。优选地，在本发明的上下文，“对象”是人。
在本发明的上下文中提到的术语“趋化因子受体CCR6”或“CCR6受体”、“趋化因子配体18”或“CCL18”和“趋化因子配体20”或“CCL20”在本领域中是公知的。因此，一般技术人员可以容易地从任何合适的公共数据库(如NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/))获得CCR6受体、CCL18和CCL20及其直系同源物和剪接同工型的多核苷酸序列和氨基酸序列。术语“CCR6受体”和“CCR6”在本文中互换使用。
在本发明的上下文中提到的“CCR6受体”、“CCL18”和“CCL20”优选为哺乳动物CCR6受体、CCL18和CCL20，最优选人CCR6受体和人CCL18或人CCL20。人CCR6受体可以例如以登录号NM_004367.5(转录变体1；SEQ ID NO.：3)或NM_031409.3(转录变体2；SEQ ID NO.：4)见于NCBI数据库中。人CCL18可以例如以登录号NM_002988.2(SEQ IDNO.：5)见于NCBI数据库中。人CCL20可以例如以登录号NM_004591.2(转录变体1；SEQ ID NO.：6)或NM_001130046.1(转录变体2；SEQ IDNO.：7)见于NCBI数据库中。
CCR6有时也称为CD196。CCL18有时也称为肺和活化调节的趋化因子(PARC)、替代性巨噬细胞活化相关CC趋化因子1(AMAC-1)、巨噬细胞炎性蛋白-4(MIP-4)和树突状细胞衍生趋化因子1(DCCK1)。
术语“IPF”(特发性肺纤维化)和“UIP”(普通型间质性肺炎)在本文中同义地使用。
本发明人出乎意料地发现CCL18是CCR6受体(七次跨膜G-蛋白偶联趋化因子受体家族的成员)的配体/激动剂。本发明人还出乎意料地发现可溶性CCR6受体多肽可见于健康人类志愿者的血清中，但是在来自人类IPF患者的血清中仅可以以减少的量检测到或者根本检测不到。本发明人还发现分离的可溶性CCR6受体多肽可用于治疗中，特别是用于治疗间质性肺病或癌症。本发明人还出乎意料地发现CCR6受体活性的抑制剂可用于治疗间质性肺病或癌症。
因此，在一方面，本发明涉及分离的可溶性CCR6受体多肽，其包含选自以下的氨基酸序列或者由其组成的：
(a)与根据SEQ ID NO.：1的序列显示至少80％同一性的氨基酸序列；和
(b)根据(a)的氨基酸序列的片段；
其中，所述分离的可溶性CCR6受体多肽能够与CCL18和/或CCL20结合。
在一个优选实施方案中，本发明分离的可溶性CCR6受体多肽还包含与根据SEQ ID NO.：2的序列或其片段显示至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列。在一个特别优选的实施方案中，本发明的分离的可溶性CCR6受体多肽还包含与根据SEQ ID NO.：2的序列或其片段显示至少95％同一性的氨基酸序列。在另一特别优选的实施方案中，本发明的分离的可溶性CCR6受体多肽还包含根据SEQ ID NO.：2的氨基酸序列或其片段。在另一优选的实施方案中，本发明的分离的可溶性CCR6受体多肽包含与根据SEQ ID NO.：1的序列或其片段显示至少80％同一性的氨基酸序列和与根据SEQ ID NO.：2的序列或其片段显示至少80％同一性的氨基酸序列，或者由所述氨基酸序列组成。在又一优选的实施方案中，本发明的分离的可溶性CCR6受体多肽包含与根据SEQ ID NO.：1的序列或其片段显示至少90％同一性的氨基酸序列和与根据SEQ ID NO.：2的序列或其片段显示至少90％同一性的氨基酸序列，或者由所述氨基酸序列组成。在又一优选的实施方案中，本发明的分离的可溶性CCR6受体多肽包含与根据SEQ ID NO.：1的序列或其片段显示至少95％同一性的氨基酸序列和与根据SEQ ID NO.：2的序列或其片段显示至少95％同一性的氨基酸序列，或者由所述氨基酸序列组成。
在又一优选的实施方案中，本发明的分离的可溶性CCR6受体多肽包含根据SEQ ID NO.：1或其片段的氨基酸序列和根据SEQ ID NO.：2或其片段的氨基酸序列，或者由所述氨基酸序列组成。
优选地，CCL18和/或CCL20是人CCL18和/或人CCL20。最优选地，所述CCL18是根据SEQ ID NO.：18的多肽，所述CCL20是根据SEQ IDNO.：19的多肽.
在本发明的上下文中，术语“分离的”是指多肽或多核苷酸从其天然环境中移出和/或以不存在于自然中的形式呈现。“分离的”多肽或“分离的”多核苷酸还可以是在体外产生的多肽或多核苷酸。
本文所使用的术语“分离的可溶性CCR6受体多肽”意于将本发明的分离的可溶性CCR6受体多肽与膜结合的受体多肽(如膜结合的CCR6受体)区分开。例如，在本发明的上下文中，认为在内源条件下溶解于对象的体液(如血清、血浆、支气管肺泡灌洗流体、胸膜腔积液、痰、唾液或尿)中并且不嵌入或结合到细胞膜的任何天然可溶性CCR6受体多肽是“可溶的”。
因此，在一个实例中，本发明的分离的可溶性CCR6受体多肽可以是分离自来自对象之样品的天然可溶性CCR6受体多肽。
在另一实例中，本发明的分离的可溶性CCR6受体多肽还可以是在体外产生并且在水性溶液(如生理水性溶液，优选在血清、血浆、支气管肺泡灌洗流体、胸膜腔积液、痰、唾液或尿中)中基本可溶的重组多肽。最优选在血清中。
在一个优选实施方案中，本发明的分离的可溶性CCR6受体多肽的至少50％、优选至少60％、更优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％或者最优选至少90％可溶于水性溶液中，优选血清、血浆、支气管肺泡灌洗流体、胸膜腔积液、痰、唾液或尿中。在一个特别优选的实施方案中，本发明的分离的可溶性CCR6受体多肽的至少75％可溶于水性溶液中，优选血清、血浆、支气管肺泡灌洗流体、胸膜腔积液、痰、唾液或尿中。为了确定本发明的分离的可溶性CCR6多肽的溶解百分数，本领域技术人员可以例如离心包含所述多肽的样品，然后测量上清液中多肽的量和样品中多肽的总量。然后将溶解百分数计算为上清液中多肽的量占离心前样品中多肽的总量的百分数。
在一个优选实施方案中，本发明的分离的可溶性CCR6受体多肽在前述水性溶液中的溶解无需添加去污剂。在另一优选实施方案中，本发明的分离的可溶性CCR6受体多肽不包含跨膜结构域。
在一个优选实施方案中，根据(a)的氨基酸序列与根据SEQ ID NO.：1的序列显示至少85％、更优选至少91％、甚至更优选至少92％、甚至更优选至少93％、甚至更优选至少94％、甚至更优选至少95％、甚至更优选至少96％、甚至更优选至少97％、甚至更优选至少98％或者更优选至少99％的同一性。
在一个特别优选的实施方案中，根据(a)的氨基酸序列与根据SEQ IDNO.：1的序列显示90％、95％或100％的同一性。
在另一特别优选的实施方案中，根据(a)的氨基酸序列是根据SEQ IDNO.：1的序列。如果本发明的分离的可溶性CCR6受体多肽由根据SEQ IDNO.：1的氨基酸序列组成，则本发明的分离的可溶性CCR6受体多肽优选具有48个氨基酸的长度。
在另一优选实施方案中，根据(a)的氨基酸序列中根据SEQ ID NO：1的序列的不多于1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸被改变(即缺失、插入、修饰和/或被其它氨基酸替换)。
本发明的氨基酸序列中的替换可以是保守替换或非保守替换，优选保守替换。在一些实施方案中，替换还包括将天然氨基酸换为非天然氨基酸。保守替换包括将氨基酸替换为与被替换氨基酸具有相似化学特性的另一氨基酸。优选地，保守替换是选自以下的替换：
(i)用另一不同的碱性氨基酸替换碱性氨基酸；
(ii)用另一不同的酸性氨基酸替换酸性氨基酸；
(iii)用另一不同的芳族氨基酸替换芳族氨基酸；
(iv)用另一不同的非极性脂肪族氨基酸替换非极性脂肪族氨基酸；
(v)用另一不同的极性不带电氨基酸替换极性不带电氨基酸。
碱性氨基酸优选地选自精氨酸、组氨酸和赖氨酸。酸性氨基酸优选为天冬氨酸或谷氨酸。
芳族氨基酸优选地选自苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。非极性脂肪族氨基酸优选地选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和异亮氨酸。极性不带电氨基酸优选地选自丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。与保守氨基酸替换不同，非保守氨基酸替换是不落在上述列举的保守替换(i)至(v)中的氨基酸与任意氨基酸的交换。
本发明的分离的可溶性CCR6多肽的氨基酸还可以被修饰，例如化学修饰。例如，蛋白质氨基酸的侧链或游离氨基端或羧基端可以通过例如糖基化、酰胺化、磷酸化、泛素化等被修饰。为了增加胞内稳定性和/或降低对象对本发明的分离的可溶性CCR6多肽的免疫应答，本发明的分离的可溶性CCR6多肽可以例如通过乙酰化、PEG化、酰胺化或并入D-氨基酸而被修饰。
在一个优选实施方案中，根据(a)的氨基酸序列包含根据SEQ ID NO.：1的序列的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40或至少45个连续氨基酸。在一个特别优选的实施方案中，根据(a)的氨基酸序列包含根据SEQ ID NO.：1的序列的至少8、至少15、至少20、至少30或至少40个氨基。
在另一优选实施方案中，根据(a)的氨基酸序列与根据SEQ ID NO.：1的序列显示至少80％、优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少91％、更优选至少92％、更优选至少93％、更优选至少94％、更优选至少95％、更优选至少96％、更优选至少97％、更优选至少98％、甚至更优选至少99％或者最优选100％的同一性，并且包含根据SEQ ID NO.：1的序列的至少8个、更优选至少12个、更优选至少15个、更优选至少20个、更优选至少25个、更优选至少30个、更优选至少35个、更优选至少40个和最优选45个连续氨基酸。
在又一优选实施方案中，根据(a)的氨基酸序列与根据SEQ ID NO.：1的序列显示至少95％或至少98％的同一性，并且包含根据SEQ ID NO.：1的序列的至少20、至少25、至少30或至少40个连续氨基酸。在一个最优选的实施方案中，根据(a)的氨基酸序列与根据SEQ ID NO.：1的序列显示至少95％的同一性，并且包含根据SEQ ID NO.：1的序列的至少20个连续氨基酸，或者与根据SEQ ID NO.：1的序列显示至少98％的同一性，并且包含根据SEQ ID NO.：1的序列的至少25个连续氨基酸。
在一个优选实施方案中，本发明的分离的可溶性CCR6受体多肽具有以下长度：少于3000个氨基酸，优选少于2000个氨基酸，更优选少于1000个氨基酸，更优选少于500个氨基酸，更优选少于300个氨基酸，更优选少于200个氨基酸，更优选少于100个氨基酸或者最优选少于80个氨基酸。
在另一优选实施方案中，本发明的分离的可溶性CCR6受体多肽具有以下长度：至少8个至至少3000个氨基酸，优选至少8个至至少2000个氨基酸，更优选至少8个至至少1000个氨基酸，更优选至少8个至500个氨基酸，更优选至少8个至300个氨基酸，更优选至少8个至200个氨基酸，更优选至少8个至100个氨基酸或者至少8个至80个氨基酸。
在又一优选实施方案中，本发明的分离的可溶性CCR6受体多肽具有以下长度：至少20个至至少3000个氨基酸，优选至少20个至至少2000个氨基酸，更优选至少20个至至少1000个氨基酸，更优选至少20个至500个氨基酸，更优选至少20个至300个氨基酸，更优选至少20个至200个氨基酸，甚至更优选至少20个至100个氨基酸或者至少20个至80个氨基酸。在又一优选实施方案中，本发明的分离的可溶性CCR6受体多肽具有以下长度：至少30个至至少3000个氨基酸，优选至少30个至至少2000个氨基酸，更优选至少30个至至少1000个氨基酸，更优选至少30个至500个氨基酸，更优选至少30个至300个氨基酸，更优选至少30个至200个氨基酸，甚至更优选至少30个至100个氨基酸或者至少30个至80个氨基酸。
在另一优选实施方案中，本发明的分离的可溶性CCR6受体多肽具有以下长度：至少40个至至少3000个氨基酸，优选至少40个至至少2000个氨基酸，更优选至少40个至至少1000个氨基酸，更优选至少40个至500个氨基酸，更优选至少40个至300个氨基酸，更优选至少40个至200个氨基酸，甚至更优选至少40个至100个氨基酸或者至少40个至80个氨基酸。在又一优选实施方案中，本发明的分离的可溶性CCR6受体多肽具有以下长度：至少50个至至少3000个氨基酸，优选至少50个至至少2000个氨基酸，更优选至少50个至至少1000个氨基酸，更优选至少50个至500个氨基酸，更优选至少50个至300个氨基酸，更优选至少50个至200个氨基酸，甚至更优选至少50个至100个氨基酸或者至少50个至80个氨基酸。在一个特别优选的实施方案中，本发明的分离的可溶性CCR6受体多肽具有至少20个至至少500个氨基酸的长度。
在另一优选实施方案中，本发明的分离的可溶性CCR6受体多肽具有以下长度：至少8个，更优选至少10个，更优选至少20个，更优选至少30个，更优选至少40个，更优选至少45个，甚至更优选至少48个氨基酸。在一个特别优选的实施方案中，本发明的分离的可溶性CCR6受体多肽具有以下长度：至少30个，至少40个或者至少48个氨基酸。在一个特别优选的实施方案中，本发明的分离的可溶性CCR6受体多肽具有48个氨基酸的长度。
片段通常是其所涉及的氨基酸序列的一部分。
在一个优选实施方案中，根据(b)的片段的长度为至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27或者至少28个氨基酸。在一个优选实施方案中，根据(b)的片段具有至少10、至少15或者至少20个氨基酸的长度。在一个特别优选的实施方案中，根据(b)的片段具有以下长度：至少15个氨基酸，更优选至少20个、更优选至少30个或者最优选至少40个氨基酸。在另一特别优选的实施方案中，根据(b)的片段具有至少40个氨基酸的长度。
本发明的分离的可溶性CCR6受体多肽是否能够与CCL18和/或CCL20结合可以通过本领域技术人员已知的任意合适的方法来确定。例如，本领域技术人员可以通过使用酵母双杂交测定或者生物化学测定如下拉测定(pull-down assay)、免疫共沉淀测定、酶联免疫吸附测定(ELISA)、定量放射性配体结合测定、等离子体共振测定(Plasmon resonance assay)或者本领域技术人员已知的任意其它方法来确定本发明的可溶性CCR6受体多肽是否能够与CCL18和/或CCL20结合。当使用下拉测定或等离子体共振测定时，有用的是将至少一种蛋白质与亲和标签(如HIS-标签、GST-标签或生物化学领域公知的其它标签)融合。
在一个优选实施方案中，本发明的分离的可溶性CCR6受体多肽能够抑制CCL18和/或CCL20的活性。
本文所使用的术语“抑制CCL18和/或CCL20的活性”意指CCL18和/或CCL20的活性被本发明的分离的可溶性CCR6受体多肽或者本文所述的能够抑制CCL18和/或CCL20活性的任意其它化合物(如对CCL18和/或CCL20特异的抗体)下调或者消除。
例如，在一个实施方案中，本发明的分离的可溶性CCR6受体多肽或者本文所述的能够抑制CCL18和/或CCL20活性的任意其它化合物在与CCL18和/或CCL20结合后可以抑制CCL18和/或CCL20与膜结合CCR6受体的相互作用，使得CCL18或CCL20不能活化所述受体。因此，CCL18和/或CCL20活性的抑制可以例如是由于CCL18和/或CCL20与膜结合CCR6受体的相互作用的抑制。在另一实施方案中，本发明的分离的可溶性CCR6受体多肽或者本文所述的能够抑制CCL18和/或CCL20活性的任意其它化合物在与CCL18和/或CCL20结合后可以抑制CCL18和/或CCL20的趋化活性(chemotactic activity)。在又一优选实施方案中，本发明的分离的可溶性CCR6受体多肽或者本文所述的能够抑制CCL18和/或CCL20活性的任意其它化合物在与CCL18和/或CCL20结合后可以抑制CCL18和/或CCL20与膜结合CCR6受体的相互作用以及CCL18和/或CCL20的趋化活性。本发明的分离的可溶性CCR6受体多肽或者本文所述的能够抑制CCL18和/或CCL20的活性的任意其它化合物可以例如通过螯合所述蛋白质从而降低它们的生物可获得性(bioavailability)来抑制CCL18和/或CCL20的活性。
可以例如通过测量膜结合CCR6受体的活性来确定本发明的分离的可溶性CCR6受体多肽或者待测试的任意其它化合物是否能够抑制CCR6受体配体CCL18和/或CCL20的活性。
在一个实例中，技术人员可以例如通过以下方法来确定本发明的分离的可溶性CCR6受体多肽或者待测试的任意其它化合物抑制CCL18和/或CCL20活性的能力：在存在CCL18或CCL20以及在存在或不存在本发明的分离的可溶性CCR6受体多肽或者待测试的任意其它化合物的条件下孵育表达膜结合CCR6受体的细胞，然后裂解细胞，并通过Western印迹分析来分析CCR6信号转导的下游分子ERK的磷酸化。在该实例中，与不存在本发明的分离的可溶性CCR6受体多肽或者待测试的任意其它化合物时的ERK磷酸化水平相比，在存在本发明的分离的可溶性CCR6受体多肽或者待测试的任意其它化合物时ERK磷酸化的水平更低表明本发明的分离的可溶性CCR6受体多肽或者所测试的其它化合物能够通过CCL18和/或CCL20抑制膜结合CCR6受体的活化。用于通过Western印迹分析来确定ERK磷酸化的一种方法例如描述于Lin等.J Proteome Res.2010Jan；9(1)：283-97中。在一个类似的实例中，可以分析其它CCR6受体下游效应因子(如Akt、SAPK/JNK激酶、磷脂酰肌醇3-激酶或磷脂酶C)的磷酸化以确定本发明的分离的可溶性CCR6受体多肽或者待测试的任意其它化合物是否能够抑制CCL18和/或CCL20的活性。
还可以例如通过测量CCL18和/或CCL20的趋化活性来确定本发明的分离的可溶性CCR6多肽或者待测试的任意其它化合物是否能够抑制CCL18和/或CCL20的活性。
可以例如通过在存在或不存在本发明的分离的可溶性CCR6受体多肽或待测试的任意其它化合物的条件下进行趋化测定来确定CCL18和/或CCL20的趋化活性。本领域技术人员可以例如进行趋化室测定(chemotaxischamber assay)。例如，这样的测定的实例描述于Christopherson等.JPharmacol Exp Ther.2002 Jul；302(1)：290-5中。在存在本发明的分离的可溶性CCR6受体多肽或者待测试的其它化合物时，CCL18和/或CCL20的的趋化活性降低表明本发明的分离的可溶性CCR6受体多肽或者所测试的其它化合物能够抑制CCL18和/或CCL20的趋化活性。
此外，还可以例如通过在存在本发明的分离的可溶性CCR6多肽或待测试的任意其它化合物的条件下测量CCL18刺激的FGF2释放或CCL18介导之胶原和/或α-SMA的诱导来确定所述分离的可溶性CCR6多肽或其它化合物是否能够抑制CCL18的活性。在该实例中，与其中未添加分离的可溶性CCR6多肽其它化合物的对照相比，在存在分离的可溶性CCR6多肽或待测试的其它化合物的条件下CCL18诱导的FGF2上调的抑制和/或CCL18介导之胶原和/或α-SMA表达的诱导被抑制表明分离的可溶性CCR6多肽或其它化合物能够抑制CCL18的活性。此外，为了确定本发明的分离的可溶性CCR6多肽或者待测试的任意其它化合物抑制CCL18活性的能力，本领域技术人员还可以确定由CCL18引起的上皮间充质转化(Epithelial-Mesenchymal-Transition，EMT)的诱导是否下调或消除。
作为替代地或另外地，还可以使用适于确定CCL18和/或CCL20活性且存在于本领域中且为本领域普通技术人员所知的任意其它方法。
与对照相比，本发明的分离的可溶性CCR6受体多肽或者能够抑制CCL18和/或CCL20活性的任意其它化合物可以将CCL18和/或CCL20的活性抑制至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、更优选至少80％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。在一个优选实施方案中，本发明的分离的可溶性CCR6受体多肽或者能够抑制CCL18和/或CCL20活性的任意其它化合物将CCL18和/或CCL20的活性抑制至少50％、至少60％或至少70％。在另一优选实施方案中，本发明的分离的可溶性CCR6受体多肽或者本文所述的能够抑制CCL18和/或CCL20活性的任意其它化合物可以将CCL18和/或CCL20的活性抑制100％。
在另一优选实施方案中，本发明的分离的可溶性CCR6受体多肽不包含跨膜结构域。
本文所使用的术语“路膜结构域”根据其常规的且本领域公知的含义。跨膜结构域可以例如是蛋白质的这样的部分，其包含高百分比的非极性疏水氨基酸残基(如缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸或色氨酸)且使进入脂质双层膜的蛋白质分区。术语“高百分比的非极性疏水氨基酸残基”意指跨膜结构域中氨基酸的至少50％、优选至少60％、更优选至少70％、更优选至少80％、更优选至少90％、最优选至少95％或更多是非极性疏水氨基酸残基。
在另一方面，本发明涉及编码本发明的分离的可溶性CCR6受体多肽的分离的多核苷酸。
在一个优选实施方案中，本发明的分离的多核苷酸具有以下长度：少于9000个核苷酸、少于8000个核苷酸、少于7000个核苷酸、少于6000个核苷酸、少于5000个核苷酸、少于4000个核苷酸、少于3000个核苷酸、少于2000个核苷酸、少于1000个核苷酸、少于500个核苷酸或少于300个核苷酸。
在又一优选实施方案中，本发明的分离的多核苷酸具有以下长度：至少24个至9000个核苷酸，优选至少24个至8000个核苷酸，更优选至少24个至7000个核苷酸，更优选至少24个至6000个核苷酸，更优选至少24个至5000个核苷酸，更优选至少24个至4000个核苷酸，更优选至少24个至3000个核苷酸，更优选至少24个至2000个核苷酸，更优选至少24个至1000个核苷酸或者甚至更优选至少24个至500个核苷酸或者甚至更优选至少24个至300个核苷酸。在另一优选实施方案中，本发明的分离的多核苷酸具有以下长度：至少60个至9000个核苷酸，优选至少60个至8000个核苷酸，更优选至少60个至7000个核苷酸，更优选至少60个至6000个核苷酸，更优选至少60个至5000个核苷酸，更优选至少60个至4000个核苷酸，更优选至少60个至3000个核苷酸，更优选至少60个至2000个核苷酸，更优选至少60个至1000个核苷酸或者甚至更优选至少60个至500个核苷酸或者甚至更优选至少60个至300个核苷酸。在又一优选实施方案中，本发明的分离的多核苷酸具有以下长度：至少90个至9000个核苷酸，优选至少90个至8000个核苷酸，更优选至少90个至7000个核苷酸，更优选至少90个至6000个核苷酸，更优选至少90个至5000个核苷酸，更优选至少90个至4000个核苷酸，更优选至少90个至3000个核苷酸，更优选至少90个至2000个核苷酸，更优选至少90个至1000个核苷酸或者甚至更优选至少90个至500个核苷酸或者甚至更优选至少90个至300个核苷酸。在另一优选实施方案中，本发明的分离的多核苷酸具有以下长度：至少120个至9000个核苷酸，优选至少120个至8000个核苷酸，更优选至少120个至7000个核苷酸，更优选至少120个至6000个核苷酸，更优选至少120个至5000个核苷酸，更优选至少120个至4000个核苷酸，更优选至少120个至3000个核苷酸，更优选至少120个至2000个核苷酸，更优选至少120个至1000个核苷酸或者甚至更优选至少120个至500个核苷酸或者甚至更优选至少120个至300个核苷酸。在另一优选实施方案中，本发明的分离的多核苷酸具有以下长度：至少140个至9000个核苷酸，优选至少140个至8000个核苷酸，更优选至少140个至7000个核苷酸，更优选至少140个至6000个核苷酸，更优选至少140个至5000个核苷酸，更优选至少140个至4000个核苷酸，更优选至少140个至3000个核苷酸，更优选至少140个至2000个核苷酸，更优选至少140个至1000个核苷酸或者甚至更优选至少140个至500个核苷酸或者甚至更优选至少140个至300个核苷酸。
在另一优选实施方案中，本发明的分离的多核苷酸具有以下长度：至少24个核苷酸、至少50个核苷酸、至少60个核苷酸、至少70个核苷酸、至少80个核苷酸、至少90个核苷酸、至少100个核苷酸、至少200个核苷酸、至少500个核苷酸、至少800个核苷酸、至少1000个核苷酸、至少1500个核苷酸、至少2000个核苷酸、至少2500个核苷酸、至少3000个核苷酸或者至少3500个核苷酸。在一个特别优选的实施方案中，本发明的分离的多核苷酸具有以下长度：至少24个核苷酸、至少50个核苷酸、至少60个核苷酸、至少70个核苷酸、至少80个核苷酸、至少90个核苷酸、至少100个核苷酸、至少200个核苷酸。在一个特别优选的实施方案中，本发明的分离的多核苷酸具有至少140个核苷酸的长度。
在另一特别优选的实施方案中，本发明的分离的多核苷酸具有144个核苷酸的长度。
对本领域技术人员明显的是，由于遗传编码的简并性，本发明的给定多肽可以由不同核苷酸序列编码。
在一个优选实施方案中，本发明的分离的多核苷酸包含与根据SEQ IDNO.：8的序列显示至少80％同一性的序列或者由所述序列组成。
在又一优选实施方案中，本发明的分离的多核苷酸包含与根据SEQ IDNO.：8的序列显示至少85％、优选至少90％、更优选至少91％、甚至更优选至少92％、甚至更优选至少93％、甚至更优选至少94％、甚至更优选至少95％、甚至更优选至少96％、甚至更优选至少97％、甚至更优选至少98％或者甚至更优选至少99％同一性的序列或者由所述序列组成。在一个特别优选的实施方案中，本发明的多核苷酸包含与根据SEQ ID NO.：8的序列显示至少85％、优选至少90％、更优选至少95％或者甚至更优选至少98％同一性的序列或者由所述序列组成。
在一个特别优选的实施方案中，本发明的分离的多核苷酸包含与根据SEQ ID NO.：8的序列显示100％同一性的序列或者由所述序列组成。在另一特别优选的实施方案中，本发明的分离的多核苷酸包含根据SEQ IDNO.：8的序列或者由所述序列组成。
本发明的分离的多核苷酸可以是单链或双链的RNA分子或DNA分子。
在一些实施方案中，本发明的分离的多核苷酸可以被插入表达载体中。所述表达载体可以例如是原核表达载体或真核表达载体，如质粒、微小染色体、粘粒、噬菌体、逆转录病毒载体或者本领域技术人员已知的任意其它载体。本领域技术人员熟悉如何根据具体需要选择合适的载体。
因此，本发明还涉及包含本发明的多核苷酸的表达载体。
在又一方面，本发明涉及对来自对象的液体样品中可溶性CCR6受体多肽的浓度进行定量的方法，其中，所述方法包括以下步骤：
(a)在固体支持物上固定所述可溶性CCR6受体多肽的捕捉分子；
(b)添加来自所述对象的液体样品；
(c)任选地添加所述可溶性CCR6受体多肽的配体，其中所述配体是多肽，其包含与根据SEQ ID NO.：18、SEQ ID NO.：19、SEQ ID NO.：20或SEQ ID NO.：21的序列显示至少80％同一性的氨基酸序列或者由其组成。
(d)添加对根据(c)的配体特异的检测剂，其中检测包含标记；
(e)对来自根据(d)的检测剂的信号进行定量。
在前述方法的一个优选实施方案中，步骤(a)、(b)、(c)、(d)、(e)以所述顺序进行。该方法优选在体外进行。
本文所使用的术语“可溶性CCR6受体多肽”意指未嵌入或结合到细胞膜的CCR6受体多肽。因此，“可溶性CCR6受体多肽”应当与“膜结合CCR6受体”区分开。例如，在本发明的上下文中，认为在内源条件下溶解于对象的体液(如血清、血浆、支气管肺泡灌洗流体、胸膜腔积液、痰、唾液或尿)中并且不嵌入或结合到细胞膜的任何天然可溶性CCR6受体多肽是“可溶的”。
因此，在一个实例中，本发明前述方法的上下文中的“可溶性CCR6受体多肽”可以是天然可溶性CCR6受体多肽。在一个优选实施方案中，用针对CCR6N端胞外结构域的抗-CCR6抗体可以检测所述天然可溶性CCR6受体多肽。
在另一优选实施方案中，所述天然可溶性CCR6受体多肽包含选自以下的氨基酸序列或者由其组成：
(a)与根据SEQ ID NO.：1的序列显示至少80％同一性的氨基酸序列；和
(b)根据(a)的氨基酸序列的片段；
其中所述分离的可溶性CCR6受体多肽能够与CCL18和/或CCL20结合。
在一个优选实施方案中，根据(a)的氨基酸序列与根据SEQ ID NO.：1的序列显示至少85％、更优选至少90％、更优选至少95％或者甚至更优选至少98％的同一性。在一个特别优选的实施方案中，根据(a)的氨基酸序列与根据SEQ ID NO.：1的序列显示至少95％的同一性。在一个最优选的实施方案中，根据(a)的氨基酸序列与根据SEQ ID NO.：1的序列显示100％的同一性。
在另一特别优选的实施方案中，天然可溶性CCR6受体多肽包含根据根据SEQ ID NO.：1的氨基酸序列或者由其组成。
在另一实例中，在本发明前述方法上下文中的“可溶性CCR6受体多肽”还可以是这样的重组“可溶性CCR6受体多肽”，其已在体外产生并且在水性溶液(如生理水性溶液，优选血清、血浆、支气管肺泡灌洗流体、胸膜腔积液、痰、唾液或尿)中基本可溶。在一个优选实施方案中，可溶性CCR6受体多肽是本发明的分离的可溶性CCR6受体多肽。
优选地，本发明前述方法上下文中的“可溶性CCR6受体多肽”的至少50％、更优选至少60％、更优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％或者最优选至少90％可溶于水性溶液中，优选血清、血浆、支气管肺泡灌洗流体、胸膜腔积液、痰、唾液或尿中。在一个特别优选的实施方案中，本发明前述方法上下文中的“可溶性CCR6受体多肽”的至少75％可溶于水性溶液中，优选血清、血浆、支气管肺泡灌洗流体、胸膜腔积液、痰、唾液或尿中。为了确定“可溶性CCR6受体多肽”的溶解百分数，本领域技术人员可以例如对包含可溶性CCR6受体多肽的样品进行离心，然后测量上清液中所述多肽的量和样品中所述多肽的总量。然后可以将溶解百分数计算为上清液中CCR6受体多肽的量占离心前样品中CCR6受体多肽的总量的百分数。
在本发明前述方法的一个优选实施方案中，来自对象的液体样品选自血清、血浆、支气管肺泡灌洗流体、胸膜腔积液、痰、唾液和尿。在一个特别优选的实施方案中，来自对象的液体样品是血清。优选地，所述样品是从从中获取样品之对象的机体分离的。
在一个优选实施方案中，(a)中的所述捕捉分子和/或(d)中所述的检测剂是抗体或适配体。
“适配体(aptamer)”可以是DNA、RNA或肽适配体。多核苷酸适配体的长度优选为约10至约300个核苷酸。优选地，适配体的长度为约30至约100个核苷酸。最优选地，适配体的长度为约10至60个核苷酸。适配体可以通过本领域已知的任意方法(包括例如合成、重组和纯化方法)来制备。
优选地，所述抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。在一些实施方案中，抗体还可以选自抗体变体或片段，如单链抗体、双功能抗体(diabodies)、微小抗体(minibodies)、单链FV片段(sc(Fv))、sc(Fv)2抗体、Fab片段或F(ab’)2片段。
如果与样品中的任意其它化合物(即，非靶标)相比，捕捉分子或检测剂以更高的亲和力结合给定化合物(如可溶性CCR6受体多肽或可溶性CCR6受体多肽的配体)，则其对所述化合物特异。优选地，如果捕捉分子或检测剂只结合给定化合物而根本不结合非靶标，则其对所述化合物特异。(d)中的检测剂包含标记。可以使用可以与检测剂结合的任意合适标记。优选地，标记是可检测的或者催化产物可检测的酶促反应。
在一个优选实施方案中，标记共价地或非共价地与检测剂结合。可以与检测剂结合的标记的实例包括例如荧光染料如Cyanine染料(例如Cyanine3、Cyanine 5或Cyanine7)、Alexa Fluor染料(例如Alexa 594、Alexa 488或Alexa 532)、荧光素家族染料、R-藻红蛋白、德克萨斯红、罗丹明和异硫氰酸荧光素(FITC)。还可以用酶(如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或β-内酰胺酶)、放射性同位素(如3H、14C、32P、33P、35S或125I)、金属(如金)或用生物素来标记检测剂。在一个特别优选的实施方案中，标记是荧光标记。在另一实施方案中，标记还可以是包含上文所述标记的第二检测剂(secondary detecting agent)。优选地，第二检测剂能够特异地结合上述检测剂。在一个特别优选的实施方案中，第二检测剂是抗体。
在一个优选实施方案中，(d)中的检测剂对这样的多肽特异，所述多肽包含与根据SEQ ID NO.：18、SEQ ID NO.：19、SEQ ID NO.：20或SEQ IDNO.：21的序列显示至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列或者由其组成。在又一优选实施方案中，(d)中的检测剂对这样的多肽特异，所述多肽包含与根据SEQ ID NO.：18的序列显示至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列或者由其组成。在另一优选实施方案中，(d)中的检测剂对这样的多肽特异，所述多肽包含与根据SEQ ID NO.：19的序列显示至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列或者由其组成。在另一优选实施方案中，(d)中的检测剂对这样的多肽特异，所述多肽包含与根据SEQ ID NO.：20的序列显示至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列或者由其组成。在又一优选实施方案中，(d)中的检测剂对这样的多肽特异，所述多肽包含与根据SEQ ID NO.：21的序列显示至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列或者由其组成。
在一个最优选的实施方案中，(d)中的检测剂对这样的多肽特异，所述多肽包含与根据SEQ ID NO.：18的序列显示至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列或者由其组成。
优选地，(a)中的所述固体支持物是塑料或玻璃表面。为了允许捕捉分子固定在固体支持物上，在一些实施方案中，固体支持物可以预包被有选自以下的试剂：碳二亚胺(carbodiimines)、亚氨基酯或琥珀酰亚胺酯、乙磺酸、戊二醛和聚赖氨酸。
在一个优选实施方案中，在微量滴定板上进行本发明的前述方法。
在另一优选实施方案中，根据(c)的配体是多肽，所述多肽包含与根据SEQ ID NO.：18、SEQ ID NO.：19、SEQ ID NO.：20或SEQ ID NO.：21的序列显示至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列或者由其组成。在又一优选实施方案中，根据(c)的配体是多肽，所述多肽包含与根据SEQ ID NO.：18的序列显示至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列或者由其组成。在另一优选实施方案中，根据(c)的配体是多肽，所述多肽包含与根据SEQ IDNO.：19的序列显示至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列或者由其组成。在另一优选实施方案中，根据(c)的配体是多肽，所述多肽包含与根据SEQ ID NO.：20的序列显示至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列或者由其组成。在又一优选实施方案中，根据(c)的配体是多肽，所述多肽包含与根据SEQ ID NO.：21的序列显示至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列或者由其组成。
在一个特别优选的实施方案中，根据(c)的配体是多肽，所述多肽包含与根据SEQ ID NO.：18、SEQ ID NO.：19或SEQ ID NO.：20或SEQ IDNO.：21的序列显示95％、至少98％或100％同一性的氨基酸序列或者由其组成。在又一特别优选的实施方案中，根据(c)的配体是多肽，所述多肽包含与根据SEQ ID NO.：18的序列显示95％、至少98％或100％同一性的氨基酸序列或者由其组成。在另一特别优选的实施方案中，根据(c)的配体是多肽，所述多肽包含与根据SEQ ID NO.：19的序列显示95％、至少98％或100％同一性的氨基酸序列或者由其组成。在另一特别优选的实施方案中，根据(c)的配体是多肽，所述多肽包含与根据SEQ ID NO.：20的序列显示95％、至少98％或100％同一性的氨基酸序列或者由其组成。在另一特别优选的实施方案中，根据(c)的配体是多肽，所述多肽包含与根据SEQ ID NO.：21的序列显示95％、至少98％或100％同一性的氨基酸序列或者由其组成。
在又一特别优选的实施方案中，根据(c)的配体是多肽，所述多肽包含与根据SEQ ID NO.：18、SEQ ID NO.：19、SEQ ID NO.：20或SEQ ID NO.：21的序列显示至少95％同一性的氨基酸序列或者由其组成。
在另一特别优选的实施方案中，根据(c)的配体是多肽，所述多肽包含与根据SEQ ID NO.：18的序列显示至少95％同一性的氨基酸序列或者由其组成。在一个最优选的实施方案中，根据(c)的配体是多肽，所述多肽包含根据SEQ ID NO.：18的氨基酸序列或者由其组成。
本发明的前述方法可用于对来自对象的液体样品中可溶性CCR6受体多肽的总量或来自对象的液体样品中与CCL18、CCL20和/或β防御素结合的可溶性CCR6受体多肽的量进行定量。
如果要对液体样品中可溶性CCR6受体多肽的总量进行定量，则优选在步骤(c)中添加配体以用配体饱和存在于样品中的CCR6受体多肽。如果要对来自对象的液体样品中与CCL18、CCL20和/或β防御素结合的可溶性CCR6受体多肽的量进行定量，则优选在步骤(c)中不添加配体。则(d)中的检测剂将仅检测液体样品中结合配体的可溶性CCR6受体多肽。
对来自步骤(e)检测剂的信号进行定量的合适方法的选择将取决于检测剂标记的性质。对来自经标记检测剂的信号进行定量的合适方法在本领域是公知的。
例如，如果标记是酶(如碱性磷酸酶)，则可以添加被酶转化为有色产物的无色底物(如，对硝基苯基磷酸酯)。在添加所述底物之后，可以例如通过分光光度法测量通过酶而产生的有色产物的量。
在另一实例中，如果标记是荧光染料，则可以例如通过使用激光扫描仪来对荧光信号进行定量。
在又一方面，本发明还涉及在对象中检测和/或预测间质性肺病或癌症的方法，其中所述方法包括确定来自所述对象的样品中可溶性CCR6受体多肽的水平的步骤。
所述方法优选在体外进行。
本发明前述方法的上下文中的“可溶性CCR6受体多肽”优选为天然可溶性CCR6受体多肽。
在一个优选实施方案中，所述可溶性CCR6受体多肽包含选自以下的氨基酸序列或由其组成：
(a)与根据SEQ ID NO.：1的序列显示至少80％同一性的氨基酸序列；和
(b)根据(a)的氨基酸序列的片段；
其中，所述分离的可溶性CCR6受体多肽能够与CCL18和/或CCL20结合。
在一个优选实施方案中，根据(a)的氨基酸序列与根据SEQ ID NO.：1的序列显示至少85％、更优选至少90％、更优选至少95％或者甚至更优选至少98％的同一性。在一个特别优选的实施方案中，根据(a)的氨基酸序列与根据SEQ ID NO.：1的序列显示至少95％的同一性。在一个最优选的实施方案中，根据(a)的氨基酸序列与根据SEQ ID NO.：1的序列显示100％的同一性。
在另一特别优选的实施方案中，所述可溶性CCR6受体多肽包含根据SEQ ID NO.：1的氨基酸序列或者由其组成。
在又一优选实施方案中，所述可溶性CCR6受体多肽是无配体的可溶性CCR6受体多肽。在这样的上下文中，术语“无配体”意指可溶性CCR6受体多肽未与配体(如CCL18或CCL20)结合。
在一个实施方案中，可以通过使来自对象的样品与对CCR6特异的检测剂(优选地与对可溶性CCR6受体多肽特异的检测剂)接触来完成可溶性CCR6受体多肽水平的确定。如果与样品中的任意其它化合物(即非靶标)相比，检测剂以更高的亲和力与CCR6或可溶性CCR6受体多肽结合，则其对CCR6或可溶性CCR6受体多肽特异。优选地，如果检测剂只与CCR6或可溶性CCR6受体多肽结合并且根本不与非靶标结合，则其对CCR6或可溶性CCR6受体多肽特异。在一个优选实施方案中，对可溶性CCR6受体多肽特异的检测剂与CCR6的胞外结构域结合。在一个特别优选的实施方案中，对可溶性CCR6受体多肽特异的检测剂与根据SEQ IDNO.：1的序列结合。
用于检测可溶性CCR6受体多肽的优选的检测剂是抗体或适配体。优选地，所述抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。在一些实施方案中，所述检测剂还可以选自抗体变体或片段，如单链抗体、双功能抗体、微小抗体、单链Fv片段(sc(Fv))、sc(Fv)2抗体、Fab片段或F(ab’)2片段。在一个优选的实施方案中，可以使用对CCR6或可溶性CCR6受体多肽特异的市售抗体。
本文所述的抗体可以根据本领域技术人员已知的任意合适的方法生产。多克隆抗体可以例如通过用所选抗原免疫动物来生产，而具有确定特异性的单克隆抗体可以例如通过使用由
Figure BDA00002659247200281
和Milstein开发的杂交技术(
Figure BDA00002659247200282
和Milstein，1976，Eur.J.Immunol.，6：511-519)来生产。
在一个优选实施方案中，上文所述的检测剂可以包含可检测标记。可以使用能够与检测剂结合的任意合适标记。在一个优选实施方案中，可检测标记与检测剂共价或非共价结合。可以与检测剂相结合的标记的实例包括例如荧光染料如Cyanine染料(例如Cyanine3、Cyanine5或Cyanine7)、Alexa Fluor染料(例如Alexa 594、Alexa 488或Alexa 532)、荧光素家族染料、R-藻红蛋白、德克萨斯红、罗丹明和异硫氰酸荧光素(FITC)。还可以用酶(如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或β-内酰胺酶)、放射性同位素(如3H、14C、32P、33P、35S或125I)、金属(如金)或用生物素来标记检测剂。在另一优选实施方案中，还可以通过包含上述标记的第二检测剂来检测所述检测剂。
优选地，第二检测剂能够特异性地结合上述检测剂。在一个特别优选的实施方案中，第二检测剂是抗体。
可以通过本领域中已知的任意方法来完成来自对象的样品中可溶性CCR6受体多肽水平的确定。在一些实施方案中，可以例如使用免疫测定(如ELISA、Western印迹、免疫沉淀或放射性免疫测定)来检测来自对象的样品中可溶性CCR6受体多肽的水平。还可以通过使用对来自对象的液体样品中可溶性CCR6受体多肽的量进行定量的上述方法来检测来自对象的样品中的可溶性CCR6受体多肽的水平。
本文所使用的术语“检测间质性肺病”或“检测癌症”意指可以在对象中或来自对象的样品中鉴定间质性肺病或癌性疾病或病症的存在。优选地，之前未知所述对象各自患有间质性肺病或癌症。在一个优选实施方案中，怀疑对象患有间质性肺病或癌症。
为了在对象中检测间质性肺病和癌症，在一些实施方案中，可以在确定来自对象的样品中可溶性CCR6受体多肽的水平的同时测量或确定分别指示间质性肺病或癌症的其它化合物或因子的量。例如，可以在来自对象的同一样品或不同样品中检测间质性肺病的已知标志物(如血清标志物表面活性蛋白(SP)A和D)或已知的癌症标志物。其它合适的标志物对于本领域技术人员而言是已知的。
在一个优选实施方案中，上述方法还包括将来自对象的样品中确定的可溶性CCR6受体多肽的水平与对照中可溶性CCR6受体多肽的水平进行比较的步骤，其中与对照相比，来自对象的样品中确定的可溶性CCR6受体多肽的水平更低表明所述对象中存在间质性肺病或癌症。
在另一优选实施方案中，上述方法还包括将来自对象的样品中确定的无配体可溶性CCR6受体多肽的水平与对照中无配体可溶性CCR6受体多肽的水平进行比较的步骤，其中与对照相比，来自对象的样品中确定的无配体可溶性CCR6受体多肽的水平更低表明在对象中存在间质性肺病或癌症。在这种上下文中，术语“无配体”意指可溶性CCR6受体多肽未与配体(如CCL18或CCL20)结合。
为了确定来自对象的样品中总可溶性CCR6受体多肽的量或结合配体/无配体的可溶性CCR6受体多肽的量，本领域技术人员可以例如使用对来自对象的液体样品中可溶性CCR6受体多肽的量进行定量的上述方法。
在一个优选实施方案中，对照是来自健康对象的样品。在一个优选实施方案中，与对照相比，来自对象的样品中确定的可溶性CCR6受体多肽的水平更低表明对象中存在间质性肺病或癌症。优选地，与对照相比，来自对象的样品中确定的可溶性CCR6受体多肽的水平低至少2倍、优选至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍、至少100倍、至少500倍、至少1000倍或至少10000倍。最优选地，与对照相比，来自对象的样品中确定的可溶性CCR6受体的水平低至少2倍、至少3倍、至少10倍、至少50倍、至少100倍或至少1000倍。在一个优选实施方案中，可溶性CCR6受体多肽是无配体的可溶性受体多肽。
在另一优选实施方案中，所述对照还可以是得自已知患间质性肺病或癌症的对象(对照对象)(即，独立地诊断为患间质性肺病或癌症的对象)的样品，其中所述癌症优选为腺癌，最优选为肺的腺癌。在这种情况下，与对照相比，来自对象的样品中确定的可溶性CCR6受体多肽的水平更低表明与对照对象相比，从中获取样品之对象的间质性肺病或癌症进展程度更高。在一个优选实施方案中，可溶性CCR6受体多肽是无配体的可溶性CCR6受体多肽。
在本发明的上下文中，对照优选地分离自从中获取所述对照的对象的机体。
本文所使用的术语“预测间质性肺病或癌症”是指在例如某时间段(如治疗期间或治疗后)预测所诊断的或所检测的间质性肺病或癌症的时期(course)或结果。该术语还可以指确定从间质性肺病或癌症中存活或恢复的机会以及预测对象的预期存活时间。
例如，可以在给定时间点确定来自对象的样品中可溶性CCR6受体多肽的水平，并与在之后的时间点来自同一对象的样品中确定的可溶性CCR6受体多肽的相应水平进行比较，其中可溶性CCR6受体多肽水平的增加或降低表示疾病情况的改善或恶化。可以例如在有间质性肺病或癌症患者的医疗期间使用这样的方法。
因此，在一个优选实施方案中，本发明的前述方法还可以用于在体外监测间质性肺病或癌症的治疗效力。可以例如通过以下方法来监测间质性肺病或癌症的治疗效力：在从中获取样品的对象接受间质性肺病或癌症治疗期间检测在给定时间内获得的来自对象的不同样品中可溶性CCR6多肽的水平。从而在给定的时间内获得自对象的样品中可溶性CCR6多肽的水平的增加或降低可以指示治疗效力。在一个优选实施方案中，可溶性CCR6受体多肽是无配体的可溶性CCR6受体多肽。
在一个优选实施方案中，可以平行地确定对照中可溶性CCR6受体多肽的水平和来自对象的样品中可溶性CCR6受体多肽的水平。
在另一优选实施方案中，对照可以是预定值。这样的值可以例如基于之前的实验结果，所述实验确定来自健康对象或已知患间质性肺病或癌症之对象的一个或更多个样品中可溶性CCR6受体多肽的水平。在一些实施方案中，预定值可以得自数据库。
在一个优选实施方案中，可以将可溶性CCR6受体多肽的水平与多于一个对照进行比较，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100或多于100个对照。
优选地，用于本发明方法的来自对象的样品从对象的机体分离。所述样品优选为液体样品。在一个优选实施方案中，所述液体样品选自：血液、血清、血浆、支气管肺泡灌洗流体、胸膜腔积液、痰、唾液或尿。在一个特别优选的实施方案中，所述样品是血清。优选地，所述样品无细胞且无膜。为了从样品中去除细胞和细胞膜，本领域技术人员可以例如在确定可溶性CCR6受体多肽的水平之前进行离心。
在又一方面，本发明还涉及用于检测间质性肺病或癌症的诊断试剂盒，其包含对CCR6或可溶性CCR6受体多肽特异的检测剂。
在一个优选实施方案中，对可溶性CCR6受体多肽特异的检测剂特异性地结合CCR6的胞外结构域。在一个特别优选的实施方案中，对可溶性CCR6受体多肽特异的检测剂特异性结合根据SEQ ID NO.：1的序列。
在一个优选实施方案中，所述检测剂是抗体或适配体。
优选地，所述抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。在一些实施方案中，所述检测剂还可以选自抗体变体或片段，如单链抗体、双功能抗体、微小抗体、单链Fv片段(sc(Fv))、sc(Fv)2抗体、Fab片段或F(ab’)2片段。在一个优选实施方案中，可以使用对CCR6或可溶性CCR6受体多肽特异的市售抗体。
对CCR6或可溶性CCR6受体多肽特异的“适配体”可以是例如DNA、RNA或肽适配体。
多核苷酸适配体的长度优选为约10至约300个核苷酸。优选地，适配体的长度为约30至约100个核苷酸。最优选地，适配体的长度为约10至60个核苷酸。
适配体可以通过任意已知方法(包括合成、重组和纯化方法)来制备，并且可单独使用或者与对CCR6或可溶性CCR6受体多肽特异的其它适配体组合使用。
在一个优选实施方案中，在本发明上述方法的上下文中，可溶性CCR6受体多肽是无配体的可溶性CCR6受体多肽。
在上述方法的一个优选实施方案中，间质性肺病选自：原因已知的弥漫性实质性肺病(diffuse parenchymal lung disease)(优选胶原血管病或者环境或药物相关的弥漫性实质性肺病)、肉芽肿性弥漫性实质性肺病(优选结节病)和其它形式的弥漫性实质性肺病(优选淋巴管平滑肌瘤病(LAM)、肺部朗格汉斯氏细胞组织细胞增生/组织细胞增生X(HX)或嗜酸细胞性肺炎)。
在上述方法的另一优选实施方案中，所述间质性肺病是特发性间质性肺炎。
在上述方法的一个特别优选的实施方案中，所述间质性肺病选自：特发性肺纤维化、非特异性间质性肺炎、隐源性机化性肺炎、呼吸性细支气管炎相关间质性肺病(respiratory bronchiolitis-associated interstitial lungdisease)、脱屑性间质性肺炎(desquamative interstitial pneumonia)、急性间质性肺炎和淋巴细胞性间质性肺炎。最优选地，所述间质性肺病是特发性肺纤维化。
在上述方法的又一优选实施方案中，所述癌症选自：肺癌、乳腺癌(breast cancer)、胰腺癌、前列腺癌、成神经细胞瘤、黑色素瘤、脑癌、肾癌、膀胱癌、卵巢癌、血液癌症和结肠癌。
在上述方法的一个特别优选的实施方案中，所述癌症选自：腺癌(优选肺的腺癌)、胸膜间皮瘤(pleuramesothelioma)、结直肠癌、前列腺癌、乳癌(mamma carcinoma)、肾细胞癌、肝细胞癌、非霍奇金淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤。最优选地，所述癌症是腺癌，优选为肺的腺癌。
在又一方面，本发明还涉及药物组合物，其包含能抑制CCL18或CCL20的活性和/或表达的化合物。
本发明的药物组合物可以经口施用，例如以丸剂、片剂、涂层片剂(lacquered tablet)、糖包衣片剂、颗粒剂、硬和软明胶胶囊、含水、含醇或含油溶液剂、糖浆、乳剂或混悬剂的形式；或者经直肠，例如以栓剂的形式。施用还可以经肠胃外进行，例如以用于注射或输注的溶液的形式皮下、肌内或静脉内进行。另一些合适的施用形式是，例如经皮施用或局部施用(例如以油膏、酊剂、喷雾剂或透皮治疗系统的形式)或者以鼻喷雾剂或气雾剂混合物的形式吸入施用。
在一个优选实施方案中，本发明的药物组合物肠胃外(例如，以用于注射或输注的溶液的形式)、经口(例如，以片剂、丸剂、锭剂或胶囊的形式)或者通过吸入来施用。
对于丸剂、片剂、糖包衣片剂和硬明胶胶囊的生产，例如可以使用乳糖、淀粉(例如，玉米淀粉或淀粉衍生物)、滑石、硬脂酸或其盐等。软明胶胶囊和栓剂的载体是，例如脂肪、蜡、半固体和液体多元醇、天然或硬化油等。用于制备溶液剂(例如注射液)或乳剂或糖浆的合适的载体是，例如水、生理氯化钠溶液、醇(如乙醇)、甘油、多元醇、蔗糖、转化糖、葡萄糖、甘露醇、植物油等。
在一些实施方案中，所述药物组合物还包含添加剂，如填充剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、润湿剂、稳定剂、乳化剂、分散剂、防腐剂、甜味剂、着色剂、调味剂、芳香剂(aromatizer)、增稠剂、稀释剂、缓冲物质、溶剂、增溶剂、用于实现储库(depot)作用的试剂、用于改变渗透压的盐、包衣剂或抗氧化剂。
用于本文所述的多种不同药物组合物形式的合适的赋形剂的实例可例如见于A Wade和PJ Weller编的″Handbook of PharmaceuticalExcipients”，第2版，(1994)。
在一个优选实施方案中，能够抑制CCL18或CCL20的活性和/或表达的化合物选自：本发明的分离的可溶性CCR6受体多肽、能够与CCL18或CCL20结合的小分子、对CCL18或CCL20特异的适配体、对CCL18或CCL20特异的抗体、适于降低或抑制CCL18或CCL20表达的反义分子和适于降低或抑制CCL18或CCL20表达的siRNA分子。
本文所使用的术语“小分子”是指具有低分子量的小有机化合物。
小分子可以是在自然中未发现的合成化合物或者从自然资源(如细胞、植物、真菌、动物等)中分离的或者已知存在于自然资源(如细胞、植物、真菌、动物等)中的天然化合物。在本发明的上下文中，小分子优选具有以下分子量：小于5000道尔顿、更优选小于4000道尔顿、更优选小于3000道尔顿、更优选小于2000道尔顿或者甚至更优选小于1000道尔顿。在一个特别优选的实施方案中，在本发明的上下文中，小分子具有小于800道尔顿的分子量。
在另一优选实施方案中，在本发明的上下文中，小分子具有以下分子量：50至3000道尔顿、优选100至2000道尔顿、更优选100至1500道尔顿以及甚至更优选100至1000道尔顿。最优选地，在本发明的上下文中，小分子具有100至800道尔顿的分子量。
可以例如通过筛选小化合物文库来鉴定能够与CCL18或CCL20结合的小分子。
“适配体”可以是对CCL18或CCL20特异的DNA、RNA或肽适配体。
多核苷酸适配体的长度优选为约10至约300个核苷酸。优选地，适配体的长度为约30至约100个核苷酸。最优选地，适配体的长度为约10至60个核苷酸。
适配体可以通过任意已知方法(包括合成、重组和纯化方法)来制备，并且可以单独使用或者与对CCL18或CCL20特异的其它适配体组合使用。
对CCL18或CCL20特异的抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。在一些实施方案中，所述抗体还可以选自：抗体变体或片段，如单链抗体、双功能抗体、微小抗体、单链Fv片段(sc(Fv))、sc(Fv)2抗体、Fab片段或F(ab’)2片段，前提是所述抗体变体或片段对CCL18或CCL20特异。
术语“适于降低或抑制CCL18或CCL20表达的反义分子”是指分别与CCL18mRNA或CCL20mRNA互补的多核苷酸。优选所述反义分子适用于反义方法中以在细胞中抑制CCL18mRNA或CCL20mRNA的翻译。所述反义分子可以是DNA或RNA分子，并且可以是单链的或双链的。在一个优选实施方案中，反义分子是单链DNA分子或者双链或单链RNA分子。
反义分子优选地具有以下长度：约10至约500个核苷酸、约11至约200个核苷酸、约12至约100个核苷酸、约13至约75个核苷酸或者约14至约50个核苷酸、约15至约40个核苷酸、约16至约30个核苷酸或者约17至约25个核苷酸。
适于降低或抑制CCL18或CCL20表达的siRNA分子可以是单链或双链siRNA分子，其能够与CCL18mRNA或CCL20mRNA杂交从而诱导RNA干扰或者导致CCL18蛋白或CCL20蛋白表达下降或抑制的任意其它细胞内反义机制。
所述siRNA分子可以具有使siRNA分子诱导导致CCL18蛋白或CCL20蛋白表达降低或抑制之RNA干扰的任意序列。
优选地，siRNA分子具有以下长度：10至100、12至80、14至60、16至50、17至40，更优选18至30个核苷酸，最优选18至26个核苷酸。
与对照相比，能够或适于降低或抑制CCL18或CCL20表达的化合物可以将CCL18或CCL20的表达降低或抑制至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、更优选至少80％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。在一些优选实施方案中，能够或适于降低或抑制CCL18或CCL20表达的化合物可以将CCL18或CCL20的表达降低或抑制100％。
在另一优选实施方案中，本发明的药物组合物包含适于治疗或预防间质性肺病和/或癌症的其它活性化合物。
适于治疗间质性肺病的其它活性化合物的实例是，例如抗炎性药物如强的松或其它皮质类固醇、硫唑嘌呤，氨甲蝶呤，mycophenolate或环磷酰胺，抗氧化剂，如乙酰半胱氨酸抗纤维化剂如波生坦(bosentan)或吡非尼酮(pirfenidone)，米诺环素(minocycline)，西地那非(sildenafil)，酞咪哌啶酮(thalidomide)，抗TNF抗体，如英夫利西(Infliximab)，依那西普(etanercept)，干扰素γ，抗IL-13抗体，内皮素抑制剂，齐留通(Zileuton)，抗凝血剂，大环内酯类，磷酸二酯酶(PDE)4抑制剂，如罗氟司特(roflumilast)，阿肽地尔(Aviptadil)，α-黑素细胞刺激激素(α-MSH)，酪氨酸激酶抑制剂，如伊马替尼(imatinib)，达沙替尼(dasatinib)和尼罗替尼(nilotinib)。
适于治疗癌症的其它活性化合物优选为化学治疗剂。适于治疗癌症的化学治疗剂对本领域技术人员而言是公知的。化学治疗剂的实例是，例如替莫唑胺(temozolomide)、阿霉素(adriamycin)、亚德里亚霉素(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、5-氟尿嘧啶、胞嘧啶阿拉伯糖苷(“Ara-C”)、环磷酰胺、噻替派(thiotepa)、白消安(busulfan)、细胞毒素(cytoxin)、紫杉烷类如紫杉醇、多西紫杉醇(toxotere)、氨甲蝶呤(methotrexate)、顺铂、美法仑、长春碱、博来霉素(bleomycin)、依托泊苷(etoposide)、异环磷酰胺(ifosfamide)、丝裂霉素C、米托蒽醌(mitoxantrone)、长春新碱(vincristine)、长春瑞滨(vinorelbine)、卡铂、替尼泊苷(teniposide)、道诺霉素(daunomycin)、洋红霉素(carminomycin)、氨基喋呤、更生霉素(dactinomycin)、丝裂霉素、美法仑及其它相关氮芥和作用为调节或抑制对肿瘤的激素行为的激素剂，如它莫西芬(tamoxifen)和奥那司酮(onapristone)。
本发明的药物组合物可以包含一种或多于一种适于治疗或预防间质性肺病的其它活性化合物和/或一种或多于一种适于治疗或预防癌症的其它活性化合物。在一个优选实施方案中，本发明的药物组合物包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或多于10种适于治疗或预防间质性肺病的其它活性化合物和/或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或多于10种适于治疗癌症的其它活性化合物。
在另一优选实施方案中，可以对对象(优选人类对象)施用与包含能够抑制CCL18或CCL20的活性和/或表达之化合物的本发明药物组合物联合的一种或更多种分离组合物，其包含用于治疗或预防间质性肺病的活性化合物和/或适于治疗或预防癌症的活性化合物。
在一个优选实施方案中，所述间质性肺病选自：原因已知的弥漫性实质性肺病(优选胶原血管病或者环境或药物相关的弥漫性实质性肺病)、肉芽肿性弥漫性实质性肺病(优选结节病)和其它形式的弥漫性实质性肺病(优选淋巴管平滑肌瘤病(LAM)、肺部朗格汉斯氏细胞组织细胞增生/组织细胞增生X(HX)或嗜酸细胞性肺炎)。
在另一优选实施方案中，所述间质性肺病是特发性间质性肺炎。
在一个特别优选的实施方案中，所述间质性肺病选自：特发性肺纤维化、非特异性间质性肺炎、隐源性机化性肺炎、呼吸性细支气管炎相关间质性肺病、脱屑性间质性肺炎、急性间质性肺炎和淋巴细胞性间质性肺炎。最优选地，间质性肺病是特发性肺纤维化。
在另一优选实施方案中，所述癌症选自：肺癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、成神经细胞瘤、黑色素瘤、脑癌、肾癌、膀胱癌、卵巢癌、血液癌症和结肠癌。
在一个特别优选的实施方案中，所述癌症选自：腺癌(优选肺的腺癌)、胸膜间皮瘤、结直肠癌、前列腺癌、乳癌、肾细胞癌、肝细胞癌、非霍奇金淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤。最优选地，所述癌症是腺癌，优选为肺的腺癌。
本发明人出乎意料地发现本发明的分离的可溶性CCR6受体多肽适用于治疗用途。
因此，在又一方面，本发明涉及本发明的分离的可溶性CCR6受体多肽用于治疗中。
已发现数种疾病的特征在于CCL18或CCL20的血清水平升高，意指与健康对照的血清中CCL18或CCL20的水平相比，所述疾病患者的血清中CCL18或CCL20的水平升高。
因此，本发明还涉及本发明的分离的可溶性CCR6受体多肽或本发明的药物组合物用于治疗或预防特征为CCL18和/或CCL20血清水平升高的疾病。术语“CCL18和/或CCL20血清水平升高”意指与健康对照的血清中的CCL18和/或CCL20水平相比，所述疾病患者的血清中CCL18和/或CCL20的水平升高。
在另一方面，本发明还涉及本发明的分离的可溶性CCR6受体多肽或本发明的药物组合物用于治疗或预防选自以下的疾病：间质性肺病、癌症、戈谢病(Gaucher disease)、地中海贫血(优选β-地中海贫血)、类风湿性关节炎、腹膜后纤维化(奥蒙德病(Ormond′s disease))和/或慢性炎性皮肤病，优选为特应性皮炎或大疱性类疱疮。
在一个优选实施方案中，所述间质性肺病选自：原因已知的弥漫性实质性肺病(优选胶原血管病或者环境或药物相关的弥漫性实质性肺病)、肉芽肿性弥漫性实质性肺病(优选结节病)和其它形式的弥漫性实质性肺病(优选淋巴管平滑肌瘤病(LAM)、肺部朗格汉斯氏细胞组织细胞增生/组织细胞增生X(HX)或嗜酸细胞性肺炎)。
在另一优选实施方案中，所述间质性肺病是特发性间质性肺炎。
在一个特别优选的实施方案中，所述间质性肺病选自：特发性肺纤维化、非特异性间质性肺炎、隐源性机化性肺炎、呼吸性细支气管炎相关间质性肺病、脱屑性间质性肺炎、急性间质性肺炎和淋巴细胞性间质性肺炎。最优选地，所述间质性肺病是特发性肺纤维化。
在又一优选实施方案中，所述癌症选自：肺癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、成神经细胞瘤、黑色素瘤、脑癌、肾癌、膀胱癌、卵巢癌、血液癌症和结肠癌。
在一个特别优选的实施方案中，所述癌症选自：腺癌(优选为肺的腺癌)、胸膜间皮瘤、结直肠癌、前列腺癌、乳癌、肾细胞癌、肝细胞癌、非霍奇金淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤。最优选地，所述癌症是腺癌，优选为肺的腺癌。
在又一方面，本发明涉及本发明的分离的可溶性CCR6受体多肽或本发明的药物组合物用于治疗或预防间质性肺病和/或癌症。
本文所使用的术语“预防”是指对象对发生间质性肺病和/或癌症的倾向或风险的任何降低。
在另一方面，本发明涉及本发明的分离的可溶性CCR6受体多肽或本发明的药物组合物在制备用于治疗或预防间质性肺病和/或癌症的药物中的用途。
在另一方面，本发明还涉及对本发明的分离的可溶性CCR6受体多肽特异的检测剂。
在一个优选实施方案中，所述检测剂是抗体或适配体。
“适配体”可以是DNA、RNA或肽适配体。多核苷酸适配体的长度优选为约10至约300个核苷酸。优选地，适配体的长度为约30至约100个核苷酸。最优选地，适配体的长度为约10至60个核苷酸。适配体可以通过本领域中已知的任意方法(包括例如合成、重组和纯化方法)来制备。
优选地，所述抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。在一些实施方案中，所述检测剂还可以选自抗体变体或片段，如单链抗体、双功能抗体、微小抗体、单链Fv片段(sc(Fv))、sc(Fv)2抗体、Fab片段或F(ab’)2片段。所述检测剂优选地包含可检测标记。在上文中已描述了合适的标记。
如果与样品中的任意其它化合物(即，非靶标)相比，检测剂以更高的亲和力与本发明的分离的可溶性CCR6受体多肽结合，则其对本发明的可溶性CCR6受体多肽特异。优选地，如果检测剂只结合本发明的分离可溶性CCR6受体多肽而根本不结合非靶标，则其对本发明的分离的可溶性CCR6受体多肽特异。
在一个优选实施方案中，所述间质性肺病选自原因已知的弥漫性实质性肺病(优选胶原血管病或者环境或药物相关的弥漫性实质性肺病)、肉芽肿性弥漫性实质性肺病(优选结节病)和其它形式的弥漫性实质性肺病(优选淋巴管平滑肌瘤病(LAM)、肺部朗格汉斯氏细胞组织细胞增生/组织细胞增生X(HX)或嗜酸细胞性肺炎)。
在另一优选实施方案中，所述间质性肺病是特发性间质性肺炎。
在一个特别优选的实施方案中，所述间质性肺病选自：特发性肺纤维化、非特异性间质性肺炎、隐源性机化性肺炎、呼吸性细支气管炎相关间质性肺病、脱屑性间质性肺炎、急性间质性肺炎和淋巴细胞性间质性肺炎。最优选地，所述间质性肺病是特发性肺纤维化。
在又一优选实施方案中，所述癌症选自：肺癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、成神经细胞瘤、黑色素瘤、脑癌、肾癌、膀胱癌、卵巢癌、血液癌症和结肠癌。
在一个特别优选的实施方案中，所述癌症选自：腺癌(优选肺的腺癌)、胸膜间皮瘤、结直肠癌、前列腺癌、乳癌、肾细胞癌、肝细胞癌、非霍奇金淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤。最优选地，所述癌症是腺癌，优选为肺的腺癌。
在又一方面，本发明还涉及对本发明的CCR6受体或分离的可溶性CCR6受体多肽特异的检测剂，其用于在来自对象的样品中检测间质性肺病或癌症。
在一个优选实施方案中，所述间质性肺病选自：原因已知的弥漫性实质性肺病(优选胶原血管病或者环境或药物相关的弥漫性实质性肺病)、肉芽肿性弥漫性实质性肺病(优选结节病)和其它形式的弥漫性实质性肺病(优选淋巴管平滑肌瘤病(LAM)、肺部朗格汉斯氏细胞组织细胞增生/组织细胞增生X(HX)或嗜酸细胞性肺炎)。
在另一优选实施方案中，所述间质性肺病是特发性间质性肺炎。
在一个特别优选的实施方案中，所述间质性肺病选自：特发性肺纤维化、非特异性间质性肺炎、隐源性机化性肺炎、呼吸性细支气管炎相关间质性肺病、脱屑性间质性肺炎、急性间质性肺炎和淋巴细胞性间质性肺炎。最优选地，所述间质性肺病是特发性肺纤维化。
在又一优选实施方案中，所述癌症选自：肺癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、成神经细胞瘤、黑色素瘤、脑癌、肾癌、膀胱癌、卵巢癌、血液癌症和结肠癌。
在一个特别优选的实施方案中，所述癌症选自：腺癌(优选肺的腺癌)、胸膜间皮瘤、结直肠癌、前列腺癌、乳癌、肾细胞癌、肝细胞癌、非霍奇金淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤。最优选地，所述癌症是腺癌，优选为肺的腺癌。
在另一优选实施方案中，所述检测剂是抗体或适配体。
“适配体”可以是DNA、RNA或肽适配体。多核苷酸适配体的长度优选为约10至约300个核苷酸。优选地，适配体的长度为约30至约100个核苷酸。最优选地，适配体的长度为约10至60个核苷酸。适配体可以通过本领域已知的任意方法(包括例如合成、重组和纯化方法)来制备。
优选地，所述抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。在一些实施方案中，所述检测剂还可以选自抗体变体或片段，如单链抗体、双功能抗体、微小抗体、单链Fv片段(sc(Fv))、sc(Fv)2抗体、Fab片段或F(ab’)2片段。所述检测剂优选包含可检测标记。在上文中已描述了合适的标记。
如果与样品中的任意其它化合物(即，非靶标)相比，检测剂以更高的亲和力结合本发明的CCR6受体或分离的可溶性CCR6受体多肽，则其对本发明的CCR6受体或分离的可溶性CCR6受体多肽特异。优选地，如果检测剂只结合本发明的CCR6受体或分离的可溶性CCR6受体多肽而根本不结合非靶标，则其对本发明的CCR6受体或分离的可溶性CCR6受体多肽特异。
在这种上下文中，来自对象的样品可以是液体样品或固体样品。在一个优选实施方案中，来自对象的样品选自：血清、血浆、支气管肺泡灌洗流体、胸膜腔积液、痰、唾液和尿。在一个特别优选的实施方案中，来自对象的液体样品是血清。在另一优选实施方案中，来自对象的样品是组织样品，优选为肺组织样品。组织样品可以是，例如新鲜的或冷冻的组织样品或固定的石蜡包埋样品。在一个优选实施方案中，样品可以是活检样品或切除术样品(resection sample)。在又一优选实施方案中，样品是支气管刷拭样品(bronchial brushing sample)。
在本发明的方法、本发明的分离的可溶性CCR6受体多肽、本发明的诊断试剂盒、本发明的药物组合物、本发明的用途和/或本发明的检测剂的一个优选实施方案中，所述间质性肺病选自：原因已知的弥漫性实质性肺病(优选胶原血管病或者环境或药物相关的弥漫性实质性肺病)、肉芽肿性弥漫性实质性肺病(优选结节病)和其它形式的弥漫性实质性肺病(优选淋巴管平滑肌瘤病(LAM)、肺部朗格汉斯氏细胞组织细胞增生/组织细胞增生X(HX)或嗜酸细胞性肺炎)。
在本发明的方法、本发明的分离的可溶性CCR6受体多肽、本发明的诊断试剂盒、本发明的药物组合物、本发明的用途和/或本发明的检测剂的一个特别优选的实施方案中，所述间质性肺病是特发性间质性肺炎。
在本发明的方法、本发明的分离的可溶性CCR6受体多肽、本发明的诊断试剂盒、本发明的药物组合物、本发明的用途和/或本发明的检测剂的又一优选的实施方案中，所述间质性肺病选自：特发性肺纤维化、非特异性间质性肺炎、隐源性机化性肺炎、呼吸性细支气管炎相关间质性肺病、脱屑性间质性肺炎、急性间质性肺炎和淋巴细胞性间质性肺炎。
在本发明的方法、本发明的分离的可溶性CCR6受体多肽、本发明的诊断试剂盒、本发明的药物组合物、本发明的用途和/或本发明的检测剂的一个特别优选的实施方案中，所述间质性肺病是特发性肺纤维化。对于间质性肺病分类的概述，本领域技术人员可以例如参考American ThoracicSociety/European Respiratory Society International MultidisciplinaryConsensus Classification of the Idiopathic Interstitial Pneumonias，American Thoracic Society；European Respiratory Society，Am J RespirCrit Care Med.2002年1月15日；165(2)：277-304。
在一些实施方案中，所述间质性肺病可以是由选自以下的病症引起的：硬皮性肺病、结节病、过敏性肺炎、类风湿性关节炎、红斑狼疮和石棉沉着病。
在本发明的方法、本发明的分离的可溶性CCR6受体多肽、本发明的诊断试剂盒、本发明的药物组合物、本发明的用途和/或本发明的检测剂的另一优选实施方案中，所述癌症选自：肺癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、成神经细胞瘤、黑色素瘤、脑癌、肾癌、膀胱癌、卵巢癌、血液癌症和结肠癌。
在本发明的方法、本发明的分离的可溶性CCR6受体多肽、本发明的诊断试剂盒、本发明的药物组合物、本发明的用途和/或本发明的检测剂的又一优选实施方案中，所述癌症选自：腺癌(优选为肺的腺癌)、胸膜间皮瘤、结直肠癌、前列腺癌、乳癌、肾细胞癌、肝细胞癌、非霍奇金淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤。
在本发明的方法、本发明的分离的可溶性CCR6受体多肽、本发明的诊断试剂盒、本发明的药物组合物、本发明的用途和/或本发明的检测剂的一个特别优选实施方案中，所述癌症是肺癌，最优选为肺的腺癌或胸膜间皮瘤。在一个最优选的实施方案中，所述癌症是肺的腺癌。
本发明人还出乎意料地发现CCR6受体活性的抑制剂可用于治疗间质性肺病或癌症。
因此，在又一方面，本发明涉及分离的多肽，其包含选自以下的氨基酸序列或由其组成：
(a)与根据SEQ ID NO.：9、22或23的序列显示至少80％、优选至少85％、更优选至少90％、甚至更优选至少95％以及最优选100％同一性的氨基酸序列；和
(b)根据(a)的氨基酸序列的片段。
其中，所述分离的多肽能够与CCR6受体结合并抑制其活性。
优选地，所述CCR6受体是人CCR6受体。在一个优选实施方案中，所述CCR6受体是由根据SEQ ID NO.：3或SEQ ID NO.：4的序列编码的多肽。在另一优选实施方案中，所述CCR6受体是根据SEQ ID NO.：27的多肽。
在一个优选实施方案中，根据(a)的氨基酸序列与根据SEQ ID NO.：9、SEQ ID NO.：22或SEQ ID NO.：23的序列显示至少91％、甚至更优选至少92％、甚至更优选至少93％、甚至更优选至少94％、甚至更优选至少95％、甚至更优选至少96％、甚至更优选至少97％、甚至更优选至少98％或者甚至更优选至少99％的同一性。在一个最优选的实施方案中，根据(a)的氨基酸序列与根据SEQ ID NO.：9、SEQ ID NO.：22或SEQ ID NO.：23的序列显示的序列显示100％的同一性。
在另一优选实施方案中，根据(a)的氨基酸序列与根据SEQ ID NO.：9的序列显示至少91％、甚至更优选至少92％、甚至更优选至少93％、甚至更优选至少94％、甚至更优选至少95％、甚至更优选至少96％、甚至更优选至少97％、甚至更优选至少98％或者甚至更优选至少99％的同一性。在又一优选实施方案中，根据(a)的氨基酸序列是根据SEQ ID NO.：9的氨基酸序列。
在又一优选实施方案中，根据(a)的氨基酸序列与根据SEQ ID NO.：22的序列显示至少91％、甚至更优选至少92％、甚至更优选至少93％、甚至更优选至少94％、甚至更优选至少95％、甚至更优选至少96％、甚至更优选至少97％、甚至更优选至少98％或者甚至更优选至少99％的同一性。在又一优选实施方案中，根据(a)的氨基酸序列是根据SEQ ID NO.：22的氨基酸序列。
在另一优选实施方案中，根据(a)的氨基酸序列与根据SEQ ID NO.：23的序列显示至少91％、甚至更优选至少92％、甚至更优选至少93％、甚至更优选至少94％、甚至更优选至少95％、甚至更优选至少96％、甚至更优选至少97％、甚至更优选至少98％或者甚至更优选至少99％的同一性。在又一优选实施方案中，根据(a)的氨基酸序列是根据SEQ ID NO.：23的氨基酸序列。
在一些优选实施方案中，根据(a)的氨基酸序列可以与根据SEQ IDNO.：9和SEQ ID NO.：22的序列显示至少80％、优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少91％、更优选至少92％、更优选至少93％、更优选至少94％、更优选至少95％、更优选至少96％、更优选至少97％、更优选至少98％或者甚至更优选至少99％的同一性。
在另一优选实施方案中，在根据(a)的氨基酸序列中，根据SEQ IDNO：9、SEQ ID NO.：22或SEQ ID NO.：23的序列的不多于1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸被改变(即，缺失、插入、修饰和/或被其它氨基酸替换)。
在又一优选实施方案中，在根据(a)的氨基酸序列中，根据SEQ IDNO：9的序列的不多于1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸被改变(即，缺失、插入、修饰和/或被其它氨基酸替换)。在另一优选实施方案中，在根据(a)的氨基酸序列中，根据SEQ ID NO.：22的序列的不多于1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸被改变(即，缺失、插入、修饰和/或被其它氨基酸替换)。在另一优选实施方案中，在根据(a)的氨基酸序列中，根据SEQ ID NO.：23的序列的不多于1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸被改变(即，缺失、插入、修饰和/或替换)。
本发明前述分离的多肽的氨基酸也可以被修饰，例如化学修饰。例如，蛋白质氨基酸的侧链或游离的氨基端或羧基端可以通过例如糖基化、酰胺化、磷酸化、泛素化等被修饰。
在一个优选实施方案中，根据(a)的氨基酸序列包含根据SEQ IDNO.：9、22或23的序列的至少8个连续氨基酸。因此，在一个优选实施方案中，根据(a)的氨基酸序列与根据SEQ ID NO.：9、22或23的序列显示至少80％、优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少91％、更优选至少92％、更优选至少93％、更优选至少94％、更优选至少95％、更优选至少96％、更优选至少97％、更优选至少98％、甚至更优选至少99％或最优选100％的同一性，并且包含根据SEQ ID NO.：9、22或23的序列的至少8个连续氨基酸。在另一优选实施方案中，根据(a)的氨基酸序列与根据SEQ ID NO.：9的序列显示至少80％、优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少91％、更优选至少92％、更优选至少93％、更优选至少94％、更优选至少95％、更优选至少96％、更优选至少97％、更优选至少98％、甚至更优选至少99％或最优选100％的同一性，并且包含根据SEQ IDNO.：9的序列的至少8个或至少15个连续氨基酸。在又一优选实施方案中，根据(a)的氨基酸序列与根据SEQ ID NO.：22的序列显示至少80％、优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少91％、更优选至少92％、更优选至少93％、更优选至少94％、更优选至少95％、更优选至少96％、更优选至少97％、更优选至少98％、甚至更优选至少99％或最优选100％的同一性，并且包含根据SEQ ID NO.22的序列的至少8个或至少15个连续氨基酸。在另一优选实施方案中，根据(a)的氨基酸序列与根据SEQ IDNO.：23的序列显示至少80％、优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少91％、更优选至少92％、更优选至少93％、更优选至少94％、更优选至少95％、更优选至少96％、更优选至少97％、更优选至少98％、甚至更优选至少99％或最优选100％的同一性，并且包含根据SEQ ID NO.23的序列的至少8个或至少15个连续氨基酸。在另一优选实施方案中，根据(a)的氨基酸序列与根据SEQ ID NO.：9、22或23的序列显示至少95％、98％或100％的同一性，并且包含根据SEQ ID NO.：9、22或23的序列的至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20个连续氨基酸。在一个更优选的实施方案中，根据(a)的氨基酸序列与根据SEQ ID NO.：9，22或23的序列显示至少95％、98％或100％的同一性，并且包含根据SEQ ID NO.：9，22或23的序列的至少8个或至少15个连续氨基酸。
在又一优选实施方案中，根据(a)的氨基酸序列与根据SEQ ID NO.：9的序列显示至少95％、98％或100％的同一性，并且包含根据SEQ ID NO.：9的序列的至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20个连续氨基酸。
在另一优选实施方案中，根据(a)的氨基酸序列与根据SEQ ID NO.：22的序列显示至少95％、98％或100％同一性，并且包含根据SEQ ID NO.：22的序列的至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20个连续氨基酸。
在又一优选实施方案中，根据(a)的氨基酸序列与根据SEQ ID NO.：23的序列显示至少95％、98％或100％的同一性，并且包含根据SEQ IDNO.：23的序列的至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20个连续氨基酸。
在一个优选实施方案中，本发明的分离的多肽具有以下长度：少于3000个氨基酸，优选少于2000个氨基酸，更优选少于1000个氨基酸，更优选少于500个氨基酸，更优选少于300个氨基酸，更优选少于200个氨基酸，更优选少于100个氨基酸或者最优选少于50个氨基酸。
在又一优选实施方案中，本发明的分离的多肽具有以下长度：至少8个至至少3000个氨基酸，优选至少8个至至少2000个氨基酸，更优选至少8个至至少1000个氨基酸，更优选至少8个至500个氨基酸，更优选至少8个至300个氨基酸，更优选至少8个至200个氨基酸，甚至更优选至少8个至100个氨基酸或者至少8个至50个氨基酸。
最优选地，本发明的分离的多肽具有至少8个、至少29个或至少31个氨基酸的长度。
在另一优选实施方案中，根据(a)的分离的多肽具有以下长度：至少29个至3000个氨基酸，优选至少29个至2000个氨基酸，更优选至少29个至1000个氨基酸，至少29个至500个氨基酸，至少29个至300个氨基酸，至少29个至200个氨基酸，至少29个至100个氨基酸或者至少29个至50个氨基酸。
在又一优选实施方案中，根据(a)的分离的多肽具有以下长度：至少31个至3000个氨基酸，优选至少31个至2000个氨基酸，更优选至少31个至1000个氨基酸，至少31个至500个氨基酸，至少31个至300个氨基酸，至少31个至200个氨基酸，至少31个至100个氨基酸或者至少31个至50个氨基酸。
片段通常是其涉及的氨基酸序列的一部分。
在一个优选实施方案中，根据(b)的片段的长度为：至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27或者至少28个氨基酸。在一个优选实施方案中，根据(b)的片段具有至少10、至少15或至少或者至少20个氨基酸的长度。在一个最优选的实施方案中，根据(b)的片段具有15个氨基酸的长度。
在另一特别优选的实施方案中，本发明的分离的多肽包含根据SEQ IDNO.：9、SEQ ID NO.：22或SEQ ID NO.：23的氨基酸序列或者由所述氨基酸序列组成，其中所述多肽能够与CCR6受体相结合并抑制其活性。最优选地，本发明上述分离的多肽包含根据SEQ ID NO.：9的氨基酸序列或者由所述氨基酸序列组成，其中所述多肽能够与CCR6受体相结合并抑制其活性。
本发明的多肽是否能够与CCR6受体相结合可以通过技术人员已知的任意合适的方法来确定。例如，本领域技术人员可以通过使用酵母双杂交测定或者生物化学测定如下拉测定、免疫共沉淀测定、酶联免疫吸附测定(ELISA)、定量放射性配体结合测定、基于荧光活化细胞分选(FACS)的测定、等离子体共振测定或者本领域技术人员已知的任意其它方法来确定多肽是否能够与CCR6受体相结合。当使用下拉测定或等离子体共振测定时，有用的是将至少一种蛋白质与亲和标签(如HIS-标签、GST-标签或生物化学领域公知的其它标签)相融合。
本文所使用的术语“抑制CCR6受体的活性”意指CCR6受体的活性被下调或者消除和/或CCR6受体的活化被抑制。
例如，在一个实施方案中，本发明的分离的多肽或者本文所述的能够抑制CCR6受体的活性和/或表达的任意其它化合物可以在空间上阻止CCR6受体，使得CCR6受体激动剂(例如CCL18或CCL20)不能活化该受体。因此，CCR6受体活性的抑制可以是例如由于与CCR6受体结合但其本身不介导信号转导事件的多肽或任意其它化合物抑制CCR6受体与其配体之一(即，CCL18或CCL20)之间的相互作用。
在另一实施方案中，本发明的分离的多肽或者能够抑制CCR6受体的活性和/或表达的任意其它化合物可以下调或消除现有的CCR6受体活性。
可以例如通过测量CCR6的细胞表面表达(如下文的实施例6和图13及14中所述的)来确定本发明的分离的多肽或待测试的任意其它化合物是否能够抑制CCR6受体的活性，其中与对照(例如，只存在CCR6受体激动剂)相比，在存在CCR6受体激动剂(如CCL18)和分离的多肽或待测试的其它化合物的条件下，CCR6受体内化的抑制表明分离的多肽或其它化合物能够抑制CCR6受体的活性。
在另一实例中，本领域技术人员还可以通过以下方法来确定本发明的分离的多肽或待测试的任意其它化合物抑制CCR6受体活性的能力：在存在CCR6受体激动剂(如CCL18或CCL20)以及存在或不存在分离的多肽或待测试的其它化合物的条件下孵育表达CCR6的细胞，然后裂解细胞并通过Western印迹分析来分析CCR6信号转导的下游分子ERK的磷酸化。在该实例中，与不存在分离的多肽或待测试的其它化合物的条件下ERK磷酸化的水平相比，存在多肽或待测试的其它化合物的条件下ERK磷酸化水平更低表明多肽或其它化合物能够抑制CCR6受体的活性。用于通过Western印迹分析确定ERK磷酸化的一种方法例如描述于Lin等.JProteome Res.2010 Jan；9(1)：283-97中。在一个类似实例中，可以分析其它CCR6受体下游效应因子(如Akt、SAPK/JNK激酶、磷脂酰肌醇3-激酶或磷脂酶C)以确定本发明的分离的多肽或者待测试的任意其它化合物是否能抑制CCR6受体的活性。
还可以例如通过在存在本发明的分离的多肽或待测试的任意其它化合物(例如下文的实施例4和图4及图5中所述)的条件下测量CCL18刺激的FGF2释放或CCL18介导的胶原和/或α-SMA的诱导来确定所述多肽或其它化合物是否能够抑制CCR6受体的活性。在该实例中，与其中未添加多肽或其它化合物的对照相比，在存在多肽或待测试的其它化合物的条件下，CCL18诱导的FGF2上调的抑制和/或CCL18介导的胶原和/或α-SMA表达诱导的抑制表明分离的多肽或其它化合物能够抑制CCR6受体的活性。此外，为了确定本发明的分离的多肽或者待测试的任意其它化合物抑制CCR6受体活性的能力，本领域技术人员还可以确定由CCL18引起的上皮间充质转化(EMT)的诱导是否被下调或消除。
作为替代地或另外地，还可以使用适于确定CCR6受体活性并且于本领域中存在且为本领域普通技术人员已知的任意其它方法。
与对照相比，本发明的分离的多肽或者能够抑制CCR6受体活性的任意其它化合物可以将CCR6受体的活性抑制至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、更优选至少80％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。在一些优选实施方案中，能够抑制CCR6受体活性的本发明多肽或本文所述的任意其它化合物可以将CCR6受体的活性抑制100％。
在另一方面，本发明涉及编码本发明的分离的多肽的分离的多核苷酸。
在一个优选实施方案中，本发明的分离的多核苷酸具有以下长度：少于6000个核苷酸、少于5000个核苷酸、少于4000个核苷酸、少于3000个核苷酸、少于2000个核苷酸、少于1000个核苷酸或少于500个核苷酸。
在又一优选实施方案中，本发明的分离的多核苷酸具有以下长度：至少24个至9000个核苷酸，优选至少24个至8000个核苷酸，更优选至少24个至7000个核苷酸，更优选至少24个至6000个核苷酸，更优选至少24个至5000个核苷酸，更优选至少24个至4000个核苷酸，更优选至少24个至3000个核苷酸，更优选至少24个至2000个核苷酸，更优选至少24个至1000个核苷酸或者甚至更优选至少24个至500个核苷酸。在另一优选实施方案中，本发明的分离的多核苷酸具有至少24个、至少87个或至少93个核苷酸的长度。
在另一优选实施方案中，本发明的分离的多核苷酸具有以下长度：至少87个至9000个核苷酸，优选至少87个至8000个核苷酸，更优选至少87个至7000个核苷酸，更优选至少87个至6000个核苷酸，更优选至少87个至5000个核苷酸，更优选至少87个至4000个核苷酸，更优选至少87个至3000个核苷酸，更优选至少87个至2000个核苷酸，更优选至少87个至1000个核苷酸或者甚至更优选至少87个至500个核苷酸。
在另一优选实施方案中，本发明的分离的多核苷酸具有以下长度：至少87个核苷酸、至少100个核苷酸、至少200个核苷酸、至少500个核苷酸、至少800个核苷酸、至少1000个核苷酸、至少1500个核苷酸、至少2000个核苷酸、至少2500个核苷酸、至少3000个核苷酸或者至少3500个核苷酸。在一个特别优选的实施方案中，本发明的分离的多核苷酸具有至少87个核苷酸或者至少100个核苷酸的长度。
在另一优选实施方案中，本发明的分离的多核苷酸具有以下长度：至少93个至9000个核苷酸，优选至少93个至8000个核苷酸，更优选至少93个至7000个核苷酸，更优选至少93个至6000个核苷酸，更优选至少93个至5000个核苷酸，更优选至少93个至4000个核苷酸，更优选至少93个至3000个核苷酸，更优选至少93个至2000个核苷酸，更优选至少93个至1000个核苷酸或者甚至更优选至少93个至500个核苷酸。
在另一优选实施方案中，本发明的分离的多核苷酸具有以下长度：至少24个核苷酸、至少50个核苷酸、至少87个核苷酸、至少93个核苷酸、至少100个核苷酸、至少200个核苷酸、至少500个核苷酸、至少800个核苷酸、至少1000个核苷酸、至少1500个核苷酸、至少2000个核苷酸、至少2500个核苷酸、至少3000个核苷酸或者至少3500个核苷酸。在一个特别优选的实施方案中，本发明的分离的多核苷酸具有至少24个、至少87或者至少93个核苷酸的长度。
对本领域技术人员明显的是，由于遗传编码的简并性，本发明的给定多肽可以由不同核苷酸序列编码。
在一个优选实施方案中，本发明的分离的多核苷酸包含与根据SEQ IDNO.：24、SEQ ID NO.：25或SEQ ID NO.：26的序列显示至少80％同一性的序列或者由所述序列组成。
在又一优选实施方案中，本发明的多核苷酸包含与根据SEQ ID NO.：24、SEQ ID NO.：25或SEQ ID NO.：26的序列显示至少85％、优选至少90％、更优选至少91％、甚至更优选至少92％、甚至更优选至少93％、甚至更优选至少94％、甚至更优选至少95％、甚至更优选至少96％、甚至更优选至少97％、甚至更优选至少98％或者甚至更优选至少99％同一性的序列或者由所述序列组成。在一个特别优选的实施方案中，本发明的多核苷酸包含与根据SEQ ID NO.：24、SEQ ID NO.：25或SEQ ID NO.：26的序列显示至少85％、优选至少90％、更优选至少95％或者甚至更优选至少98％的同一性的序列或者由所述序列组成。
在另一优选实施方案中，本发明的多核苷酸包含与根据SEQ ID NO.：24的序列显示至少80％、至少85％、优选至少90％、更优选至少91％、甚至更优选至少92％、甚至更优选至少93％、甚至更优选至少94％、甚至更优选至少95％、甚至更优选至少96％、甚至更优选至少97％、甚至更优选至少98％或者甚至更优选至少99％同一性的序列或者由所述序列组成。在另一优选实施方案中，本发明的多核苷酸包含与根据SEQ IDNO.：25的序列显示至少80％、至少85％、优选至少90％、更优选至少91％、甚至更优选至少92％、甚至更优选至少93％、甚至更优选至少94％、甚至更优选至少95％、甚至更优选至少96％、甚至更优选至少97％、甚至更优选至少98％或者甚至更优选至少99％同一性的序列或者由所述序列组成。在又一优选实施方案中，本发明的多核苷酸包含与根据SEQ IDNO.：26的序列显示至少80％、至少85％、优选至少90％、更优选至少91％、甚至更优选至少92％、甚至更优选至少93％、甚至更优选至少94％、甚至更优选至少95％、甚至更优选至少96％、甚至更优选至少97％、甚至更优选至少98％或者甚至更优选至少99％同一性的序列或者由所述序列组成。
在一个特别优选的实施方案中，本发明的分离的多核苷酸包含与根据SEQ ID NO.：24、SEQ ID NO.：25或SEQ ID NO.：26的序列显示100％同一性的序列或者由所述序列组成。在另一特别优选的实施方案中，本发明的分离的多核苷酸包含与根据SEQ ID NO.：24、SEQ ID NO.：25或SEQID NO.：26的序列或者由所述序列组成。
本发明的分离的多核苷酸可以是单链的或双链的RNA或DNA分子。
在一些实施方案中，本发明的分离的多核苷酸可以被插入表达载体中。表达载体可以是原核表达载体或真核表达载体，如质粒、微小染色体、粘粒、噬菌体、逆转录病毒载体或者本领域技术人员已知的任意其它载体。本领域技术人员熟悉如何根据具体需要选择合适的载体。
因此，本发明还涉及包含本发明的多核苷酸的表达载体。
在又一方面，本发明还涉及用于鉴定能够抑制CCR6受体之活性的化合物的方法，其中所述方法包括以下步骤：
(a)使CCR6受体与测试化合物相接触；
(b)添加CCR6受体激动剂，其中所述激动剂是多肽，所述多肽包含与根据SEQ ID NO.：5或SEQ ID NO.：18的序列显示至少80％同一性的氨基酸序列或者由其组成；
(c)确定所述CCR6受体的活性；以及
(d)如果(c)中确定的CCR6受体活性低于对照中确定的CCR6受体的活性，则选择所述测试化合物作为能够抑制CCR6受体活性的化合物。
在前述方法的一个优选实施方案中，步骤(a)、(b)、(c)、(d)以如上顺序进行。
在一个优选实施方案中，(a)中的CCR6受体由细胞表达，优选在细胞的表面上表达。在另一优选实施方案中，(a)中的CCR6受体是重组CCR6受体，优选为纯化的重组CCR6受体。如果(a)中的CCR6受体由细胞表达，优选地在细胞的表面上表达，则所述细胞可以例如包含于基于细胞的反应系统中。在一个优选实施方案中，所述细胞选自：成纤维细胞、肺泡上皮细胞、淋巴细胞和肺细胞。在又一优选实施方案中，所述细胞选自：成纤维细胞、肺泡上皮细胞、淋巴细胞和肺细胞，其中所述细胞来自间质性肺病或癌症患者。在一个优选实施方案中，所述间质性肺病是特发性肺纤维化，所述癌症是腺癌，优选为肺的腺癌。
如果(a)中的CCR6受体是重组CCR6受体，优选为纯化的重组CCR6受体，则CCR6受体可以包含于无细胞的反应系统中。然后可以将(b)中的CCR6受体激动剂添加到基于细胞的反应系统或者无细胞的反应系统中。
在这种上下文中，术语“反应系统”意指这样的实验装备(set up)，其中将表达CCR6受体或重组CCR6受体的细胞置于含有必要缓冲剂和/或适于进行前述方法的其它试剂的细胞培养管、组织培养管、Eppendorf管、反应室或其它容器装置中，而且其中所述方法在所述细胞培养管、组织培养管、Eppendorf管、反应室或其它容器装置中进行。因此，在一些实施方案中，前述方法还可以包括提供包含CCR6受体之基于细胞的反应系统或无细胞的反应系统的步骤。如果所述方法包括所述步骤，则优选所述步骤是步骤(a)，即所述方法的第一步骤。
优选地，CCR6受体是人CCR6受体。在一个优选实施方案中，所述CCR6受体是由根据SEQ ID NO.：3或SEQ ID NO.：4的序列编码的多肽。在另一优选实施方案中，所述CCR6受体是根据SEQ ID NO.：27的多肽。
在一个优选实施方案中，所述测试化合物是抗体、小分子或肽。优选地，所述抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。在一些实施方案中，所述抗体还可以选自抗体变体或片段，如单链抗体、双功能抗体、微小抗体、单链Fv片段(sc(Fv))、sc(Fv)2抗体、Fab片段或F(ab’)2片段。
在另一优选实施方案中，根据(b)的多肽包含与根据SEQ ID NO.：5的序列显示至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列或者由其组成。在一个特别优选的实施方案中，根据(b)的多肽包含与根据SEQ ID NO.：5的序列显示至少95％、至少98％或100％同一性的氨基酸序列或者由所述氨基酸序列组成。
在又一优选实施方案中，根据(b)的多肽包含与根据SEQ ID NO.：18的序列显示至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列或者由所述氨基酸序列组成。在一个特别优选的实施方案中，根据(b)的多肽包含与根据SEQ ID NO.：18的序列显示至少95％、至少98％或100％同一性的氨基酸序列或者由所述氨基酸序列组成。
在又一优选实施方案中，根据(b)的多肽包含以下氨基酸序列或者由以下氨基酸序列组成，所述氨基酸序列包含根据SEQ ID NO.：5的序列的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、20、30、50或60个连续氨基酸。
在又一优选实施方案中，根据(b)的多肽包含以下氨基酸序列或者由以下氨基酸序列组成，所述氨基酸序列包含根据SEQ ID NO.：18的序列的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、20、30、50或60个连续氨基酸。
在另一优选实施方案中，根据(b)的多肽包含以下氨基酸序列或者由以下氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与根据SEQ ID NO.：5的序列显示至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的同一性且包含根据SEQ ID NO.：5的序列的至少30个或者至少50个连续氨基酸。
在另一优选实施方案中，根据(b)的多肽包含以下氨基酸序列或者由以下氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与根据SEQ ID NO.：18的序列显示至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的同一性且包含根据SEQ ID NO.：18的序列的至少30个或者至少50个连续氨基酸。在一个特别优选的实施方案中，根据(b)的多肽是根据SEQ ID NO：18的多肽。
CCR6受体的活性可以例如通过本文上述用于确定CCR6受体活性的任意方法来确定。
合适对照的选择取决于用于确定CCR6受体活性的方法。本领域技术人员将知道如何选择合适的对照。在下文中的实施例部分描述了用于确定CCR6受体活性的一些合适的实施例和合适的对照。
对照可以例如是其中仅在存在CCR6受体激动剂且不存在测试化合物的条件下确定了CCR6受体活性的样品。
在一个优选实施方案中，(c)中确定的CCR6受体活性比对照中的CCR6受体活性低至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％。
在一个特别优选的实施方案中，(c)中确定的CCR6受体活性比对照中的CCR6受体活性低至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或者至少98％。
在另一优选实施方案中，(c)中确定的CCR6受体活性比对照中的CCR6受体活性低100％。
在又一优选实施方案中，(c)中确定的CCR6受体活性比对照中的CCR6受体活性低至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍、至少100倍、至少500倍、至少1000倍或者至少10000倍。
本发明还提供了在对象中检测间质性肺病或癌症的方法，其包括在来自所述对象的样品中确定CCR6基因表达的水平的步骤。
所述方法优选地在体外进行。
优选地，CCR6受体是人CCR6受体。在一个优选实施方案中，所述CCR6受体是由根据SEQ ID NO.：3或SEQ ID NO.：4的序列编码的多肽。在另一优选实施方案中，所述CCR6受体是根据SEQ ID NO.：27的多肽。
在一个实施方案中，可以通过使来自对象的样品与对CCR6特异的检测剂接触来进行CCR6表达水平的确定。如果与样品中任意其它化合物(即，非靶标)相比，检测剂以更高的亲和力结合CCR6，则检测剂对CCR6特异。优选地，如果检测剂只与结合CCR6而根本不结合非靶标，则检测剂对CCR6特异。
本发明还提供了在对象中检测癌症或者对癌症进行分级的方法，其包括确定来自所述对象的样品中CCL18基因表达水平的步骤。
本文所使用的术语“对癌症进行分级(grading cancer)”是指通过确定癌症的某些特征(如，其侵袭性(aggressiveness)及其预后)来对癌症进行分级。在一个优选实施方案中，可以通过将来自对象的样品中确定的CCL18的量与癌症级别(优选为腺癌的级别，最优选为肺的腺癌的级别)相关联来“对癌症进行分级”，优选腺癌。
在一个实施方案中，可以通过使来自对象的样品与对CCL18特异的检测剂相接触来进行CCL18表达的水平的确定。如果与样品中任意其它化合物(即，非靶标)相比，检测剂以更高的亲和力结合CCL18，则检测剂对CCL18特异。优选地，如果检测剂只结合CCL18而根本不结合非靶标，则检测剂对CCL18特异。
“确定CCR6基因表达的水平”意指可以确定CCR6 mRNA和/或蛋白质的水平或量。在一些实施方案中，可以确定CCR6受体的细胞表面表达。“确定CCL18基因表达的水平”意指可以确定CCL18 mRNA和/或蛋白质的水平或量。在一个优选实施方案中，所述CCL18是根据SEQ ID NO.：18的多肽。
可以例如通过原位杂交、northern印迹、RNA酶保护测定或基于PCR的方法(如反转录PCR或实时定量PCR)来确定CCR6 mRNA表达或CCL18 mRNA表达。本领域技术人员将知道如何进行这些方法。
在一些实施方案中，在确定mRNA的量之前，可以从来自对象的样品中分离总RNA。
可以用于确定CCR6mRNA表达水平的合适检测剂是例如对CCR6mRNA特异的反义寡核苷酸探针。可以用于确定CCL18 mRNA表达水平的合适检测剂是例如对CCL18 mRNA特异的反义寡核苷酸探针。所述反义寡核苷酸探针可以是RNA或DNA寡核苷酸探针。在一个优选实施方案中，所述寡核苷酸探针是单链RNA分子。
如果寡核苷酸探针能够在高严格条件(highly stringent conditions)下与CCR6 mRNA杂交，则其对CCR6 mRNA特异。如果寡核苷酸探针能够在高严格条件下与CCL18 mRNA杂交，则其对CCL18 mRNA特异。
本文所使用的术语“杂交”意指第一多核苷酸与第二多核苷酸的杂交。为了确定两条多核苷酸是否彼此杂交，本领域技术人员优选地在中度或严格杂交条件下在体外进行杂交实验。杂交测定和条件对于本领域技术人员而言是已知的并且可见于例如Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，N.Y.，6.3.1-6.3.6，1991中。严格条件可以例如是这样的条件，其中杂交在45℃下于6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中发生，然后在65℃下于0.2×SSC、0.1％SDS中洗涤。
用于检测CCR6蛋白或CCL18蛋白的优选检测剂是抗体或适配体。优选地，所述抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。在一些实施方案中，所述检测剂还可以选自抗体变体或片段，如单链抗体、双功能抗体、微小抗体、单链Fv片段(sc(Fv))、sc(Fv)2抗体、Fab片段或F(ab’)2片段。在一个优选实施方案中，可以使用对CCR6或CCL18特异的市售抗体。市售抗体的一个实例是在下文实施例1中所述的抗人CCR6mAb。
在一个优选实施方案中，上文所述的检测剂可以包含可检测标记。可以使用可以与检测剂相结合的任意合适标记。在一个优选实施方案中，所述可检测标记共价地或非共价地与检测剂相结合。可以与检测剂相结合的标记的实例包括，例如荧光染料如Cyanine染料(例如Cyanine3、Cyanine5或Cyanine7)、Alexa Fluor染料(例如Alexa 594、Alexa 488或Alexa 532)、荧光素家族染料、R-藻红蛋白、德克萨斯红、罗丹明和异硫氰酸荧光素(FITC)。还可以用酶(如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或β-内酰胺酶)、放射性同位素(如3H、14C、32P、33P、35S或125I)、金属(如金)或用生物素来标记检测剂。在另一优选实施方案中，所述检测剂还可以通过包含上述标记的第二检测剂来检测。
优选地，第二检测剂能够特异性地与上述检测剂相结合。在一个特别优选的实施方案中，第二检测剂是抗体。
在一些实施方案中，可以例如通过涉及组织学或细胞生物学手段的方法来检测CCR6表达或CCL18表达的水平。在一些实施方案中，可以使用可视化技术，如光学显微镜、免疫荧光显微镜或电子显微镜，或者流式细胞术或发光法(luminometry)。在一个优选实施方案中，通过免疫组织化学来检测CCR6表达或CCL18表达的水平。
本文所使用的术语“检测间质性肺病”或“检测癌症”意指可以在对象中或来自对象的样品中鉴定间质性肺病或癌性疾病或病症的存在。优选地，之前未知所述对象各自患有间质性肺病或癌症。在一个优选实施方案中，怀疑所述对象患有间质性肺病或癌症。
为了在对象中检测间质性肺病或癌症，在一些实施方案中，可以在确定来自对象的样品中CCR6基因表达水平的同时测量或确定分别指示间质性肺病或癌症的其它化合物或因子的量。例如，可以在来自对象的同一样品或不同样品中检测间质性肺病的已知标志物(如血清标志物表面活性蛋白(SP)A和D)或者已知的癌症标志物。其它合适的标志物对于技术人员而言是已知的。在一些实施方案中，除确定来自对象的样品中的CCR6基因表达的水平以外，本领域技术人员还可以检查样品的组织学模式以进一步检查对象是否患有间质性肺病或癌症。
为了在对象中检测癌症，在一些实施方案中，可以在确定来自对象的样品中CCL18基因表达水平的同时测量或确定指示癌症的其它化合物或因子的量。例如，可以在来自对象的同一样品或不同样品中检测已知的癌症标志物。其它合适的标志物对于本领域技术人员而言是已知的。在一些实施方案中，除确定来自对象的样品中CCL18基因表达水平以外，本领域技术人员还可以检查样品的组织学模式以进一步检查对象是否患有癌症。
在一个优选实施方案中，前述方法还包括将来自对象的样品中确定的CCR6基因表达水平与对照中的CCR6基因表达水平进行比较的步骤，其中与对照相比，来自对象的样品中确定的CCR6基因表达水平较高表明对象中存在间质性肺病或癌症。
在另一优选实施方案中，前述方法还包括将来自对象的样品中确定的CCL18基因表达水平与对照中的CCL18基因表达水平进行比较的步骤，其中与对照相比，来自对象的样品中确定的CCL18基因表达水平较高表明对象中存在癌症。
在一个优选实施方案中，对照是来自健康对象的样品。在一个优选实施方案中，与对照相比，来自对象的样品中确定的CCR6表达水平较高表明对象中存在间质性肺病或癌症。在另一优选实施方案中，与对照相比，来自对象的样品中确定的CCL18表达水平较高表明对象中存在癌症。术语“水平较高”意指与对照相比，来自对象的样品中确定的CCR6表达或CCL18表达水平为至少2倍、优选至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍、至少100倍、至少500倍、至少1000倍或者至少10000倍。最优选地，与对照相比，来自对象的样品中确定的CCR6表达或CCL18表达的水平为至少2倍、至少3倍、至少10倍、至少50倍、至少100倍或者至少1000倍。
在另一优选实施方案中，对照还可以是来自已知患有间质性肺病或癌症的对象(对照对象，即独立地诊断为具有间质性肺病或癌症的对象)的样品，其中所述癌症优选为腺癌，最优选为肺的腺癌。在这种情况下，与对照相比，来自对象的样品中确定的CCR6基因表达或CCL18基因表达的水平较高表明与对照对象相比，从中获取样品的对象中间质性肺病或癌症的进展程度更高。
在又一优选实施方案中，对照还可以是来自已知或怀疑患间质性肺病或癌症的对象的受感染器官的健康组织，其中所述癌症优选为腺癌，最优选为肺的腺癌。在这种情况下，优选待测试样品(即，来自对象的样品)来自所述器官的受感染(即患病)部分或者怀疑受感染的所述器官的一部分，所述对照来自同一器官的健康部分。在这种上下文中术语“受感染器官”意指感染疾病(即，间质性肺病或癌症)的器官。
在本发明的上下文中，所述对照优选从从中获取对照的对象的机体分离。
在一些优选实施方案中，本发明的前述方法还可用于在体外监测间质性肺病或癌症的治疗效力。可以例如通过以下方法来监测间质性肺病或癌症的治疗效力：在从中获取样品的对象接受间质性肺病或癌症的治疗期间，检测在给定的时间段中获得的来自对象的不同样品中CCR6表达的水平。从而在给定的时间段中得自对象的样品中CCR6表达水平的升高或降低可以指示治疗效力。
还可以例如通过以下方法来监测癌症的治疗效力：在从中获取样品的对象接受癌症的治疗期间，检测在给定的时间段中获得的来自对象的不同样品中CCL18的表达水平。从而在给定的时间段中得自对象的样品中CCL18表达水平的升高或降低可以指示治疗效力。
在一个优选实施方案中，可以平行地确定对照中CCR6表达的水平和来自对象的样品中CCR6表达的水平。在又一优选实施方案中，可以平行地确定对照中CCL18表达的水平和来自对象的样品中CCL18表达的水平。
在另一优选实施方案中，对照可以是预定值。这样的值可以例如基于之前的实验结果，所述实验确定来自健康对象或已知患有间质性肺病或癌症的对象的一个或更多个样品中CCR6表达水平或CCL18表达水平的量。在一些实施方案中，预定值可以得自数据库。
在一个优选实施方案中，可以将CCR6表达的水平与多于一个对照进行比较，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100或多于100个对照。在另一优选实施方案中，可以将CCL18表达的水平与多于一个对照进行比较，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100或多于100个对照。
优选地，本发明方法中使用的来自对象的样品从所述对象的机体分离。样品优选地为固体样品。在一个优选实施方案中，来自对象的样品是组织样品，优选为肺组织样品。组织样品可以例如是新鲜的或冷冻的组织样品或者固定的石蜡包埋样品。在一个优选实施方案中，样品可以是活检样品或切除术样品。在另一优选实施方案中，样品是用外科材料或得自纤维化肺的材料建成的成纤维细胞系(如下文中的实施例1中所述)。在又一优选实施方案中，样品是支气管刷拭样品。
在一些实施方案中，来自对象的样品是液体，优选为体液。
在一个优选实施方案中，体液选自血液、血浆、支气管肺泡灌洗流体、胸膜腔积液、痰、唾液、血清或尿。
在一些实施方案中，如果样品用于检查对象是否患有间质性肺病或癌症，如果样品用于检查对象是否患有癌症，则可以使液体样品富集目的细胞，例如循环纤维细胞或T细胞。
富集可以通过技术人员已知的任意方法进行。
富集可以例如通过使用包被有特异性抗体(如待富集的是T细胞的话则为对T细胞特异的抗体，或者如果待富集的是肺癌细胞的话则为对肺癌抗原特异的抗体)的固体支持物(例如柱)来完成。作为替代地，富集还可以例如通过使用过滤方法来完成如经网纱(mesh gauze)过滤，或者通过在微流体通道上固定特异性适配体并使液体样品泵经装置。
在又一方面，本发明还涉及用于检测间质性肺病或癌症的诊断试剂盒，其包含对CCR6多核苷酸或CCR6多肽特异的检测剂。
优选地，所述CCR6多核苷酸是CCR6mRNA。
在一个优选实施方案中，所述检测剂是抗体、适配体或寡核苷酸探针。
已在上文中描述了适于检测CCR6多核苷酸(特别是CCR6mRNA)和CCR6多肽的抗体和寡核苷酸探针。
在又一方面，本发明还涉及用于检测癌症的诊断试剂盒，其包含对CCL18多核苷酸或CCL18多肽特异的检测剂。
优选地，所述CCL18多核苷酸是CCL18mRNA。
在一个优选实施方案中，所述检测剂是抗体、适配体或寡核苷酸探针。
已在上文中描述了适于检测CCL18多核苷酸(特别是CCL18mRNA)和CCRL18多肽的抗体和寡核苷酸探针。
在一个优选实施方案中，所述诊断试剂盒还包含适于进行本发明方法的其它组分或试剂，如缓冲剂或对照。在另一优选实施方案中，包含于诊断试剂盒的组分包含于一个或更多个容器中。本发明的诊断试剂盒还包含说明书页，其指示如何使用诊断试剂盒及其组分。
在又一方面，本发明还涉及药物组合物，其包含能够抑制CCR6受体的活性和/或表达的化合物。
本发明的药物组合物可以经口施用，例如以丸剂、片剂、涂层片剂、糖包衣片剂、颗粒剂、硬和软明胶胶囊、含水、含醇或含油溶液、糖浆、乳剂或混悬剂的形式；或者经直肠施用，例如以栓剂的形式。施用还可以经肠胃外进行，例如以用于注射或输注的溶液的形式皮下、肌内或静脉内进行。其它合适的施用形式是，例如经皮施用或局部施用(例如以油膏、酊剂、喷雾剂或透皮治疗系统的形式)或者以鼻喷雾剂或气雾剂混合物的形式吸入施用。
在一个优选实施方案中，本发明的组合物肠胃外(例如，以用于注射或输注的溶液的形式)、经口(例如，以片剂、丸剂、锭剂或胶囊的形式)或者通过吸入来施用。
对于丸剂、片剂、糖包衣片剂和硬明胶胶囊的生产，可以使用例如乳糖、淀粉(例如，玉米淀粉或淀粉衍生物)、滑石、硬脂酸或其盐等。软明胶胶囊和栓剂的载体是，例如脂肪、蜡、半固体和液体多元醇、天然油或硬化油等。用于制备溶液(例如注射用溶液或乳剂或糖浆)的合适载体是，例如水、生理氯化钠溶液、醇(如乙醇)、甘油、多元醇、蔗糖、转化糖、葡萄糖、甘露醇、植物油等。
在一些实施方案中，所述药物组合物还包含添加剂，如填充剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、润湿剂、稳定剂、乳化剂、分散剂、防腐剂、甜味剂、着色剂、调味剂、芳香剂、增稠剂、稀释剂、缓冲物质、溶剂、增溶剂、用于实现储库作用的试剂、用于改变渗透压的盐、包衣剂或抗氧化剂。
用于本文所述的多种不同形式的药物组合物的合适赋形剂的实例可以例如见于A Wade和PJ Weller编辑的″Handbook of PharmaceuticalExcipients”，第2版，(1994)中。
在一个优选实施方案中，能够抑制CCR6受体的活性和/或表达的化合物选自：本发明的多肽、能够与CCR6受体结合的小分子、本发明的分离的多核苷酸、对CCR6受体特异的适配体、对CCR6受体特异的抗体、适于降低或抑制CCR6受体的表达的反义分子和适于降低或抑制CCR6受体的表达的siRNA分子。
可以例如通过筛选小化合物文库来鉴定能够与CCR6受体结合的小分子。
可以例如通过上文中所述的方法来确定小分子是否能够与CCR6受体结合。还可以例如使用类似方法以确定小分子是否能够与CCL18或CCL20结合。
本文所使用的术语“适配体”是指分别对CCR6受体、CCL18或CCL20特异的DNA、RNA或肽适配体。
多核苷酸适配体的长度优选为约10至约300个核苷酸。优选地，适配体的长度为约30至约100个核苷酸。最优选地，适配体的长度为约10至60个核苷酸。
适配体可以通过任意已知方法(包括合成、重组和纯化方法)来制备，并且可以单独使用或者与对CCR6、CCL18或CCL20特异的其他适配体组合使用。
对CCR6受体特异的抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。在一些实施方案中，所述抗体还可以选自抗体变体或片段，如单链抗体、双功能抗体、微小抗体、单链Fv片段(sc(Fv))、sc(Fv)2抗体、Fab片段或F(ab’)2片段，前提是所述抗体变体或片段对CCR6受体特异。
术语“适于降低或抑制CCR6受体表达的反义分子”是指与CCR6mRNA互补的多核苷酸。优选所述反义分子适用于抑制细胞中CCR6mRNA之翻译的反义方法。所述反义分子可以是DNA分子或RNA分子，并且可以是单链的或双链的。在一个优选实施方案中，反义分子是单链DNA分子或者双链或单链RNA分子。
反义分子优选地具有以下长度：约10至约500个核苷酸、约11至约200个核苷酸、约12至约100个核苷酸、约13至约75个核苷酸或者约14至约50个核苷酸、约15至约40个核苷酸、约16至约30个核苷酸或者约17至约25个核苷酸。
适于降低或抑制CCR6受体表达的siRNA分子可以是能够与CCR6mRNA杂交从而诱导RNA干扰或导致CCR6蛋白表达被降低或抑制的任意其它细胞内反义机制的单链或双链siRNA分子。
所述siRNA分子可以是使得siRNA分子诱导导致CCR6蛋白表达被降低或抑制之RNA干扰的任意序列。
优选地，所述siRNA分子具有以下长度：10至100、12至80、14至60、16至50、17至40、更优选18至30个核苷酸，最优选18至26个核苷酸。
在另一优选实施方案中，本发明的药物组合物包含适于治疗或预防间质性肺病和/或癌症的其它活性化合物。
适于治疗间质性疾病的其它活性化合物的实例是例如抗炎性药物如强的松或其它皮质类固醇，硫唑嘌呤，氨甲蝶呤，mycophenolate或环磷酰胺，抗氧化剂，如乙酰半胱氨酸抗纤维化剂如波生坦或吡非尼酮，米诺环素，西地那非，酞咪哌啶酮，抗TNF抗体，如英夫利西，依那西普，干扰素γ，抗IL-13抗体，内皮素抑制剂，齐留通，抗凝血剂，大环内酯类，磷酸二酯酶(PDE)4抑制剂，如罗氟司特，阿肽地尔，α-黑素细胞刺激激素(α-MSH)，酪氨酸激酶抑制剂，如伊马替尼，达沙替尼和尼罗替尼。
适于治疗癌症的其它活性化合物优选为化学治疗剂。适于治疗癌症的化学治疗剂对本领域技术人员而言是公知的。化学治疗剂的实例是，例如替莫唑胺、阿霉素、亚德里亚霉素、表柔比星、5-氟尿嘧啶、胞嘧啶阿拉伯糖苷(“Ara-C”)、环磷酰胺、噻替派、白消安、细胞毒素、紫杉烷类如紫杉醇、多西紫杉醇、氨甲蝶呤、顺铂、美法仑、长春碱、博来霉素、依托泊苷、异环磷酰胺、丝裂霉素C、米托蒽醌、长春新碱、长春瑞滨、卡铂、替尼泊苷、道诺霉素、洋红霉素、氨基喋呤、更生霉素、丝裂霉素、美法仑及其它相关氮芥和作用为调节或抑制对肿瘤的激素行为的激素剂，如它莫西芬和奥那司酮。
本发明的药物组合物可以包含一种或多于一种适于治疗或预防间质性肺病的其它活性化合物和/或一种或多于一种适于治疗或预防癌症的其它活性化合物。在一个优选实施方案中，本发明的药物组合物包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或多于10种适于治疗预防间质性肺病的其它活性化合物和/或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或多于10种适于治疗癌症的其它活性化合物。
在另一些优选实施方案中，可以对对象(优选人类对象)施用一种或更多种分离的组合物，其包含用于治疗或预防间质性肺病的活性化合物和/或适于治疗或预防癌症的活性化合物，其与包含能够抑制CCR6受体活性和/或表达之化合物的本发明药物组合物联合施用。
在又一方面，本发明涉及本发明的药物组合用于治疗或预防间质性肺病和/或癌症。
在另一方面，本发明涉及本发明的能够抑制CCR6受体活性和/或表达的化合物或药物组合物在制备用于治疗或预防间质性肺病和/或癌症的药物中的用途。
在本发明的用途的一个优选实施方案中，能够抑制CCR6受体活性和/或表达的化合物选自：本发明的分离的多肽、能够与CCR6受体结合的小分子、编码本发明的分离的多肽的分离的多核苷酸、对CCR6受体特异的适配体、对CCR6受体特异的抗体、适于降低或抑制CCR6受体表达的反义分子以及适于降低或抑制CCR6受体表达的siRNA分子。在上文中已描述了能够抑制CCR6受体的活性和/或表达的这样的化合物。在本发明用途的一个特别优选的实施方案中，能够抑制CCR6受体的活性和/或表达的化合物选自：本发明的分离的多肽、编码本发明分离的多肽的分离的多核苷酸。
本发明还涉及能够抑制CCL18或CCL20的活性和/或表达的化合物在制备用于治疗或预防间质性肺病和/或癌症的药物中的用途。
在本发明前述用途的一个优选实施方案中，能够抑制CCL18或CCL20的活性和/或表达的化合物选自：能够与CCL18或CCL20结合的小分子、对CCL18或CCL20特异的适配体、对CCL18或CCL20特异的抗体、适于降低或抑制CCL18或CCL20表达的反义分子以及适于降低或抑制CCL18或CCL20表达的siRNA分子。
本发明还涉及选自以下的检测剂在来自对象的样品中检测间质性肺病或癌症的用途：
(a)对编码CCR6受体的多核苷酸特异的检测剂；
(b)对CCR6受体特异的检测剂；
(c)对编码CCL18的多核苷酸特异的检测剂；
(d)对CCL18蛋白特异的检测剂；
(e)对编码CCL20的多核苷酸特异的检测剂；以及
(f)对CCL20蛋白特异的检测剂。
优选地，(a)、(c)和/或(e)中所述的多核苷酸是mRNA。用于检测CCR6mRNA、CCRL18mRNA或CCL20mRNA的合适检测剂是例如对CCR6mRNA、CCRL18mRNA或CCL20mRNA特异的反义寡核苷酸探针。用于检测CCR6受体、CCL18蛋白或CCL20蛋白的优选检测剂是抗体或适配体。优选地，所述抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。在一些实施方案中，检测剂还可以选自抗体变体或片段，如单链抗体、双功能抗体、微小抗体、单链Fv片段(sc(Fv))、sc(Fv)2抗体、Fab片段或F(ab’)2片段。对CCR6特异的市售抗体的一个实例是下文中实施例1中所述的抗人CCR6mAb。检测剂优选地包含可检测标记。
在本发明的方法、本发明的诊断试剂盒、本发明的药物组合物和/或本发明的用途的一个优选实施方案中，所述间质性肺病选自：原因已知的弥漫性实质性肺病(优选为胶原血管病或者环境或药物相关的弥漫性实质性肺病)、肉芽肿性弥漫性实质性肺病(优选为结节病)和其它形式的弥漫性实质性肺病(优选为淋巴管平滑肌瘤病(LAM)、肺部朗格汉斯氏细胞组织细胞增生/组织细胞增生X(HX)或嗜酸细胞性肺炎)。
在本发明的方法、本发明的诊断试剂盒、本发明的药物组合物和/或本发明的用途的一个特别优选的实施方案中，所述间质性肺病是特发性间质性肺炎。
在本发明的方法、本发明的诊断试剂盒、本发明的药物组合物和/或本发明的用途的又一优选的实施方案中，所述间质性肺病选自：特发性肺纤维化、非特异性间质性肺炎、隐源性机化性肺炎、呼吸性细支气管炎相关间质性肺病、脱屑性间质性肺炎、急性间质性肺炎和淋巴细胞性间质性肺炎。在本发明的方法、本发明的诊断试剂盒、本发明的药物组合物和/或本发明的用途的一个特别优选的实施方案中，所述间质性肺病是特发性肺纤维化。对于间质性肺病的分类的概述，本领域技术人员可以例如参考American Thoracic Society/European Respiratory Society InternationalMultidisciplinary Consensus Classification of the Idiopathic InterstitialPneumonias，American Thoracic Society；European Respiratory Society，Am J Respir Crit Care Med.2002年1月15日；165(2)：277-304。
在一些实施方案中，所述间质性肺病可以由选自以下的病症引起：硬皮性肺病、结节病、过敏性肺炎、类风湿性关节炎、红斑狼疮和石棉沉着病。
在本发明的方法、本发明的诊断试剂盒、本发明的药物组合物和/或本发明的用途的另一优选实施方案中，所述癌症选自：肺癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、成神经细胞瘤、黑色素瘤、脑癌、肾癌、膀胱癌、卵巢癌、血液癌症和结肠癌。在本发明的方法、本发明的诊断试剂盒、本发明的药物组合物和/或本发明的用途的又一优选实施方案中，所述癌症选自：腺癌(优选肺的腺癌)、胸膜间皮瘤、结直肠癌、前列腺癌、乳癌、肾细胞癌、肝细胞癌、非霍奇金淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤。
在本发明的方法、本发明的诊断试剂盒、本发明的药物组合物和/或本发明的用途的一个特别优选实施方案中，所述癌症是肺癌(最优选肺的腺癌)或胸膜间皮瘤。在一个最优选的实施方案中，所述癌症是肺的腺癌。
本发明还涉及：
(1)用于鉴定能够抑制CCR6受体之活性的化合物的方法，其中所述方法包括以下步骤：
(a)使CCR6受体与测试化合物接触；
(b)添加CCR6受体激动剂，其中所述激动剂是多肽，所述多肽包含与根据SEQ ID NO.：5或SEQ ID NO.：18的序列显示至少80％同一性的氨基酸序列或者由其组成；
(c)确定所述CCR6受体的活性；和
(d)如果在(c)中确定的CCR6受体活性低于对照中确定的CCR6受体活性，则选择所述测试化合物作为能够抑制CCR6受体活性的化合物。
(2)根据(1)的方法，其中所述测试化合物是抗体、小分子或肽。
(3)用于在对象中检测间质性肺病或癌症的方法，其包括在来自所述对象的样品中确定CCR6基因表达水平的步骤。
(4)根据(3)的方法，其中所述方法还包括以下步骤：将来自对象的样品中确定的CCR6基因表达水平与对照中的CCR6基因表达水平进行比较，其中与对照相比，来自对象的样品中确定的CCR6基因表达水平更高表明所述对象中存在间质性肺病或癌症。
(5)根据(3)或(4)的方法，其中所述间质性肺病选自：特发性肺纤维化、非特异性间质性肺炎、隐源性机化性肺炎、呼吸性细支气管炎相关间质性肺病、脱屑性间质性肺炎、急性间质性肺炎和淋巴细胞性间质性肺炎。
(6)根据(3)或(4)的方法，其中所述癌症选自：腺癌，优选肺的腺癌，胸膜间皮瘤，结直肠癌，前列腺癌，乳癌，肾细胞癌，肝细胞癌，非霍奇金淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤。
(7)用于在来自对象的液体样品中对可溶性CCR6受体多肽的浓度进行定量的方法，其中所述方法包括以下步骤：
(a)在固体支持物上固定对所述可溶性CCR6受体多肽特异的捕捉分子；
(b)添加来自所述对象的液体样品；
(c)任选地添加所述可溶性CCR6受体多肽的配体，其中所述配体是多肽，所述多肽包含与根据SEQ ID NO.：18、SEQ ID NO.：19、SEQ ID NO.：20或SEQ ID NO.：21的序列显示至少80％同一性的氨基酸序列或者由其组成；
(d)添加对根据(c)的配体特异的检测剂，其中所述检测剂包含标记；
(e)对来自根据(d)的检测剂的信号进行定量。
(8)根据(7)的方法，其中所述可溶性CCR6受体多肽是本发明的分离的可溶性CCR6受体多肽。
(9)用于在对象中检测和/或预测间质性肺病或癌症的方法，其中所述方法包括确定来自所述对象的样品中可溶性CCR6受体多肽的水平的步骤。
(10)根据(9)的方法，其中所述方法还包括以下步骤：将来自对象的样品中确定的可溶性CCR6受体多肽水平与对照中的可溶性CCR6受体多肽水平进行比较，其中与对照相比，来自对象的样品中确定的可溶性CCR6受体多肽水平更低表明所述对象中存在间质性肺病或癌症。
(11)根据(9)或(10)的方法，其中所述间质性肺病选自：特发性肺纤维化、非特异性间质性肺炎、隐源性机化性肺炎、呼吸性细支气管炎相关间质性肺病、脱屑性间质性肺炎、急性间质性肺炎和淋巴细胞性间质性肺炎。
(12)根据(9)或(10)的方法，其中所述癌症选自：腺癌，优选肺的腺癌，胸膜间皮瘤，结直肠癌，前列腺癌，乳癌，肾细胞癌，肝细胞癌，非霍奇金淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤。
现在将参照一些具体实施例来对本发明进行描述。但是，不应将这些实施例理解为限制。
实施例
实施例1-材料和方法
噬菌体展示文库
对于CCL18-结合基序的鉴定，使用已建立的噬菌体展示文库(1)。
细胞和细胞系
成纤维细胞系是由以下建立的：来自多种肿瘤患者的肺切除术或叶切除术(lobe-ectomies)的外科材料，或者来自通过电视辅助胸腔镜(video-assisted thoracoscopies，VATS)从纤维化肺获得的剩余材料。所述患者患有肺的腺癌、非小细胞癌或鳞癌。纤维化是由特发性肺纤维化(UIP)、非特异性间质性肺炎、结节病、过敏性肺炎、肺尘症(pneumoconiosis)或系统性硬皮症引起的。将组织切为小块(边长为约0.5cm)并置于含1ml Quantum 333(PAA，Pasching，Austria)(具有1％的青霉素/链霉素)的6孔板中。当成纤维细胞的汇合度达到约80％时，通过胰蛋白酶消化收获过度生长的成纤维细胞，在Quantum 333中培养于75cm2细胞培养瓶(NUNC Thermo Fisher，Roskilde，Denmark)中，然后进行传代(split)(1∶3至1∶5)。所建成的系的第3至8代用于研究中。
除非另有指明，否则用10ng/ml人重组CCL18、有或没有另外的1ng/ml TNFα的2.5ng/ml TGFβ来刺激所述细胞。
如之前(2)所述分离AECII。简言之，首先，通过显微镜将无肿瘤的肺组织切片，然后将切片在4℃下于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤3次，然后在37℃下于无菌的分散酶溶液(2,5mg分散酶II(InvitrogenGmbH，Karlsruhe，Germany)ml和50μg/ml DNase I(Roche Diagnostics，Mannheim，Germany))中消化60分钟。分散酶消化之后，使用具有宽口的10ml吸管将切片整个吸取几分钟。经具有50μm和20μm筛目的尼龙纱布过滤粗组织和细胞悬液。然后，将细胞悬液在密度梯度溶液(PANBiotech GmbH，Aidenbach，Germany)上成层，以800×g离心20分钟。
洗涤来自间期的细胞，并在37℃下于加湿孵箱(5％CO2，37℃)中，在100mm Petri皿(最大6×107细胞/皿)中的具有10％胎牛血清(FCS)(PAA Laboratories GmbH，Germany)和1％青霉素/链霉素(Biochrom AG，Berlin，Germany)的RPMI(Invitrogen，Karlsruhe，Germany)中孵育15分钟、20分钟以及如果可能的话30分钟，以从非贴附细胞去除贴附细胞(主要是肺泡巨噬细胞、单核细胞和成纤维细胞)。
人肺腺癌细胞和胸膜间皮瘤细胞是来自HH Fiebig教授(Oncotest，Freiburg)的慷慨捐赠。细胞培养于含有10％FCS和100U/ml链霉素和青霉素的RPMI1640中。当培养物汇合度达到90％时，将培养物以1∶3传代。
流式细胞术
使用FITC标记的抗人CCR6抗体(R&D Systems，Minneapolis，MN)来评估成纤维和肿瘤细胞系以及RLE-6TN的CCR6表面表达，使用FACScalibur(BD，Heidelberg，Germany)计数。需要将胰蛋白酶消化的细胞在37℃下于培养基中孵育3小时，以使表面分子再表达。为了抑制细胞的贴附，在聚丙烯管中进行该孵育。
还使用多克隆山羊抗CCR6抗体(CKR6/C20，Santa CruzBiotechnology，Santa Cruz，CA)和FITC标记的小鼠抗山羊抗体(DAKO，Glostrup，Denmark)分析RLE-6TN的CCR6表达。
还使用PE标记的抗人CCR6抗体(R&D Systems，Minneapolis，MN)评估了肿瘤细胞系的CCR6表面表达，用FACS Calibur(BecktonDickinson，Heidelberg，FRG)进行了测量。
人肺癌中CCR6表达的分析
将从肺的腺癌新鲜分离的肿瘤组织切成边长不大于1×1×0.5cm的片。在4℃下使用HOPE稳定化溶液(DCS，Hamburg，FRG)稳定组织，用石蜡包埋。使组织切片脱石蜡，使用市售抗体(R&D Systems，Wiesbaden，FRG)通过过氧化物技术(5)对CCR6表达进行染色。
免疫组化
如(3，4)所述，使用抗人CCR6mAb(克隆53103，同型小鼠IgG2b；R&D Systems Europe，UK)和过氧化物酶标记的链霉亲和素-生物素技术(DAKO LSAB2System；DakoCytomation，Germany)进行免疫组化。用美尔氏苏木素(Mayer’s hemalum)进行复染。对于包含于每个染色系列的阴性对照，不用第一抗体对切片进行染色。
FGF2ELISA
为了评估CCL18诱导的FGF2释放，收获成纤维细胞，计数并在Quantum333中于6孔细胞培养板中每孔接种300000个细胞。使细胞贴附过夜，将培养基更换为1ml的DMEM加10％FCS。不刺激细胞或者用10ng/ml的人重组体CCL18刺激细胞。为了阻断CCR6/CCL18相互作用，在平行培养物中添加针对CCR6的阻断抗体(R&D systems，Wiesbaden，FRG)或不相关抗体(小鼠抗人IgG，R&D Systems)至终浓度为20μg/ml。培养24小时之后，收获上清液，并在-80℃下储存直至FGF2进行测定。
用ELISA显色试剂盒(R&D)测量FGF2浓度，如供应商所建议的来进行。
实时PCR
在所述的培养时期之后，使用TRIzol试剂，根据制造商的方案(Invitrogen，Karlsruhe，Germany)提取总RNA。使用oligo(dT)12-18引物，根据制造商的方案用StrataScript RT(Stratagene，Santa Clara，CA)反转录总RNA以生成cDNA。使用LocusLink和GenBank数据库(NationalCenter for Biotechnology Information；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/LocusLink/index.html)，采用Primer3软件(Whitehead Institute forBiomedical Research，Cambridge，USA；http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi)、Amplify1.2软件(University of Wisconsin，USA；http://engels.genetics.wisc.edu/amplify)设计人CCR6、I型胶原、α-平滑肌肌动蛋白和GAPDH的特异性引物。用于产生各引物的核苷酸序列的登记号和引物序列描述于图17中。
所有引物都是跨内含子的并且通过MWG-Biotech(MWG-Biotech AG，Germany)合成。使用iQ SYBR Green SuperMix，iCycler热循环仪和iCycler iQ 3.0软件(Bio-Rad Laboratories GmbH，Germany)，根据制造商的方案来进行实时PCR。为了控制扩增产物的特异性，进行熔解曲线分析。在任何这些反应中均未观察到非特异产物的扩增。计算循环阈值(Ct)并用于通过下式计算特异mRNA的相对水平：对每个cDNA样品“相对表达＝2(CtGAPDH-CtCCL18)×10000”。
Western印迹
在孵育期之后，在PBS中洗涤细胞一次，在冰冷的裂解缓冲液中裂解。将全细胞裂解液在等体积的上样缓冲液(0,5M Tris-HCl pH 6.8，2％SDS，0,05％溴酚蓝，20％2-巯基乙醇，10％甘油)中于93℃下煮5分钟。
使所有样品经历12％十二烷基硫酸钠-PAGE，通过电泳分离并转移聚偏二氟乙烯膜(PVDF)。在含有5％脱脂奶粉的Tris缓冲盐水(TBS)中封闭2小时之后，在4℃下，用以1∶700用TBS稀释的第一抗体(兔抗胶原I(Rockland，Gilbertsville PA)、抗αSMA(兔抗αSMA(Abcam，Cambridge，MA))、抗波形蛋白(Santa Cruz)、抗CCR6：CKR6/C20(SantaCruz))将膜孵育过夜。使用以1∶10000至1∶20000稀释的标记有IRDye800CW或IRDye 700CW的合适第二抗体(Li-COR Bioscience，BadHomburg，Germany)进行可视化2小时，根据制造商的说明书使用Odyssey系统(Li-COR Biosience)进行扫描。
对存在或不存在PHA的条件下PBMNC的CCR6表达进行分析
通过密度离心从静脉穿刺血分离人外周血单核细胞，洗涤并计数。在完全培养基(具有10％胎牛血清和100U青霉素/链霉素的RPMI1640)中将细胞调整为1×106个细胞/ml，在存在或不存在10μg/ml植物凝集素(PHA)的条件下培养24小时。使用FITC标记的抗CCR6抗体(R&DSystems，Wiesbaden FRG)测量CCR6阳性细胞的百分比，并在FACSCalibur(Becton Dickinson，Heidelberg，FRG)中计数。
CCR6下调的抑制
将新鲜分离的单核细胞用10ng/ml的CCL18、100ng/ml的抑制剂肽PS-AU-105(根据SEQ ID NO.：9的多肽)、二者的组合孵育20分钟，或者不进行处理。孵育在37℃下于具有10％胎牛血清和100U/ml链霉素/青霉素的RPMI1640中进行。孵育之后，将细胞离心并弃去上清液。在冰上用4％多聚甲醛将细胞固定5分钟，并在含1％FCS的PBS中洗涤两次。固定之后，使用针对CCR6的荧光素缀合抗体(R&D systems，Wiesbaden，FRG)对细胞进行染色，通过流式细胞术(FACScalibur和Quantiquest；均为Becton DickinsonFranklin Lakes，USA)进行分析。
统计(图1至16)
使用非参数统计进行所有统计。使用Wilcoxon符号秩分析进行增加或抑制的成对分析；使用Mann-Whitney U测试分析未配对组。认为p＜0.05的值具有显著性。使用框图显示数据。在这种情况下，中值给出为表示25至75的百分比的矩形中的线。5至95百分比表示为矩形下方或上方的线，高于5至95的百分比或其之外的值表示为点。
患者
通过静脉穿刺从健康志愿者(n＝6)、NSIP(n＝6)和UIP(n＝13)患者收集血清。凝结一小时之后，将血液离心15分钟，将血清样品等分，在ELISA之前在-80℃下保存。
血清的Western印迹分析(实施例8)
用Western印迹缓冲液将血清1∶10稀释，在93℃下于等体积的上样缓冲液(0,5M Tris-HCl pH 6.8、2％SDS、0,05％溴芬蓝、20％2-巯基乙醇、10％甘油)中煮5分钟。
使样品经历12％十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，通过电泳分离并转移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)。在含有5％脱脂奶粉的Tris缓冲盐水(TBS)中封闭2小时之后，在4℃下，用以1∶700用TBS稀释的第一抗CCR6抗体(CKR6/20，Santa Cruz)将膜孵育过夜。使用以1∶10000至1∶20000稀释的标记有IRDye 800CW的第二抗体(Li-CORBioscience，Bad Homburg，Germany)进行可视化2小时。然后，根据制造商的说明书，使用Odyssey系统和软件(Li-COR Biosience)对印迹进行扫描和评价。
CCR6ELISA
按照供应商(Uscn Life Science Inc.Wuhan，China)所建议的进行Elisa。
游离可溶性CCR6的阻断
用不含任何添加剂或包含CCL18或CCL20(均为PeproTech，Hamburg，Germany；各100ng/ml)的等体积的PBS/BSA(1％牛血清白蛋白，Sigma，Deisenhofen，Germany)稀释血清。然后在37℃下将稀释的血清孵育1小时，随后通过ELISA测量。
支气管肺泡灌洗
使用如之前所述的标准技术(8，9)进行支气管镜检、支气管肺泡灌洗和BAL细胞培养。在培养期结束时，收获上清液，并在-70℃下储存直至CCL18浓度测定。细胞活力通过台盼蓝排除法来确定，并且全部超过95％。
BAL细胞分化计数
通过用Mary-Grunwald染色进行染色的细胞涂片上对至少200个细胞进行计数来确定细胞分化。
就免疫过氧化物酶染色而言，将细胞固定在聚L-赖氨酸涂覆的载片(Bio-Rad，Munich，Germany)上，使用针对CD4、CD8、IL-2R(OrthoDiagnostic Systems；Neckargemünd，Germany)和人白细胞抗原-DR(HLA-DR)(Becton Dickinson，Heidelberg，Germany)的单克隆抗体，采用过氧化物酶-抗过氧化物酶(PAP)技术显影。对至少200个细胞进行计数，阳性细胞表示为占所有淋巴细胞的百分数。
统计(图18至22)
数据描述为平均值±SD。使用卡方检验对标称数据进行比较。使用非参数Mann-Whitney U检验对连续数据进行分析。使用StatView进行所有统计。
与实施例11至17和图23至32相关的材料和方法
NSCLC患者和健康对照的特征
本研究中包括170名诊断患有NSCLS(UICC阶段I至阶段IV，第6版)的患者和31名健康志愿者的对照组。患者的平均年龄为64±10岁，有125名男性和45名女性。70名患者诊断患有腺癌，54名患者显示鳞癌，进行检查的病理学家将46例描述为具有混合的组织学特征。根据UICC阶段分类(第6版)，我们发现22名患者处于阶段IA，19名处于阶段IB，5名处于阶段IIB，29名处于IIIA，25名处于IIIB，69名处于阶段IV。在一例中，由于数据记录不充分(其只描述了结节状态)，所以未确定UICC阶段。对照组由平均年龄为32±11岁的10名女性对象和22名男性对象组成。
知情同意书、数据收集和隐私保护的所有程序均University MedicalCenter Freiburg的道德委员会批准。临床数据是从University MedicalCenter Freiburg的医学记录数据库提取的。在开始任何治疗之前，在个体的临床收录期间的诊断时从各个体获取血清样品。将血清储存于-80℃直至进行分析。通过组织学或细胞学验证NSCLC的诊断。根据世界卫生组织分类确定组织学类型。根据UICC第六版对所有肿瘤就行分类。
血清CCL18的免疫检测
采用常规方法对静脉血进行采样。离心前将血液样品静置20分钟。离心之后，在-80℃下冷冻血清样品并储存。使用DuoSet ELISA显色系统试剂盒(R&D Systems Europe，Wiesbaden，Germany)对CCL18进行定量。CCL18ELISA的检测限度为7pg/ml。所有样品一式两份测量。对于一式两份的样品，接受10％的测定内变异系数和20％的测定间变异系数。
由CCL18引起的EMT诱导
将腺癌细胞系A549的细胞接种于6孔板中，并使其贴附过夜。贴附之后，用所示量的CCL18刺激细胞。TGFβ用作阳性对照。72小时后收获细胞，并通过PCR或通过Western印迹进行分析。
成纤维细胞系的分离
从多种肿瘤患者用肺切除术或叶切除术的手术材料建立成纤维细胞系。将组织切为小片(边长为约0.5cm)，并置于含1ml Quantum 333(PAA，Pasching，Austria)(具有1％的青霉素/链霉素)的6孔板中。当成纤维细胞的汇合度达到约80％时，通过胰蛋白酶消化收获过度生长的成纤维细胞，在Quantum 333中培养于75cm2细胞培养瓶(NUNC Thermo Fisher，Roskilde，Denmark)中，然后传代(1∶3至1∶5)。
流式细胞术
使用FITC标记的抗人CCR6抗体(R&D Systems，Minneapolis，MN)评估成纤维细胞系的CCR6表面表达，并通过流式细胞术(FACScalibur，Becton Dickinson，Franklin Lakes，USA)进行测量。
统计
浓度以中值(范围)给出。使用StatView 5.0软件(SAS Institute，NC)进行数据分析。数据呈现为平均值和标准差并表示为框图。使用ANOVA和用于多重比较的Bonferroni-Dunn检验进行患者组的比较。通过Wilcoxon标记秩检验比较相关变量如不同刺激之后的相同细胞培养物的细胞因子生产。使用MedCalc(MedCalc Software bvba，Mariakerke，Belgium)进行ROC分析和“点相比于标准值(plots versus criterionvalue)”。
在单重比较中，如果概率值小于0.05，则认为其具有显著性。在多重比较中，根据比较(Bonferroni)数调整p水平。
实施例2-使用噬菌体展示鉴定CCL18结合肽
在噬菌体文库(如实施例1所述)的噬菌体与板结合的人CCL18结合3个循环之后，将噬菌体感染的大肠杆菌在琼脂上涂板，挑取20个菌落，扩增，分离DNA用于测序。一些序列无信息或者编码非人基因靶标，但是鉴定出了与CC-趋化因子受体6(CCR6)明显相关的一个序列。
实施例3-原代人成纤维细胞系上CCR6表达的分析
PCR
使用CCR6的引物进行的表达研究揭示CCR6mRNA表达的高度可变性。最高的表达见于源自普通型间质性肺炎(UIP)患者的肺的成纤维细胞系中。源自非特异性间质性肺炎(NSIP)或鳞癌患者的细胞系仅表达低水平的CCR6mRNA(图1)。
FACS
建成的成纤维细胞系的流式细胞术分析表明，仅在源自UIP患者的成纤维细胞系中有可检测的CCR6表达。从鳞癌或NSIP患者的肺产生的细胞系在其表面不表达可检测的CCR6(图2)。来自纤维化肺的成纤维细胞的增加的CCR6表达在所有代中保持增加(数据未显示)。
免疫组织化学
对取自IPF/UIP患者肺的组织切片的免疫组织化学研究未显示正常肺组织中CCR6的表达(图3A)。在纤维化肺中，在肺泡上皮细胞(图3B)和成纤维细胞(图3C)的顶部表面上检测到了CCR6的表达。
实施例4CCR6的功能性分析
FGF2表达
来自非纤维化肺的成纤维细胞仅释放了低水平的FGF2。CCL18在这些细胞中仅刺激了少量的FGF2释放。相反，来自纤维化肺的未受刺激的成纤维细胞释放了增加水平的FGF2(p＜0.005，与对照相比)，其由CCL18进一步上调(p＜0.05，图4)。
通过阻断抗体对CCR6进行阻断对非纤维化成纤维细胞系中CCL18刺激的FGF2释放没有作用。在来自纤维化肺的成纤维细胞中，CCR6的阻断显著地降低了CCL18诱导的FGF2上调(p＜0.05)。
胶原表达
已报道CCL18诱导胶原和αSMA的表达(7，18)。因此，确定这些分子的诱导是否也是CCR6依赖性的。如图5(上图)所示，CCL18在所分析的四个细胞系的3个中上调胶原I的表达。在所有三种CCL18反应性细胞系中，该诱导被使用阻断抗体进行的CCR6阻断而抑制。对于CCL18诱导的αSMA上调获得了相同的结果。不能通过CCL18刺激增加胶原I表达的细胞系在αSMA的情况下也不反应(图5，下图)。
实施例5-由CCL18引起的肌成纤维细胞的上皮间充质转化(EMT)的诱导是CCR6依赖性的
大鼠肺泡上皮细胞系RLE-6TN的EMT
大鼠肺泡上皮细胞系RLE-6TN显示上皮细胞的典型立方形细胞形态(图6，上)。在CCL18的存在下培养这些细胞6天在一些区域中诱导分化为纺锤状的成纤维细胞样细胞(图6，中，见箭头)。该分化在TGFβ的存在下更显著(图6，下，见箭头)，因为几乎所有细胞显示纺锤状的成纤维细胞样表型。这表明CCL18在RLE-6TN细胞中至少部分地诱导EMT。
由CCL18或TGFβ诱导EMT之后，RLE-6TN的Western印迹分析显示在CCL18的存在下进行培养后波形蛋白的表达，其由TGFα增强(图7)。在两种条件下，仅可见微量的αSMA。TGFβ诱导了αSMA的强表达，但未能诱导波形蛋白的表达。
荧光显微镜观察的结果证实用TGFβ刺激确实诱导了RLE-6TN细胞中αSMA的表达(图8B)，而CCL18或CCL18/TGFα未能如此(图8C和D)。相反，所有刺激均诱导CD90的表达(图9B和C)，但使用CCL18的话CD90的表达更强。RLE-6TN的定量实时PCR表明大鼠CCR6的微量表达。但是，使用Western印迹或流式细胞术的CCR6蛋白质分析不能证实RLE-6TN的CCR6表达(数据未显示)。因此，对细胞瞬时地转染含编码人CCR6的DNA序列的市售质粒。转染之后，用CCL18刺激在转染有CCR6的细胞中诱导了αSMA，而在模拟转染的细胞中并非如此。相反，TGFβ在两种细胞类型中都诱导αSMA表达(图10)。
人原代肺泡上皮细胞的EMT
如由波形蛋白和αSMA表达的诱导和细胞角蛋白的表达降低所证实的，用TGFβ+TNFα或CCL18(有或没有TNFα)刺激的分离的人原代肺泡上皮细胞类型II的刺激也诱导EMT(图11)。
实施例6-PBMNC中CCL18诱导的CCR6表达下调的抑制
按照分离的人外周血单核细胞(PBMNC)的CCR6+细胞的基础百分比将其分组。培养PBMNC而无任何活化不改变CCR6+细胞的百分比。相反，用PHA活化在具有低起始CCR6+比例的制备物中增加CCR6+百分比(图12，阴影柱)，但在具有高CCR6+比例的制备物中降低CCR6+的百分比(图12，白色柱)。
用CCL18孵育分离的富含CCR6+的PBMNC 20分钟导致CCR6+细胞的百分比降低(图13)，这可能是由CCR6受体的内化引起的。CCL18诱导的CCR6表达的下降在抑制剂肽PS-AU-105(根据SEQ ID No.：9的多肽)的存在下降低。图14证明在未刺激的(阳性对照)培养物中有清楚的CCR6+细胞亚群。如第二峰(仅CCL18)的降低所证实的，用CCL18刺激减少了该亚群。在抑制剂肽PS-AU-105(根据SEQ ID No.：9的多肽)的存在下，CCL18刺激未能下调CCR6+亚群。单独的抑制剂未显示作用(仅抑制剂)。
实施例7-人肺癌中CCR6表达的分析
免疫组织化学
对对照肺的分析未显示CCR6染色(图15A)。相反，肿瘤细胞清楚地显示CCR6表达(图15B和C，箭头)。此外，一些成纤维细胞还显示微量的CCR6表达(图15C，箭头)。
FACS
FACS分析在三种腺癌细胞系的两种(图16，上图)和所有胸膜间皮瘤细胞系(图16，下图)中显示出清楚的CCR6表达。肺腺癌细胞系LxFA526L显示了微量的CCR6表达。
实施例8-来自肺纤维化患者血清和健康对照血清的可溶性CCR6(sCCR6)的检测
Western印迹分析
Western印迹分析显示sCCR6存在于来自健康志愿者和UIP患者的血清中(图18A)。Western印迹的定量分析表明与对照相比，纤维化患者中有轻微但仍显著降低的峰密度(图18B)。
ELISA
为了更精确地评价Western印迹分析中观察到的差异，使用市售的CCR6ELISA测量sCCR6的浓度。在来自纤维化患者的19个(NSIP：n＝6，UIP：n＝13)样品的15个中，未检测到sCCR6，但来自健康志愿者的9个血清样品中只发现2个是阴性的(p＜0.005)。即使在通过Western印迹显示阳性的两个样品中(图18A的泳道4和6)，通过ELISA也未检测到sCCR6。与对照相比，来自肺纤维化患者血清中sCCR6的浓度显著较低(18±11相比于216±95pg/ml；p＜0.001；图19)。对纤维化疾病的进一步分析未显示来自UIP患者或NSIP患者的血清中sCCR6浓度有差异。
实施例9-来自纤维化患者的血清中的sCCR6分子是结合配体的。
实施例8所述的sCCR6ELISA使用单克隆抗CCR6抗体作为结合在板上的捕捉抗体，使用缀合生物素的多克隆抗CCR6抗体作为检测抗体。大多数单克隆抗CCR6抗体针对具有配体结合位点的受体N端部分。为了测试来自纤维化患者血清中的sCCR6分子的抗体识别位点是否可因这些血清中的高丰度CCL18而被配体覆盖[6，7]，分别用100ng/ml的CCL18或CCL20孵育来自健康志愿者的血清，通过ELISA测量封闭血清和未封闭血清中的sCCR6。添加这些CCR6配体导致sCCR6信号显著降低(图20)。添加100ng CCL18或CCL20几乎消除了具有低和中sCCR6浓度的血清中的CCR6检测。在具有高浓度sCCR6的血清中，在CCL18的情况下仅见到36％的降低，在CCL20的情况下为14％。
因此，通过ELISA不再检测到与其配体CCL18和CCL20结合的sCCR6。
这些结果表明，来自纤维化患者血清中的sCCR6分子是与配体结合的，从而通过ELISA在来自所述患者的血清中检测到较低浓度的sCCR6(实施例8)。数据还表明在血清中无配体sCCR6为阴性的患者中，CCL18封闭能力耗尽。
实施例10-与sCCR6阴性患者相比，血清中sCCR6呈阳性的纤维化患者在支气管肺泡灌洗流体(BAL)中显示较高的淋巴细胞百分比
CCL18被本发明人鉴定为CCR6受体的配体，其已被报道诱导T细胞趋化作用。因此，测试了sCCR6对支气管肺泡灌洗流体(BAL)中细胞群的可能的影响。事实上，与血清中无配体sCCR6呈阴性的患者相比，血清中无配体sCCR6呈阳性的纤维化患者(NSIP：n＝6，UIP：n＝13)在BAL中显示显著更高的淋巴细胞百分比(35.5％相比于17.8％，p＜0.05)。在对照中未见该差异(图21)。
这些数据表明，sCCR6降低了血清中CCL18的生物可获得性，从而增加肺与外周之间的CCL18浓度梯度以及促使免疫细胞趋化进肺泡。该功能在无配体sCCR6呈阴性的那些患者中耗尽，导致CCL18的积累和功能性CCL18的浓度梯度减小。
一般地，与在BAL中具有低百分比的淋巴细胞的患者相比，具有增加的淋巴细胞的百分比的患者中肺纤维化严重程度较低。分析淋巴细胞亚群表明血清中sCCR6呈阳性的患者中CD3+T细胞有轻微但仍显著的增加(91.0±1.4％相比于95.7±1.2％；p＜0.05)。相反，与sCCR6阴性患者相比，sCCR6阳性患者中HLA-DR阳性淋巴细胞的百分比较低(32.3±14.4％相比于7.0±7.8％；p＜0.05)。sCCR6阳性患者还显示NK细胞(CD57+)和CD1a阳性细胞的百分比增加(分别为33.0±9.6％相比于14.5±5.6％和1.0±1.0％相比于0.1±0.3％；在两种情况下均为p＜0.05)(图22)。
实施例11-NSCLC患者中CCL18的血清水平及其与临床病理学参数的相关性
所有患者组与对照相比具有显著性差异(p＜0.0001；图23)。鳞状细胞癌患者中CCL18血清水平与来自腺癌患者血清中的相比较高(分别为172±95ng/ml，207±139ng/ml；p＜0.02)。CCL18血清水平随T阶段的进展而逐步且显著地增加(图24)。与对照相比，阶段I(134±74ng/ml，n＝39，p＝0.0002)的CCL18血清水平显著较高，阶段II(176±99ng/ml，n＝61p＜0.0001)、III(215±106ng/ml，n＝26p＜0.0001)和IV(219±177ng/ml，n＝28p＜0.0001)患者中更是如此。肿瘤患者之间的比较表明阶段I中的水平与阶段III(215±106ng/ml，n＝26，p＜0.005)和阶段IV(219±177ng/ml，n＝28，p＝0.002)相比显著较低。阶段III和IV中的CCL18水平与对照相比也具有显著差异(p＜0.0001)。
实施例12-CCL18血清水平截断点的确定
受试者工作曲线(ROC)分析显示83ng/ml(曲线下面积(AUC)：0.968；p＜0.0001，图25左)的截断点以区分健康对照和NSCLC患者。用于区分癌症相关死亡或非癌症相关死亡的ROC分析未产生有效AUC。为了将肿瘤患者分层，使用观察期中的标准死亡进行标准值作图。该分析显示162ng/ml的等敏感度和特异性(54％)点(图25，右)。
实施例13-NSCLC患者中CCL18血清水平和存活
患有NSCLC且CCL18血清水平高于160ng/ml的患者具有623天的平均存活时间，而患有NSCLC且血清水平为160ng/ml至80ng/ml的患者具有984天的平均存活时间。在CCL18水平低于80ng/ml的患者中，平均存活时间为841天(p＜0.004，图26)。
实施例14-组织学亚组的CCL18血清水平和存活
在肺腺癌患者中，在具有最高CCL18水平的组中发现了388天的平均存活时间。在CCL18水平为160ng/ml至80ng/ml的组中，平均存活时间为788天，在具有正常CCL18水平的组中，平均存活时间为1152天(p＜0,002)。
实施例15-组织学亚组中的CCL18血清水平和肿瘤阶段
对于腺癌患者的亚组，与具有正常血清CCL18水平的亚组相比，血清CCL18浓度大于160ng/ml的组中平均N-阶段显著较高(1.7±1.1)(0.5±1；p＜0.005，图28)。对于腺癌患者，还有这样的趋势：在血清CCL18高于160ng(58％)的亚组中转移率较高，其在其它组中较低(＜160ng/ml：42％；正常：25％)。
实施例16-CCL18在腺癌细胞中诱导EMT
用CCL18刺激腺癌细胞72小时诱导显著及剂量依赖性的成纤维细胞标志物FSP1的mRNA表达上调。与由TGFβ诱导的上调相比，由CCL18诱导的上调较高(图29)。此外，CCL18还剂量依赖性地诱导成纤维细胞相关的转录因子snail的表达。同样，与TGFβ相比，用CCL18刺激更有效(图30)。与上述标志物相反，上皮标志物E-钙粘蛋白在用CCL18刺激24小时之后大幅下调(图31)。
实施例17-来自组织学亚组的成纤维细胞系中的CCR6表达
与来自鳞癌或肺的具有混合组织学的成纤维细胞系(分别为2±1％，n＝8和2±2％，n＝6)相比，从腺癌患者的肺分离的成纤维细胞显示较高的CCR6阳性细胞百分比(30±22％，n＝4；图32)。
实施例11至17中所述的结果呈现出研究肺癌患者中的CCL18血清水平的第一研究。观察到与健康对照相比，肺癌患者中CCL18的平均血清水平增加为多于4倍。所获得的数据表明CCL18血清水平升高对应于T阶段。相反，N-和M-阶段与CCL18血清水平无关。此外，根据肺癌的不同组织学，CCL18血清水平不同。
肿瘤相关巨噬细胞(TAM)类似于以另外方式活化的巨噬细胞，包括CCL18的释放。
用于区分健康对象和NSCLC患者的截断点是83ng/ml，其与本发明人确定的用于区分纤维化和健康对照的截断点在相同范围内。使用ROC分析不能根据CCL18血清水平预测癌症相关的死亡。因此，为了定义截断值以将患者分层，进行了针对存活的标准值作图。该CCL18标准值作图表明160ng/ml的浓度为截断点。160ng/ml的截断点强烈地预测NSCLC患者的平均存活时间。CCL18血清浓度为160ng/ml或更高的患者具有比CCL18浓度小于160ng/ml的患者短三分之一的平均存活时间。该作用在腺癌患者的亚组中最为显著。CCL18是以另外方式活化巨噬细胞的典型产物，并且是TAM的可能标志物。由于TAM位于肿瘤中，其数目应随肿瘤量而增加。从而分析了CCL18血清水平与T阶段的相关性以将其作为肿瘤大小的替代标志物。这特别适用于较低的T阶段，并且事实上，CCL18血清水平随从T1到T3的增加的T阶段而增加。T3阶段与T4阶段之间的主要的区别是重要纵隔结构的渗透，但不一定反映为大小的增加。在T3和T4阶段的患者中未发现CCL18血清水平的显著差异。
N和M阶段是血源性和淋巴性转移的替代标志物。具有高水平血清CCL18的患者中N-阶段的增加和转移频率较高的趋势表明CCL18是更严重的腺癌疾病的标志物。
与上皮细胞获得的结果平行，CCL18在腺癌细胞中也诱导上皮间充质转化。认为EMT是转移过程中的重要事件。癌症细胞确实只有有限的迁移能力。在EMT过程中，癌症细胞失去了它们与周围组织的接触，并且获得使细胞迁移的功能。间充质标志物FSP1和snail的上调和E-钙粘蛋白的下调表明CCL18在腺癌细胞中诱导EMT。因此，粘附分子E-钙粘蛋白的损失使得细胞逃离肿瘤组织。认为FSP1与转移和肿瘤侵袭相关。转录因子snail调节胶原、一些基质金属蛋白酶和α-平滑肌肌动蛋白的表达，这对细胞的运动而言是重要的
因此，CCL18是对高风险腺癌患者分层的生物标志物。数据还表明，CCL18通过EMT的诱导促进肿瘤转移。
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Claims (22)

1.分离的可溶性CCR6受体多肽，其包含选自以下的氨基酸序列或者由其组成：
(a)与根据SEQ ID NO.：1的序列显示至少80％同一性的氨基酸序列；和
(b)根据(a)的所述氨基酸序列的片段；
其中，所述分离的可溶性CCR6受体多肽能够与CCL18和/或CCL20结合。
2.根据权利要求1所述的分离的可溶性CCR6受体多肽，其中根据(a)的所述氨基酸序列包含所述根据SEQ ID NO.：1的序列的至少8个连续氨基酸。
3.根据权利要求1或2所述的分离的可溶性CCR6受体多肽，其中所述分离的可溶性CCR6受体多肽不包含跨膜结构域。
4.药物组合物，其包含能够抑制CCL18或CCL20的活性和/或表达的化合物。
5.根据权利要求4所述的药物组合物，其中所述能够抑制CCL18或CCL20的活性和/或表达的化合物选自：根据权利要求1至3中任一项所述的分离的可溶性CCR6受体多肽、能够与CCL18或CCL20结合的小分子、对CCL18或CCL20特异的适配体、对CCL18或CCL20特异的抗体、适于降低或抑制CCL18或CCL20的表达的反义分子和适于降低或抑制CCL18或CCL20的表达的siRNA分子。
6.根据权利要求4或5所述的药物组合物，其中所述组合物包含适于治疗或预防间质性肺病和/或癌症的其它活性化合物。
7.根据权利要求1至3中任一项所述的分离的可溶性CCR6受体多肽，其用于治疗中。
8.根据权利要求1至3中任一项所述的分离的可溶性CCR6受体多肽或根据权利要求4至6中任一项所述的药物组合物，其用于治疗或预防间质性肺病和/或癌症。
9.对根据权利要求1至3中任一项所述的分离的可溶性CCR6受体多肽特异的检测剂，其用于在来自对象的样品中检测间质性肺病或癌症。
10.根据权利要求8所述的分离的可溶性CCR6受体多肽、根据权利要求8所述的药物组合物和/或根据权利要求9所述的检测剂，其中所述间质性肺病选自：特发性肺纤维化、非特异性间质性肺炎、隐源性机化性肺炎、呼吸性细支气管炎相关间质性肺病、脱屑性间质性肺炎、急性间质性肺炎和淋巴细胞性间质性肺炎。
11.根据权利要求8所述的分离的可溶性CCR6受体多肽、根据权利要求8所述的药物组合物和/或根据权利要求9所述的检测剂，其中所述癌症选自：腺癌，优选为肺的腺癌；胸膜间皮瘤；结直肠癌；前列腺癌；乳癌；肾细胞癌；肝细胞癌；非霍奇金淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤。
12.分离的多肽，其包含选自以下的氨基酸序列或者由其组成：
(a)与根据SEQ ID NO.：9、22或23的序列显示至少80％同一性的氨基酸序列；和
(b)根据(a)的所述氨基酸序列的片段；
其中所述分离的多肽能够与CCR6受体结合并且抑制其活性。
13.根据权利要求12所述的分离的多肽，其中根据(a)的所述氨基酸序列包含所述根据SEQ ID NO.：9、22或23的序列的至少8个连续氨基酸。
14.分离的多核苷酸，其编码根据权利要求12或13所述的多肽。
15.根据权利要求14所述的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含与根据SEQ ID NO.：24、SEQ ID NO.：25或SEQ ID NO.：26的序列显示至少80％同一性的序列或者由其组成。
16.药物组合物，其包含能够抑制CCR6受体的活性和/或表达的化合物。
17.根据权利要求16所述的药物组合物，其中所述能够抑制CCR6受体的活性和/或表达的化合物选自：根据权利要求12或13所述的分离的多肽、能够与所述CCR6受体结合的小分子、根据权利要求14或15所述的分离的多核苷酸、对CCR6受体特异的适配体、对CCR6受体特异的抗体、适于降低或抑制所述CCR6受体的表达的反义分子和适于降低或抑制所述CCR6受体的表达的siRNA分子。
18.根据权利要求16或17所述的药物组合物，其中所述组合物包含适于治疗或预防间质性肺病和/或癌症的其它活性化合物。
19.根据权利要求16至18中任一项所述的药物组合物，其用于治疗或预防间质性肺病和/或癌症。
20.能够抑制CCR6受体的活性和/或表达的化合物或根据权利要求16至18中任一项所述的药物组合物在制备用于治疗或预防间质性肺病和/或癌症的药物中的用途。
21.根据权利要求18或19所述的药物组合物和/或根据权利要求20所述的用途，其中所述间质性肺病选自：特发性肺纤维化、非特异性间质性肺炎、隐源性机化性肺炎、呼吸性细支气管炎相关间质性肺病、脱屑性间质性肺炎、急性间质性肺炎和淋巴细胞性间质性肺炎。
22.根据权利要求18或19所述的药物组合物和/或根据权利要求20所述的用途，其中所述癌症选自：腺癌、优选为肺的腺癌；胸膜间皮瘤；结直肠癌；前列腺癌；乳癌；肾细胞癌；肝细胞癌；非霍奇金淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤。
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